Aulas passadas. Células, tecidos e orgãos Reinos filogenéticos. Compartimentalização em sistemas biológicos - rompimento e fracionamento celular

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Aulas passadas

Células 1: Procariotos e eucariotos

Células, tecidos e orgãos

Reinos filogenéticos

Compartimentalização em sistemas biológicos

- rompimento e fracionamento celular

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QBQ2451- 2013

Célula 2: Marcadores químicos de organelas

- microscopia

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Célula animal

Cada organela tem uma função e produz proteínas específicas: marcadores

Diversas possibilidades de marcação de estruturas celulares para:

1. investigar as suas funções

2. localizá-las (identificação e isolamento)

3. acompanhar eventos celulares (influxo de Ca+2_{, reconhecimento, determinadas}

ações biológicas, p.ex.)

Enzima Golgi-residente humana N-acetilgalactosaminiltransferase-2 Histonas/DNA Myristoylation/palmitoylation Lck tyrosine kinase Receptores proteicos Monômero de tubulina MAP4 Calreticulina KDEL Succinato desidrogenase Hexoquinases (citoesqueleto) (citoesqueleto)

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Técnicas de visualização/localização de estruturas celulares:

microscopia

Tipo de

Microscopia Resolução Tipo de Feixe O que mede Estado da amostra

Ótica 0,2 Luz branca

(visível) Luz absorvida ou refletida molhadas ou Amostras fixadas Eletrônica (transmissão ou de varredura) 0,05 Feixe de

elétrons transmitidos, Elétrons secundários,

raios X

Amostras secas e fixadas

Aumento de contraste: melhoria da imagem obtida!

microscopias de campo claro, campo escuro, fluorescência, contraste de fase Geralmente para células intactas

visualizar organelas com grande definição e até mesmo estruturas intraorganelas. Também permite obter informações multidimensionais

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(a) Microscópio óptico composto.(b) microscópios eletrônicos

Tipos: microscopias de campo claro, campo escuro, fluorescência, invertida, de transmissão confocal (microscopia de varredura confocal) e de polarização.

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Microscopia de campo claro Microscopia de contraste de fase Microscopia de campo escuro Largura média = 8-10 µm Dihidrocloreto de (4',6-diamidino-2-fenilindole: se liga a DNA

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Marcadores químicos coloridos ou fluorescentes 

substituiram os radioisótopos

• Marcadores coloridos:

aumento de contraste na microscopia de campo claro

• Marcadores fluorescentes  fluorescência permite:

maior sensibilidade

variabilidade de cor

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Reveladores de organelas: corantes ou fluorescentes

Compostos orgânicos que coram ou fluorescem estruturas nas células com base em suas naturezas químicas.

Muitos: básicos: carregados +  interação com estruturas carregadas – (ác. nucleicos, carboidratos ácidos, superfícies celulares)

Exemplos incluem:

1. Rastreador para mitocôndria

2. Corantes de ácidos nucleicos para núcleo

3. Lisorastreador e lisosensor para compartimentos ácidos 4. Corantes lipofílicos para membranas

5. Rastreador para retículo endoplasmático

6. Conjugados de ceramida para complexo de Golgi

Células vivas LBPAE incubadas simultaneamente com:

MitoTracker® Deep Red FM -mitocôndrias

LysoTracker® Green DND-26 -lisossomas Hoechst 33342 - núcleolo

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Exemplos de corantes:

azul de metileno, cristal violeta, safranina

Bactérias: Gram + ou -?

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Para Complexo de Golgi N1154 NBD-ceramide

D3521 BODIPY® FL ceramide D7540 BODIPY® TR ceramide

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Para Mitocôndria

Produção de organelas fluorescentes

pq produzem proteinas recombinantes fluorescentes

+

1) Experimentos de co-localização: localização de alvo intracelular de um bioativo

2) Tráfico celular

3) Indução ou repressão da expressão gênica

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Anticorpos marcados com fluorescentes (radioativos)

Anti-Calreticulina detectada com AF488 secundário, Mitotracker Red e DAPI

(os últimos são referências na microscopia)

Etapas

- Determinar sequência do antígeno/parte dela (peptídeo) produzida na célula de interesse (humana, p.ex.) 

- Produzir anticorpo 1º. contra o antígeno em coelho ou cavalo (o anticorpo 1o. não é

marcado) 

-Produzir anticorpo 2º. (contra o 1º.) e marcá-lo -Ligar o 1º. com antígeno e anticorpo 2º.

marcado com AF488 ao complexo (reconhece o anticorpo 1º. de coelho ou cavalo; não liga o antígeno humano)

-Ligação dele ao anticorpo 1º. possibilita a visualização da organela associada ao

antígeno

Células mortas

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Possibilidades para estudar função ou localizar alvo

de interesse em organelas celulares

1) Introdução de “reveladores”  marcadores = corantes ou fluorescentes que reagem com proteínas específicas ou outros alvos moleculares, p. ex. ácidos nucleicos (mais indicados para localizar tais proteínas e alvos)

2) Detecção de proteínas específicas (antígenos) marcadores = anticorpos (mais indicados para entender função)

3) Uso de microscopias adequadas

Células vivas ou fixadas!

Cuidados para uso de células vivas (manter a sua integridade):

1) Garantir que o tecido (células) foi incubado em condições apropriadas 2) Usar o mínimo de reagente revelador

3) Se possível, não expor as células à excitação de luz, principalmente na presença de reagente revelador

4) Se não, usar a menor excitação de luz possível

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Referências bibliográficas:

1) Invitrogen Corporation, Eugene OR.

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-

Analysis/Cellular-Imaging/Fluorescence-Microscopy-and-Immunofluorescence-IF/Organelle-Stains-for-Fluorescence-Imaging-Selection-Guide.html 2) http://www.sanidadanimal.info/cursos/inmun/segun2.htm

3) Nelson D.L & Cox M.M. Lenhinger – Principles of Biochemistry, Fourth Edition , 2005

4) B. Alberts e col., Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 5th. Edition, Cap. 9, 2008

5) Microbiologia de Brock, M.T. Madigan, J.M. Martinko, P.V. Dunlap, D.P.Clark, 12ª. edição, 2010.