BIOTECNOLOGIAS EMPREGADAS NA MEDICINA VETERINÁRIA. Biotecnologia

Biotecnologia

BIOTECNOLOGIAS

EMPREGADAS NA

MEDICINA

O que é isso???

É qualquer técnica que utilize

organismos vivos ou suas

partes, para fazer ou modificar

produtos, melhorar plantas ou

animais ou desenvolver

microorganismos para usos

específicos.

Amplificação reprodutiva

• Reprodução animal: Limitação na

capacidade natural na reprodução

• Capacidade de serviço

• Produção e qualidade de sêmen

Inseminação Artificial

• Fatores que afetam a produção de espermatozóides  Idade

 Ambiente

 Níveis hormonais

Etapas da Inseminação Artificial

• Seleção de machos

» Informações sobre os animais ( DEP)

• Coleta do sêmen

• Avaliação do sêmen

• Diluição do sêmen

• Utilização do sêmen

Usos da Inseminação Artificial

• Melhoramento genético

• Diminuir a relação macho/fêmea • Organização de Testes de progênie • Acasalamento em diferentes raças • Absorção de raças que se deseja criar

• Conservação de raças em perigo de extinção • Controle de doenças

• Eliminação de custos de produção e manutenção de machos no estabelecimento

• Facilidade de coletas de dados sobre paternidade • Disseminação de genes superiores de animais

corretamente avaliados que levam ao aumento de produção

Transferência de embrião (TE)

• Definição: Implantar em fêmeas

receptoras embriões produzidos por

fêmeas doadoras (0 até 30 Embriões)

• No que consiste a TE???

» Estimulação hormonal – superovulação

» Inseminação Artificial ou fecundação Natural » Coleta e armazenamento de embriões

ETAPAS DA TE

• Seleção de doadoras para TE

– Machos e fêmeas com genótipo comprovadamente superiores

– Escolha das características a serem melhoradas – Escolha das receptoras

– Aspectos sanitários

• Superovulação

– Resposta das doadoras ( 10 -15 % não respondem) – Hormônio mais utilizado FHS

ETAPAS DA TE

• Inseminação Artificial

– 7 dias após o inicio da superovulação;

– Utiliza-se sêmen congelado.

• Coleta de embriões

– 6-7 dias após a IA;

– Recuperação de embriões (transcervical)

– Sonda de coleta, fixada num dos cornos

– Taxa embrião x corpo lúteo : 70 %

Etapas da TE

• Isolamento e classificação de embriões

– Avaliação morfológica: microscopia óptica

– Observa-se

» Tamanho; » Forma ; » Cor ;

» Citoplasma;

» Membrana pelúcida e vesículas

Etapas da TE

• Estocagem de embriões

– Objetivo: Manter a viabilidade dos embriões

por varias horas ou dias fora do trato

reprodutivo da fêmea

– A fresco: fêmeas aptas a transferência.

– Congelado (Crio preservação): glicerol,

etileno-glicol, ISOCRIOGEN.

– Técnicas de descongelamento: Banho maria,

re-hidratação

Etapas da TE

• Sincronização do ciclo estral das

receptoras

– Objetivo: conseguir que as fêmeas estejam

em cio no momento desejado tanto para a IA

como TE.

– Melhora as chances de implantação, melhora

a taxa de prenhes

– Hormônios utilizados: prostaglandina,

progestagenos.

Etapas da TE

• A transferência do embrião (inovulação)

– Objetivo: Posicionar o embrião no útero da receptora – Técnica: Não cirúrgica ( inovulação trans-cervical) – Local da introdução do pailletes: corno uterino com

deposição do embrião na junção útero-tubárica. – Resultado: 2 a 3 meses após a TE realiza-se o

diagnostico de gestação nas vacas receptoras, que 9 meses após a TE darão origem a animais

geneticamente semelhantes a progênie das vacas doadoras de embriões e aos touros utilizados na IA.

FATORES QUE AFETAM A

EFICÁCIA TE:

• Resposta individual de cada vaca a estimulação hormonal

• Nível técnico da equipe que conduz a TE; • Escolha das técnicas da coleta e TE;

• Grau de sincronização do cio entre o ciclo estral das fêmeas doadoras e receptoras;

• Fertilidade natural das doadoras; • Qualidade do sêmen utilizado • Qualidade dos embriões

• Nutrição e manejo dos animais

OBS: Embriões normais, equipe capacitada,animais saudáveis e em época de ciclo adequados : taxa de eficiência de 50 %.

USOS da TE

• Obtenção de maior número de progênie de

fêmeas de alto valor genético;

• Expansão rápida de núcleos de vacas

selecionadas;

• Controle na transmissão de doenças;

• Comércio de embriões;

• Teste de homozigose para genes dominantes.

• Conservação de raças em perigo de extinção,

Limitações da TE

• Impacto menor no melhoramento genético

do que a IA;

• Tecnologia complexa e mais cara;

• Uso de mão de obra especializada.

SEXAGEM DE SEMÊN

• Determinação do sexo do espermatozóide: Y ou X • Vantagens:

• Melhor programação das populações • Maior ganho na produção de carne e leite

• Facilidade em direcionar reposição de matrizes

• Ganhos genéticos e redução de tempo na seleção de plantéis • Garantia de acurácia acima de 85% na determinação do sexo • Melhor direcionamento nos testes de progênies

• Poder de decisão passa para as mãos do pecuarista

• A aplicação comercial de sêmen sexado já existe no Brasil desde 2004.

• Atualmente a acurácia fica em torno de 90 %. • Devido ao alto custo, em relação ao sêmen não

sexado, recomenda-se utilização de fêmeas com bom histórico reprodutivo, e em condições ideais de

Fertilização IN VITRO

• Definição : Embriões são produzidos fora do

corpo da fêmea

• Etapas:

• Coleta de ovócitos na fêmea: Laparoscopia

• Maturação dos ovócitos in vitro;

• Capacitação dos espermatozóides;

• Desenvolvimento do embrião até blastocisto.

• Implantações de embriões nas fêmeas

receptoras.

OBS: Eficiência da técnica até 40% (embriões

viáveis / ovócito maduro)

Sexagem de embriões

• É a disponibilidade de embriões cujo o

sexo já esteja previamente determinado.

• Técnica: Amplificação enzimática dirigida

de DNA ( PCR), com kit comercial.

• Vantagem: Produção de machos ou

fêmeas de acordo com os objetivos da

produção

• Desvantagens: As técnicas ainda são

caras e sujeita a erros

CLONAGEM

• Definição: a clonagem é um processo de reprodução assexuada, onde são obtidos indivíduos geneticamente iguais (microorganismo, vegetal ou animal) a partir de uma célula-mãe

• Ocorre de forma natural no caso de gêmeos univitelínos • É um meio de propagação comum em plantas, bactérias

e protozoários

• Ainda não existe comercialmente a venda de embriões clonados

• Uso no melhoramento: Possibilidade da multiplicação de animais geneticamente superiores em larga escala.

• Desvantagem no melhoramento genético: Perda da variabilidade genética, no aspecto de resistência a doenças, fatores climáticos

Animais trangênico

• Definição : Possui em seu genoma um DNA estranho (de outra espécie geralmente), integrado de forma estável, em que se transmite a sua descendência de acordo com as leis de genética Mendeliana.

• Técnica: micro manipulação ou vírus: introdução, modificação ou inativação de um gene.

• Aplicação no melhoramento: aumento de produção: carne, lã, resistência a doenças, e modificação de produtos (maciez da carne, nível colesterol da carne, lactose)

• Limitação: técnica ainda em desenvolvimento, aceitação quanto ao consumo dos produtos, pouco conhecimento sobre os efeitos na saúde humana.

Estudo com animais trangênicos

• Suínos: bGH ( hormônio de crescimento bovino)

– Vantagens: aumento do crescimento; aumento na conversão alimentar; mudança na composição da carcaça; redução da espessura de gordura

subcutânea

– Efeitos adversos: aumento dos níveis circulantes do plasma ( ulceras, artrites, problemas cardíacos,

dermatites e IR: pouco tempo de vida)

• Bovino: lacto albumina ( proteína humana)

– Esse leite transgênico é mais nutritivo para humanos que o leite natural, e poderia ser introduzido na

alimentação de crianças com carência de nutrientes específicos .

Controle na produção de Animais

trangênicos

• Comissão do Codex alimentarius (Lei alimentar

ou Código alimentar, em latim), estabelecida

conjuntamente pela FAO (Organização das

Nações Unidas para a Agricultura e a

Alimentação) e pela OMS (Organização Mundial

da Saúde), está trabalhando em colaboração

com vários países, dentre eles o Brasil, com o

objetivo de criar normas de aplicação

internacional visando a segurança de alimentos

produzidos a partir desses animais.

MARCADORES GENÉTICOS

• Identificar ou etiquetar alguma coisa

• 1923: feijão com ausência de cor escura no tegumento x tamanho do semente : seleção de forma indireta

(tegumento claro = marcador)

• Qualidade de um bom marcador

» Herdável

» Fácil observação » Herdabilidade alta

» Intimamente relacionado ao alelo que desejamos selecionar

• OBS: Essas qualidades tornam mas eficientes a seleção indireta

• Os marcadores genéticos podem ser morfológicos e moleculares.

MARCADORES MORFOLOGICOS

• Fenótipo de fácil identificação

• Normalmente determinada por único alelo.

• Exemplo 1: planta de milho jovem verde clara x

esterilidade masculina ( fenótipo importante na produção de híbrido mas de difícil identificação = estão em lócus bastante próximos e tem alta probabilidade de serem herdados juntos)

• Exemplo 2: cor amarela do milho x teor de vitamina (o mesmo alelo para ambas características: mais fácil selecionar pela cor)

• Limitação dos marcadores morfológicos:

• Ocorrência em numero reduzido

• Muitas características de interesse econômico não tem marcador morfológico

Marcadores que utilizam o próprio

DNA

• São os próprios genes ou seus vizinhos, isto é

seqüências de DNA situadas próxima ao gene

que se deseja marcar

• Vantagens;

• Grande variabilidade entre indivíduos

• Numero de marcadores suficientes para marcar todos os alelos de todos os genes que se deseja marcar.

• Desvantagens:

RFLP

DNA).

• Isolamento do DNA dos indivíduos

• Enzimas de restrição que geram milhares de fragmentos • Separação por eletroforese ( tamanhos das seqüências) • Observa-se polimorfismo entre indivíduos diferentes

• Hibridização com DNA marcado radioativamante (sonda), P radioativo

• Fotografia do fragmento identificado pela sonda

• Admitindo-se que o fragmento de DNA identificado pela sonda esteja intimamante ligado a um alelo de interesse, pode –se selecionar esse alelo por meio desse

fragmento. Assim o fragmento RFLP funciona como um marcador ou etiqueta do alelo de interesse.

AFLP

• AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) Significa o Polimorfismo de Comprimento de

Fragmentos Amplificados.

O AFLP combina a especificidade, resolução e poder de amostragem da digestão com enzimas de restrição e a praticidade e velocidade do PCR.

• ETAPAS

– Clivagem com 2 enzimas de restrição; – Ligação de adaptadores específicos;

– São sintetizados inicializadores complementares aos adaptadores;

– Amplificação seletiva ( reação de PCR) – Eletroforese.

Microssatélites

• Seqüências curtas (2 a 5 pb)

• Repetições em tandem (6 a 8

nucleotídeos = mais comuns TG/AC)

• Mais utilizada em mapeamento genético

• Necessita-se de primers específicos para

as regiões de DNA que flanqueiam os

microssatélites

SNP

• Marcadores moleculares de DNA que

identificam polimorfismos com base em

um único nucleotídeo

• São fontes abundantes de variação

genética

• Vantagem: Possibilidade de detecção de

grande quantidade de polimorfismos entre

alelos

• De todos os marcadores moleculares, são

os de mais cara técnica laboratorial

Uso de marcadores no estudo de

caracteres quantitativos

• Caracteres quantitativos

– Controlados por vários genes de pequeno efeito – Sofrem maior influencia ambiental

– Não se sabe quanto ele contribui para o fenótipo

• QTL: Quantitative Trait Loci; Locos de um caractere quantitativo identificado por marcadores moleculares. • Finalidade: determinar quanto de um caractere

quantitativo é explicada por um ou mais marcadores

• Como os caracteres quantitativos são medidos por meio de médias os variâncias, pode-se ter idéia da

porcentagem do fenótipo do caractere que é explicado pelo marcador.

QTL

• São regiões cromossômicas relacionadas com

variação fenotípicas das características

quantitativas

• Limitações:

• Dificuldade de avaliação dos caracteres quantitativos aliados a necessidade de ligação dos marcadores com os QTL

• Dificuldade de obtenção dos próprios marcadores • Estudo difícil e trabalhoso

• Obs: Há necessidade de mais pesquisas para

tornar mais eficientes o emprego dos

marcadores moleculares no estudo das

características quantitativas