Métodos cromatográficos e espectrométricos usados em quimiotaxonomia, prospecção de metabólitos bioativos e identificação rápida de fungos

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Métodos cromatográficos e espectrométricos usados

em quimiotaxonomia, prospecção de metabólitos

bioativos e identificação rápida de fungos

Lucas M. de Abreu, DFP, UFLA

Setembro, 2011

V Simpósio Brasileiro de Microbiologia Aplicada

? O O H O O H O H O H

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2

Metab

Metabóólitos primlitos primáários e metabrios e metabóólitos secundlitos secundáários...rios...

substâncias com distribuição generalizada

substâncias com distribuição restrita

O H O O O O O O O O O H O Dewick, 2001

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3

Metab

Metabóólitos secundlitos secundáários produzidos por fungos rios produzidos por fungos

100 mil espécies de fungos descritas

25 mil metabólitos secundários descritos (2005)

10 mil spp. investigadas quanto ao metabolismo secundário

funções

competição, proteção toxinas, antibióticos

controle metabolismo (sob certas condições) comunicação

nenhuma ?

diversidade - aproximadamente...

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4

usos - fármacos e seus precursores

O N O O O H S N H H O O H O O S N

tiamulina - antibiótico de uso veterinário caspofungina - antifúngico griseofulvina - antifúngico penicilina G - antibiótico

Metab

(5)

5 N O N O N O N O NH _O N H O N O N H O N O N O N H O O H H ciclosporina A - imunossupressor

ácido micofenólico - imunossupressor

lovastatina - inibidor da síntese do colesterol

ergotamina - vasoconstritor (enxaqueca)

usos - fármacos e seus precursores

Metab

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6 perigos - micotoxinas aflatoxina B1 toxina T2 ocratoxina A patulina citrinina fumonisina B1 Metab

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7

Prospec

Prospecçção quão quíímica de fungosmica de fungos

em geral desvinculada de um trabalho taxonômico

fontes de diversidade

solo (tradicional), plantas (endófitos e patógenos) e ambiente marinho

escolha dos isolados

aleatória ou baseada em resultados de bioensaios

frequente ocorrência de redundâncias taxonômica e química

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8

Fungos toxigênicos

métodos analíticos para detecção de toxinas em alimentos e fungos contaminantes

taxonomia é importante: conhecendo-se as espécies e seus metabólitos tem-se idéia do risco associado

Penicillium roqueforti

Frisvad & Samson, 2004

Maturação de queijos - sem riscos

Contaminação de forragens e grãos - toxina PR

Toxina PR Toxina PR

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9

Estrat

Estratéégiagia

obtenção de perfis de metabólitos produzidos

comparações entre perfis; uso de bancos de dados

caracterização parcial das substâncias presentes nos extratos

Prospecção química, análise toxicológica e quimiotaxonomia

Larsen et al., 2005; Smedsgaaard & Nielsen, 2005

avaliação dos metabólitos secundários produzidos por fungos cultivados em pequena escala

métodos analíticos - CLAE, CLAE-EM

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10

Primeira etapa

Primeira etapa -- obtenobtençção de extratosão de extratos

cultivo dos isolados em meio(s) apropriado(s)

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11

Obten

Obtençção de extratosão de extratos

extração em micro-escala

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12

Cromatografia l

Cromatografia lííquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos quida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE

(CLAE--DAD, HPLC) DAD, HPLC)

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RT = 9,5 min_{RT = 10,8 min} RT = 5,5 minRT = 6,9 min

13 Fel 355

CLAE

CLAE--DADDAD

Alternariol

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14

CLAE

CLAE--DAD acoplada DAD acoplada àà espectrometria de massas (EM)espectrometria de massas (EM)

metabólitos separados por CLAE são analisados por EM

EM - íons são separados de acordo com sua razão massa / carga (m/z)

espectrômetro de massas

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15

CLAE

CLAE--DADDAD--EMEM

espectrômetros de alta resolução - determinação de fórmulas moleculares bancos de dados - identificação de metabólitos, desreplicação

Perfil de metabólitos secundários de Aspergillus fumigatus obtido por CLAE-EM. Adaptado de Frisvad et al., 2009

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16

Uso de perfis de metab

Uso de perfis de metabóólitos na desreplicalitos na desreplicaçção e descoberta de substânciasão e descoberta de substâncias

Triagem inteligente

obtenção de perfis de metabólitos em pequena escala e definição de quimiotipos

CLAE-DAD, CLAE-DAD-EM

seleção de representantes de cada quimiotipo e desreplicação espectros de massa, bancos de dados

condução de bioensaios

extratos brutos ou (micro) fracionados

cultivo em grande escala, purificação e elucidação estrutural metabólitos alvo

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17

novos análogos da mevastatina produzidos por Penicillium solitum

Mevastatina Mevastatina

Solistatina

Solistatina Solistatinol

Espectros de absorção no UV dos metabólitos mevastatina, solistatina e solistatinol. Adaptado de Sørensen et al., 1999; Larsen et al., 2007

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18 Alantripinona N N O N H O N H O Alantripinona N N O N H O N H O

descoberta de análogos de metabólitos conhecidos - programa X-hitting

avalia arquivos gerados por CLAE-DAD em busca de espectros de absorção no UV semelhantes ao de uma substância alvo

Lapatina A N H N N O NH N O H O Lapatina A N H N N O NH N O H O Lapatina B Lapatina B

Comparação entre os espectros de absorção no UV da alantripinona (azul) com aqueles da lapatina A (esquerda) e lapatina B (direita). Adaptado de Hansen et al., 2005

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19

Fracionamento de extratos por CLAE seguido de bioensaios

metabólitos eluídos são distribuídos em uma placa de microtitulação

o conteúdo dos poços é submetido a bioensaios (micro-escala)

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20 [M+H]+ [M+NH₄]+ Fórmula molecular: C₂₉H₃₅NO₈ Escoparasina A Fenocalasina B Microfracionamento Microfracionamento

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21

Perfil por CLAE, atividade antibacteriana e citotóxica do extrato do fungo Gliocladium sp. Adaptado de Lang et al., 2006 4-ceto-clonostaquidiol O O O O O O H 4-ceto-clonostaquidiol O O O O O O H Microfracionamento Microfracionamento

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objetivo

uso de metabólitos secundários como caracteres (marcadores) para caracterização e identificação de fungos

hipótese

quimioconsistência - espécies diferentes produzem perfis de metabólitos secundários distintos

Quimiotaxonomia

Frisvad et al. 2008

gêneros mais estudados

Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria,Trichoderma, Stachybotrys, Xylaria, Hypoxylon

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Samson et al. 2004

abordagem descritiva - marcadores qu€micos para caracteriza•‚o de espƒcies definidas; indica•‚o de poss€veis novos t„xons

P. roqueforti – produ•‚o de queijos; contamina•‚o de p‚es, silagem e gr‚os

Produz toxina PR, „cido micofen†lico, isofumigaclavina A e B, roquefortina C

P.carneum – contamina•‚o de carne, p‚es, cerveja, queijos e silagem

P. paneum – contamina•‚o de p‚es, gr‚os e silagem

Produz patulina, penitrem A, „cido micofen†lico, isofumigaclavina A e B, roquefortina C

Produz patulina, botriodiplodina, roquefortina C

Quimiotaxonomia

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24

taxonomia numérica - classificação multivariada de isolados com base em perfis de metabólitos

matrizes binárias isolados X metabólitos (RI) - índices de similaridades 667 681 688 689 696 697 699 702 703 707 712 718 721 733 740 744 745 CML871_Coffee_MG 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 CML1316_Coffee_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 CML1501_Mango_MG 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 CML1506_Mango_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 CML1527_Cacao_BA 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 CML1928_Phoradendron_MG0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 CML1930_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 CML1932_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 CML1933_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 CML1500_Mango_MG 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 CML1502_Mango_MG 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 CML1503_Mango_MG 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 CML1507_Mango_MG 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 CML1931_Tapirira_MG 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 CML1934_Phoradendron_MG0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 CML1936_Phoradendron_MG0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 CML1481_Mango_MG 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 CML1520_Cacao_AM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 CML1529_Cacao_BA 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 CML1530_Cacao_BA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 CML1939_Phoradendron_MG0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 CML1929_Tapirira_MG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia

(25)

25

taxonomia numérica

Overy et al. 2005

Quimiotaxonomia

(26)

26

quimiotipos e filogenia

Quimiotaxonomia

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27

Penicillium polonicum

Identifica

Identificaçção rão ráápida (e taxonomia) de fungospida (e taxonomia) de fungos

ESI - ionização de um grande número de metabólitos; de perfis de massa

Larsen et al., 2005

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28

id

id--EMEM

Id-EM Filogenia

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29

An

Anáálise de perfis de protelise de perfis de proteíínas por EMnas por EM

extratos brutos, micélio ou esporos analisados diretamente por EM ionização de proteínas - MALDI

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30

An

Anáálise de perfis de protelise de perfis de proteíínas por EMnas por EM

analisador de massas por tempo de vôo - TOF

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An

An„„lise de perfis de protelise de perfis de prote€€nas por EM nas por EM –– MALDIMALDI--TOFTOF

A. candidus A. chevalieri A. flavus A. fumigatus A. sydowii A. terreus A. ustus A. versicolor

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An

A - A. candidus B - A. chevalieri C - A. flavus D - A. fumigatus E - A. nidulans F - A. niger G - A. parasiticus H - A. repens I - A. sydowii J - A. terreus K - A. ustus L - A. versicolor

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An

P. aurantiogriseum P. brevicompactum P. citrinum P. chrysogenum P. purpurogenum P. roqueforti P. simplicissimum P. variabile Hettick et al. 2008b

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An

A - P. aurantiogriseum B - P. brevicompactum C - P. citrinum D - P. chrysogenum E - P. expansum F - P. fellutanum G - P. jensenii H - P. melinii I - P. purpurogenum J - P. roqueforti K - P. simplicissimum L - P. variabile Hettick et al. 2008b

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contato:

lmabreu@gmail.com