INOCULAÇÃO ARTIFICIAL DE SEMENTES DE SOJA POR FUNGOS,
UTILIZANDO SOLUÇÃO DE MANITOL
11Aceito para publicação em 30.10.2001; trabalho desenvolvido com apoio de CNPq/FAPEMIG.
2Engo Agro, Ph.D., Prof. do Depto. de Fitopatologia/UFLA; bolsista do CNPq; e-mail: machado@ufla.br
3Biólogo, Dr. Pesquisador/UFLA; prof. bolsista do CNPq.
4Enga Agra, Dra., Prof. do Depto. de Agricultura/UFLA; bolsista do CNPq; e-mail: mariagvc@ufla.br
5Graduando em Agronomia; bolsista do CNPq.
JOSÉ CRUZ MACHADO1, JOÃO ALMIR OLIVEIRA3, MARIA GRAÇAS G.C. VIEIRA4 E MARCELO C. ALVES5
RESUMO - O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia de inoculação de sementes de soja com os fungos Colletotrichum truncatum, Phomopsis sojae e Sclerotinia sclerotiorum por meio da técnica de restrição hídrica de modo a obter sementes infectadas por estes patógenos. O trabalho consistiu na exposição das sementes às colônias fúngicas em desenvolvimento em meio BDA (extrato de batata + dextrose e agar), em potenciais hídricos 0,0; -0,4; -0,6; -0,8 e -1,0MPa, obtidos por meio do uso de manitol em diferentes concentrações. Após o período de incubação para cada potencial osmótico, a 25oC, estabelecido com base no início do processo de germinação,
as sementes eram removidas das placas de Petri e submetidas aos testes de germinação, emergência e sanidade. A inoculação das sementes nos potenciais hídricos mais elevados proporcionou os maiores índices de plantas doentes sem afetar negativamente a germinação das sementes. Durante o período de incubação, a protrusão radicular foi eficazmente impedida pela restrição hídrica nos potenciais mais elevados.
Termos para indexação: restrição hídrica, inoculação de sementes, Glycine max. ARTIFICIAL INOCULATION OF FUNGI IN SOYBEAN SEEDS USING
MANITOL SOLUTION
ABSTRACT - The objective of this work was to develop a method to inoculate seeds of soybean with Colletotrichum truncatum, Phomopsis sojae and Sclerotinia sclerotiorum, so as to obtain infected seeds using water restriction technology. The work consisted of exposing seeds to growing colonies of the fungi on PDA medium amended with mannitol at concentrations producing osmotic potentials of 0.0; -0.4; -0.6; -0.8 and -1.0MPa. Seeds were placed on developing fungal colonies on PDA medium for different periods of incubation at 25oC. After each incubation period seeds
were removed from the Petri dishes and submitted to germination, emergency and seed health testings. Inoculation of seeds at higher osmotic potentials presented the highest levels of diseased seedlings without affecting adversely the germination of seeds. During the exposition of seeds to the fungi, radicle protrusion from seeds was impeded by water restriction at the highest potentials. Index terms: water restriction, inoculation of seeds, Glycine max.
INTRODUÇÃO
As sementes são importantes veículos de agentes fitopatogênicos, que podem ser levados ao campo e provoca-rem redução na germinação e vigor, originando focos
primá-rios de doença. A maioria das doenças de importância econô-mica que ocorre na cultura da soja é causada por patógenos que são transmitidos pelas sementes, dentre eles merecem destaque: Phomopsis sp. (causador do cancro da haste da soja, seca da haste e da vagem da soja e da deterioração de semen-tes), Colletotrichum truncatum (causador da antracnose) e
Sclerotinia sclerotiorum (causador da podridão branca da
haste e da vagem) (Goulart, 1997).
Os prejuízos causados por estes fungos, à cultura da soja, têm exigido estudos mais pormenorizados das relações entre patógenos e hospedeiro. No entanto, pelas dificuldades de obter sementes com diferentes níveis de infecção por estes patógenos, a inoculação artificial das sementes torna-se
ne-cessário. Os métodos existentes de inoculação não apresen-tam eficácia no sentido de se obter níveis desejáveis de infec-ção. Consistem em inocular esporos dos fungos diretamente nas plantas já adultas, ou em sementes secas. A inoculação de fungos em plantas, já em desenvolvimento, apresenta al-guns inconvenientes não só em termos de período de tempo que este método requer como pelos riscos determinados por fatores não controlados durante o desenvolvimento das plan-tas. Machado & Carvalho (1975) observaram que inoculação de Colletotrichum truncatum, em plantas de soja, de diferen-tes cultivares, realizada aos 30 e 35 dias após a floração le-vou a ocorrência de índices de 18 a 40% desse fungo, nas sementes colhidas ao final do ciclo da cultura.
No método da inoculação de fungos diretamente em se-mentes, por meio da imersão destas em suspensão de esporos, os fungos ficam apenas aderidos ao tegumento das sementes, não se caracterizando o processo de infecção e sim contami-nação. Vieira (1988) comenta que embebição de sementes de soja em suspensão de ascosporos de Sclerotinia sclerotiorum, visando avaliar resistência varietal gerou reações influencia-das pela causa e do nível de deterioração influencia-das sementes inocu-ladas. A inoculação de sementes por contato direto com os fungos em meio agarizado (BDA), pode determinar níveis insatisfatórios de infecção, pelo fato de limitar o tempo de permanência das sementes junto ao meio, visto que as se-mentes podem iniciar o processo de germinação em curto período de tempo. Neste sentido, Peres (1996) verificou que a inoculação de sementes de soja, pelo contato destas com colônias de Sclerotinia sclerotiorum, em meio BDA por 30 horas de exposição, apresentou uma contaminação entre 35 a 100%.
O crescente interesse em tratamentos que envolvem o início das atividades pré-germinativas, levou ao desenvolvi-mento de vários estudos envolvendo técnicas que permitem controlar a hidratação e a germinação das sementes. Entre estes estudos, destaca-se a técnica do condicionamento osmótico, relatada para sementes de diferentes espécies (Eira, 1988; Guimarães, 1991 e Braccini, 1996), também referida como “priming” (Heydeckeret et al., 1975), condicionamen-to fisiológico (Doni-Filho, 1992 e Vazquez, 1995), entre ou-tras denominações.
A técnica do condicionamento osmótico consiste em colocar as sementes em contato com um substrato, com o potencial hídrico ajustado para que a semente absorva água até um nível, em que todos os processos preparatórios à ger-minação ocorram, sem contudo, atingir a fase de elongamento celular e, conseqüentemente, a emissão da radícula (Heydecker et al., 1975 e Bradford, 1986). Vários produtos
já foram utilizados para o ajuste do potencial hídrico de substratos em estudos envolvendo o condicionamento osmótico de sementes de diferentes espécies. Entre estes cita-se sais como MgSO4, NaCl, MgCl2, K3PO4m KH2PO4, glicerol, manitol e polietileno glicol (Pill, 1994).
Carvalho (1999) mostrou que o uso da restrição hídrica em meio BDA com manitol foi eficaz na inoculação de
Colletotrichum lindemuthianum em sementes de feijão, já que
o período de exposição das sementes ao inóculo do fungo pôde ser aumentado, havendo também neste caso estímulo ao crescimento radial das colônias fúngicas até a restrição hídrica de -0,8MPa.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a viabili-dade do uso da técnica de restrição hídrica na inoculação de sementes de soja pelos fungos Colletotrichum truncatum,
Phomopsis sojae e Sclerotinia sclerotiorum visando à
obten-ção de sementes infectadas por estes patógenos.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de Patolo-gia de Sementes do Departamento de FitopatoloPatolo-gia da Uni-versidade Federal de Lavras - MG, no ano de 1999. As se-mentes utilizadas foram da cultivar Doko safra 98/99, previ-amente esterilizadas superficialmente com hipoclorito de sódio a 1% por um minuto seguidas de lavagem rápida em água esterilizada e secadas à sombra. Em seguida, as mesmas fo-ram submetidas aos testes de germinação e sanidade, para checagem de sua qualidade.
Os fungos C. truncatum, P. sojae e S. sclerotiorum, fo-ram isolados de sementes de soja em análises de rotina do teste de sanidade, no Laboratório de Patologia de Sementes da UFLA. O meio de cultura básico utilizado neste trabalho foi o BDA (extrato de 200g de batata, 20g de dextrose e 20g de ágar), ao qual foi adicionado o soluto manitol nos potenci-ais hídricos 0,0; -0,4; -0,6; -0,8 e -1,0MPa. As concentrações dos solutos para o preparo dos meios, em cada potencial hídrico, foram obtidas por meio da fórmula de Van’t Hoff (Salisbury & Ross, 1991):
Po = -CiRT, onde: Po = Potencial osmótico (MPa); I = Constante de ionização; R = Constante geral dos gases (0,00831 x Kg x MPa x mol-1 x K-1); T = Temperatura
absolu-ta (ºC + 273); C = Concentração (moles/kg de água). Após a adição de manitol em cada concentração ao meio BDA procedeu-se à autoclavagem e a distribuição do mesmo em placa de Petri de 15cm de diâmetro na proporção de 50ml por placa. Três discos repicados da colônia pura de cada fun-go foram transferidos em separado para cada placa, sendo
utilizadas cinco placas para cada fungo, por potencial hídrico. As placas foram vedadas com rolopac e distribuídas ao acaso em câmara com fotoperíodo de 12 horas, e temperatura de 25ºC, por cinco dias, quando as colônias de cada fungo já haviam tomado toda a placa. Em seguida, 40g de sementes foram distribuídas sobre a colônia de cada fungo, em camada única e levemente prensadas sobre o meio, permanecendo aí por diferentes períodos de exposição, em função do potenci-al hídrico. Assim que pelo menos uma semente iniciava o processo de germinação, as restantes foram retiradas do meio e secadas sobre papel filtro em condições de laboratório. Os tempos de retirada das sementes foram de 48 horas para os potenciais hídricos de 0,0 e -0,4MPa e 72, 96 e 120 horas para os potenciais -0,6; -0,8 e -1,0 MPa, respectivamente. Os parâmetros avaliados foram teste de germinação, emergência de plântulas, teste de sanidade e crescimento micelial dos fun-gos in vitro: teste de germinação - foram utilizadas quatro repetições de 50 sementes por tratamento, acondicionadas em rolos de papel toalha, umedecidos com água destilada 2,5 ve-zes o peso do papel. Os rolos foram levados para um germinador regulado a 25ºC por sete dias. Na avaliação, fo-ram computadas as porcentagens de plântulas normais, anor-mais e sementes mortas, segundo Brasil (1992); emergência das plântulas - foi realizada em bandejas plásticas de 47x27x08cm, contendo areia e solo misturados na proporção de 2:1, utilizando quatro repetições de 50 sementes por trata-mento, semeadas na profundidade aproximada de 1,5cm. As bandejas foram distribuídas ao acaso numa sala de cresci-mento vegetal, à temperatura de 25ºC e fotoperíodo alterna-do de 12 horas. As avaliações foram realizadas aos sete e vinte e um dias após a semeadura, computando-se o número de plântulas emergidas. Aos 21 dias as plântulas foram arran-cadas e analisadas quanto à presença de sintomas da doença causada por cada patógeno estudado; teste de sanidade - fo-ram utilizadas oito repetições de 25 sementes por placa de plástico de 15cm de diâmetro, com e sem desinfestação com solução de hipoclorito de sódio 1% por um minuto. As placas foram mantidas em câmara de crescimento à 22oC, em
regi-me alternado de 12 horas de luz branca. A presença de cada patógeno nas sementes foi avaliada aos sete dias após a se-meadura com auxílio de microscópio estereoscópico; cresci-mento micelial em meio de cultura osmoticamente modi-ficado - foi utilizado meio BDA (extrato de batata-dextrose-ágar), no qual foi adicionado o soluto manitol nos potenciais hídricos 0,0; -0,4; -0,6; -0,8 e -1,0MPa. Após a adição de manitol em cada concentração ao meio BDA, este foi autoclavado e vertido na proporção de 20ml por placa de Petri de 9cm de diâmetro. Um disco retirado da margem da
colô-nia pura de cada fungo foi transferido para o centro de cada placa, sendo utilizadas cinco placas para cada fungo em cada concentração. As placas foram vedadas com rolopac e distri-buídas ao acaso em câmara com fotoperíodo de 12 horas, e a temperatura de 15ºC. As avaliações foram realizadas diaria-mente, medindo-se no verso de cada placa o crescimento micelial de cada fungo, até que a colônia ocupasse toda pla-ca. O índice de crescimento micelial (ICM), foi determinado seguindo-se a fórmula proposta por Oliveira (1991):
onde: ICM = índice de crescimento micelial; C1, C2, Cn = crescimento micelial das colônias na primeira, segunda e úl-tima avaliação; N1, N2, Nn = número de dias.
A análise estatística foi realizada com o auxílio do pro-cedimento ANAVA do SAS (SAS Institute Inc., 1992). O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade, analisando cada potencial como uma metodologia isolada, não considerando se as aná-lises dos valores nos intervalos.
C1 + C2 + ... + Cn N1 + N2 + ... + Nn ICM =
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observa-se pela Figura 1A que a percentagem de germi-nação das sementes inoculadas com o fungo Colletotricum
truncatum foi drasticamente reduzida em função do aumento
da restrição hídrica. Provavelmente, este fato se deveu ao maior tempo de exposição das sementes ao inóculo, propici-ando maior nível de infecção. No potencial -1,0MPa a germi-nação foi menor que 10%. A maior percentagem de plântulas com lesões ocorreu quando as sementes foram inoculadas no potencial hídrico de -0,4MPa, pois nos potenciais hídricos mais negativos, a infecção por este fungo afetou o percentual de germinação, com conseqüente aumento do número de se-mentes mortas. Nota-se ainda que mais de 60% de plântulas apresentaram lesões características da doença quando da in-cubação em meio sem restrição hídrica. Verifica-se portanto, que para fungos muito agressivos como C. truncatum, não há necessidade de prolongamento do tempo de exposição das sementes ao inóculo, visto que no menor tempo utilizado (48 horas) obteve-se quase 100% de infecção (Figura 3A).
Pelos resultados da Figura 1B, vê-se que o fungo
Phomopsis sojae foi também extremamente agressivo,
ocasi-onando uma redução da germinação para menos de 20% em sementes que permaneceram em contato com inóculo no menor tempo (48 horas). Houve uma relação positiva entre
potencial hídrico e percentual de sementes mortas, sendo que no potencial hídrico de -0,8 e -1,0MPa esse percentual foi maior que 80%. Comparando estes resultados com aqueles da Figura 1A constata-se que este fungo foi mais agressivo. Estes resultados reforçam os obtidos por Goulart (1997), que relata ser este fungo capaz de se desenvolver rapidamente nas condições em que o teste de germinação é realizado po-dendo afetar a germinação das sementes.
Em relação a Sclerotinia sclerotiorum (Figura 1C), ob-serva-se que houve um comportamento semelhante aos re-sultados da Figura 1B, ou seja, as sementes que ficaram me-nos tempo em contato com o inóculo do fungo apresentaram germinação abaixo de 20% e nos potenciais de -0,6; -0,8 e -1,0MPa praticamente não houve germinação, com mais de 90% de sementes mortas. Pelos resultados do teste de sanida-de, nota-se que o fungo estava internamente presente nas se-mentes, uma vez que em mais que 90% das sementes que foram desinfectadas com hipoclorito a presença do fungo foi detectada (Figura 3C).
A emergência das plântulas aos sete dias (Figura 2A) foi gradativamente reduzida com o aumento da restrição hídrica do meio em que as sementes foram inoculadas com o fungo
C. truncatum, sendo que no potencial de -1,0MPa a
percenta-gem de plântulas normais emergidas aos sete dias foi de 22%. No entanto aos 21 dias, o percentual de plântulas estabelecidas neste mesmo potencial foi praticamente nulo, nota-se tam-bém que mesmo no meio sem restritor hídrico (potencial 0), este percentual foi próximo de 30% o que sugere a alta agressi-vidade desse fungo. Com relação ao percentual de plântulas com lesões este foi mais baixo no potencial de -1,0MPa, pro-vavelmente em função do grande número de sementes mor-tas, bem como pela morte das plântulas entre a emergência e seu estabelecimento.
Pelos resultados do teste de emergência de sementes de soja inoculadas com C. truncatum (Figura 2B), observa-se que o percentual de plântulas, emergidas aos sete dias, foi gradativamente reduzido à medida que o potencial hídrico do meio foi mais negativo. O estande aos 21 dias após a semea-dura foi acentuadamente reduzido em relação ao das semen-tes não inoculadas. Esse baixo estande também ocorreu nos tratamentos em que as sementes permaneceram menor tempo em contato com o fungo (potencial 0), sendo o percentual de plântulas estabelecidas próximo de 35%. No potencial de -1,0MPa, mais de 95% das plântulas estavam com lesões do fungo. Com relação às plântulas com lesões, nota-se que à FIG. 1. Valores médios (%) de germinação ( ), plântulas
com lesões ( ) e sementes mortas ( ) do teste de germinação em sementes de soja, inoculadas com Colletotrichum truncatum (A), Phomopsis sojae (B) e Sclerotinia sclerotiorum (C), em diferentes potenciais osmóticos.
Médias seguidas pela mesma letra, para cada parâmetro, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5%.
FIG. 2. Valores médios (%) de plântulas normais aos sete ( ) e 21 ( ) dias e plântulas com lesões ( ) do teste de emergência em sementes de soja, inoculadas com Colletotrichum truncatum (A), Phomopsis sojae (B) e Sclerotinia sclerotiorum (C), em diferentes potenciais osmóticos.
Médias seguidas pela mesma letra, para cada parâmetro, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5%.
FIG. 3. Porcentagens de Colletotrichum truncatum (A), Phomopsis sojae (B) e Sclerotinia sclerotiorum (C) detectadas pelo teste de sanidade “incubação em papel de filtro”, em sementes de soja, com e sem inoculação em diferentes potenciais osmóticos e desinfestadas ( ) e não desinfestadas ( ) com hipoclorito de sódio a 1%.
medida em que aumentou o potencial hídrico do meio houve redução do percentual, isto pode ser explicado pelo fato de que com o prolongamento do período de exposição das mentes ao inóculo houve um incremento no número de se-mentes mortas. Segundo Goulart (1997), C. truncatum é um patógeno altamente agressivo à cultura da soja, principalmente durante a fase de emergência causando tombamento das plântulas ou morte das sementes.
Pelos resultados do teste de emergência em solo, nota-se que Phomopsis sojae (Figura 2B), foi mais agressivo do que o C. truncatum, posto que mesmo no meio sem restrição hídrica, somente 40% das sementes germinaram. Essa redu-ção na emergência de plântulas foi mais evidente com a ele-vação do potencial hídrico do meio de inoculação. De acordo com a literatura (Goulart, 1997), esse fungo em contato com as sementes pode causar a morte da mesma ou provocar tom-bamento das plântulas recém-germinadas.
Por sua vez, sementes inoculadas com S. sclerotiorum (Figura 2C), apresentaram um comportamento semelhante àquelas inoculadas com Phomopsis (Figura 2B), ou seja, com o aumento do tempo de exposição das sementes houve menor percentagem de emergência, sendo que no potencial -1,0MPa todas as sementes estavam mortas e no meio sem restrição hídrica apenas 20% das sementes emergiram.
O teste de sanidade (Figuras 3A, 3B e 3C) das sementes de soja inoculadas com os fungos C. truncatum, P. sojae e S.
sclerotiorum, revelou que, de um modo geral, houve um
com-portamento semelhante entre esses fungos. Mais de 90% das sementes foram infectadas mesmo quando a desinfecção su-perficial com hipoclorito de sódio foi realizada. Nestes casos os fungos estavam presentes nas sementes, o que foi também confirmado pelos resultados dos testes de germinação e emer-gência em solo onde houve um elevado percentual de plântulas com lesões e de sementes mortas.
Desta forma, pode-se afirmar que a técnica de restrição hídrica do meio de inoculação é viável para infectar semen-tes com alguns fungos de importância econômica, uma vez que as sementes podem ficar em contato com o fungo por um maior período de tempo, sem contudo, iniciar o processo de germinação e ainda com a vantagem destas poderem posterior-mente ser secadas e armazenadas por algum período de tempo. Pelo ensaio “in vitro”, a restrição hídrica promovida pelo manitol não inibiu o crescimento micelial dos fungos C.
truncatum, P. sojae e C. sclerotiorum, em meio BDA tendo
apresentado ao contrário, efeito estimulante ao crescimento micelial desses organismos quando comparado com meio sem restrição hídrica (0,0MPa).
CONCLUSÕES
! A restrição hídrica, até o nível de -1,0MPa determinada pelo uso de manitol em meio agar, propicia condições para um maior tempo de exposição das sementes aos patógenos e permite a obtenção de maior infecção das plântulas pelos fungos C. truncatum, S. sclerotiorum e P. sojae;
! as sementes de soja inoculadas com os fungos C. truncatum,
S. sclerotiorum e P. sojae em qualquer potencial hídrico
utilizado são severamente afetadas.
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