UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
“Variabilidade inter e intra-populacional de Nannotrigona testaceicornis analisadas com técnicas de morfometria geométrica.”
Marcelo Fidelis Marques Mendes
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
RIBEIRÃO PRETO – SP 2006
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
“Variabilidade inter e intra-populacional de Nannotrigona testaceicornis analisadas com técnicas de morfometria geométrica.”
Marcelo Fidelis Marques Mendes
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Orientador: Tiago Mauricio Francoy
Nome do Co-orientador: Vera Lucia Imperatriz-Fonseca
RIBEIRÃO PRETO – SP 2006
Verdade, Mentira
Verdade, mentira, certeza, incerteza...
Aquele cego ali na estrada também conhece estas palavras. Estou sentado num degrau alto e tenho as mãos apertadas Sobre o mais alto dos joelhos cruzados.
Bem: verdade, mentira, certeza, incerteza o que são? O cego pára na estrada,
Desliguei as mãos de cima do joelho
Verdade mentira, certeza, incerteza são as mesmas?
Qualquer cousa mudou numa parte da realidade — os meus joelhos e as minhas mãos.
Qual é a ciência que tem conhecimento para isto?
O cego continua o seu caminho e eu não faço mais gestos. Já não é a mesma hora, nem a mesma gente, nem nada igual. Ser real é isto.
Agradecimentos
Agradeço a todos aqueles que me auxiliaram diretamente ou indiretamente na conclusão deste trabalho:
A meus orientadores Vera L. Imperatriz-Fonseca pela oportunidade fornecida e Tiago M. Francoy pela onipresença no MSN;
Aos colaboradores do laboratório: Patrícia Nunes-Silva, pela ajuda na montagem das asas; Cristiano Menezes e Gisele Cabral pelas fotos; Lampréia, companheiro de “bigrafia”; ao Sérgio e ao Prof. Dr. Ronaldo Zucchi, pelo empréstimo da máquina fotográfica e do estereomicroscópio; ao Sidney pelas instruções sobre os ninhos;
A meus pais, Carlos e Cidália pela herança genética;
Aos meus irmãos e Cristina pelo apoio;
A minha namorada Francine pela compreensão;
A Deus por inventar a Nannotrigona testaceicornis;
A meus amigos, os quais não agradeço nominalmente, mas foram fundamentais no meu progresso profissional e pessoal.
ÍNDICE:
1. Resumo 1
2. Introdução 3
2.1.Os meliponíneos e seu uso como polinizadores 3
2.2. Hábitos de nidificação 5
2.3. Análises Morfométricas 7
2.3.1. Contexto histórico: 8
2.3.2. Morfometria Geométrica X Morfometria Tradicional 10
2.3.3. Landmarks 12
2.3.4. Distâncias de Procrustes e Espaço da Forma de Kendall 12
2.3.5. Thin-Plate Splines 14
2.3.6. Partial Warps, Relative Warps e Partial Warps 15
2.4 Objetivo do trabalho 15
3.Material e método 17
3.1. Descrição das localidades amostradas 17
3.1.3. São Paulo 19
3.1.4. Prudentópolis 20
3.2. Coleta dos indivíduos 20
3.3. Captura das imagens 21
3.4. Morfometria geométrica e análises estatísticas 22
4. Resultados 24
4.1. Populações 24
4.2. Sub-populações de Uberlândia 27
4.3. Colônias de Ribeirão Preto 30
5. Discussão 34
5.1. Populações de Nannotrigona testaceicornis e a introdução das amostras de Uberlândia – MG em Ribeirão Preto: 34
5.2. Sub-estruturação da população de Uberlândia: 37
5.3. Colméias de Ribeirão Preto 38
6. Considerações Finais 40
7. Referências Bibliográficas 42
Anexo I 51
1. Resumo
A morfometria geométrica é uma metodologia relativamente nova que vem sendo utilizada com sucesso na identificação de subespécies de Apis mellifera e sua utilização em estudos preliminares com diversas espécies de abelhas sem ferrão também se mostrou eficiente.
Nannotrigona testaceicornis é uma espécie de abelha nativa comum em
ambientes urbanos da região Sudeste. Constrói os seus ninhos em cavidades pré-existentes, sejam naturais ou de edificações. Como uma peça chave para o desenvolvimento de um projeto Biota, o objetivo deste trabalho visa a caracterização morfométrica dos padrões de venação de asas de quatro populações desta espécie e a verificação da variabilidade deste grupo em relação a esse caráter. Esses dados informarão a precisão dessa metodologia para diferenciação de populações, de sub-populações e de ninhos.
Para o presente trabalho foram utilizadas amostras de operárias de populações de
N. testaceicornis das cidades de Uberlândia - MG, Ribeirão Preto - SP, São Paulo - SP e
Prudentópolis - PR. Como base de comparação entre os grupos utilizamos uma amostra de Nannotrigona punctata como grupo externo.
As análises de relative warps foram desenvolvidas utilizando os softwares tpsUtil, tpsDig2 e tpsRelw e os dados foram estatisticamente analisados no software STATISTICA 6.0 e SPSS 12.0.
As amostras das populações de N. testaceicornis incluindo N. punctata como grupo externo mostraram certa diferenciação morfológica, mas muito pequena quando comparada com a diferenciação para o grupo externo. Os ninhos de Uberlândia – MG que estão sendo introduzidos em Ribeirão Preto – SP não devem ocasionar muitas
mudanças no perfil da população atual, uma vez que as duas populações são as mais próximas em termos de morfologia de asa. Tal população de Uberlândia – MG encontra-se ainda dividida em subpopulações que habitam os ambientes urbano e natural do município.
A discriminação de indivíduos pertencentes a colônias diferentes também foi possível com o uso da técnica usada. Tais resultados são muito animadores e o uso das técnicas de morfometria geométrica para caracterização e identificação de populações e espécies de abelhas sem ferrão é muito promissor para a realização de trabalhos futuros.
2. Introdução
2.1.Os meliponíneos e seu uso como polinizadores
Os Meliponini são abelhas sociais sem ferrão naturais das regiões tropicais do globo. Temos no Brasil uma rica fauna de Meliponini, com 56 gêneros. Algumas espécies são conhecidas pelo excelente mel que produzem, sendo geralmente criadas para esta finalidade (Cortopassi-Laurino et al, 2006). No entanto, o papel ecológico fundamental dessas abelhas é na manutenção da biodiversidade de espécies vegetais (durante suas visitas às flores, ocorre a transferência do pólen de uma flor para outra, promovendo o que se chama polinização cruzada). A polinização para o visitante floral é uma conseqüência da coleta de um recurso alimentar (pólen e/ou néctar), mas para a planta é uma maneira de aumentar ao máximo o fluxo de genes.
Heard (1999) fez o primeiro trabalho focalizando as abelhas sem ferrão e a polinização. Em 2006, Slaa et al.publicou uma outra revisão, mostrando o avanço dos estudos. Imperatriz-Fonseca et al. (2006) mostraram a importância destas abelhas como polinizadores de culturas.
Destacam-se na literatura recente os trabalhos do uso de Nannotrigona
testaceicornis Lepeletier, 1836 como polinizadores de estufa em Salvia farinaceae (Slaa et al., 2006); no México, a Nannotrigona pirilampoides tem sido usada como
polinizadora de culturas mantidas em estufas, atuando com muita eficiência na polinização de tomates (Cauich et al., 2005), com a característica especial de fazer polinização por vibração. Aliás, o primeiro trabalho do uso de meliponíneos como
polinizador de estufas foi feito por Maeta et al. (1992), no Japão, utilizando-se
Nannotrigona testaceicornis como polinizador de morango. O primeiro estudo de
polinização de planta cultivada no Brasil foi feito por Nogueira-Neto & Carvalho, 1959, em cultivos de café Bourbon.
Malagodi-Braga et al. (2004) consideraram que os meliponíneos possuem diversas características importantes para sua utilização na polinização de plantas cultivadas, entre as quais se destacam:
• O hábito alimentar generalista: visitam as flores das mais variadas famílias de plantas;
• A fidelidade às flores: suas campeiras, em geral, visitam uma única espécie de planta em um vôo de forrageamento;
• A domesticação: as colônias podem ser mantidas em colméias e estas podem ser manejadas;
• A ausência de ferrão funcional, que facilita a instalação e manejo das colônias;
• Colônias são perenes;
• Incapacidade de abandono de ninhos (a rainha fecundada perde a capacidade de voar após adquirir a fisogastria);
• Podem armazenar grande quantidade de alimento no ninho.
Apesar de ter sido pouco estudada até o momento, Nannotrigona testaceicornis parece muito promissora como agente polinizador. Já foi comprovada a efetividade desta abelha em muitas espécies vegetais de interesse econômico, dentre elas podemos realçar experiências com acerola (Martins et al., 1999), morango (Maeta et al., 1992; Roselino et al., 2004), e, inclusive sendo citada por Ribeiro (2004) como a principal
polinizadora de espécies de pepino. Além disso, Amaral (1972) verificou a visitação de operárias desta espécie em plantações de café. Singer (2004) constatou que machos de
Nannotrigona testaceicornis polinizam as orquídeas Mormolyca rigens.
Estudos de abelhas nas flores realizados em vários levantamentos brasileiros propiciaram uma base de dados utilizada para avaliar as redes e conectância entre Meliponini e flores (Biesmeijer et al., 2005; Biesmeijer & Slaa, 2006), mostrando que
Nannotrigona é um gênero que se destaca entre os demais com relação a este aspecto,
evidenciando especificidades na utilização de recursos florais.
2.2. Hábitos de nidificação
Os Meliponini costumam geralmente habitar ocos de árvores vivas. Apesar de muito raros em áreas urbanizadas existem aqueles que são bastante tolerantes a ambientes urbanos, nidificando, além de árvores, muros de pedras, blocos de concreto, tijolos vazados, etc. (Anexo I - Figura I). Este é o caso das N. testaceicornis (Nogueira-Neto, 1970; Pedro & Camargo, 1999; Freitas, 2001). No campus da USP em Ribeirão Preto, 10% dos ninhos encontrados por Geusa Freitas (op. cit) foram de Nannotrigona (55 ninhos, 74,55% em paredes, 23,64 em troncos e 1,82% em tubulação).
Nannotrigona testaceicornis é conhecida popularmente como iraí, essas abelhas
sociais são extremamente mansas. Faz ninhos em cavidades de árvores ou de edificações, que raramente são ocupados inteiramente, o que também ocorre em colméias artificiais: parte da cavidade é isolada da zona ocupada pela colônia por meio de um batume crivado de cerume. Isso, aliás, já foi salientado por Mariano Filho (1911:134-135, apud Nogueira-Neto, 1970). A princípio esse batume é fino, mas com o
tempo ele vai sendo engrossado, tornando-se duro. Essas abelhas não possuem depósitos grandes de própolis puro no seu ninho, embora utilizem essa substância nos seus ninhos. Esse material é muito menos viscoso que o empregado pelas jataís e mirins. No batume e na calafetação dos ninhos a iraí usa própolis e cerume.
A entrada do ninho é geralmente rendilhada e curta, construída com cerume durante a noite e aberta ao amanhecer, permanecendo a entrada como um orifício circular em torno do qual as abelhas-guarda formam um anel (Anexo I - Figura II). Os favos de cria são helicoidais (Anexo I - Figura III), mas podem ocorrer favos horizontais com presença de células reais. O invólucro está presente nos favos de cria. Os potes de alimento são pequenos e podem atingir 1,5 cm de altura (Nogueira-Neto, 1970).
As colônias apresentam de 2.000 a 3.000 abelhas (Lindauer & Kerr, 1960). Essa espécie pode ser diferenciada de outros Meliponini por apresentar, na periferia dos ninhos velhos, muitas lamelas ou membranas de cerume espesso, escuro, endurecido e quebradiço, contendo provavelmente muito própolis. Essas membranas formam túneis e passagens nas quais podem ser encontradas inúmeras abelhas (Nogueira-Neto, 1970).
Trata-se de uma abelha que mede cerca de 4 mm de comprimento, é preta possui pilosidade grisalha e asas esfumaçadas no terço apical (Monteiro, 2001) (Anexo I - Figura IV). Sempre que há rainha virgem para ser fecundada no ninho, uma nuvem de machos permanece alguns dias em frente à entrada do mesmo (Nogueira-Neto, 1953; Menezes, inf. pess.). Não conhecemos, no entanto a freqüência de enxames naturais. Quanto às rainhas, um estudo preliminar (Imperatriz-Fonseca et al., 1997) mostrou que podemos ter rainhas miniaturas originárias de células de cria iguais às de operárias, assim como rainhas provenientes de células reais. Entretanto, até o momento as rainhas
fecundadas dos ninhos ainda não foram medidas, de modo que não podemos acrescentar dados aos existentes para Schwarziana quadripunctata e Plebeia remota sobre rainhas miniaturas.
Um avanço no manejo desta espécie foi feito por Menezes (2005), que desenvolveu uma técnica para a criação de rainhas desta espécie in vitro, em condições de laboratório. Esta técnica precisa ser refinada para que rainhas possam ser produzidas em larga escala.
A Nannotrigona testaceicornis é encontrada principalmente nos Estados da Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo (Silveira et al., 2002). Mas pode ser encontrada também fora do Brasil, em países localizados na faixa tropical que se estende do norte do Paraná ao México (Nogueira-Neto, 1970).
2.3. Análises Morfométricas
Observações sobre padrões de formatos encontrados na natureza, de um modo geral, sempre foram um dos grandes focos de interesse de pesquisadores da Biologia. Relações entre tamanho dos organismos, comprimento e largura de estruturas que os compõem, propriedades angulares de artefatos que produzem são características examinadas no sentido de qualificar de alguma maneira os indivíduos estudados.
O estudo da forma e do tamanho, e de como estas duas variáveis se relacionam entre si pode ser definido como morfometria. Esta é uma ferramenta utilizada para entender a relação destas com diversas outras variáveis, como por exemplo, a idade, o sexo, ou as relações filogenéticas entre os organismos estudados. Investigações comparando as formas podem vir a elucidar as mais variadas indagações, que vão desde a compreensão da distribuição dos grupos taxonômicos até os processos evolutivos
envolvidos no surgimento de espécies, passando pelos processos fisiológicos, genéticos e moleculares próprios a cada uma destas (Peres-Neto, 1995).
A morfometria geométrica se propõe a ser uma metodologia que não somente permite a análise e a quantificação desta variação, mas possibilita também a visualização de forma gráfica e clara destas diferenças, ao contrário de diversos métodos morfométricos já estabelecidos e amplamente usados, agrupados aqui sob o nome de morfometria tradicional. Esta metodologia tem sido eficiente em estudos que relacionam formas anatômicas de organismos ou, no geral, parte destes, a algum tipo de sistematização e/ou classificação deles.
Alguns trabalhos realizados que podem ser citados como exemplos e serviram de base para esta pesquisa foram os realizados com populações de Apis melifera, que forneceram grandes contribuições para caracterização e identificação de subespécies (Francoy et al., 2006)(Tabela 1); a pesquisa realizada com crânio de roedores em diferentes estágios ontogênicos (Moraes, 2003); além da feita com pegadas de dinossauros por Rodrigues & Santos (2003), em ácaros (Návia, 2004), peixes (Albertson & Kocher, 2005), humanos (Frieß, 2003) entre outras.
2.3.1. Contexto histórico
Tabela 1: História do uso da morfometria no estudo de abelhas (confeccionada por T. M.Francoy)
Cochlov, 1916 (apud Ruttner,
1988)
Primeiros trabalhos com morfometria tradicional; mediu o comprimento de língua em seis raças geográficas de Apis
Michailov, 1924, 1926; Alpatov, 1935, 1929; Skorikov, 1929 (apud Ruttner, 1988).
Série de outros trabalhos com a constatação de um aumento no comprimento da língua de acordo com uma clima Norte-Sul ao longo das planícies russas.
Goetze, 1940. Descreveu uma grande gama de medidas que poderiam ser utilizadas para a discriminação de subespécies de A. mellifera.
Gonçalves, 1970.
Primeiro trabalho com morfometria de abelhas brasileiro; ealizou uma série de cruzamentos e retrocruzamentos entre A.m. ligustica e A.m. scutellata, que até aquele momento era identificada como sendo A.m. adansonii.
DuPraw, 1964, 1965a, 1965b.
Iniciou o uso das técnicas de análises estatísticas multivariadas, como Análise de Componentes Principais e Análises discriminantes. Nestes mesmos trabalhos, DuPraw propõe também o uso de medidas que sejam independentes de tamanho, como ângulos entre as junções de nervura da asa.
Ruttner, 1973, 1975, 1976, entre
outros.
Série de trabalhos que culminam com a publicação de um guia de medidas necessárias para se discriminar as subespécies de Apis
mellifera (Ruttner et al., 1978).
Dally & Balling, 1978.
Trabalhos de simples identificação, que utilizava 25 medidas de diversas partes do corpo das abelhas com o intuito de discriminar abelhas africanizadas e européias.
Ruttner, 1988. Trabalho de biogeografia, onde foram propostas as linhagens evolutivas das subespécies de Apis mellifera.
Daly et al.,1982.
Desenvolveram um sistema de medidas acoplado a um microcomputador, o que tornava a tomada de dados e o restante das análises muito mais rápidos e fáceis.
Schroder et al., 1995; Steinhage et
al., 1997.
Desenvolveram um sistema semi-automatico de obtenção de medidas, classificação e identificação de espécies (ABIS). Para um reconhecimento e classificação com maior confiabilidade, o sistema precisa primeiro ser treinado com pelo menos 30 indivíduos por espécie. Uma vez feito esse treinamento, a identificação se torna extremamente rápida.
Steinhage e.t al., 2001.
Automatização do sistema ABIS, com dois grandes melhoramentos que facilitavam o uso do software e aumentavam a precisão das classificações. A primeira delas foi a detecção automática dos pontos de junção de nervuras e marcação automática dos landmarks utilizados na análise. A segunda grande melhora no software foi a utilização de Análises Discriminantes de Kernel (KDA).
Schroder et al., 2006.
Com o sistema acima mencionado, utilizando funções discriminantes não lineares que se dobram no espaço, foi possível uma melhor classificação dos grupos estudados e possibilitando uma taxa de acerto de até 99,8% nas classificações dos indivíduos dentro de suas respectivas espécies, mesmo quando os grupos utilizados na análise apresentavam grandes similaridades, como no caso das abelhas do gênero Colletes, Andrena e Bombus.
Drauschkle et al., submetido.
Testaram o sistema com subespécies de Apis mellifera e também obtiveram um resultado muito bom, atingindo 94% de acerto nas taxas de classificação, com apenas uma característica sendo analisada.
2.3.2. Morfometria Geométrica X Morfometria Tradicional
O estudo da variação e covariação de medidas de distância, sejam estas entre pares de pontos anatomicamente homólogos ou entre pontos de tangência ou extremos de estruturas analisados pela morfometria tradicional, possui o problema de, por usar distâncias lineares, geralmente não poder capturar muita informação sobre a forma do
organismo como um todo, apesar de descrever o padrão de covariação do todo das medidas, inclusive podendo identificar regiões com maior ou menor grau de covariação. Além disso, a técnica não leva em consideração o padrão de localização dos pontos no espaço. Em contrapartida, a morfometria geométrica é capaz de descrever e localizar mais claramente as regiões de mudanças na forma e, sobretudo, de reconstruir e reconstituir graficamente estas diferenças (Rodrigues & Santos, 2003).
Muitas vezes, na morfologia tradicional, as medidas concentram-se em umas poucas dimensões ou direções e o grande número inicial de medidas que concentram a maior parte da variação existente é reduzido a umas poucas. Geralmente não é possível reconstruir a forma das espécies estudadas após as diferentes análises multivariadas. Ou seja, apesar de evidenciarem que existem diferenças por vezes significativas, não é possível uma representação gráfica da localização destas diferenças que são deduzidas das análises das matrizes geradas pelos métodos multivariados. Já nas análises baseadas em pontos de referência, pela abordagem da morfometria geométrica, as coordenadas destes pontos são as variáveis que capturam as informações sobre a geometria das estruturas estudadas. A vantagem do uso de coordenadas (em relação a medidas lineares) é que estas incluem informação sobre suas posições relativas, e deste modo permitem a reconstrução da forma após as diversas análises uni e multivariadas (Moraes, 2003).
Em suma, a morfometria geométrica abrange uma série de técnicas que visam descrever e representar a geometria das formas estudadas. Enquanto nas abordagens tradicionais a variação da forma é estudada através da covariação entre pares de medidas lineares.
2.3.3. Landmarks
Nessa nova metodologia são utilizados marcos anatômicos homólogos no estudo das formas de estruturas biológicas conhecidos como landmarks (Rohlf & Marcus, 1993). São esses pontos nos quais as estruturas biológicas são analisadas e que permitem identificar as variações de forma entre as mesmas estruturas morfológicas nos diferentes exemplares em estudo. Outra das grandes vantagens da morfometria geométrica sobre os métodos tradicionais é o processo através do qual se quantifica a variação entre formas – Distância de Procrustes (Rohlf, 1999).
2.3.4. Distâncias de Procrustes e Espaço da Forma de Kendall
As Distâncias de Procrustes são distâncias não-lineares e não-euclidianas representadas em um universo matemático multidimensional chamado de espaço da forma Kendall. Este é um espaço multidimensional curvo no qual cada forma é representada por um ponto. A distância entre dois pontos nesse espaço multidimensional representa portanto o quão distante duas formas estão, ou o quanto as formas diferem entre si. Assim, as Distâncias de Procrustes são, na prática, uma maneira de medir a diferença entre duas formas (Moraes, 2003).
É nesse espaço de Kendall que é aplicada a análise estatística da forma (Kendall, 1984; Dryden & Mardia, 1998; Rohlf, 1999). Porém, no caso, não podem ser diretamente empregados métodos de análise estatística multivariada. A nova abordagem permite a descrição da variabilidade usando uma análise estatística robusta bem como a
utilização de Thin-Plate Spline (que será explicada adiante) para ilustrar e descrever os resultados em termos de deformações.
Uma das principais inovações da morfometria geométrica foi a reformulação das idéias de D’Arcy Thompson, o qual visualizava as formas biológicas como distorções de um sistema de Coordenadas Geométricas (Thompson, 1917). Comparando a forma adulta de várias espécies de peixes Thompson propôs que mudanças complexas na forma geométrica dos organismos podem surgir a partir de alterações simples nas taxas de crescimento, ou seja, mediante certas leis da física a forma dos organismos deformariam dando origem a novas formas (Figura 1).
Figura 1: Grades de deformação propostas por D'Arcy Thompson para representar as variações na forma de 4 gêneros de peixe (a: Polyprion, b: Pseudopriacanthus, c: Scorpaena, d: Antigonia). Retirados de Moraes, 2003
Para a análise das Distâncias de Procrustes faz-se a sobreposição de vários exemplares a uma dada configuração referência chamada configuração consenso. Os
parâmetros de sobreposição são escolhidos de maneira a minimizar a soma de quadrados de distâncias entre pontos de cada configuração e os pontos correspondentes à referência (configuração de landmarks na qual os dados são sobrepostos) (Rodrigues & Santos, 2003).
Neste alinhamento, a configuração dos landmarks de cada espécime é escalonada para um padrão uniforme de tamanho e depois normalizada por translação (centra a configuração de landmarks), rotação dos espécimes (gira todas as configurações de landmarks de forma a minimizar as distâncias entre elas) e escalamento (padronização da configuração de landmarks a partir do tamanho do centróide). Deste modo a distância entre os landmarks de cada espécime até os
landmarks da configuração consenso (média) seja a menor possível. Para cada landmark, um residual de Procrustes é a diferença entre a posição dos landmarks dos
exemplares e a posição do landmark homólogo do consenso. Utiliza-se a matriz dos residuais de Procrustes para qualquer procedimento estatístico. (Chapman, 1990; Rohlf & Slice, 1990).
2.3.5. Thin-Plate Splines
Como artifício de visualização do que está ocorrendo de fato nestas análises, o procedimento mais bem sucedido atualmente é o de Thin-Plate Splines Functions (Funções de Flexão de Placas Finas). Com este pode-se avaliar mudanças em pontos de referência. Esta função modela o comportamento de uma placa de metal infinitamente fina que se dobra a medida que os landmarks se movem de sua posição na configuração consenso até a sua posição final. Desta maneira, as diferenças nas formas analisadas são as medidas de força necessária para se deslocar os landmarks, e são visualizadas como o
deslocamento destes (Bookstein, 1991).
2.3.6. Principal Warps, Relative Warps e Partial Warps
A análise das deformações inicia-se com a construção de uma matriz com todas as distâncias entre os pares de pontos de referência, chamada de matriz da energia de deformação. Esta é decomposta gerando duas outras relacionadas, a de autovetores e a de autovalores. A partir da matriz de autovetores pode-se calcular os principais eixos de deformações possíveis na configuração de referência representados pelos valores das deformações principais (principal warps), sendo que cada deformação tem um autovalor relacionado (Moraes, 2003).
O próximo passo é a obtenção da matriz de pesos. Para isso as coordenadas de pontos de cada uma das amostras são projetadas nas principal warps. Os escores resultantes daí descrevem o peso de cada deformação principal para transformar a configuração de referência na configuração de cada indivíduo. Os vetores gerados nessa nova matriz são chamados de deformações parciais (partial warps) (Moraes, 2003).
Da mesma maneira que as deformações principais são características da configuração de referência, as deformações parciais são intrísecas de cada exemplar. Cada indivíduos é representado na matriz de pesos como uma combinação linear das deformações principais. Fazendo-se uma análise de componentes principais sobre a matriz de pesos gera-se um conjunto de autovetores chamados de deformações relativas (relative warps). Com estes pode-se constatar quais os eixos ortogonais que mais variaram suas formas a partir das deformações parciais. Gerados estes valores pode-se
recuperar as grades de deformação de qualquer indivíduo em relação a configuração de referência (Moraes, 2003).
2.4 Objetivo do trabalho
Uma vez que Nannotrigona testaceicornis foi uma das espécies escolhidas para uma série de trabalhos no projeto Biota/Fapesp “Biodiversidade e uso sustentável de polinizadores, com ênfase em abelhas”, houve necessidade de aumentar o número de ninhos em colméias racionais na Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo. Algumas colméias vieram de Uberlândia - MG, outras de São Paulo - SP; sendo que em São Paulo havia também colônias originárias de Prudentópolis - PR (Anexo II - Figura I). O nosso interesse maior é o de conhecer as possíveis variações entre estas populações e a existente no campus de Ribeirão Preto - SP.
3.Material e método
3.1. Descrição das localidades amostradas
3.1.1. Ribeirão Preto
Todos os espécimes foram coletados em uma área urbanizada de Ribeirão Preto, provenientes de diversas localidades de dentro do campus da USP. Este está situado a 21º10’30”S e 47º48’38”W na cidade de Ribeirão Preto, na região nordeste do Estado de São Paulo, conhecida como região da Alta Mogiana, distante 319 km da cidade de São Paulo (Reis, 2004). A sazonalidade no regime de chuvas é característica da cidade, que possui um inverno seco e um verão chuvoso. A temperatura média da cidade é de 22.6°C, a precipitação média anual é de 1.467,9mm anuais e a umidade relativa média é de 71,82%.
De acordo com o trabalho de Kottchetkoff-Henriques de 2003 a cidade de Ribeirão Preto apresenta uma que corresponde a área urbana de 22,73% do município, sendo que há mais 18,85% correspondentes à área de expansão urbana. A área de ocupação rural é de 58,42%, onde predomina a cultura de cana-de-açúcar. A área de coberura vegetal natural domina 3,9% da área, nestes estão incluídas Mata Decíduas, Matas Paludícolas, Cerrado e Matas Mesófilas.
3.1.2. Uberlândia
Uberlândia é um município brasileiro do estado de Minas Gerais, fica na região Metropolitana do Triângulo Mineiro, soma cerca de 700 mil habitantes (IBGE 2006), e tem uma área de mais de 4000 km². Tem seu limite dentro das coordenadas geográficas de 18° 30’ e 19° 30’ de latitude sul e de 47° 50’ e 48° 50’ de longitude oeste e dista 605 km da cidade de São Paulo (http://pt.wikipedia.org/wiki/Uberl%C3%A2ndia).
O clima da cidade é semitropical, que se caracteriza pela alternância de invernos secos e verões chuvosos. A média anual da temperatura é de 22ºC. Os meses de outubro a março são os mais quentes, em torno de 24,7ºC. Os meses mais frios são junho e julho, com uma média de 18,8ºC. No verão, há grande instabilidade, sobretudo de origem frontal (Frente Polar Atlântica) e instabilidades de Noroeste, que provocam grandes chuvas, concentradas de outubro a março. Os meses de dezembro a fevereiro são responsáveis por cerca de 50% da precipitação anual, que é de 1.500 a 1.600mm (Uberlândia Online - http://www2.uol.com.br/uberlandia/relevo_udi.html).
O município de Uberlândia está inserido no Bioma cerrado, sendo que seus principais tipos fisionômicos são: vereda, campo limpo, campo sujo, cerradão, mata de várzea, mata galeria ou ciliar e mata mesofítica. A hidrografia do município pertence à bacia do rio Paraná, tendo o rio Uberabinha e seu afluente Bom Jardim como principais cursos d’água, que são utilizados como fontes de abastecimento de água para a cidade. (Brito, 2005)
Nesta cidade foram coletadas amostras de três locais de características bastante diferentes (Anexo II - Figura II). As abelhas do município utilizadas na pesquisa são originárias do centro da cidade, do campus Umuarama da Universidade Federal de Uberlândia (distante 10 km do centro) e de Capim Branco.
Esta última localidade, que dista 20km do centro, encontra-se na porção norte da cidade, próxima ao vale do rio Araguari, a paisagem mostra um relevo fortemente ondulado, com altitudes de 500 a 700m e manchas de solo muito férteis (latossolo vermelho escuro e podzólico), que são recortados pelo que restou das matas originais.
3.1.3. São Paulo
O clima de São Paulo é considerado subtropical tipo Cwa (Köppen, 1948), sobretudo devido a sua altitude elevada, com médias anuais de 19°C. Devido à proximidade do mar, São Paulo é influenciada pela maritimidade, tornando os dias praticamente sempre úmidos e os verões mais amenos. A precipitação anual média é de 1317 mm. Possui também duas estações relativamente bem definidas: o inverno, estio e ameno, e o verão, quente e chuvoso. A menor temperatura já registrada pelo INMET em São Paulo foi de -2,1°C em 1955. Ocorrências de neve são raríssimas na cidade. A única registrada foi a 18 de junho de 1918 quando a temperatura atingiu -2°C, porém há registros não oficias que indicam precipitação de neve em anos anteriores. A máxima registrada foi de 37,8°C em 1999. (http://pt.wikipedia.org/wiki/S%C3%A3o_paulo).
As coordenadas geográficas da cidade são 23º32’0”S e 46º38’0”W. Dado que é o principal pólo econômico da América do Sul, é esperado que a cobertura vegetal esteja quase completamente devastada. Atualmente esta é constituída basicamente por: fragmentos da vegetação natural secundária (floresta ombrófila densa, floresta ombrófila densa alto montana, floresta ombrófila densa sobre turfeira e campos naturais), que ainda resistem ao processo de expansão urbana, em porções mais preservadas no extremo sul, na Serra da Cantareira ao Norte e em manchas isoladas,
como as APAs do Carmo e Iguatemi, na zona leste; por ambientes implantados, em áreas urbanizadas, restringindo-se aos parques e praças municipais e a escassa arborização viária; e por conjuntos ou espécimes isolados em terrenos particulares (http://atlasambiental.prefeitura.sp.gov.br/).
Todos os espécimes coletados na cidade são provenientes do campus da Universidade de São Paulo, que é uma área urbanizada. Apesar de se encontrar no centro da cidade pode-se dizer que dentro de suas propriedades o clima é um pouco diferenciado dos arredores por possuir uma maior área proporção de área verde.
3.1.4. Prudentópolis
A cidade de Prudentópolis é localizada no estado do Paraná. A vegetação predominante é a floresta subtropical, composta principalmente por Araucária
augustifolia. Localizado nas coordenadas geográficas 25º12’46”S 50º58’40”W, dista
616km da cidade de São Paulo e tem o seu clima classificado como temperado úmido. (http://pt.wikipedia.org/wiki/Prudent%C3%B3polis). Durante o verão a temperatura média é de 22ºC e nos meses frios ela varia entre 3 e 18ºC. (Köppen, 1948).
3.2. Coleta dos indivíduos
Foram coletados 389 indivíduos provenientes de colônias de quatro localidades para fins de comparações populacionais. Os 10 ninhos de Ribeirão Preto - SP estavam localizados no campus da Universidade de São Paulo. Foram ainda utilizados 20 ninhos mantidos em colméias provenientes de Uberlândia – MG. Destes havia 16 ninhos
provenientes de áreas urbanizadas e 6 ninhos de Capim Branco, que é uma região pertencente a cidade de Uberlândia, estava em colméias e é proveniente de um programa de salvamento de fauna em área que será inundada por água de represa. Os 8 ninhos de São Paulo estão distribuídos pelo Campus da Universidade de São Paulo, no Instituto de Biociências, e os 2 de Prudentópolis - PR estavam em colméias no Laboratório de Abelhas do IB-USP. Como grupo de comparação de diferenças morfológicas entre as populações foram utilizadas duas amostras de Nannotrigona
puctata de 10 e 9 indivíduos respectivamente oriundos das cidades de Jardim Seridó -
RN e Recife - PE que estavam depositados na Coleção Entomológica Paulo Nogueira-Neto, a qual se encontra digitalizada (programa Fapesp-Coleções Biológicas).
Para a coleta dos espécimes foram utilizados sugadores feitos de mangueiras de borracha ou puçás. Geralmente as abelhas eram capturadas com uso do sugador na entrada da colméia. Algumas que se encontravam voando na porta do ninho eram coletados com o auxílio do puçá. Depois de aprisionados os animais eram introduzidos em recipientes com álcool para serem preservados.
3.3. Captura das imagens
As asas anteriores direita de aproximadamente 10 indivíduos por colônia foram retiradas com o auxílio de uma pinça e montadas entre lâminas de microscopia separadas por massa de modelar. Cada uma foi posicionada sob um estereomicroscópio Leica MZ75 acoplado a uma câmera digital Leica DFC280, fotografadas com uso do Leica Software IM50 e armazenadas no computador. As asas de Nannotrigona punctata
foram gentilmente montadas e cedidas por Patrícia Nunes Silva do Laboratório de Abelhas do Departamento de Ecologia do Instituto de Biociências da USP-SP.
3.4. Morfometria geométrica e análises estatísticas
Primeiramente, com o software tpsUtil versão 1.33 (Rohlf, 2004) foi construído um arquivo para possibilitar a análise das imagens e a marcação dos marcos anatômicos. Posteriormente 12 landmarks homólogos foram manualmente marcados nas intersecções das veias das asas anteriores (Anexo I - FiguraV) com o auxílio do software tpsDig, versão 2.04 (Rohlf, 2005a). As imagens foram então alinhadas de acordo com a metodologia Procrustes. Nesta metodologia, todos os indivíduos são escalonados para um tamanho uniforme, sobrepostos com base nos centróides das asas e rotacionados de modo que a distância entre os landmarks seja a menor possível. O escalonamento de todos os indivíduos para um tamanho uniforme garante que as diferenças apresentadas nas formas finais sejam somente diferenças no posicionamento dos marcos anatômicos analisados, sendo independentes do tamanho e eliminando possíveis efeitos ambientais nos indivíduos, como disponibilidade de alimento.
Para estas análises, o parâmetro α foi utilizado como zero e assim, o mesmo peso foi dado a todas as medidas de relative warps, ou seja, foi dada igual importância aos partial warps, a todas as escalas espaciais, sendo esta a melhor opção para estudos exploratórios (Rohlf, 1993). Todas as análises para obtenção dos valores de deformações relativas foram feitas por meio do software tpsRelw versão 1.42 (Rohlf, 2005b). Os dados obtidos foram analisados por análises discriminantes lineares no software STATISTICA (Statsoft) e as distâncias entre os grupos foram calculadas.
4. Resultados
4.1. Populações
Dentre as 20 medidas de relative warps geradas pelas análises, 17 contribuíram significativamente (p<0,05) para a separação dos grupos. Os seis primeiros relative
warps são capazes de explicar 74,47% da variabilidade de todo o conjunto de dados,
sendo que a maior variação de posicionamento foi encontrada, em ordem decrescente, nos landmarks 11, 6 e 10.
A análise de variância multivariada (MANOVA), de todos os relative warps considerando as quatro populações mais o grupo externo (N. punctata), demonstrou diferenças entre os grupos com o valor do λ de Wilks é igual a 0,17536. Tal resultado demonstrou-se um valor altamente significativo (p < 0,00001).
As distâncias de Mahalanobis entre os centróides das distribuições (Tabela 2) (Figura 2) foram estatisticamente significantes (p<0,05) (Tabela 3). Observa-se que o grupo externo, N. punctata possui um centróide muito distante dos demais, o que já era esperado dado que pertence a uma espécie diferente. Comparando-se apenas as populações de N. testaceicornis, os de centróide mais distantes ficam entre os de Prudentópolis - PR e Ribeirão Preto - SP.
Tabela 2: distâncias de Mahalanobis entre as populações
Uberlândia São Paulo Prudentópolis Ribeirão Preto N. punctata
Uberlândia 0,00 4,88 7,07 2,88 21,11
São Paulo 0,00 4,51 6,21 24,05
Prudentópolis 0,00 7,61 28,32
Ribeirão Preto 0,00 23,54
N. punctata 0,00
Tabela 3: Significância p das diferenças estatísticas entre os centróides das populações
Uberlândia São Paulo Prudentópolis Ribeirão Preto N. punctata
Uberlândia 0,0000001 0,0000001 0,0000001 00,0000001
São Paulo 0,000013 0,0000001 0,0000001
Prudentópolis 0,0000001 0,0000001
Ribeirão Preto 0,0000001
A partir das distâncias quadradas de Mahalanobis foi construído um dendograma de proximidade morfológica entre os grupos estudados (Figura 3). Neste dendograma, as populações de São Paulo - SP e Uberlândia - MG ficam agrupadas em um ramo. A população de Ribeirão Preto - SP fica agrupada como grupo-irmão deste ramo, seguida pela população de Uberlândia. A amostra de N.punctata fica posicionada em um ramo lateral, bem distante das demais.
São Paulo - SP Prudentópolis - PR Ribeirão Preto - SP Uberlândia - MG Nannotrigona punctata 2
Figura 3: Dendograma de proximidade morfológica entre as populações de Nannotrigona testaceicornis. A espécie Nannotrigona punctata foi usada como grupo externo para comparação
As funções discriminantes classificaram corretamente 81,25% das amostras de Uberlândia, 61,67% das amostras de São Paulo, 60,00% de Prudentópolis, 70,71% de Ribeirão Preto e 94,44% das N. puntacta (Tabela 4). Assim, do total de 389 asas, 97 foram classificadas em grupos errados 23 de São Paulo, 29 de Ribeirão Preto, 8 de Prudentópolis, 36 de Uberlândia e 1 de N. punctata
A maior porcentagem de acertos de classificação das amostras do grupo externo deve ter ocorrido por ser, comparativamente, a de maior diferença morfológica.
Tabela 4: matriz de classificação das populações
Porcentagem Uberlândia São Paulo Prudentópolis Ribeirão Preto N. punctata
Uberlândia 81,25 156 11 4 19 2 São Paulo 61,67 15 37 2 6 0 Prudentópolis 60,00 2 3 12 3 0 Ribeirão Preto 70,71 28 1 0 70 0 N. punctata 94,44 1 0 0 0 17 Total 75,06 202 52 18 98 19
Os testes de validação cruzada indicaram que pouco mais de 60% das amostras foram corretamente classificadas. Esses testes são utilizados para verificar a confiabilidade das classificações das amostras. Esta técnica permite examinar qual a porcentagem da amostra é corretamente classificada quando sua identidade não é revelada ao programa estatístico. A sua utilização é importante para confirmar a confiabilidade das equações discriminantes geradas pelas analises.
O teste leave 10% out repetido 100 vezes consiste em deixar 10% da amostra não identificadas por 100 repetições de modo que estas amostras sejam classificadas pelas equações sem o prévio conhecimento de sua origem. Para este teste obteve-se um valor de 64,4% de classificações corretas.
O teste leave 20% out também repetido por 100 vezes resultou um valor de 63,6% de classificações corretas.
4.2. Sub-populações de Uberlândia
Dentre as 20 medidas de relative warps geradas pelas análises, 13 contribuíram significativamente (p<0,05) para a separação dos grupos. Os seis primeiros relative
warps são capazes de explicar 72,54% da variabilidade de todo o conjunto de dados,
sendo que a maior variação de posicionamento foi encontrada, em ordem decrescente, nos landmarks 11, 6 e 10.
A análise de variância multivariada (MANOVA), de todos os relative warps, considerando as três sub-populações, demonstrou diferenças entre os grupos com o valor do λ de Wilks igual a 0,30065. Tal resultado demonstrou-se um valor altamente significativo (p < 0,00001).
As distâncias de Mahalanobis entre os centróides das distribuições (Tabela 5) (Figura 4) foram estatisticamente significantes (p<0,05) (Tabela 6). Observa-se que a amostra de Capim Branco possui um centróide mais distante do Centro e de Umuarama do que os dois últimos comparados.
Tabela 5: distâncias de Mahalanobis entre as subpopulações de Uberlândia
Capim Branco Umuarama Centro
Capim Branco 0 6,961937 7,482054
Umuarama 0 2,285608
Tabela 6: siginificância dos centróides das subpopulções de Uberlândia
Capim Branco Umuarama Centro
Capim Branco 0,0000001 0,0000001
Umuarama 0,000012
Centro
Figura 4: Análise discriminante dos grupos de N. testaceicornis de Uberlândia.
As funções discriminantes classificaram corretamente 82,76% das amostras de Capim Branco, 78,20% das amostras de Umuarama e 71,60% das pertencentes ao Centro. (Tabela 7). Assim, do total de 192 asas, 43 foram classificadas em grupos errados sendo 10 de Capim Branco, 17 de Umuarama e 16 do Centro.
Tabela 7: matriz de classificação das subpopulações de Uberlândia
Porcentagem Capim Branco Umuarama Centro
Capim Branco 6 82,76 48 7 3
Umuarama 9 78 5 61 12
Centro 6 71,43 3 13 40
Total 77,60 56 81 55
A validação cruzada resultou no valor de classificações corretas de 69,79% para o teste leave 1 out, 68,1% para o teste leave 10% out repetido 100 vezes e 66,5% para o teste leave 20% out também com 100 repetições.
4.3. Colônias de Ribeirão Preto
Dentre as 20 medidas de relative warps geradas pelas análises, 12 contribuíram significativamente (p<0,05) para a separação dos grupos. Os seis primeiros relative
warps são capazes de explicar 70,16% da variabilidade de todo o conjunto de dados,
sendo que a maior variação de posicionamento foi encontrada, em ordem decrescente, nos landmarks 6, 11 e 10.
A análise de variância multivariada (MANOVA), de todos os relative warps considerando as 10 colônias amostradas em Ribeirão Preto - SP demonstrou diferenças entre os grupos com o valor do λ de Wilks é igual a 0, 0013159. Tal resultado demonstrou-se um valor altamente significativo (p < 0,00001).
As distâncias de Mahalanobis (Tabela 8) entre os centróides das distribuições das colônias (Figura 5) foram estatisticamente significantes (p<0,05) (Tabela 9), exceto para os pares 4 – 6 e 6 – 8. que apresentaram um p em torno de 0,06.
Tabela 8: Distâncias de Mahalanobis dos ninhos de Ribeirão Preto
ninho 1 ninho 2 ninho 3 ninho 4 ninho 5 ninho 6 ninho 7 ninho 8 ninho 9 ninho 10 ninho 1 0 24,61 21,82 11,66 27,35 17,07 33,75 27,59 19,78 30,61 ninho 2 0 26,88 16,41 23,35 17,67 36,47 33,29 36,34 35,85 ninho 3 0 20,57 34,16 23,72 21,65 26,50 34,37 34,88 ninho 4 0 23,42 10,22 21,55 17,46 17,91 17,28 ninho 5 0,00 16,16 31,55 26,82 31,10 40,90 ninho 6 0 28,78 9,51 34,39 31,50 ninho 7 0 25,08 21,81 21,65 ninho 8 0 28,27 31,17 ninho 9 0 21,04 ninho 10 0
Tabela 9: significância dos centróides das colônias
ninho 1 ninho 2 ninho 3 ninho 4 ninho 5 ninho 6 ninho 7 ninho 8 ninho 9 ninho 10 ninho 1 0,000002 0,000014 0,022098 0,0000001 0,000335 0,0000001 0,0000001 0,000053 0,0000001 ninho 2 0,000001 0,00103 0,000005 0,000223 0,0000001 0,0000001 0,0000001 0,0000001 ninho 3 0,00007 0,0000001 0,000004 0,000015 0,000001 0,0000001 0,0000001 ninho 4 0,000012 0,05362 0,000038 0,00052 0,000387 0,000584 ninho 5 0,000626 0,0000001 0,000001 0,0000001 0,0000001 ninho 6 0,0000001 0,057735 0,0000001 0,0000001 ninho 7 0,000002 0,000014 0,000015 ninho 8 0,0000001 0,0000001 ninho 9 0,000023
Figura 5: Análise discriminante das colônias de N. testaceicornis de Ribeirão Preto.
Aproximadamente 90% dos indivíduos foram corretamente classificadas pelas funções discriminantes geradas classificaram como pertencentes a sua respectiva colônia. O ninho com maior número de classificações erradas obteve um 77,8% de acertos enquanto duas colônias obtiveram 100% de acertos (Tabela 9). De um total de 99 asas 10 foram classificadas em ninhos errados. A maior parte dos indivíduos corretamente classificados teve um p > 0,95.
Tabela 10: matriz de classificação dos ninhos de Ribeirão Preto
Porcentagem ninho 1 ninho 2 ninho 3 ninho 4 ninho 5 ninho 6 ninho 7 ninho 8 ninho 9 ninho 10
Ninho 1 90,00 9 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Ninho 2 90,00 0 9 0 1 0 0 0 0 0 0 Ninho 3 90,00 0 0 9 1 0 0 0 0 0 0 Ninho 4 77,78 1 0 0 7 0 0 0 0 0 1 Ninho 5 100,00 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 Ninho 6 90,00 0 0 0 0 0 9 0 1 0 0 Ninho 7 100,00 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 Ninho 8 90,00 0 0 0 0 0 1 0 9 0 0 Ninho 9 80,00 0 0 0 0 0 0 2 0 8 0 ninho 10 90,00 0 0 0 0 0 0 0 0 1 9 Total 90,00 10 9 9 10 10 10 12 10 9 10
No caso da validação cruzada, o teste leave 1 out obteve um acerto de 62,63% nas classificações. O teste leave 10% out, repetido por 100 vezes, resultou um valor de 61,7% de classificações corretas. Por fim, no teste leave 20% out, repetido por 100 vezes, verificou-se um valor de 58,7% de classificações certas.
5. Discussão
Quando diversos caracteres das amostras são medidas simultaneamente, as distâncias de Mahalanobis (D2) podem ser tomadas como estimativas de diversidade genética entre os grupos. Essa diversidade é obtida segundo diferenças fisiológicas, morfológicas e ecológicas, avaliadas a partir de um grupo de genótipos (GHADERI et
al., 1984). No nosso caso, são análises morfológicas entre as asas que contribuíram para
os valores de Mahalanobis presentes nas Tabelas 2, 5 e 8 nos servem como parâmetro de comparação entre a diversidade genética dos grupos e sua proximidade morfológica. Assim, tendo em vista esta situação, nossos resultados foram discutidos de acordo com a seguinte estruturação:
5.1. Populações de Nannotrigona testaceicornis e a introdução das amostras de Uberlândia – MG em Ribeirão Preto:
O objetivo principal do trabalho é o de se comparar os perfis morfológicos das amostras das diversas localidades amostradas no trabalho com a população do campus da USP de Ribeirão Preto, tendo em vista que colônias provenientes de todos estas localidades podem ser introduzidas na cidade em um futuro próximo devido ao crescente interesse na espécie em questão. As diferenças estatísticas encontradas entre os grupos, apesar de significativas não mostram uma grande divergência entre os grupos. Como as quatro amostras de N. testaceicornis foram coletadas em três estados brasileiros diferentes uma certa variabilidade genética diferencial é esperada para os
grupos, tendo em vista que estes habitam diferentes biomas e conseqüentemente sofrem diferentes pressões seletivas. Entretanto, quando comparadas as distância morfológica entre as populações de N. testaceicornis com a distância destes grupos com N.
punctata, fica evidenciado que elas são muito mais próximas entre si do que com
relação ao grupo externo. Ao analisar-se cuidadosamente o gráfico, pode-se perceber que os indivíduos dos grupos ficam muito espalhados, encontrando-se uma grande sobreposição dos indivíduos dos diversos grupos, mesmo que seja encontrada uma nuvem mais densa de pontos nas proximidades do centro de distribuição.
De uma maneira geral, podemos ver uma certa coerência entre as distâncias morfológicas e geográficas entre as localidades, fato este que é evidenciado pela analise do dendograma de proximidade morfológica. Um modelo de fluxo gênico relacionado com as distâncias geográficas é suficiente para explicar o posicionamento das populações no gráfico. Interessante notar que as populações de São Paulo – SP e Prudentópolis – PR se encontram no Laboratório de Abelhas do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo já há alguns anos. Entretanto, ainda é possível distinguir as duas populações, sendo que estas populações apresentam uma distância morfológica considerável quando comparada com a distância entre Ribeirão Preto – SP e Uberlândia – MG. Como as duas amostras teóricamente pertencem à mesma espécie era esperado que estas populações se misturassem e que tivessem um padrão de nervuras de asas muito parecido ou praticamente indistinguível. Um fluxo gênico reduzido ou ausente seria uma das explicações para esta manutenção dos padrões morfológicos das populações atuais em detrimento da mistura. Entretanto, um estudo mais detalhado e com um maior número de amostras se faz necessário antes de qualquer conclusão. Nunes-Silva et. al. (in prep.) Encontraram uma situação parecida para abelhas da espécie Plebeia remota provenientes das localidades de Cunha – SP e Prudentópolis –
PR. Colônias que foram mantidas na mesma localidade por mais de 10 anos. Tais colônias mantiveram seus padrões de asa originais e não ocorreu mistura, sendo que este mesmo isolamento reprodutivo também foi confirmado por padrões de DNA mitocondrial.
Em um primeiro momento, os ninhos de Uberlândia que estão sendo salvos da inundação estão sendo trazidos para Ribeirão Preto. Estas duas são as populações mais próximas morfologicamente e também são as que apresentam a maior taxa de erros na classificação de seus indivíduos. Provavelmente, por serem as duas populações que estão mais próximas geograficamente, elas também são as duas populações que apresentam um maior fluxo gênico. A capacidade de dispersão dos enxames de N.
testaceicornis é desconhecida, mas ainda sim é mais provável que haja um fluxo gênico
maior entre as populações de Ribeirão Preto – SP e Uberlândia – MG do que entre Uberlândia – MG e Prudentópolis – PR.
Assim, tendo em vista a maior proximidade das populações de Uberlândia – MG e Ribeirão Preto – RP e todas a semelhanças entre as duas populações já apresentadas, a introdução destes organismos em Ribeirão Preto – SP nos parece a melhor alternativa, uma vez que a melhor de todas as alternativas, que seria a salvação do habitat destas colméias não é possível. A introdução destas colônias em Ribeirão Preto ainda vai assegurar um aumento na variabilidade genética da população, uma vez que, por estarem submetidas a diferentes pressões seletivas, as populações certamente gozam de diferentes genótipos selecionados ao longo do tempo.
5.2. Sub-estruturação da população de Uberlândia:
De todas as nossas amostras, a população de Uberlândia – MG foi a única a ser coletada em mais de um ponto dentro do município, sendo algumas amostras coletadas no campus da Universidade Federal de Uberlândia, que fica no bairro Umuarama, que foi como denominamos a amostra, algumas coletadas no centro da cidade e outras coletadas numa área natural que vai ser alagada para a construção de uma represa. Desta maneira, o intuito desta análise é o de se checar se existe uma estruturação da população deste município em sub-populações que possam ser evidenciadas com base na morfologia de suas asas. De fato, essa diferença é encontrada, como fica evidenciado pela distâncias de Mahalanobis entre os grupos, que mostra as populações urbanas (Umuarama e Centro) muito mais parecida entre si (Distância de 2,29) do que quando comparadas com a população da área natural de Capim Branco (6,96 para Umuarama e 7,48 para Centro).
A pequena diferenciação entre Centro e Umuarama pode ser explicada devido a uma densidade geralmente menor de ninhos na região urbana, bem como uma menor disponibilidade de alimento e recursos para os grupos. Esta menor disponibilidade de material genético e de recursos provavelmente gera um pequeno
inbreeding, concentrando algumas características das asas dessas abelhas e acaba por
diminuir a variabilidade genética do grupo. No campo, a disponibilidade de ninhos e material genético é maior o que impede esse efeito. O efeito do inbreeding em asas de abelhas foi demonstrado por Francoy et al., (não publicado) para Apis mellifera mantidas em isolamento na Ilha de Fernando de Noronha por mais de 20 anos. Apesar destas abelhas, que foram introduzidas na ilha em 1986 serem originalmente pertencentes a subespécie Apis mellifera ligustica, quando comparadas
morfometricamente com amostras puras desta subespécies as abelhas provenientes da ilha se mostram muito distintas.
Assim, os indivíduos de Capim Branco devem possuir uma variabilidade genética constante, enquanto as duas demais tendem a se distribuir em nuvens de variabilidade mais restitas tanto geneticamente como morfologicamente (figura 4).
5.3. Colméias de Ribeirão Preto
Dado que o uso da morfometria geométrica para estudo de abelhas é muito recente, sendo o primeiro trabalho publicado em 2006 por Francoy et al., um dos interesses do presente trabalho foi o de testar a capacidade de refinamento que essa técnica pode fornecer no quesito poder de discriminação. Para obtenção de tal resultado foi testada a menor unidade evolutiva possível para Meliponini, que é a colméia.
Foram escolhidas as colméias de Ribeirão Preto porque todos animais são originários teoricamente do mesmo ambiente, o campus da Universidade de São Paulo. Espera-se que essa homogeinidade nos tenha fornecido mais consistência nas respostas.
Assim, o baixo valor do wilks’s λ (0,0013159) é interpretado em morfometria geométrica como um grande distanciamento entre as amostras.
Os dados obtidos na tabela 8 mostram que as distâncias de Mahalanobis entre cada colméia é bem alta. Sendo que a média total é de praticamente 90% e apesar de os valores obtidos nos testes de validação cruzada, apesar de bem menores, estes ainda se mostram bastante altos quando pensamos no nível de refinamento da identificação. Tal discriminação não é possível entre colônias Apis mellifera (Francoy, inf. pessoal), provavelmente devido a promiscuidade das rainhas de Apis em relação aos Meliponini. É sabido que rainhas deste grupo tendem a acasalar com 17 a 20 machos, o
que aumenta muito a variabilidade intra-colonial enquanto rainhas de Meliponini geralmente acasalam com apenas um macho (Peters et al, 1999)
Tendo em vista que para esta pesquisa foram utilzados apenas 12 pontos homógos de referência bastante simples, o atual resultado se mostra muito bom. O aumento do numero de landmarks que por ventura venham a acrescentar informação discriminatória nas análises pode aumentar ainda mais a precisão das identificações e melhorar ainda mais as perspectivas no uso das técnicas de morfometria geométrica.
6. Considerações Finais
• As populações de Nannotrigona testaceicornis se mostraram bem próximas se comparadas com as distâncias quadradas de Mahalanobis. A salvação dos ninhos provenientes da região de alagamento por uma represa em Uberlândia – MG e sua introdução em Ribeirão Preto – SP nos parece adequada, pois foram as duas populações que se mostraram mais próximas de acordo com as análises realizadas.
• As populações de São Paulo – SP e Prudentópolis – PR, apesar de já serem mantidas em um mesmo lugar há vários anos ainda mantém um padrão de venação de asas que pode ser distinguido. Esse fato pode indicar um fluxo gênico reduzido ou mesmo ausente entre os dois grupos. Estudos mais aprofundados neste tema se fazem necessários.
• A população de Uberlândia – MG se mostrou estruturada em subpopulações localizadas nas áreas urbanas e naturais do município. Tal estruturação pode ser explicada devido a um acasalamento preferencial dos indivíduos das áreas urbanas por uma questão de distanciamento geográfico com o grupo da área natural. Esse acasalamento preferencial acaba por diminuir a variabilidade dos grupos, tornando-os mais homogêneos.
• As altas taxas de discriminação de indivíduos pertencentes a colônias diferentes dentro da população de Ribeirão Preto – SP reflete o poder discriminatório da técnica empregada neste trabalho. Os landmarks utilizados neste trabalho foram escolhidos aleatoriamente de acordo
com a sua facilidade de identificação. Um trabalho exploratório para definir outros possíveis landmarks que acrescentem informação discriminatória na análise pode melhorar ainda mais tais resultados. • A morfometria geométrica se mostrou uma excelente ferramenta na
discriminação dos grupos aqui propostos e seu uso em futuros trabalhos para caracterização e identificação de espécies de abelhas sem ferrão é muito promissor. A utilização destas novas ferramentas automatizadas de identificação de espécies nos apresentam uma ótima oportunidade nesta área, sem nunca nos esquecermos do trabalho do taxonomista, sem o qual tais trabalhos dificilmente se tornariam factíveis.
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