UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

Influência da ingestão de uma fonte protéica na produção de ovos e na receptividade sexual de fêmeas adultas selvagens de Anastrepha obliqua

(Diptera: Tephritidae)

Luanda Medeiros

Orientador: Fernando Sérgio Zucoloto

Tese apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP, como parte das exigências para a obtenção do título de DOUTOR EM CIÊNCIAS – Área: ENTOMOLOGIA

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AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de Ribeirão Preto/USP

Medeiros, Luanda

Influência da ingestão de uma fonte protéica na produção de ovos e na receptividade sexual de fêmeas selvagens de Anastrepha obliqua

(Diptera: Tephritidae) p.70 : il. ; 30cm

Tese apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Entomologia. Orientador: Zucoloto, Fernando Sérgio.

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_______________________________________________________Agradecimentos

Agradecimentos

Gostaria de deixar minha gratidão a todas as pessoas e entidades que colaboraram com a realização deste trabalho, especialmente agradeço:

ao Prof Dr Fernando Sérgio Zucoloto, pela oportunidade, orientação, amizade, sugestões, exemplo científico e confiança em minha pessoa e no meu trabalho;

ao departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto e ao Programa de Pós-Graduação em Entomologia, pela oportunidade e condições de trabalho oferecidas;

à Renata, secretária da Pós-Graduação, por ter me orientado quanto às questões relativas ao doutorado e pela amizade;

às meninas do laboratório: Carla, Tânia, Thamara, Luzia, Alessandra, Isabel, Helen, Rebecca, Rosana e Juliana, que estão participando do meu trabalho desde a Graduação, obrigada pela amizade, discussões e a paciência;

à minha mãe, com muito carinho, pelo apoio e por ter feito tanto para que eu pudesse ter chegado até aqui, me dando a oportunidade de estudar, além do maior presente que alguém pode receber, a vida;

ao meu pai, que mesmo não estando mais entre nós, está sempre no meu coração e que tenho certeza, está orgulhoso de tudo o que conquistei;

à minha irmã Ana Lúcia, pela compreensão, paciência e pelo apoio;

ao meu querido Weyder, por ser mais do que um namorado, ser um amigo, um confidente; um corretor, um orientador e por ter me proporcionado momentos

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_______________________________________________________Agradecimentos

ao Prof. Dr. Ronaldo Zucchi, pelo equipamento utilizado para a medida das asas das moscas;

à Ana Paula, pelo auxílio técnico e inesquecíveis cafezinhos;

ao Laércio, pela dedicação e competência, e pelas nossas divertidas coletas; a todos os indivíduos de Anastrepha obliqua que foram utilizadas neste trabalho, pois deram a vida para o desenvolvimento da Ciência;

à Fundação Educandário Cel Quito Junqueira em Ribeirão Preto, por ter me cedido os frutos utilizados neste trabalho;

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_______________________________________________________________Índice Índice RESUMO...vii INTRODUÇÃO ...8 OBJETIVOS ...17 MATERIAL E MÉTODOS ...18

- Padrão diário de oviposição ...19

- Padrão diário de oviposição: fêmeas em grupos ...19

- Padrão diário de oviposição: fêmeas isoladas...21

- Receptividade sexual...22

- Quantidade de fêmeas acasaladas ...22

- Condição de laboratório ...23

- Experimento Lab 1...23

Receptividade sexual x condição nutricional das fêmeas (laboratório) - Experimento Lab 2...24

Receptividade sexual x carga de ovos das fêmeas (laboratório) - Condição de campo ...26

- Experimento campo 1: ...26

- Receptividade sexual x condição nutricional das fêmeas (Gaiolas) - Experimento campo 2 ...27

- Receptividade sexual x carga de ovos das fêmeas (Gaiolas) RESULTADOS ...28

- Padrão diário de oviposição: fêmeas em grupos ...28

- Figura 2 ...29

- Figura 3 ...31

- Padrão diário de oviposição: fêmeas isoladas...32

- Figura 4 ...33

- Figura 5 ...35

- Tabela 1...37

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_______________________________________________________________Índice

- Quantidade de fêmeas acasaladas ...42

- Condição de laboratório ...42

- Experimento Lab 1...42

Receptividade sexual x condição nutricional das fêmeas (laboratório) - Experimento Lab 2: ...42

Receptividade sexual x carga de ovos das fêmeas (laboratório) - Tabela 2...43

- Condição de campo ...43

Receptividade sexual x condição nutricional das fêmeas (Gaiolas) - Figura 9 ...44

Receptividade sexual x carga de ovos das fêmeas (Gaiolas) DISCUSSÃO ...46

- Receptividade sexual...53

BIBLIOGRAFIA ...59

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______________________________________________________________Resumo

As proteínas têm um importante papel nos processos metabólicos dos seres vivos; são o constituinte alimentar que mais influencia no crescimento, fecundidade e longevidade de diversos insetos. Anastrepha obliqua, espécie escolhida para o presente estudo, é anautógena, ou seja, as fêmeas necessitam de uma fonte de proteína como alimento na fase adulta para que maturem os oócitos, sendo que a concentração deste nutriente influencia, também, a quantidade de oócitos maduros produzidos. A nutrição também é um importante fator envolvido na receptividade sexual de algumas espécies de insetos. A receptividade sexual é um comportamento da fêmea que permite ou ajuda o macho a fertilizar seus ovos. Os objetivos deste trabalho foram determinar o padrão de oviposição diário das fêmeas de A. obliqua levando em consideração a concentração de proteína na alimentação dos adultos e a densidade de indivíduos durante os experimentos, e analisar a influência da alimentação protéica e da carga de ovos na receptividade sexual das fêmeas adultas selvagens de A. obliqua. O padrão diário de oviposição de desta espécie foi determinado quando as fêmeas estiveram em grupos e isoladas. As fêmeas alimentadas na dieta com maior concentração de lêvedo ovipositaram maior quantidade de ovos, tanto mantidas em grupos quanto isoladamente. Além disso, a longevidade das fêmeas isoladas foi maior. A concentração de lêvedo e a competição pelo alimento e hospedeiros podem ter influenciado os dados obtidos. Também foi observada a receptividade sexual das fêmeas alimentadas nessas dietas e com diferentes cargas de ovos. Fêmeas alimentadas nas dietas com maior concentração de lêvedo foram mais receptivas do que as demais. Quando alimentadas no mesmo tipo de dieta aquelas fêmeas com maior carga de ovos foram mais receptivas sexualmente. Esses dados sugerem que a ingestão de uma fonte protéica é necessária para aumentar a

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Os insetos, de modo geral, necessitam de uma dieta que lhes ofereçam carboidratos, proteínas, vitaminas do complexo B e alguns sais minerais; esses nutrientes são encontrados na natureza e desempenham uma série de funções para os organismos como fonte de energia, manutenção e construção dos tecidos, precursores de hormônios, entre outras (Dadd, 1985).

As necessidades nutricionais de uma espécie de inseto não são constantes e variam dependendo da fase de desenvolvimento, da fase reprodutiva, da fase de crescimento do imaturo e também de fatores abióticos como temperatura, umidade, fotoperíodo (Zucoloto, 2000).

As proteínas têm funções importantes para o crescimento e manutenção da vida dos seres vivos. São importantes na construção e manutenção de tecidos, formação de enzimas, nucleotídeos e quitina, e podem servir como fonte energética (Dadd, 1985; Zucoloto, 2000) As proteínas têm um importante papel nos processos metabólicos; são o constituinte alimentar que mais influencia no crescimento, fecundidade e longevidade de diversos insetos (ver Dadd, 1985).

Alguns trabalhos mostram que a ingestão de fontes protéicas aumenta a longevidade dos insetos inclusive espécies de moscas-das-frutas (Souza et al., 1978; Jones, 1988; Ferraz, 1994; Simpson et al., 1994; Cangussu & Zucoloto, 1997). Na fase imatura, a proteína é extremamente importante para o crescimento, sobrevivência e estocagem de material nutritivo para a fase pupal. Já na fase adulta, a ingestão de proteína interfere na produção de ovos (Braga & Zucoloto, 1981; Tsitsipis, 1989).

Os insetos da família Tephritidae (Diptera) são conhecidos por infestarem inúmeras espécies de frutos em todo o mundo. Dentre as espécies dessa família

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pode-___________________________________________________________Introdução

seja, as fêmeas necessitam de uma fonte de proteína como alimento na fase adulta para que maturem os oócitos (Braga & Zucoloto, 1981). Além disso, a concentração de proteína na dieta influencia a quantidade de oócitos maduros produzidos durante a vida adulta desses insetos (Cresoni-Pereira & Zucoloto, 2001; Medeiros & Zucoloto, 2006). Os principais alimentos utilizados pelos adultos de moscas-das-frutas na natureza são sucos de frutos, secreções glandulares extraflorais, néctar, pólen, fezes de pássaros, honeydew e bactérias (Bateman, 1972; Robacker, 1991; Manrakhan & Luz, 2006).

Os sucos de fruta são ricos em açúcares e pobres em proteína, já o honeydew possui 80% de açúcares e poucos aminoácidos; no campo, o honeydew também serve como um substrato para o crescimento de bactérias que podem ser usadas pelas moscas como fonte de proteína (Manrakhan & Luz, 2006). As fezes de pássaros contêm pouquíssima quantidade de açúcar, mas apresentam formas digeríveis e indigeríveis de proteínas (Manrakhan & Luz, 2006).

Fletcher (1987) sugeriu que tefritídeos frugívoros inoculam a superfície do fruto, regurgitando alimento em folhas e frutos, e utilizam as colônias de bactérias que proliferam no regurgitado como fonte protéica.

As fêmeas das moscas-das-frutas do gênero Anastrepha depositam seus ovos no epicarpo e mesocarpo dos frutos, as larvas se desenvolvem dentro do fruto alimentando-se de sua polpa (Aluja et al., 2000). Alguns autores discutem uma complementação da alimentação das larvas pela ingestão de bactérias que proliferam devido ao amadurecimento do fruto e de larvas mortas ou de ovos que não eclodiram dentro dos frutos, uma vez que o alimento larval dessas espécies é pobre em

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Medeiros, 2004). Outros autores discutem a existência de organismos simbiontes que supririam esses aminoácidos e, talvez, outros nutrientes (Hendrichs et al., 1993).

Após a alimentação e crescimento dentro do hospedeiro, as larvas saem do fruto, principalmente nos horários de menor temperatura, evitando, com isso, a dessecação, e entram na fase de pupa dentro do solo (Aluja et al., 2000). A saída do fruto é estimulada pela temperatura ambiente, chuvas e pelo impacto do fruto no chão (Aluja et al., 2000). A fase de pupa é ocorre no solo e após o período de desenvolvimento pupal, característico para cada espécie de Anastrepha o adulto emerge.

A vitelogênese em insetos - acúmulo de vitelo no oócito na passagem através do vitelarium (Bownes, 1982) - é marcada pela síntese, no corpo gorduroso, de uma classe de proteínas conhecidas como vitelogeninas que são transportadas através da hemolinfa para o desenvolvimento dos oócitos nos ovaríolos (Papaj, 2000). Vários fatores como temperatura, umidade, fotoperíodo, acasalamento, contexto social e dieta influenciam o desenvolvimento ovariano nos insetos, através de um elaborado sistema de controle hormonal e neural (Papaj, 2000).

O acasalamento, a disponibilidade de hospedeiros e a nutrição influenciam processos fisiológicos nos insetos que desencadeiam a maturação dos oócitos (Bownes, 1982, Yin et al., 1999, Moobola & Cupp, 1978, Carsten & Papaj, 2005). A nutrição é o principal fator envolvido na produção de ovos na maioria das espécies de insetos e está relacionada também com a longevidade e receptividade sexual (Barton Browne et al., 1976; Medeiros & Zucoloto, 2006).

Em alguns insetos, a ingestão de proteínas é necessária para ativar o sistema endócrino relacionado a produção de ovos. A falta de alimentação em proteína em

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pelo controle hormonal exercido pelo Hormônio Juvenil, que induz a síntese de vitelo pelo corpo gorduroso de algumas espécies (Wheeler, 1996). Já em dípteros superiores, não só o Hormônio Juvenil, mas os Ecdisteróides têm importante papel na regulação da produção de ovos (Wheeler, 1996). Fêmeas de Drosophyla melanogaster privadas de alimento desde a eclosão têm menor taxa de transcrição de genes de peptídeos de vitelo, além disso, a falta de alimento parece afetar diretamente a absorção de vitelo pelos ovários (Bownes et al., 1988).

Em Phormia regina, há a necessidade de uma alimentação protéica para a ativação de um sistema endócrino cefálico que ativa a síntese de Ecdisteróides pelos ovários e de Hormônio Juvenil pela corpora allata (Yin et al., 1994). A biossíntese de vitelogenina é regulada pela Ecdisona (Yin et al., 1990) e a tomada de vitelogenina pelos oócitos pelo Hormônio Juvenil (Yin et al, 1989). Os resultados do trabalho de Yin, et al., (1994), demonstraram que um peptídeo do intestino médio em moscas alimentadas com proteína é necessário para a ativação de células secretoras do cérebro, que então ativam uma cascata neuroendócrina para ocorrer a ovogênese. A neurossecreção do cérebro, allatotropina, induz a corpora allata (glândula secretora de Hormônio Juvenil) a produzir Hormônio Juvenil que é requerido pelos ovários previtelogênicos e o corpo gorduroso para tornarem-se competentes. Outra neurossecreção do cérebro, Hormônio Neurosecretor de Desenvolvimento dos Ovos, estimula os ovários a produzirem Ecdisteróides, que estimula os corpos gordurosos a produzir a vitelogenina (Thomsen & Thomsen, 1978). Em resposta ao Hormônio Juvenil, os folículos dos ovários competentes desenvolvem patência (espaços intercelulares que permitem acesso da hemolinfa para a superfície dos oócitos) e

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A receptividade sexual é um comportamento da fêmea que permite ou ajuda o macho a realizar a cópula e fertilizar seus ovos; as fêmeas dão sinais ritualizados e estereotipados de rejeição ao acasalamento e esses sinais podem envolver movimentos das asas, pernas e ovipositor, além disso, podem agir violentamente contra as investidas do macho (Ringo, 1996). A fêmea receptiva responde aos sinais do macho, expondo a vagina ou abrindo os elementos da vagina, estridulando, vibrando ou abanando as asas ou colocando ovos (Ringo, 1996). A receptividade pode ser estimulada ou inibida pela dieta, estágio de desenvolvimento ovariano ou título endógeno de hormônios (Ringo, 1996).

Em mosca doméstica (Musca domestica), fêmeas que tiveram a corpora allata retirada não permitiram que o ovipositor fosse tocado pelo clásper do macho (Adams & Hintz, 1969 – artigo 119).

Alguns trabalhos reportam a influência da alimentação (Chapman et al., 1994; Barton Browne et al., 1976; Spielman et al., 1969; Cangussu & Zucoloto, 1997), da carga de ovos (definida como o número de oócitos maduros nos ovários das fêmeas) (Gwynne, 1984; Carsten & Papaj, 2005) e do estágio de desenvolvimento dos oócitos na receptividade sexual de alguns insetos (Adams & Hintz, 1969; Yin et al., 1999). Em dípteros superiores, o acasalamento tem sido correlacionado com o estágio de desenvolvimento ovariano em M. domestica, Lucilia cuprina, Phormia regina e Calliphora vomitora (Adams & Hintz, 1969; Barton Bowne et al., 1976; Crystal, 1983; Trabalon et al., 1987; Ringo, 1996).

Cangussu & Zucoloto (1997), trabalhando com Ceratitis capitata, observaram que a privação de proteína para as fêmeas adultas dessa espécie acarreta uma diferença na aceitabilidade à cópula com os machos: as fêmeas privadas de

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___________________________________________________________Introdução

Sendo que o número de cópulas entre fêmeas alimentadas somente com carboidrato diferiu significativamente das fêmeas alimentadas com proteína, sendo maior nas fêmeas que ingeriram a dieta com proteína (Cohen & Voet, 2002).

Fêmeas de L. cuprina alimentadas com baixas concentrações de proteína ou somente com sacarose mostraram comportamento de rejeição às tentativas de cópula pelos machos; já as fêmeas alimentadas com proteínas foram mais receptivas sexualmente, sendo o nível de receptividade relacionado à quantidade de proteína no alimento (Barton Browne et al., 1976).

Carsten & Papaj (2005) observaram que as cópulas em Rhagoletis juglandis foram mais freqüentes quando as fêmeas possuíam grande carga de ovos. Em Anabrus simplex, Gwynne (1984) observou que fêmeas maiores possuem mais ovos em seus ovários do que fêmeas menores; sendo que em ambientes onde há uma alta densidade populacional de indivíduos dessa espécie, as fêmeas maiores ganham a competição pelos machos porque produzem mais ovos e os retém nos ovários. Dessa forma, nesse ambiente, há uma pressão seletiva para o aumento do tamanho do corpo das fêmeas desta espécie.

O estágio de desenvolvimento ovariano de algumas espécies de insetos tem relação com a receptividade sexual como em P. regina nas quais apenas 10,7% das fêmeas com folículos pré-vitelogênicos (estágios de 1 a 3) foram inseminadas em 18 horas de observação; entretanto, a taxa de inseminação das fêmeas aumentou drasticamente de 25% para 84% para as fêmeas com os estágios 4 e 10 de desenvolvimento dos oócitos, respectivamente (Yin et al., 1999). Fêmeas de M. domestica raramente acasalam quando possuem folículos nos estágios de 3 e 4, mas

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Há dois tipos de comportamento sexual em moscas-das-frutas. Os machos formam agregados denominados “leks” na folhagem que pode ser ou não na própria planta hospedeira; uma vez agregados, os machos apresentam um comportamento elaborado, exibindo vibração das asas, quando ocorre a emissão de sons, simultaneamente à liberação de feromônios. As fêmeas, atraídas para esses agregados, aparentemente selecionam, o parceiro para a cópula, de acordo com o tamanho, dando preferência aos maiores machos (Sivisnki & Burk, 1989). Essa estratégia é comum em espécies de moscas-das-frutas tropicais e sub-tropicais, com amplo círculo de hospedeiros e mais de uma geração anual (Sugayama & Malavasi, 2000).

Outro tipo de comportamento sexual observado em moscas-das-frutas é o encontro entre machos e fêmeas no fruto, onde o macho estabeleceu o território; ao avistar uma fêmea em seu território, ele força a cópula (Malavasi et al., 1983; Sivinski & Burk, 1989; Selivosn, 1991). Essa estratégia é observada em espécies monófagas e univoltínas, em geral, de clima temperado, onde a fenologia do hospedeiro é mais previsível. (Sugayama & Malavasi, 2000).

O comportamento reprodutivo dos machos de A. obliqua geralmente inclui a formação de agregados em territórios (leks), a emissão de feromônios para a atração de outros machos e das fêmeas, deposição de feromônio nas folhas, emissão de sinais acústicos com o batimento das asas, e a extensão das peças bucais (Sivinski et al., 1984; Sivinski & Burk, 1986); as fêmeas escolhem os machos nos leks.

Na procura por alimento e parceiros sexuais, tefritídeos frugívoros respondem a fatores visuais e olfativos do alimento, de feromônios produzidos pelos machos e, como verificado em A. suspensa, pelo som produzido pelo batimento das

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O som de chamamento dos machos é uma característica importante do comportamento de côrte e certas propriedades do som produzido estão correlacionadas com o tamanho dos machos, sendo uma característica que sofre pressão de seleção sexual por parte da fêmea (Burk & Webb, 1983).

As fêmeas de A. suspensa usam características do som produzido pelos machos para selecionar o parceiro (Burk & Webb, 1983). Trujillo (1998) observou que 96% das fêmeas de A. obliqua acasala apenas uma vez, independentemente da dieta de ambos os sexos.

Uma vez fertilizada, a fêmea de A. obliqua armazena os espermatozóides em três espermatecas e está apta a ovipositar. A seleção do local para a oviposição para um inseto polífago pode ser entendida como uma forma de investimento maternal em que as fêmeas gastam tempo e energia para selecionar locais em que seja mais provável a sobrevivência da prole. A seleção do substrato de oviposição é uma etapa crítica do ciclo de vida dos tefritídeos frugívoros, já que as espécies de plantas podem variar com relação a sua adequação como alimento (Díaz-Fleischer et al., 2000). O fruto hospedeiro influencia o desenvolvimento dos estágios imaturos e também a sobrevivência e fecundidade dos adultos (Leyva, et al., 1991; Zucoloto, 1993; Fernades-da-Silva & Zucoloto, 1997; Sugayama et al., 1998).

A localização da planta hospedeira a longa distância é um processo que engloba várias etapas. A primeira refere-se a localização do habitat do hospedeiro e os estímulos olfativos são essenciais nesta fase. Compostos voláteis das plantas hospedeiras podem desencadear um vôo direcionado em fêmeas que estão forrageando por sítios de oviposição (Sugayama & Malavasi, 2000). Fêmeas

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Propriedades visuais da planta hospedeira têm um papel importante na sua localização por essas moscas-das-frutas, como forma, cor e tamanho (Prokopy & Roitberg, 1984).

O comportamento de oviposição dos insetos responde a variação na qualidade e abundância do hospedeiro; depende do estado fisiológico do indivíduo, incluindo o estágio de desenvolvimento ovariano (Papaj, 2000). Os sinais que determinam se o local é aceitável para a oviposição incluem compostos químicos da superfície do fruto, características físicas exteriores como forma, tamanho e cor; composição química e estrutura física do interior do fruto (Katsoyannos, 1989; Fletcher & Prokopy, 1991).

Uma vez que a fêmea aceita um local para oviposição e começa a introdução do ovipositor e, compostos presentes no fruto, tais como, glicose, frutose, cloreto de sódio e cloreto de cálcio podem estimular ou inibir a deposição dos ovos, dependendo da concentração (Tsiropoulos & Hagen, 1979; Girolami el al., 1986; Eismann & Rice, 1985). Após a postura dos ovos dentro do hospedeiro, a fêmea percorre a superfície do fruto com o acúleo protraído. Durante esta etapa ela deposita um Feromônio Marcador do Hospedeiro que serve para sinalizar a outras fêmeas que o hospedeiro já foi utilizado por uma fêmea para a postura dos ovos.

É essencial conhecer os fatores comportamentais e fisiológicos envolvidos na alimentação, crescimento, reprodução, movimento e sobrevivência dos insetos com importância econômica (Slansky, 1982). Estudos sobre dinâmica populacional, nutrição e fisiologia envolvida em processos comportamentais dos insetos podem contribuir para o entendimento desses fatores e auxiliar em metodologias de controle quando espécies de importância econômica são tratadas.

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____________________________________________________________Objetivos

Os objetivos iniciais deste trabalho foram determinar o padrão de oviposição diário das fêmeas de A. obliqua levando em consideração a concentração de proteína na alimentação dos adultos e a densidade de indivíduos durante os experimentos.Em um segundo momento objetivou-se analisar a influência da alimentação protéica dos adultos em dietas artificiais e da carga de ovos na receptividade sexual das fêmeas adultas selvagens de A. obliqua

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____________________________________________________Material e Métodos

Os adultos selvagens de A. obliqua foram obtidos de pupas coletadas de frutos de cajá-manga (Spondias lutea) infestados, coletados na Fundação Educandário Cel Quito Junqueira em Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. As coletas foram realizadas entre os meses de fevereiro e junho e os experimentos descritos abaixo entre os meses de março e novembro de 2004, 2005, 2006 e 2007.

Os frutos foram colocados sobre 5 cm de areia limpa (substrato para pupação), local em que as larvas que saíram dos frutos se alojaram e entraram em fase de pupa. As bacias com os frutos foram colocadas ao ar livre, em um barracão coberto com telhas e aberto nas laterais. Depois da secagem dos frutos e fim do desenvolvimento das larvas, as pupas que estavam alojadas no substrato foram coletadas e colocadas em caixas de acrílico (11 x 11 x 3 cm) com areia esterilizada. Tais caixas com as pupas foram mantidas em estufas com temperatura controlada a aproximadamente 29±1o C e 70 - 80% de umidade relativa até a emergência dos

adultos.

Este trabalho foi desenvolvido em duas etapas subdivididas em fases conforme descrito abaixo:

A primeira etapa consistiu na determinação do padrão diário de oviposição das fêmeas de A. obliqua alimentadas em dietas artificiais com diferentes concentrações de lêvedo de cerveja.

A segunda etapa teve como objetivo determinar a receptividade sexual das fêmeas dessa espécie conforme a dieta que receberam na vida adulta e com relação também a quantidade de oócitos maduros presentes nos ovários como conseqüência da alimentação em dietas com uma fonte protéica (lêvedo de cerveja).

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Padrão diário de oviposição

Nesta primeira etapa, o padrão diário de oviposição das fêmeas de A. obliqua foi determinado quando alimentadas em dietas artificiais diferentes e sob duas condições: fêmeas mantidas em grupos ou apenas uma fêmea isoladamente, em cada caixa acrílica de teste. Todas as fêmeas foram acompanhadas de machos da mesma espécie e com a mesma idade.

Padrão de oviposição: fêmeas em grupos

Neste experimento, dez fêmeas e três machos, recém emergidos, foram colocados em uma caixa acrílica (11 x 11 x 6 cm) com quatro orifícios laterais (1 cm de diâmetro) através dos quais as dietas e água foram oferecidas às moscas. As dietas sólidas foram oferecidas em pedaços de, aproximadamente, 400 mg presas em um alfinete entomológico espetado em uma rolha de cortiça. A água foi oferecida em tubos de ensaio, tampados com algodão. As caixas acrílicas foram mantidas em estufa com temperatura constante de 29±1 ºC, Umidade Relativa entre 70 e 80% e iluminação artificial por 12 horas (7:00 – 19:00h). Cada caixa de acrílico com as dez fêmeas e três machos foi considerada uma repetição.

As dietas artificiais utilizadas possuíam a seguinte constituição básica:

•Sacarose (Mallinckrodt-USA) 11,0 g

•Ágar (Difco) 2,5 g

•Nipagin (anti-fúngico) (Merck) 1,5 ml

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Foram formados três grupos com 10 repetições cada. Um dos grupos recebeu a dieta ↑Lev (alta concentração de lêvedo), outro grupo a dieta ↓Lev (baixa concentração de lêvedo) e o terceiro grupo uma dieta apenas com sacarose (Sac). A dieta ↑Lev foi constituída da dieta básica com a adição de 6,5 g de lêvedo de cerveja. A dieta ↓Lev foi constituída da dieta básica, porém com 2,0 g de lêvedo. Na dieta Sac não foi adicionado lêvedo de cerveja.

Segundo Franco (1982), a concentração de carboidratos dos frutos hospedeiros de A. obliqua é de, aproximadamente 11 %, e por isso, foi utilizada esta concentração de sacarose para a confecção das dietas. Seis gramas e meio de lêvedo de cerveja para cada 100 ml de dieta foi considerada a melhor concentração de lêvedo para a alimentação dos adultos de A. obliqua (Braga & Zucoloto,1981). As dietas foram preparadas em aquecimento, autoclavadas, distribuídas em placas de Petri (50 x 12mm) e armazenadas sob refrigeração. O lêvedo de cerveja utilizado foi sempre do mesmo lote para todos os experimentos, para que a qualidade e quantidade de proteínas fossem controladas, pois, Cangussu & Zucoloto (1995) sugeriram que lotes diferentes de lêvedo de cerveja podem ter qualidades diferentes de proteína.

Desde o décimo quinto dia de vida adulta até a morte de 80% das fêmeas de cada caixa experimental, dois substratos artificiais com formato oval (4,0 x 2,5 x 1 cm) constituídos por agar (2,5 g), lêvedo de cerveja (2,0 g), sacarose (11 g), água destilada (100 ml) e encapados com Parafilm, foram introduzidos nas caixas e trocados a cada 24 horas. Após este período, os ovos foram contados sob estereomicroscópio com a ajuda de uma agulha de seringa de insulina. O número de ovos/fêmea/dia foi determinado pela divisão do número de ovos retirados dos

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determinada pelo período de tempo desde o início do experimento até a morte de 80% das fêmeas presentes nas caixas de acrílico.

Padrão de oviposição: fêmeas isoladas

Esta fase foi realizada com o intuito de esclarecer algumas dúvidas que surgiram na determinação do padrão de oviposição das fêmeas em grupos. Dessa forma, apenas um casal em cada caixa foi utilizado para os testes e, com isso, foi possível observar o padrão de oviposição dessa espécie com mais detalhes.

O mesmo procedimento para a determinação do padrão de oviposição das fêmeas em grupo foi utilizado nesta fase. Entretanto, apenas um macho e uma fêmea foram mantidos nas caixas acrílicas (11 x 11 x 3 cm) e somente um substrato de oviposição ficou a disposição das fêmeas. Os substratos tiveram a mesma constituição dos substratos utilizados para os testes com as fêmeas em grupos e foram colocados nas caixas desde o quinto dia após a emergência dos adultos.

Como as fêmeas de A. obliqua alimentadas na dieta de sacarose não produziram e ovipositaram nenhum ovo durante os testes com as fêmeas em grupo, o padrão de oviposição das fêmeas isoladas e alimentadas nessa dieta não foi determinado.

Foram montadas 12 repetições para cada dieta (↓Lev e ↑Lev). Os substratos foram trocados diariamente e os ovos contados como descrito acima. A longevidade das fêmeas deste experimento foi determinada pelo período de tempo desde o início dos testes até a morte de 80% das fêmeas dos tratamentos.

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Receptividade sexual

Nesta segunda etapa do trabalho, o objetivo foi determinar se ocorre alteração na receptividade sexual das fêmeas de A. obliqua conforme a concentração de lêvedo de cerveja na dieta consumida na vida adulta e também se a quantidade de ovos, como conseqüência da alimentação, interfere na receptividade ao acasalamento.

Esta etapa consistiu da observação do comportamento de acasalamento das fêmeas e comparação da receptividade entre fêmeas alimentadas em dietas com diferentes concentrações de lêvedo de cerveja e de fêmeas com diferentes cargas de ovos.

Quantidade de fêmeas acasaladas

A quantidade de fêmeas fecundadas foi determinada, com o intuito de verificar se todas elas, alimentadas em diferentes dietas, são capazes de acasalar quando colocadas junto com machos por um período de 15 dias. Dez fêmeas foram colocadas em uma caixa de acrílico, constituindo uma repetição, e receberam um dos três tipos de dieta testadas neste trabalho (↓Lev, ↑Lev ou Sac) durante 15 dias (seis repetições por dieta). No décimo sexto dia de vida adulta, três machos foram introduzidos em cada caixa. Esses machos foram alimentados com a dieta ↑Lev e possuíam a mesma idade das fêmeas. Após 15 dias (30 dias de idade dos indivíduos testados), todas as fêmeas vivas nas caixas dos grupos estudados foram dissecadas e verificou-se a presença de espermatozóides nas espermatecas para determinar a quantidade de fêmeas acasaladas durante o experimento. Para isso, as três espermatecas foram retiradas, com o auxílio de uma pinça de ponta fina sob

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cloreto de sódio), esmagadas com lamínula e observadas ao microscópio (aumento de 400x).

Os experimentos que testaram a receptividade sexual das fêmeas de A. obliqua alimentadas em diferentes dietas artificiais foram realizados sob 2 condições. Uma delas em ambiente de laboratório com temperatura e umidade controladas e a segunda em gaiolas mantidas ao ar livre, com variação nas condições abióticas.

Condição de laboratório

Nesta fase, os testes foram realizados em caixas acrílicas (11 x 11 x 3 cm) em laboratório com temperatura (29±1ºC) e umidade relativa (70 - 80%) controladas.

Experimento Lab 1: Receptividade sexual x condição nutricional das fêmeas (laboratório)

Foram realizados testes de receptividade sexual das fêmeas de A. obliqua alimentadas em diferentes dietas artificiais. Um grupo de fêmeas recebeu a dieta ↑Lev; outro grupo recebeu dieta ↓Lev e o terceiro grupo dieta Sac por 15 dias. Durante este período ficaram separadas dos machos. No décimo sexto dia após a emergência, uma fêmea alimentada na deita ↑Lev e outra alimentada na dieta ↓Lev tiveram o tórax pintado com tinta atóxica em duas cores diferentes, dependendo do grupo do qual foram provenientes. Essas fêmeas foram colocadas juntamente com um macho da mesma idade, previamente alimentado com a dieta ↑Lev e mantido nas mesmas condições abióticas das fêmeas, como descrito anteriormente. Outro grupo

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destas caixas entre 9:00 e 18:00 h. Assim que um casal em cópula era observado, foi retirado da caixa e o grupo da fêmea que estava acasalando foi determinado.

As caixas nas quais não foram observadas cópulas durante o período de observação foram descartadas e novos grupos foram montados e observados até que se obtivessem 10 cópulas para cada uma das combinações das dietas (Dieta ↓Lev x Dieta ↑Lev ou Dieta Sac x Dieta↑Lev).

Experimento Lab 2: Receptividade sexual x carga de ovos das fêmeas (laboratório)

O objetivo deste experimento foi analisar se a carga de ovos das fêmeas influencia a receptividade sexual quando elas foram alimentadas em dieta artificial (Dieta ↑Lev ).

Todos os machos e as fêmeas utilizadas nestes testes permaneceram por 15 dias em condições abióticas controladas, como descrito acima e durante esse período permaneceram separados e foram alimentados na dieta ↑Lev. Três fêmeas foram colocadas juntamente com um macho da mesma idade em uma caixa acrílica. Entre 9:00 e 18:00 h, as moscas foram observadas. Quando o macho iniciou a cópula com uma das fêmeas, o casal foi retirado da caixa e colocado em um ependorf. As outras duas fêmeas também foram colocadas em outro ependorf e todos esses indivíduos, imediatamente, foram congelados para evitar que a cópula estimulasse a maturação dos oócitos. Todas as fêmeas foram dissecadas para determinar a carga de ovos através da contagem sob estereomicroscópio.

O número de oócitos maduros das fêmeas acasaladas e das não acasaladas foi comparado por Mann-Whitney Rank Sum Test (α<0,05). Para determinar se as

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Para determinar se o tamanho da fêmea é um fator associado ao maior número de ovos e ao acasalamento, a asa direita de cada fêmea deste experimento foi retirada, colada em papel de transparência e com a ajuda de uma câmera de vídeo acoplada a um estereomicroscópio, gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Ronaldo Zucchi na Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP, foi realizada a medida da nervura m-cu das asas através do programa Sigma Scan Pro Version 4.0.

Figura 1: Asa de Anastrepha mostrando nervura m-cu que foi utilizada para determinação do tamanho dos adultos (Figura de Jamil Tannús Jr., In: Zucchi, 2000).

As caixas nas quais não foram observadas cópulas durante o período de observação foram descartadas e novos grupos foram montados e observados até que se obtivessem 10 cópulas.

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Condição de campo

Nesta segunda parte de testes de receptividade sexual das fêmeas desta espécie de mosca-das-frutas, os experimentos foram realizados em gaiolas (20 x 20 x 20 cm) recobertas com filó. Durante os testes as moscas tiveram acesso a uma fonte de água e dieta sólida de sacarose (dieta Sac) para evitar a morte dos insetos. Um pequeno ramo de pitangueira (Eugenia uniflora L.) foi colocado em um substrato com areia dentro das gaiolas para que os machos fizessem o cortejo às fêmeas. As gaiolas foram mantidas em um pequeno pomar, com árvores de pitanga, localizado no Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras no Campus da Universidade de São Paulo em Ribeirão Preto, Estado de São Paulo, Brasil. A Temperatura (ºC) e Umidade Relativa (%) foram anotadas a cada hora durante o período de observação (entre 9:00 e 18:00h).

Experimento campo 1: Receptividade sexual x condição nutricional das fêmeas (Gaiolas)

Este experimento foi realizado da mesma maneira que o experimento Lab 1 (Receptividade sexual x condição nutricional das fêmeas em laboratório), entretanto, três fêmeas de cada tratamento (Dieta ↓Lev x Dieta ↑Lev ou Dieta Sac x Dieta↑Lev) e três machos alimentados na dieta ↑Lev foram colocados em cada gaiola, conforme descrito acima. O número de indivíduos de cada tratamento foi aumentado, comparado ao experimento Lab1 por causa do tamanho das gaiolas, aumentando, dessa forma, a taxa de encontro entre os indivíduos e a probabilidade de cópulas. Os machos e fêmeas tinham 15 dias de idade.

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Quando um casal foi observado em copula, foi retirado e o grupo de origem da fêmea determinado. Esta gaiola foi descartada para evitar a realização de cópulas com proporções diferentes de fêmeas de cada tratamento.

As gaiolas nas quais não foram observadas cópulas durante o período de observação foram descartadas e novas repetições foram montadas e observadas até que se obtivessem 10 cópulas para cada uma das combinações dos grupos (Dieta ↓Lev x Dieta ↑Lev ou Dieta Sac x Dieta↑Lev).

Experimento campo 2: Receptividade sexual x carga de ovos das fêmeas (Gaiolas)

Este experimento foi realizado da mesma maneira que o experimento Lab 2 (Receptividade sexual x carga de ovos das fêmeas em laboratório), entretanto os testes foram feitos em gaiolas conforme descrito acima. A quantidade de indivíduos nas gaiolas foi de três fêmeas alimentadas na dieta ↑Lev e dois machos alimentados na mesma dieta, todos com 15 dias de idade.

Quando o macho iniciou a cópula com uma das fêmeas, o casal foi retirado da caixa e colocado em um ependorf. As outras duas fêmeas também foram colocadas em outro ependorf e todos esses indivíduos, imediatamente, foram congelados para evitar que a cópula estimulasse a maturação dos oócitos. Todas as fêmeas foram dissecadas para determinar a carga de ovos através da contagem sob estereomicroscópio.

As gaiolas nas quais não foram observadas cópulas durante o período de observação foram descartadas e novas repetições foram montadas e observadas até

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___________________________________________________________Resultados

Padrão de oviposição das fêmeas mantidas em grupos

A quantidade total de ovos produzidos pelas fêmeas de A. obliqua alimentadas na dieta ↓Lev foi de 23,0±20,8 ovos/fêmea. As fêmeas alimentadas com a dieta Sac não produziram ovos durante todo o período de teste que foi de apenas 50 dias, uma vez que mais de 80% das fêmeas já haviam morrido após este período.

Quando as fêmeas foram alimentadas na dieta ↓Lev, pode-se observar (figura 2) que a quantidade de ovos ovipositados/fêmea/dia variou entre 0 e 0,8. As fêmeas já iniciaram a oviposição 15 dias após a emergência que estendeu-se por até 112 dias. O padrão de oviposição deste grupo foi esparso, com vários picos de oviposição seguidos de 3 a 5 dias de diminuição na quantidade de ovos. No 52° dia, por exemplo, ocorreu um pico de oviposição e por 5 dias, subseqüentes, a quantidade de ovos ovipositados diminuiu para a metade e, até mesmo, no dia logo após o pico de oviposição, nenhum ovo foi verificado. Este tipo de particularidade ocorreu várias vezes neste grupo. Somente, a partir do 85o dia, o efeito da idade pode ser observado

no padrão de oviposição, já que após esta idade, ocorreram vários dias nos quais não houve postura de ovos.

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___________________________________________________________Resultados

As fêmeas alimentadas na dieta ↑Lev produziram, em média, 310,3±107,7 ovos ao longo de toda a vida (figura 3). A quantidade de ovos ovipositados variou entre zero (em somente 2 dias) e 7 ovos/fêmea/dia. Com 15 dias após a emergência, as fêmeas deste grupo já produziam ovos, com uma média de 1 ovo/fêmea. A média geral foi de 4 ovos/fêmea/dia. A oviposição foi observada até o 119º após a emergência do adulto.

Houve uma menor quantidade de picos de oviposição do que os observados na figura 2. O padrão de oviposição foi mais homogêneo ao longo da vida das moscas. Apenas no fim do período de oviposição, aproximadamente próximo ao 90° dia, ocorreram picos mais esparsos, podendo ser uma conseqüência da idade avançada das moscas. Entretanto, altos picos de oviposição foram observados neste período seguidos por dias com poucos ovos/fêmea. Até o 45º dia houve uma leve oscilação no número de ovos ovipositados entre dias consecutivos, estabilizando-se em seguida. Somente após 110° dia ocorreram períodos sem nenhuma oviposição (113° e 114° dias, somente).

Em resumo, fêmeas de A. obliqua alimentadas com 6,5 g de lêvedo ovipositaram mais ovos/dia, o período de oviposição estendeu-se por mais tempo e a distribuição dos ovos ao longo do tempo foi mais homogênia do que as fêmeas alimentadas com 2,0 g de lêvedo.

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___________________________________________________________Resultados

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___________________________________________________________Resultados

Padrão de oviposição: fêmeas isoladas

As fêmeas isoladas alimentadas na dieta ↓Lev produziram em média 1,0±0,85 ovos/fêmea/dia, num total de 129±116 ovos/fêmea ao longo de toda a vida. A maior parte dos ovos foi ovipositada até os 90 dias de vida adulta. Após este período, houve uma diminuição do número de ovos ovipositados, possivelmente decorrente da idade avançada das fêmeas. O número médio máximo de ovos/fêmea/dia foi de 3,5 ovos apenas. Após 80 a 90 dias de idade das fêmeas, este número médio não ultrapassou 2,5 ovos, sendo a oviposição neste período esparsa, com picos de oviposição diários seguidos por períodos de baixo número de ovos ovipositados (figura 4).

Até 80° dia de vida, uma média de 50 a 60% das fêmeas foi responsável pelo número de ovos ovipositados, após este período, a freqüência de fêmeas realizando a oviposição caiu para menos de 35%, provavelmente devido a uma diminuição da capacidade reprodutiva dessas fêmeas decorrente da idade avançada (figura 6).

O número de ovos/fêmea/dia não ultrapassou 4 ovos. Durante a maior parte (mais de 90%) do período de oviposição as fêmeas ovipositaram entre 0 e 2 ovos. Em 30 % do período observado, as fêmeas não ovipositaram nenhum ovo (figura 7).

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___________________________________________________________Resultados

As fêmeas solitárias alimentadas na dieta ↑Lev ovipositaram em média 6,7±3,0 ovos/fêmea/dia, totalizando 796,8±610,2 ovos ao longo de todo o período de oviposição observado (161 dias).

Até, aproximadamente 105 dias de vida adulta, o padrão de oviposição parece ser mais homogêneo. Após este período, o número de ovos/fêmea/dia não ultrapassou 10 ovos, além disso, possuiu uma heterogeneidade nos picos de oviposição apresentando dias com uma diminuição considerável do número de ovos/fêmea/dia ovipositados. Novamente, isso pode ser uma conseqüência da idade avançada das fêmeas, que pode estar prejudicando a capacidade reprodutiva dessas moscas testadas (figura 5).

No início do período de oviposição, até 90% das fêmeas estavam ovipositando durante o período dos testes, alcançando em alguns dias 100%. Em torno de 70% das fêmeas ovipositaram até o 60° dia de idade adulta, entretanto, este número diminuiu para, aproximadamente, 50%, sendo menor ainda após 130 dias de vida adulta (figura 6).

Em menos de 5% de todo período de oviposição observado as fêmeas alimentadas na dieta ↑Lev (isoladas) não ovipositaram. Em, aproximadamente 40% do período amostral houve a oviposição de mais de 8 ovos/fêmea/dia. Em 10% do período as fêmeas ovipositaram mais de 10 ovos/fêmea/dia (figura 7).

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___________________________________________________________Resultados

O número de ovos/fêmea/dia ovipositados pelas fêmeas isoladas foi muito maior do que o das fêmeas em grupos, para ambas dietas testadas. O número total de ovos ovipositados durante todo o período de oviposição não foi diferente entre as fêmeas em grupo e solitárias para as duas dietas testadas, pois a variação (Desvio padrão) foi muito alta. Entretanto, a quantidade média de ovos foi bastante diferente entre esses tratamentos.

Quando alimentadas na dieta ↓Lev, as fêmeas solitárias ovipositaram, em média, 5,6 vezes mais ovos do que as fêmeas em grupo. Além disso, a produção diária das fêmeas isoladas esteve entre 0 e 3,5 ovos/fêmea/dia e das fêmeas em grupo 0 e 0,8 ovos/fêmea/dia.

A diferença na postura de ovos entre as fêmeas alimentadas na dieta ↑Lev também foi significativa (fêmeas em grupos: 310,3±107,7 ovos/fêmea; e fêmeas isoladas 796,8±610,2 ovos/fêmea). O número de ovos/fêmea/dia também variou entre os tratamentos sendo 0 a 7 ovos/fêmea/dia para as fêmeas em grupo e 2 a 15 ovos/fêmea para as fêmeas isoladas.

A longevidade foi outro parâmetro que variou bastante entre os tratamentos. Quando as fêmeas de A. obliqua foram alimentadas na dieta ↓Lev a longevidade média das fêmeas em grupo foi de 112 dias e das fêmeas isoladas 158 dias. O mesmo aconteceu com as fêmeas alimentadas na dieta ↑Lev (fêmeas em grupo 118 dias e fêmeas solitárias 161 dias). A concentração de lêvedo de cerveja não teve influência na longevidade das fêmeas de A. obliqua quando comparadas dentro de um mesmo tratamento (tabela 1).

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___________________________________________________________Resultados

Tabela 1: Variação no número de ovos/fêmea/dia, total de ovos produzidos e longevidade das fêmeas de A. obliqua alimentadas nas dietas ↓Lev e ↑Lev mantidas em grupo e isoladas (Média±DP).

Dieta Fêmeas em Grupo Fêmeas Solitárias

Ovos/fêmea/dia 0,3±0,2a,1 1,0±0,8a,2 Total de ovos 23±20,8a,1 129±116a,1 ↓Lev

Longevidade 112 diasa,1 158 diasa,2

Ovos/fêmea/dia 3,3±1,4b,1 6,7±3,0b,2 Total de ovos 310,3±107,7b,1 796,8±610,2b,1 ↑Lev

Longevidade 118 diasa,1 161 diasa,2

Médias seguidas de números diferentes na mesma linha e letras diferentes na mesma coluna são diferentes estatisticamente (Mann-Whitney Rank Sum Test, α<0,05).

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___________________________________________________________Resultados

Figura 6: Proporção de fêmeas alimentadas nas dietas ↓Lev e ↑Lev que realizaram postura de ovos ao longo do período reprodutivo observado. A linha sólida refere-se

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___________________________________________________________Resultados

O padrão de oviposição das fêmeas isoladas mostrou, mais detalhadamente, períodos de maior postura de ovos seguidos por períodos de diminuição na quantidade de ovos ovipositados, devido a senescência do que com as fêmeas em grupos. Houve uma concentração da oviposição nos primeiros 80 dias de vida adulta das fêmeas isoladas alimentadas na dieta ↓Lev, seguido por um período de diminuição e heterogeneidade dos picos de oviposição. Para as fêmeas isoladas alimentadas na dieta ↑Lev a maior parte da postura dos ovos se concentrou até os 100 dias de vida, sendo seguido por um período de menor quantidade de ovos ovipositados.

A proporção de fêmeas que realizam oviposição durante o período de postura de ovos observado é bastante diferente entre as fêmeas isoladas mantidas nas dietas ↓Lev e ↑Lev (figura 6). As fêmeas da dieta ↓Lev não produziram ovos todas ao mesmo tempo, necessitando de maior tempo para que os ovários pudessem produzir vitelo suficiente para a maturação dos oócitos. Como pode ser observado na figura 7, as fêmeas alimentadas na dieta ↓Lev permaneceram 30% do período sem ovipositar, que corresponde a quase um terço da vida adulta testada, sendo significativo para a produção total de ovos. Na dieta ↑Lev várias fêmeas produziram ovos e ovipositaram todos os dias, demonstrando uma produção contínua dos ovos.

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___________________________________________________________Resultados

Figura 7: Freqüência de ovos ovipositados durante o período de observação das ↓Lev e ↑Lev.

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___________________________________________________________Resultados

Quantidade de fêmeas acasaladas

Foram verificadas as espermatecas das fêmeas deste experimento e observou-se que todas as fêmeas de todos os tratamentos testados possuíam espermatozóides nas espermatecas e, portanto, todas acasalaram no período no qual estiveram juntas com os machos (15 dias), independentemente da dieta que receberam na vida adulta.

Condição de laboratório

Experimento Lab 1: Receptividade sexual x condição nutricional das fêmeas (laboratório)

Neste experimento as dez cópulas observadas para cada uma das combinações (Dieta ↓Lev x Dieta ↑Lev ou Dieta Sac x Dieta↑Lev) aconteceram, exclusivamente, com as fêmeas de A. obliqua alimentadas na dieta ↑Lev. Essas fêmeas foram mais receptivas à corte do macho (Fisher Exact Test, P<0,001).

Experimento Lab 2: Receptividade sexual x carga de ovos das fêmeas (laboratório)

Em oito das dez cópulas observadas neste experimento, a fêmea que iniciou a cópula com o macho foi aquela com maior número de oócitos maduros. As cópulas não ocorreram ao acaso, ou seja, o número de oócitos maduros nos ovários está relacionado com a receptividade sexual das fêmeas dessa espécie (Fisher Exact Test,

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___________________________________________________________Resultados

Tabela 2: Média ± EP do número de oócitos maduros nos ovários das fêmeas que iniciaram o

acasalamento e das demais fêmeas dos testes de receptividade sexual realizados em laboratório e em gaiolas no campo (experimentos Lab 2 e Campo 2).

Média do número de oócitos maduros das fêmeas que

iniciaram a cópula±EP

Média do número de oócitos maduros das demais

fêmeas±EP

Laboratório 34,1 ± 9,2a 13,7 ± 4,7b P=0,019

Campo 29,4 ± 5,6a 9,9 ± 2,6b P=0,004

Médias seguidas de diferentes letras na mesma linha são significativamente diferentes

(Mann-Whitney Rank Sum Test, α<0,05).

Não houve diferença significativa entre o tamanho das asas das fêmeas que acasalaram (0,311±0,027 mm) e das que não acasalaram (0,307±0,029 mm) (Mann-Whitney Rank Sum Test, α<0,05).

Condição de campo

Experimento campo 1: Receptividade sexual x condição nutricional das fêmeas (Gaiolas)

Todas as dez cópulas observadas neste experimento ocorreram com as fêmeas alimentadas na dieta ↑Lev. Obteve-se o mesmo resultado do experimento feito em laboratório. Mesmo em ambiente natural e com variação na Temperatura (ºC) e Umidade Relativa (%) (figura 9), as fêmeas de A. obliqua alimentadas em dieta com maior concentração de lêvedo de cerveja foram mais receptivas sexualmente à corte dos machos (Fisher Exact Test, P<0,001).

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___________________________________________________________Resultados

Figura 9: Temperatura (ºC) e Umidade Relativa (%) durante as observações dos testes de receptividade sexual das fêmeas de A. obliqua realizadas em gaiolas (no

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___________________________________________________________Resultados

Experimento campo 2: Receptividade sexual x carga de ovos das fêmeas (Gaiolas)

Em oito das dez cópulas observadas neste experimento, a fêmea que iniciou a cópula foi aquela com maior número de oócitos maduros. As cópulas não ocorreram ao acaso (Fisher Exact Test, P=0,023) (Tabela 2). Mesmo em um ambiente com variação nas condições abióticas, como T (ºC) e UR (%), as fêmeas de A. obliqua com maior carga de ovos foram mais receptivas sexualmente.

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____________________________________________________________Discussão

A grande diferença na produção de ovos entre fêmeas alimentadas na dieta ↓Lev e ↑Lev era esperada, uma vez que em outros artigos, nos quais foi estudada a influência da dieta na produção de ovos em A. obliqua (Cresoni-Pereira & Zucoloto, 2001; Medeiros & Zucoloto, 2006), resultado semelhante foi obtido, ou seja, fêmeas alimentadas em dieta com menor concentração de uma fonte protéica, produzem menor quantidade de ovos. Já fêmeas alimentadas em uma dieta sem uma fonte protéica não produzem de ovos (Braga & Zucoloto, 1981).

Houve uma significante diferença na produção de ovos entre fêmeas isoladas e em grupo. Uma possível razão desta diferença está no fato do número de ovos/fêmea/dia no experimento das fêmeas em grupo ter sido uma média da quantidade de ovos ovipositada pelo número de fêmeas presentes na caixa de teste. Algumas fêmeas podem não produzir ovos durante todo o período de oviposição, como pode ser observado na figura 6, e com isso a quantidade de ovos/fêmea/dia ser subestimada nesse grupo. Além disso, pode ter havido competição por alimento e sítio de oviposição entre as fêmeas mantidas na mesma caixa.

As fêmeas de algumas espécies de moscas-das-frutas, incluindo A. obliqua, produzem um feromônio de marcação do hospedeiro que é depositado no fruto logo após a oviposição, através do arrasto do ovipositor sobre a superfície do hospedeiro. Este feromônio tem a função de sinalizar a outras fêmeas que o hospedeiro já foi utilizado por uma fêmea para a postura dos ovos (Aluja et al., 2000). Este fato pode ter inibido a postura dos ovos pelas outras fêmeas da caixa quando os testes foram realizados com as fêmeas mantidas em grupos.

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____________________________________________________________Discussão

indivíduos engajados no mesmo comportamento (Clayton, 1978). A principal função deste comportamento pode incluir a exploração mais efetiva de um recurso alimentar, a proteção contra predadores ou ainda uma sincronização das proles (Clayton, 1978). Levando em consideração este tipo de mudança de comportamento na presença de co-específicos, é possível esperar que as fêmeas de A. obliqua mantidas em grupo deveriam produzir mais ovos do que as isoladas. Entretanto em um trabalho realizado por Prokopy & Bush (1973) as fêmeas de Rhagoletis pomonella em grupos poderiam ter ovipositado mais ovos durante os testes se os substratos de oviposição fossem trocados diariamente, o que não ocorreu nos seus testes. Estes mesmos autores discutem que a presença do Hormônio de Marcação do Hospedeiro pode ter diminuído a deposição dos ovos nos substratos. Fato este que também pode ter desempenhado um papel inibitório na oviposição em fêmeas de A. obliqua mantidas em grupo.

A subestimação da quantidade de ovos produzidos e a presença de feromônio de marcação nos substratos artificiais nas caixas com as fêmeas em grupo foram algumas das razões de, neste trabalho, estudarmos a produção e postura de ovos de fêmeas isoladas, o que nos deu muitas informações sobre a dinâmica ovariana nesta espécie.

Outros autores já haviam obtido um padrão de oviposição das fêmeas de A. obliqua em substratos artificiais. Entre o trabalho de Joachim-Bravo et al. (2003) e os dados do presente estudo existem semelhanças e sobretudo, diferenças marcantes na quantidade de ovos produzidos por essa espécie de mosca-das frutas apesar da dieta oferecida às fêmeas ser semelhante.

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____________________________________________________________Discussão

foram obtidos 303,3±107,7 ovos/fêmea para as fêmeas mantidas em grupos e 796,8±610,2 ovos/fêmea para as fêmeas mantidas isoladas quando em ambos os trabalhos as fêmeas foram alimentadas na dieta ↑Lev. No trabalho de Joachim-Bravo et al. (2003) as fêmeas foram testadas separadamente, a dieta teve a mesma concentração de lêvedo da utilizada no presente estudo e os substratos artificiais foram constituídos apenas de agar e água. Os substratos utilizados nesse trabalho foram constituídos de sacarose (11g) e lêvedo (2,0g) o que pode ter estimulado a postura de ovos. Segundo Papaj (2000) o comportamento de oviposição em insetos responde a variações da qualidade e abundância do hospedeiro; um elaborado sistema de controle hormonal e neural regula o tempo de desenvolvimento ovariano, com uma variedade de fatores extrínsecos influenciando o grau e o tempo de desenvolvimento ovariano, dentre eles a temperatura, umidade, fotoperíodo, acasalamento, contexto social e dieta.

Para que dúvidas fossem esclarecidas quanto ao padrão de oviposição de A. obliqua uma nova análise dos dados foi realizada da mesma maneira que os autores Joachim-Bravo et al. (2003) fizeram com os seus dados obtidos. Na figura 8, pode-se observar que foi realizada a soma da quantidade de ovos, a cada 5 dias, obtidas durante o período de oviposição das fêmeas, assim como foi feito no trabalho desses autores. Com esta nova análise pode-se observar que a quantidade de ovos/fêmea ovipositada a cada 5 dias foi diferente. A quantidade média total de ovos/fêmea ovipositada pelas fêmeas de A. obliqua verificadas por Joachim-Bravo et al. (2003) não ultrapassou 35 ovos a cada 5 dias. Já no presente trabalho, no maior pico de oviposição, a quantidade de ovos ovipositados quase atingiu 60 ovos a cada 5 dias, o que é uma diferença significativa.

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____________________________________________________________Discussão

Uma possível explicação para essa grande diferença está na contribuição dos machos durante o período de maturação dos ovos e da postura, uma vez, que permaneceram juntos com as fêmeas durante toda a vida adulta. Essa contribuição pode ter sido um presente nupcial proveniente do ejaculado do macho, que foi recebido pela fêmea durante a cópula.

O presente nupcial é uma forma de transferência de espermatozóides e nutrientes dos machos para as fêmeas durante ou diretamente após a cópula e/ou corte (Vahed, 1998). Pode ser um alimento capturado ou coletado pelo macho, produtos glandulares dos machos tais como secreções salivares, secreções de glândulas externas, espermatóforos ou substâncias dos ejaculado (Vahed, 1998).

Nos caso de insetos que tem fertilização interna, o presente nupcial pode ser algumas substâncias produzidas pelas glândulas acessórias dos machos. Além da diminuição da receptividade sexual, as substâncias das glândulas acessórias dos machos podem também contribuir com o fitness da fêmea, sendo que em algumas espécies, podem ser utilizadas pelas fêmeas como um fluido nutritivo utilizado para aumentar fecundidade e a longevidade das fêmeas; até mesmo pode ocorrer a digestão do esperma pela fêmea (Vahed, 1998). É possível que as fêmeas recebam dos machos nutrientes que são escassos na dieta aumentando a longevidade (Wagner et al., 2001). As substâncias das glândulas acessórias também modificam o comportamento de fêmeas de C. capitata; fêmeas acasaladas desta espécie têm um desvio na atração ao odor do feromônio do macho para o odor dos frutos hospedeiros para a oviposição (Jang, 1995). Na ausência de uma dieta protéica, a fecundidade inicial das fêmeas de D. mojavensis é aumentada pela doação do ejaculado do macho

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Alguns autores discutem o aumento na fecundidade da fêmea como conseqüência do acasalamento pela ação semelhante a hormônios das substâncias do ejaculado dos machos (Eberhard & Cordera, 1995) e não como uma fonte de nutrientes, pois apenas traços de algumas substâncias, tais como nitrogênio, são encontradas no corpo das fêmeas, quantidade esta muito pequena para fazer diferença como um fator nutricional importante. Entretanto, o macho pode transferir alguma vitamina para a fêmea que é necessária em pequenas quantidades como pode ocorrer para Requena verticalis (Gwynne, 1988).

Em algumas espécies nas quais foram realizados estudos sobre a influência do ejaculado dos machos no fitness das fêmeas através de técnicas de radiomarcação, foram encontrados apenas traços de substâncias das glândulas acessórias dos machos nos ovários das fêmeas em quantidades tão pequenas que sua ação como nutrientes pode ser descartada (Sivinski & Smittle, 1987; Kaulenas, 1992).

Os produtos seminais, como abordado anteriormente, podem ser incorporados aos ovos, ou em tecidos de estocagem das fêmeas tais como corpo gorduroso e podem agir diretamente em outras partes do corpo como cérebro (Leopold et al., 1971; Baumann, 1974) e gânglio abdominal (Yamaoka & Hirao, 1977), tendo ação semelhante a de hormônios. Assim sendo, a diferença na oviposição entre as fêmeas de A. obliqua neste trabalho e do estudo de Joachim-Bravo et al. (2003) pode ter sido devida ao efeito estimulador da ovulação e oviposição (semelhante a hormônios) que as substâncias das glândulas acessórias dos machos têm sobre a fisiologia da fêmea.

Além da influência das substâncias das glândulas acessórias na produção de ovos pelas fêmeas de A. obliqua, outros fatores podem ter influenciado a diferença de

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et al. (2003). Entre eles podemos destacar diferenças no tamanho das caixas e dos substratos artificiais para oviposição utilizados para os testes e fatores abióticos, como Temperatura e Umidade Relativa.

Outra diferença significante entre os dados obtidos por Joachim-Bravo et al. (2003) relaciona-se a influência da senescência na produção de ovos em A. obliqua. Tanto nos experimentos com as fêmeas em grupos quanto isoladas, a quantidade de ovos produzida foi bastante homogênia durante todo o período de oviposição, sendo observada uma ligeira influência da idade da fêmea após 90 a 100 dias de vida adulta. No trabalho de Joachim-Bravo et al. (2003) a influência da idade foi muito marcante após 70 dias de idade. Depois deste período o número de ovos, em alguns casos caiu para menos de 5 ovos/fêmea a cada 5 dias.

Segundo Novoseltsev et al. (2004) uma fêmea de inseto revela três estágios reprodutivos na vida adulta: a maturação, a maturidade e a senescência. A morte das fêmeas adultas pode ocorrer pela senescência ou prematuramente pela sobrecarga reprodutiva. Em experimentos realizados com C. capitata, esses autores classificaram as fêmeas dessa espécie em quatro categorias segundo a produção de ovos e a quantidade de energia disponibilizada para a manutenção somática. Existem fêmeas que investem muito na produção de ovos sem que a energia suficiente seja disponibilizada para a manutenção somática; essas fêmeas apresentam uma vida muito curta e a morte prematura devida a sobrecarga reprodutiva (Novoseltsev et al., 2004). Outras fêmeas podem ter gradativos investimentos em reprodução e algumas apresentam um desequilíbrio muito acentuado entre reprodução e manutenção somática, no qual ocorre uma sobrevida maior em detrimento de uma produção de

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Baseado na discussão desses autores seria possível relacionar inversamente a produção de ovos e a longevidade. Entretanto, quando observamos o padrão de oviposição das fêmeas isoladas de A. obliqua alimentadas nas dietas ↓Lev e ↑Lev não há essa relação. A longevidade das fêmeas alimentadas na dieta ↑Lev foi algumas vezes maior do que a longevidade das ↓Lev. Isso se deve ao fato da quantidade de ovos produzida pelas fêmeas dessa espécie estar relacionada a concentração de proteína na dieta (Braga & Zucoloto, 1981). Além disso, Novoseltsev et al. (2004) discutem que essa relação inversa entre longevidade e produção de ovos apenas ocorre quando a energia disponibilizada para a reprodução é maior do que a energia disponível nos recursos alimentares. A dieta com 6,5 g de lêvedo de cerveja é a melhor para a produção de ovos nesta espécie e sustenta a energia alocada para a reprodução sem causar danos fisiológicos para as fêmeas de A. obliqua (Medeiros & Zucoloto, 2006). Liedo et al. (2002) observaram que não houve uma correlação negativa entre a longevidade e a capacidade reprodutiva de fêmeas de C. capitata. Assim sendo, as fêmeas de A. obliqua regulam a produção de ovos e, por conseguinte, a oviposição em função da disponibilidade de uma dieta rica em proteína.

Novoseltsev et al. (2004) discutem a metodologia empregada na obtenção de padrões de oviposição em insetos e sugerem que a utilização de fêmeas confinadas isoladas em ambientes de testes é mais interessante experimentalmente do que utilizar a média da produção de ovos de grupos de fêmeas, isso porque os dados obtidos de fêmeas isoladas são mais claros e demonstram as diferenças entre os indivíduos de uma população.

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a este, bem como aos parceiros ou na disponibilidade de hospedeiros para oviposição (Liedo et al., 2002). Para animais em confinamento, mesmo isolados, o tamanho do ambiente no qual são mantidos pode resultar em diferenças na longevidade (Liedo et al., 2002).

Independentemente do tipo de dieta utilizada como alimento pelas fêmeas adultas de A. obliqua, 100% delas acasalaram nos 15 dias nos quais permaneceram com os machos na caixa experimental. Ou seja, fêmeas de A. obliqua alimentadas em dieta Sac acasalaram mesmo sem a presença de oócitos maduros nos ovários.

Quando fêmeas com oócitos maduros não estão disponíveis, o investimento do macho em fêmeas sem ovos pode ser importante uma vez que as fêmeas armazenam os espermatozóides do macho em espermatecas para a fertilização dos oócitos maduros quando os machos não estiverem presentes e/ou disponíveis. Dessa forma, o macho pode produzir uma prole posteriormente. Para a fêmea, o acasalamento, mesmo sem a presença de oócitos maduros, pode estimular a maturação destes ou contribuir para aumentar o seu sucesso reprodutivo. Além disso, a fêmea pode encontrar uma fonte de proteína posteriormente e já estando fecundada pode iniciar a postura dos ovos assim que os oócitos estiverem maduros. Em algumas espécies de insetos, fêmeas criadas em dietas com pouca quantidade de proteína ou sem proteína podem nutrir-se do fluido ejaculado pelo macho. Em Drosophila melanogaster e D. pseudoobscura alguns componentes do ejaculado dos machos são rapidamente transferidos para os tecidos somáticos das fêmeas fora dos ovários e do