MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ALTERAÇÕES NAS CONCENTRAÇÕES DAS SRAT, CONTEÚDO
DE GSH E ATIVIDADE DA CAT EM PACIENTES COM
ESQUISTOSSOMOSE AGUDA
GINA MICHELLE MACÊDO DA CUNHA
Orientador(a): Profª Drª Ana Claudia Galvão Freire Gouveia
NATAL/ RN
2008
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ALTERAÇÕES NAS CONCENTRAÇÕES DAS SRAT, CONTEÚDO
DE GSH E ATIVIDADE DA CAT EM PACIENTES COM
ESQUISTOSSOMOSE AGUDA
GINA MICHELLE MACÊDO DA CUNHA
Orientador(a): Profª Drª Ana Claudia Galvão Freire Gouveia
NATAL/ RN
2008
Dissertação submetida ao programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da UFRN, como requisito para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, área de concentração Bioanálises e Medicamentos.
Catalogação da Publicação na Fonte
C972a Cunha, Gina Michelle Macêdo da.
Alterações nas concentrações das SRAT, conteúdo de GSH e atividade
da CAT em pacientes com esquistossomose aguda. – Natal, RN, 2008. 65 f.; Il
Orientador: Ana Claudia Galvão Freire
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Gina Michelle Macêdo da Cunha
ALTERAÇÕES NAS CONCENTRAÇÕES DAS SRAT, CONTEÚDO
DE GSH E ATIVIDADE DA CAT EM PACIENTES COM
ESQUISTOSSOMOSE AGUDA
Banca Examinadora:
_____________________________________________ Profª Drª Ana Claudia Galvão Freire
Orientadora
_____________________________________________ Profª Drª Francisca Inês de Sousa Freitas Examinadora externa - UFPB
_____________________________________________ Profª Drª Maria das Graças Almeida
Examinadora interna - UFRN
Natal, 30 de janeiro de 2008
NATAL/ RN
2008
DEDICATÓRIA
A DEUS, que me guia em todos os caminhos da minha vida, aos meus pais, Ana e Hilton, pelo apoio, carinho e dedicação, aos meus irmãos Carolinne e Hilton Neto, pela compreensão, a meu namorado Miguel Adelino, pelo apoio, carinho, amor, compreensão, amizade e dedicação, a minha avó Dulce “in memoriam”, que sempre acreditou em mim e na minha capacidade e a minha Profª orientadora Ana Claudia pela confiança e amizade.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Ana Maria de Macêdo Cunha e Hilton Luiz da Cunha, que sempre me apoiaram e acreditaram no meu crescimento profissional.
Ao meu namorado Miguel Adelino da Silva Filho, pelo amor, companheirismo, amizade, confiança, compreensão, e incentivo na busca dos meus objetivos.
Aos meus irmãos, Carolinne Natalle Macêdo da Cunha e Hilton Fernandes da Cunha Neto, pelo incentivo e apoio.
A minha avó Dulce Carlos da Cunha “in memoriam”, pelo incentivo, apoio e dedicação, e por sempre ter acreditado em mim e em minha capacidade, e em sempre querer minha felicidade.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pelo suporte dado durante todo esse período.
A Aureliana e Edileide, funcionárias da Pós-graduação, pelo suporte dado aos alunos.
À Banca de Qualificação, composta pelos professores Drª Telma Maria Araújo Moura Lemos e Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, pelas valiosas sugestões, tão importantes para a melhoria da qualidade final desta dissertação de Mestrado.
A minha orientadora, Profª Drª Ana Claudia Galvão Freire, por acreditar que posso, pela amizade, dedicação, pelo exemplo de sabedoria, garra e profissionalismo, amiga de todas as horas em momentos de alegria e tristeza, incentivando sempre a realização de sonhos e a superação dos obstáculos da vida.
Às alunas de iniciação cientifica, Vanessa Marques de Araújo Silva, Mariana Angélica Oliveira Bitencourt e Karla Dillany Gomes Bessa, pela ajuda e dedicação na realização
dos experimentos, pela colaboração, amizade e apoio, sem elas não sei o que seria de mim e deste trabalho. Além da colaboração de Julianne Bezerra Sathler, que com dedicação participou do início da realização dos experimentos deste trabalho.
A todos os amigos do Laboratório Multidisciplinar (Labmult), em especial a Rand Randall Martins, Ulisvaldo Brunno de Oliveira Macedo e Francisco Paulo Freire Neto, alunos do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, pela ajuda e dedicação na realização deste trabalho, pois eles foram de uma ajuda sem igual, sem eles, não sei o que seria dos meus resultados.
A Profª Drª Maria das Graças Almeida, do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, pela colaboração, ao disponibilizar o Laboratório Multidisciplinar (Labmult) para a realização dos meus experimentos, além do suporte técnico e científico dados durante toda a minha parte experimental, sendo um exemplo de determinação na busca do conhecimento.
A Profª Drª Telma Maria Araújo Moura Lemos, Chefe do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da UFRN, pela contribuição indispensável, durante as análises bioquímicas do perfil lipídico e da função hepática e renal, disponibilizando o Laboratório Integrado de Análises Clínicas (LIAC) para o que fosse necessário.
A Profª Drª Tereza Maria Dantas de Medeiros, do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, pela colaboração, ao disponibilizar o Laboratório de Hematologia para a dosagem da hemoglobina.
Às Farmacêuticas-bioquímicas e Funcionários do Laboratório Integrado de Análises Clínicas (LIAC), pela importante contribuição nas análises bioquímicas e hematológicas dos pacientes, bem como aos funcionários do DACT pelo apoio dado.
A Aureliana e Edileide, funcionárias da Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRN, pela disponibilidade em ajudar sempre que necessário.
Aos Laboratórios da Faculdade de Farmácia da UFRN: LABMULT, LIAC, Laboratório de Parasitologia, Laboratório de Toxicologia, Laboratório de Bioquímica e Laboratório de Hematologia.
Aos amigos da Vigilância Sanitária de Touros/ RN, em especial a Fausto, Sandra, Ionaldo e Josafá, pelo apoio, amizade, colaboração e dedicação para a realização deste trabalho.
A Dr Lélio, da SUVISA/ SUVIGE-RN pela colaboração, apoio, sugestões, incentivo, e por acreditar na importância deste trabalho.
Aos Pacientes do município de Touros/ RN (grupo teste) e aos Alunos do Curso de Farmácia UFRN (grupo controle) em aceitarem colaborar com esta pesquisa, tornando possível a realização deste trabalho, além da contribuição para a busca do conhecimento científico.
A Maria da Luz da Silva Filha, técnica do Laboratório de Parasitologia Clínica da Faculdade de Farmácia – UFRN, pela sua ajuda e dedicação em estar sempre presente, e por apoiar na busca de material no laboratório.
A Profª Edna Marques de Araújo Silva, pela amizade, apoio, incentivo e dicas para a realização deste trabalho.
A Doutoranda Cristiane Fernandes de Assis, pela sua colaboração na idealização do projeto, participação na fase inicial dos experimentos, sugestões e incentivo para a realização deste trabalho.
A João Bosco de Medeiros, Bibliotecário da Biblioteca Setorial do Centro de Ciências da Saúde da UFRN, pela essencial colaboração na correção bibliográfica deste trabalho.
Ao Prof° Dr. Marcos Eugênio Cury de Medeiros, Estatístico, do Departamento de Estatística da UFRN, pela definição do tamanho da amostra de estudo.
A FAPERN, em especial, pelo apoio financeiro fornecido, viabilizando assim, o trabalho de campo, desde a coleta das amostras biológicas até a realização de atividades educativas, tão necessárias ao município de Touros/RN.
Ao CNPq/PPPg, pela concessão da bolsa de estudo, tão importante no incentivo da realização deste trabalho.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para realização deste trabalho, da mais simples a mais complexa colaboração, agradeço com o coração repleto de alegria.
RESUMO
A esquistossomose é uma doença milenar causada pelo helminto Schistosoma mansoni e constitui um problema de saúde pública no Brasil. A lesão granulomatosa, típica da doença, está associada com o aumento do dano oxidativo através da geração de radicais livres. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ocorrência de alterações nos parâmetros oxidante/ antioxidante que fazem parte do sistema de defesa do organismo, e observar se os mesmos provocariam estresse oxidativo em indivíduos com esquistossomose. Além disso, correlacionando com alguns parâmetros bioquímicos e hematológicos. Foram selecionados dois grupos de estudo, constituídos de indivíduos de ambos os sexos, com faixa etária compreendida entre 16 e 30 anos. Um grupo controle, formado por indivíduos sem esquistossomose (n=30) e um grupo teste, formado por indivíduos com esquistossomose (n=30). A avaliação da peroxidação lipídica no plasma foi realizada por meio da determinação do malondialdeído e a defesa antioxidante pela dosagem da glutationa reduzida e determinação da atividade da catalase. Em relação aos parâmetros que avaliam o estresse oxidativo, os resultados demonstraram uma diminuição do conteúdo de glutationa reduzida e nenhuma alteração na atividade da catalase, com um aumento nos valores de malondialdeído. Portanto, os dados encontrados sugerem a ocorrência do estresse oxidativo nos indivíduos com esquistossomose. Dos parâmetros que avaliam a função hepática, apenas os níveis de aspartato amino transferase mostraram-se elevados, enquanto ocorreu uma diminuição da bilirrubina. Não houve uma alteração significativa no perfil lipídico (p<0.5), entretanto com relação à função renal dos pacientes, houve uma diminuição da creatinina. A avaliação hematológica, realizada através do hemograma completo e a dosagem da hemoglobina, mostra eosinofilia nos indivíduos do grupo teste, que pode estar relacionada com a presença do parasita. As alterações apresentadas sugerem a participação do estresse oxidativo na fisiopatologia da referida doença.
Palavras-chave: esquistossomose, estresse oxidativo, SRAT/ malondialdeído, glutationa, exames laboratoriais.
ABSTRACT
Schistosomiasis is an ancient disease caused by helminth Schistosoma mansoni and is a public health problem in Brazil. The granulomatous lesion, typical of the disease, associates itself with increase in the oxidative damage through the generation of free radicals. The aim of this work was to evaluate the occurrence of changes in parameters oxidant / antioxidant that are part of the human defense system, and observe whether they would cause oxidative stress in subjects with schistosomiasis. Moreover, correlating with some biochemical and hematological parameters. Two groups were selected for study, consisting of individuals of both sexes, aged between 16 and 30 years. A control group, formed by individuals without schistosomiasis (n = 30) and a test group, formed by individuals with schistosomiasis (n = 30). The evaluation of lipid peroxidation in plasma was performed by determination of malondialdehyde and antioxidant defense by the quantification of reduced glutathione and catalase activity. For the parameters that assess oxidative stress, the results showed a decrease in the content of reduced glutathione and no change in the activity of catalase, with an increase in the value of malondialdehyde. Therefore, the data found suggest the occurrence of oxidative stress in subjects with schistosomiasis. Of the parameters that assess hepatic function, only levels of aspartate aminotransferase have been high, while there was a decrease of bilirubine. There was a significant change in the lipid profile (p <0.5), however with regard to the renal function of patients, there was a decrease in creatinine. The assessment hematological, made through hemogram and the quantification of hemoglobin, shows increase of eosinophils individuals in the group test, which can be related to the presence of the parasite. The amendments suggest the involvement of oxidative stress in the pathophysiology of this disease.
Keywords: schistosomiasis, oxidative stress, SRAT/ malondialdehyde, glutathione, laboratory analysis.
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADRO
FIGURA 1 - Distribuição geográfica da esquistossomose no mundo...17
FIGURA 2 - Gráfico da distribuição da esquistossomose mansônica no estado do Rio Grande do norte...19
FIGURA 3 - Ciclo de transmissão da esquistossomose...21
FIGURA 4 - Diagrama esquemático mostrando os mecanismos de produção de EROs e os sistemas de defesa antioxidante (adaptado do artigo GANDRA, ALVES, MACEDO, 2004)...27
FIGURA 5 - Estrutura química do Malondialdeído...28
FIGURA 6 - Estrutura química da Glutationa Reduzida...30
FIGURA 7 - Fluxograma esquemático de distribuição das amostras de sangue...36
FIGURA 8 - Diagrama esquemático da técnica de Kato-Katz...44
FIGURA 9 - Concentração do conteúdo de GSH dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007...46
FIGURA 10 – Atividade da catalase dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007...47
FIGURA 11 – Concentração da molécula oxidante MDA (SRAT) dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007...48
FIGURA 12 – Perfil hepático do grupo com esquistossomose do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007...51
FIGURA 13 – Concentração das moléculas antioxidante/ oxidante correlacionado com o perfil hepático dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007...52
FIGURA 14 – Perfil lipídico do grupo com esquistossomose do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007...53
FIGURA 15 – Correlação entre SRAT e o número de ovos por grama de fezes dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007...56 FIGURA 16 – Correlação entre o GSH e o número de ovos por grama de fezes dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007...57 TABELA 1 - Parâmetros bioquímicos dos pacientes avaliados do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de
2007...49 TABELA 2 - Parâmetros hematológicos dos pacientes avaliados do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007...55
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT/ TGP - Alanina Amino Transferase AST/ TGO – Aspartato Amino Transferase CT – Colesterol Total
CAT – Catalase
CHCM – Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média Creat - Creatinina
BD – Bilirrubina Direta BI – Bilirrubina Indireta BT – Bilirrubina Total
DTNB – Ácido 5,5 ditio-bis (2-nitrobenzóico) EROs – Espécies Reativas de Oxigênio
Fe - Ferro GGT – Gama-Glutamil-Transferase GSH - Glutationa Reduzida GR - Glutationa Redutase GPx – Glutationa Peroxidase GSSG – Glutationa Oxidada Hb – Hemoglobina
HCM – Hemoglobina Corpuscular Média HDL – Lipoproteína de Alta Densidade H2O2 – Peróxido de Oxigênio
IL – Interleucina
LCAT - Lecitina Colesterol Aciltransferase LDL – Lipoproteína de Baixa Densidade
LIAC – Laboratório Integrado de Análises Clínicas LPO - Peróxidos de Lipídeo
MDA – Malondialdeído
O2 - Oxigênio
PCE – Programa de Controle da Esquistossomose RLO – Radicais Livres de Oxigênio
SOD - Superóxido-dismutase
SRAT – Substâncias Reativas do Ácido Tiobarbitúrico TBA – Ácido Tiobarbitúrico
TCA – Ácido Tricloroacético TG – Triglicerídeo
Th 1 – Linfócito T Helper 1 Th 2 – Linfócito T Helper 2
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α
UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte Ur – Uréia
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1. Esquistossomose ... 16
1.1.1. Ciclo biológico e transmissão da esquistossomose ... 20
1.1.2. Fisiopatologia ... 21
1.1.3. Complicações clínicas ou hepáticas ... 24
1.2. Estresse Oxidativo ... 25
1.2.1. Mecanismos antioxidantes ... 26
1.2.2. Alguns parâmetros usados como marcadores do estresse oxidativo...28
1.2.2.1 Malondialdeído (MDA) ... 28
1.2.2.2. Catalase (CAT) ... 29
1.2.2.3. Glutationa reduzida (GSH)...29
1.3. Estresse oxidativo x esquistossomose...30
1.4. Avaliação laboratorial...31
2. OBJETIVOS ... 33
3. METODOLOGIA ... 34
3.1. Comitê de Ética em Pesquisa... 34
3.2 População de Estudo ... 34
3.2.1. Grupo Controle...34
3.2.2. Indivíduos com a doença...35
3.3. Procedimentos ...35
3.3.1. Coleta do Material Biológico...35
3.3.2. Análises Laboratoriais...36
3.3.2.1. Avaliação da peroxidação lipídica...36
3.3.2.1.1. Determinação das SRAT...36
3.3.2.2. Avaliação dos parâmetros antioxidantes...37
3.3.2.2.2. Determinação da atividade da Catalase...38
3.3.2.3. Avaliação dos Parâmetros Bioquímicos...,39
3.3.2.3.1. Determinação da Glicose Sanguínea...39
3.3.2.3.2. Determinação do Perfil Lipídico...39
3.3.2.3.3. Determinação da Função Hepática...40
3.3.2.3.4. Determinação da Função Renal...41
3.3.2.3.5. Entrega de resultados dos parâmetros bioquímicos...41
3.3.2.4. Avaliação dos Parâmetros Hematológicos...41
3.3.2.4.1. Determinação do Hemograma Completo...41
3.3.2.4.2. Determinação da Hemoglobina no Eritrócito...41
3.3.2.4.3. Entrega de resultados dos parâmetros hematológic.s...42
3.3.2.5. Avaliação da Carga Parasitária...43
3.3.3. Análises Estatísticas...44 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 45 5. CONCLUSÕES ... 58 6. PERSPECTIVAS ... 59 REFERÊNCIAS ... 60 ANEXOS ... 66 APÊNDICES...70
