Imunoensaio de sTfR humano
Quantikine
™
IVD
®
ELISA
DTFR1
As instruções de utilização em Dinamarquês, Francês, Alemão, Grego, Italiano, Polaco,
Português, Espanhol e Sueco estão disponíveis no folheto informativo suplementar.
REF
DK
FR
DE
GR
IT
PT
PL
ES
SE
Bruksanvisningen på Svenska finns i den kompletterande bipacksedeln.
La instrucciones de utilización en Castellano están disponibles en el manual suplemetario.
As instrucções de utilização em Português encontram-se nos folhetos anexos.
Instrukcja obsługi w języku Polskim jęst dostępne w dodatkowym opakowaniu.
Le istruzioni per l’uso in Italiano sono disponibili nell’inserto aggiuntivo incluso.
Τις οδηγίες χρήσης του κιτ στα Ελληνικά θα τις βρείτε σε ξεχωριστό, επί πλέον ένθετο της συσκευασίας.
Die arbeitsanleitung in Deutsch finden sie in der zusätzlichen packungsbeilage.
La notice d’utilisation en Français est disponible dans le paquet d’instructions fourni en complément.
Brugsanvisningerne på Dansk findes på den supplerende indlægsseddel.
ÍNDICE
SECÇÃO PÁGINA
FABRICADO E DISTRIBUÍDO POR:
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OUTROS MATERIAIS NECESSÁRIOS ...3
PRECAUÇÕES ...4
COLHEITA E CONSERVAÇÃO DAS AMOSTRAS ...4
PREPARAÇÃO DOS REAGENTES...4
PROCEDIMENTO DE ENSAIO ...5
RESUMO DO PROCEDIMENTO DE ENSAIO ...6
CÁLCULO DOS RESULTADOS ...7
DADOS TÍPICOS ...7
CONTROLO DE QUALIDADE ...8
GUIA DE RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS ...8
SUGESTÕES TÉCNICAS ...9 PRECISÃO ...9 RECUPERAÇÃO ... 10 LINEARIDADE ... 10 SENSIBILIDADE ... 10 CALIBRAÇÃO ... 10 VALORES ESPERADOS ... 11
REATIVIDADE CRUZADA E INTERFERÊNCIA ... 11
ELISA para recetor solúvel da transferrina Quantikine™ IVD® R&D Systems® Inc. Número de catálogo DTFR1
Ensaio imunoenzimático de absorção (ELISA) para a determinação quantitativa das concentrações do recetor solúvel da transferrina (sTfR) em soro e plasma humano como auxiliar no diagnóstico de anemia por deficiência de ferro (ADF), em especial para diagnóstico diferencial entre a anemia por deficiência de ferro e a anemia por doença crónica (ADC).
INTRODUÇÃO
O recetor da transferrina (TfR) é o principal mediador da absorção de ferro pelas células (1, 2). O TfR é um dímero transmembranar com ligação dissulfureto entre duas subunidades idênticas (3-7) que se liga à transferrina diférrica e a interioriza, levando, assim, o ferro para o citosol celular. Quando uma célula precisa de ferro, a expressão do TfR aumenta para facilitar a absorção de ferro (8-10). Como a principal utilização do ferro é a síntese de hemoglobina, cerca de 80% do total de TfR concentra-se em células progenitoras eritroides (1, 2).
O recetor solúvel da transferrina (sTfR) deriva da proteólise do TfR num local específico do domínio extracelular, que resulta em monómeros que podem ser medidos no plasma e soro (11, 12). Foi descrita uma relação constante entre o TfR total e a concentração de sTfR no plasma ou soro (13). Por conseguinte, a concentração de sTfR no plasma ou soro é uma medida indireta do TfR total. Como a expressão do TfR aumenta na deficiência de ferro e como a maioria do TfR se encontra em células progenitoras eritroides, o nível sérico do sTfR reflete a necessidade celular (principalmente eritroide) de ferro (14-19) ou a dimensão do pool de células progenitoras eritroides (ou seja, a velocidade da eritropoiese) (2, 14, 20). Existem duas linhas de evidências que suportam este raciocínio. Primeiro, a concentração de sTfR no plasma ou soro está elevada na deficiência de ferro (14-19, 21). Segundo, a concentração de sTfR no plasma ou soro está correlacionada com a absorção de transferrina por eritrão (2), uma medida ferrocinética da atividade eitropoiética, e o sTfR está elevado em indivíduos com eritropoiese hiperplásica (p. ex.: anemia hemolítica, -talassemia, policitemia, etc.) e diminuído em indivíduos com eritropoiese hipoplásica (p. ex.: insuficiência renal crónica, anemia aplásica ou anemia pós-transplante) (14, 20).
A medição do sTfR é especialmente útil como indicação da deficiência de ferro em indivíduos com doença crónica (doenças inflamatórias, infeções, tumores malignos), muitos dos quais são anémicos. A anemia por doença crónica e a anemia por deficiência de ferro, as formas mais comuns de anemia, diferenciam-se principalmente por estimativas do estado do ferro (19, 22, 23). As medidas padrão do estado do ferro, como a ferritina, a capacidade de ligação ao ferro total e o ferro sérico, são, contudo, diretamente afetadas por doenças crónicas, o que leva a resultados ambíguos (23, 24). Pelo contrário, o sTfR encontra-se elevado na deficiência de ferro, mas não é afetado percetivelmente por doenças
PRINCÍPIO DO ENSAIO
sTfR Microplate (Microplaca sTfR) (Ref. 890429) — microplaca de poliestireno
de 96 micropoços (12 tiras de 8 micropoços) revestidos com um anticorpo monoclonal de ratinho contra o sTfR.
sTfR Conjugate (Conjugado sTfR) (Ref. 890430) — 11,5 ml de anticorpo
monoclonal de ratinho contra sTfR conjugado com peroxidase de rábano, contendo corante vermelho e conservante.
sTfR Standard Set (Conjunto de padrões sTfR) (Ref. 890312-890317) — 6 frascos
de sTfR humano em 0,2 ml de soro animal tamponado, com conservante. A concentração do sTfR é mostrada no rótulo.
sTfR Control Set (Conjunto de controlos sTfR) (Ref. 895426-895428) — 3 frascos
de sTfR humano liofilizado em soro animal tamponado, com conservante.
sTfR Specimen Diluent (Diluente da amostra sTfR) (Ref. 895429) — 5 ml de soro
animal tamponado, com conservante.
sTfR Assay Diluent (Diluente do ensaio sTfR) (Ref. 895430) — 11 ml de uma base
proteica tamponada, que contém corante azul e conservante.
Wash Buffer Concentrate (Concentrado de tampão de lavagem) (Ref. 895199)
— 21 ml de uma solução concentrada 25 vezes de tensioativo tamponado, com conservante.
Substrate (Substrato) (Ref. 895431) — 12 ml de solução de substrato
estabilizada.
Stop Solution (Solução de paragem) (Ref. 895432) — 11 ml de HCl 1 N. Coberturas de placa — 4 selantes adesivos de placa.
Cartão de dados — fornece os intervalos dos controlos.
SORB CONJ CAL CON DIL SPE DIL AS BUF WASH 25X SUBS SOLN STOP
Este ensaio baseia-se na técnica de ensaio imunoenzimático em sanduíche realizado em microplaca, utilizando dois anticorpos monoclonais diferentes específicos do sTfR. As amostras ou os padrões são pipetados para os micropoços de uma microplaca pré-revestida com um anticorpo monoclonal que consegue capturar o sTfR, imobilizando, assim, o sTfR no micropoço. Após a lavagem de qualquer proteína não ligada, é adicionado um segundo anticorpo monoclonal anti-sTfR conjugado com peroxidase de rábano. O anticorpo conjugado completa a sanduíche. Após a lavagem do anticorpo conjugado não ligado, a quantidade de conjugado restante no micropoço é proporcional à quantidade de sTfR inicialmente capturada. A quantidade de enzima conjugada no poço é medida por incubação com um substrato cromogénico.
LIMITAÇÕES
• PARA UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO.
• Não foi investigada a interferência de fármacos no ensaio.
• O kit não deve ser utilizado além do prazo de validade indicado no respetivo rótulo.
• Se as amostras gerarem valores superiores ao padrão mais alto, dilua as amostras com o diluente da amostra e repita o ensaio, ou apresente os valores como > 80 nmol/l.
• Qualquer variação no diluente da amostra, no operador, na técnica de pipetagem, na técnica de lavagem, no tempo ou temperatura de incubação ou na validade do kit pode causar variações na ligação.
KIT NÃO ABERTO CONSERVAR ENTRE 2 °C E 8 °C. NÃO UTILIZAR ALÉM DO PRAZO DE VALIDADE DO KIT.
Reagentes abertos/ diluídos
Tampão de lavagem diluído
Pode ser conservado a uma temperatura entre 2 °C e 8 °C durante até 1 mês.* Solução de paragem Diluente da amostra sTfR Diluente do ensaio sTfR Conjugado de sTfR Substrato Padrões Controlos Micropoços
Volte a colocar os micropoços não usados na embalagem metalizada com o pacote de exsicante e volte a selar ao longo do fecho da embalagem. Podem ser conservados entre 2 °C e 8 °C até ao fim do prazo de validade do kit. *Desde que esta data se encontre dentro do prazo de validade do kit.
CONSERVAÇÃO
OUTROS MATERIAIS NECESSÁRIOS
• Leitor de microplaca com capacidade para medição da absorvância a 450 nm, com correção de comprimento de onda definido para 540 nm ou 570 nm
• Pipetas e pontas de pipetas • Água desionizada ou destilada
• Frasco de esguicho, dispensador múltiplo ou dispositivo de lavagem de microplacas automático • Copo graduado de 500 ml para preparação do tampão de lavagem
A solução de paragem fornecida com este kit é uma solução ácida. Usar proteção ocular, facial e das mãos e vestuário protetor quando utilizar este material.
Os padrões e os controlos sTfR contêm sTfR humano. Este sTfR foi testado ao nível de dador, utilizando um método aprovado pela FDA, e foi considerado não reativo para anticorpos anti-VIH-1/2 e
antigénio de superfície da hepatite B. Como nenhum teste pode fornecer uma garantia completa da ausência de agentes infeciosos, estes reagentes devem ser manuseados como se fossem capazes de transmitir infeção.
COLHEITA E CONSERVAÇÃO DAS AMOSTRAS
A utilidade clínica deste teste foi estabelecida com amostras de soro, mas medições independentes de soro, plasma com EDTA, plasma com heparina e plasma com citrato* de 33 indivíduos forneceram valores que foram estatisticamente indistinguíveis (análise emparelhada da variância). As amostras devem ser preparadas de acordo com as Diretrizes do CLSI/NCCLS, Procedimentos para Manuseamento e Processamento de Amostras de Sangue (CLSI/NCCLS Guideline, Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens — Documento H18 do CLSI/NCCLS). As amostras permanecem estáveis durante, pelo menos, uma semana entre 2 °C e 8 °C, 1 mês a temperatura ≤ -20 °C ou 1 ano, no mínimo, a uma temperatura ≤ -70 °C. Evitar ciclos de congelação-descongelação repetidos.
Nota: as amostras hemolisadas não são adequadas para medição do sTfR com este ensaio.
*Os valores em plasma com citrato têm de ser multiplicados por um fator de diluição para corrigir a diluição pelo anticoagulante.
PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
Antes da utilização, deixe que todos os reagentes atinjam a temperatura ambiente (20 °C-25 °C). Concentrado de tampão de lavagem — caso se tenham formado cristais no concentrado, aqueça à
temperatura ambiente e misture suavemente até os cristais se dissolverem por completo. Dilua 20 ml de concentrado de tampão de lavagem em água desionizada ou destilada para preparar 500 ml de tampão de lavagem.
Controlos sTfR — reconstituir cada frasco com 200 μl de água desionizada ou destilada. Misture no
agitador de vórtex. Deixe os controlos repousar durante 30 minutos, no mínimo, antes da utilização. Misture novamente no agitador de vórtex imediatamente antes da utilização.
Todos os outros reagentes estão prontos para utilização.
Antes da utilização, deixe que todos os reagentes e amostras atinjam a temperatura ambiente (20 °C-25 °C). Recomenda-se que todas as amostras, padrões e controlos sejam analisados em duplicado.
1. Prepare todos os reagentes, tal como indicado nas secções anteriores.
2. Retire as tiras da microplaca em excesso da estrutura da microplaca, volte a colocá-las na bolsa metalizada, que contém o pacote de exsicante, e volte a selar.
3. Adicione 100 μl de diluente do ensaio sTfR a cada micropoço.
4. Adicione 20 μl de padrão, amostra ou controlo por micropoço. Certifique-se de que a adição da amostra não é interrompida e é concluída dentro de 15 minutos. Bata suavemente na estrutura da microplaca para misturar o conteúdo do micropoço. Cubra com a tira adesiva fornecida. Incube durante 1 hora à temperatura ambiente (18 °C-25 °C).
5. Aspire cada micropoço e lave-o, repetindo o processo três vezes durante um total de quatro lavagens. Lave cada micropoço, enchendo-o com tampão de lavagem (400 μl), utilizando um frasco de esguicho, um dispensador múltiplo ou um dispositivo de lavagem automática. A total remoção do líquido em cada passo é essencial para um bom desempenho. Após a última lavagem, retire o tampão de lavagem restante por aspiração ou decantação. Inverta a placa e seque-a contra toalhetes de papel limpos.
6. Adicione 100 μl de conjugado sTfR a cada micropoço. Cubra com uma nova tira adesiva. Incube durante 1 hora à temperatura ambiente.
7. Repita a aspiração/lavagem, tal como no passo 5.
8. Adicione 100 μl de substrato a cada micropoço. Incube durante 30 minutos à temperatura ambiente. Evite colocar a placa sob luz solar direta.
9. Adicione 100 μl de solução de paragem a cada micropoço. Se a mudança de cor não parecer uniforme, bata suavemente na microplaca, para assegurar que fica totalmente misturada. 10. Determine a densidade ótica de cada micropoço dentro de 30 minutos, utilizando um leitor de
microplaca definido para 450 nm. Se a correção do comprimento de onda estiver disponível, defina para 540 nm ou 570 nm. Se a correção do comprimento de onda não estiver disponível, subtraia as leituras a 540 nm ou 570 nm das leituras a 450 nm. Esta subtração corrigirá as
imperfeições óticas na microplaca. As leituras feitas diretamente a 450 nm sem correção podem ser mais elevadas e menos exatas.
Prepare todos os reagentes, conforme indicado.
Adicione 20 µl de padrão, amostra ou controlo a cada micropoço.
Certifique-se de que a adição da amostra não é interrompida
e é concluída dentro de 15 minutos.
Incube 1 hora à temperatura ambiente (18 °C-25 °C).
Adicione 100 µl de diluente do ensaio sTfR a cada micropoço.
Adicione 100 µl de conjugado a cada micropoço.
Incube 1 hora à temperatura ambiente.
Aspire e lave 4 vezes.
Adicione 100 µl de substrato a cada micropoço.
Incube 30 minutos à temperatura ambiente.
Adicione 100 µl de solução de paragem a cada micropoço.
Leia a 450 nm dentro de 30 minutos.
Correção do λ a 540 nm ou 570 nm.
Aspire e lave 4 vezes.
Calcule a média das leituras duplicadas para cada padrão, controlo e amostra, e subtraia a densidade ótica média do padrão zero.
Trace um gráfico da densidade ótica para os padrões versus a concentração dos padrões, e desenhe a melhor curva. Os dados podem ser linearizados utilizando um logaritmo/papel logarítmico, podendo a análise de regressão ser aplicada à transformação logarítmica.
Para determinar a concentração de sTfR de cada amostra, encontre primeiro o valor de absorvância no eixo das ordenadas (y) e trace uma linha horizontal, prolongando-a até à curva padrão. No ponto de intersecção, trace uma linha vertical e prolongue-a até ao eixo das abcissas (x); leia a concentração correspondente. Se as amostras tiverem sido diluídas, a concentração lida a partir da curva padrão tem de ser multiplicada pelo fator de diluição.
Para valores acima do padrão mais alto (80 nmol/l), a amostra pode ser apresentada como tendo um resultado > 80 nmol/l, ou pode ser diluída com o diluente da amostra e reanalisada. Os valores abaixo do padrão mais baixo (3 nmol/l) devem ser apresentados como resultados < 3 nmol/l. Os valores não devem ser extrapolados para fora do intervalo da curva padrão.
CÁLCULO DOS RESULTADOS
(mUI/ml) D.O. Média Corrigido
0 0,012 0,013 0,012 — 3 0,055 0,056 0,056 0,044 7 0,123 0,125 0,124 0,112 20 0,365 0,367 0,366 0,354 40 0,825 0,793 0,809 0,797 80 1,756 1,777 1,766 1,754
DADOS TÍPICOS
Estas curvas padrão são fornecidas apenas para demonstração. Deve ser elaborada uma curva padrão para cada conjunto de amostras analisado.
CONTROLO DE QUALIDADE
Cada laboratório de testes deve estabelecer um programa de controlo de qualidade para monitorizar o desempenho do imunoensaio Quantikine IVD sTfR. Como parte deste programa de controlo de qualidade, os controlos com concentração do sTfR conhecida devem ser analisados em cada ensaio (fornecidos no kit ou comprados no mercado). No kit são fornecidos três controlos. Se os valores obtidos não se situarem dentro dos intervalos estabelecidos mostrados no cartão de dados fornecidos com o kit, os resultados do ensaio podem ser inválidos.
GUIA DE RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS
Em caso de falha de um ensaio, verifique os prazos de validade de cada reagente e assegure-se de que todos os reagentes foram conservados conforme indicado na rotulagem dos produtos. Se o
desempenho do ensaio for duvidoso ou se ocorrer um problema durante a execução do ensaio, poderá conseguir isolar o problema, consultando a tabela seguinte. Para obter mais informações técnicas, telefone para o número 1-800-343-7475.
PROBLEMA ORIGEM POSSÍVEL TESTE OU AÇÃO
Precisão insuficiente
Lavagem incompleta dos micropoços. Certifique-se de que a estação de lavagem está a funcionar corretamente. Aspiração inadequada dos micropoços. Após a aspiração, os micropoços devem parecer estar secos. Adição de volumes desiguais aos micropoços. Certifique-se de que as pipetas estão calibradas e a funcionar corretamente. Salpicos de reagente durante a adição. Pipete lentamente e com cuidado. Mistura inadequada dos reagentes. Bata no lado microplaca suavemente para misturar o conteúdo dos micropoços.
Mau ajuste da curva Erro de pipetagem. Considere editar os dados de acordo com os procedimentos laboratoriais individuais.
Desenvolvimento inadequado da cor
Aspiração inadequada dos micropoços. Após a aspiração, os micropoços devem parecer estar secos. Adição de volumes incorretos aos
micropoços.
Certifique-se de que as pipetas estão calibradas e a funcionar corretamente. Tempos ou temperaturas de incubação
incorretos.
Adira aos períodos e temperaturas de incubação recomendados.
Falha do conjugado ou do corante.
Misture volumes iguais (ou seja, 100 μl de cada) de solução de substrato e conjugado sTfR. A cor deve desenvolver-se de imediato.
SUGESTÕES TÉCNICAS
• Não misture nem substitua reagentes por outros de lotes ou fontes diferentes.
• Durante a mistura ou reconstituição das soluções proteicas, evite a formação de espuma. • Para evitar a contaminação cruzada, troque de ponta de pipeta entre as adições de cada nível
de padrão, entre as adições das amostras e entre as adições de reagentes. De igual modo, utilize reservatórios separados para cada reagente.
• Para minimizar a variação intraensaio, recomenda-se que os padrões, as amostras e os controlos sejam pipetados no prazo de 15 minutos.
• Adicione os padrões, as amostras e os controlos com força suficiente para assegurar a mistura completa.
• Para garantir resultados exatos, é necessária a adesão correta dos selantes de microplaca durante os passos de incubação.
• As adições em cada passo do protocolo devem ser ininterruptas. • Evite o contacto do substrato com agentes oxidantes ou metal.
• O substrato é sensível à luz. Durante a incubação do substrato, minimize a exposição à luz e mantenha a placa fora da luz direta.
• O substrato deve manter-se incolor até ser adicionado à placa. O substrato incubado nos micropoços positivos deve mudar de incolor para gradações de azul. Após a adição da solução de paragem, a cor desenvolvida nos micropoços mudará de azul para amarelo.
• A solução de paragem deve ser adicionada à microplaca pela mesma ordem que o substrato.
PRECISÃO
Precisão intraensaio (precisão dentro de um ensaio)
Para avaliar a precisão intraensaio, foram testadas vinte vezes numa microplaca três amostras de concentrações diferentes.
Precisão interensaio (precisão entre ensaios)
Para avaliar a precisão interensaio, foram testadas três amostras de concentrações conhecidas em sessenta ensaios separados.
Precisão intraensaio Precisão interensaio
Amostra 1 2 3 4 5 6
n 20 20 20 60 60 60
RECUPERAÇÃO
A recuperação do sTfR adicionado a três níveis diferentes em cinco amostras ao longo de todo o ensaio em várias matrizes foi avaliada.
Tipo de amostra % média de recuperação Intervalo
Soro 97 95%-100%
Plasma com EDTA 103 97%-112% Plasma com heparina 106 101%-112% Plasma com citrato 112 105%-121%
LINEARIDADE
Para avaliar a linearidade do ensaio, cinco amostras contendo concentrações altas de sTfR foram diluídas com diluente da amostra e avaliadas.
Soro Plasma com EDTA Plasma com heparina Plasma com citrato 1:2 % média de esperados 101 98 96 97 Intervalo (%) 95-111 93-103 89-102 90-105 1:4 % média de esperados 101 100 98 92 Intervalo (%) 96-107 90-109 84-104 84-96 1:8 % média de esperados 102 99 98 95 Intervalo (%) 94-110 88-105 86-105 90-108 1:16 % média de esperados 106 106 104 98 Intervalo (%) 98-112 102-111 99-115 89-116
SENSIBILIDADE
A dose mínima detetável (DMD) do sTfR é, tipicamente, inferior a 0,5 nmol/l.
O DMD foi determinado através da adição de dois desvios padrão ao valor médio da densidade ótica de vinte réplicas do padrão zero, calculando a concentração correspondente.
CALIBRAÇÃO
O ensaio é calibrado com a forma natural do sTfR de plasma humano. A calibração foi estabelecida com sTfR plasmático de elevada pureza, sendo a pureza estabelecida por SDS-PAGE e sequenciação do N-terminal. A massa foi obtida a partir da análise de aminoácidos.
VALORES ESPERADOS
Foram analisados duzentos e vinte e cinco indivíduos hematologicamente normais de vários locais nos EUA. Os valores de sTfR tiveram uma distribuição normal. Os valores entre indivíduos de raça negra foram estatisticamente mais elevados do que em indivíduos que não eram negros; indivíduos que vivem em maior altitude (Denver, ~1600 m de altitude) tiveram valores mais altos do que indivíduos que moram próximo do nível do mar. Não se observaram diferenças estatisticamente significativas entre raças, idades, sexos ou mulheres pré- vs. pós-menopausa. Cada laboratório de teste tem de estabelecer o seu próprio intervalo normal.
Média (nmol/l) Percentil de 2,5-97,5 Não negros (residentes a uma altitude
< 300 m acima do nível do mar) 18,4 8,7-28,1*
*Os indivíduos negros e os residentes a 1600 m acima do nível do mar tiveram um valor 6% mais alto do percentil 97,5. Estas diferenças foram aditivas.
Os valores séricos do sTfR situam-se acima do intervalo normal em indivíduos com anemia por
deficiência de ferro e em doentes com eritropoiese hiperplásica ou eritropoiese ineficaz. O ensaio sTfR não se destina a ser utilizado isoladamente; os resultados devem ser interpretados em conjunto com outros testes de diagnóstico.
REATIVIDADE CRUZADA E INTERFERÊNCIA
Reatividade cruzada
O ELISA do sTfR não apresenta reatividade cruzada com 8,5 mg/ml de diferritransferrina humana, 8,5 mg/ml de apotransferrina humana ou 10 mg/ml de ferritina de coração, fígado ou baço humanos.
Interferência
O ELISA do sTfR não apresenta interferência com até 100 mg/ml de trioleína, 20 mg/ml de albumina sérica humana, 1 mg/ml de bilirrubina ou 1,25 mg/ml de hemoglobina. Níveis de hemoglobina acima de 1,25 mg/ml demonstraram alguma interferência.
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