UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
MARINA AIELLO PADILLA
ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS PRODUZIDOS DE
BACTÉRIAS ISOLADAS E COLETADAS EM CUPINZEIROS
FRENTE A VÍRUS DE IMPORTÂNCIA HUMANA E ANIMAL
ANTIVIRAL ACTIVITY OF EXTRACTS PRODUCED BY
ISOLATED BACTERIA COLLECTED IN TERMITE MOUNDS
AGAINST IMPORTANT HUMAN AND ANIMAL VIRUSES
CAMPINAS 2015
MARINA AIELLO PADILLA
ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS PRODUZIDOS DE
BACTÉRIAS ISOLADAS E COLETADAS EM CUPINZEIROS FRENTE
A VÍRUS DE IMPORTÂNCIA HUMANA E ANIMAL
ANTIVIRAL ACTIVITY OF EXTRACTS PRODUCED BY ISOLATED
BACTERIA COLLECTED IN TERMITE MOUNDS AGAINST HUMAN
AND ANIMAL VIRUSES
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Genética e Biologia Molecular na área de Microbiologia
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology in Microbiology area
CAMPINAS 2015 ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE PELA ALUNA MARINA AIELLO PADILLA E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. CLARICE WEIS ARNS
Campinas, 04 de dezembro de 2015.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Clarice Weis Arns Profa. Dra.Carmen Lucia Queiroga Prof. Dr. José Luiz Proença Modena Profa. Dra. Isabela Cristina Simoni Prof. Dr. Eduardo Furtado Flores
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA À todos os meus amores.
AGRADECIMENTOS
À Deus por toda a força que me deu nessa jornada e por ter colocado pessoas tão especiais na minha vida.
Meus pais, Telma e Miguel, agradeço simplesmente por ter o privilégio de ter vocês como pais. Nada seria possível, ou pelo menos não teria a mesma satisfação, se não pudesse ser compartilhado com vocês. “Amo tanto e de tanto amar...”
À toda a minha família: meus irmãos, cunhadas, minha avó Terezinha que acreditaram e me apoiaram nessa jornada, como em todas as outras. Vocês são essenciais!
Aos meus sobrinhos lindos: Miguel, Alice e Bebel. Vocês me ensinam, me ajudam (mesmo sem perceber) e me mostraram um novo jeito de amar: o amor de tia coruja! Amo mais que demais.
Ao Marco, principalmente pela “paciência com a Mari” (potássio), mas também pelos momentos de risadas, conselhos, companheirismo, cumplicidade...Obrigada! Te quiero.
À minha orientadora, profa. Dra. Clarice, pela oportunidade, confiança, incentivo, ensinamentos, conversas e convivência. Aprendi muito durante todo esse período que estamos trabalhando juntas. Muito obrigada!
Aos meus amigos mais que especiais Matheus, Fernanda que sempre estiveram do meu lado e me ajudam em todos os sentidos para que as coisas dêem certo. Vocês são incríveis!
Aos meus amigos lindos que eu amo tanto: Flora, Buchalla, Sônia, Henrique, Rodrigo, Priscila, Eduardo, Lara, Diego, Michele, Juliana. Obrigada pelo amor, pela amizade e cumplicidade.
Aos meus amigos queridos e grande equipe do LVA. Não só companheiros de trabalho, mas também de boas risadas! Matheus, Juliana, Ana Paula, Ana Caroline, Raíssa, Paulo Simas, Leonardo, Paula, Luciana, Priscila e todos outros que passaram por lá.
Aos meus pequenos: Wood e Erick, que apesar do trabalho que as vezes me dão, são meus companheiros de casa. A vida é melhor sabendo que quando estou em casa estarei na companhia de vocês.
Aos meus anjinhos que olham e cuidam de mim: meus avôs Cadorna e Miguel, minha avó Catharina e o Kidinho.
Aos amigos e colaboradores que ganhei com as etapas realizadas no CPQBA: toda a equipe do Dr. Rodney na DQPN e a equipe da Dra. Fabiana na DRM. Obrigada por me receberem tão bem, pela paciência, pelos ensinamentos, pelas ajudas, pelas conversas, risadas e cafés.
Agradeço também aos professores que gentilmente se disponibilizaram a participar da avaliação da minha tese. Tenho grande admiração por vocês e os tenho como exemplos de profissionais.
À FASPESP e CNPq pelo suporte financeiro. À UNICAMP pela formação científica.
À todos que de alguma forma estão do meu lado e me ajudam a ser uma pessoa melhor,
“A frase mais excitante que se pode ouvir na ciência, a que anuncia novos descobrimentos, não é Eureka! (o achei!) senão “é estranho”...”Issac Asimov
RESUMO
As infecções virais acometem tanto humanos quanto animais. Problemas associados a falta de vacinas e o desenvolvimento de resistência aos medicamentos estimulam a pesquisa por compostos antivirais. As bactérias são responsáveis pela produção de inúmeros compostos com atividades biológicas importantes, portanto, esse trabalho teve como objetivo a busca por compostos antivirais produzidos por bactérias coletadas em cupinzeiros. Extratos provenientes de diferentes isolados de bactérias associadas ao cupim foram avaliados quanto a atividade antiviral in vitro frente a três vírus de importância para a saúde humana e animal: herpes humano tipo 1 (HHV-1), calicivírus felino (FCV)- modelo para o norovírus humano- e o vírus da diarréia viral bovina (BVDV) – modelo para o vírus da hepatite C. Dos 90 extratos analisados, 10% apresentaram porcentagem de inibição (PI%) ≥ 98% contra pelo menos um dos vírus: cinco foram ativos frente ao HHV-1, três apresentaram atividade contra o FCV e dois foram ativos frente ao BVDV. Das espécies ativas, seis pertencem ao gênero Streptomyces, com uma delas identificada como S. chartreusis e quatro identificadas como sendo do gênero Achromobacter. Três extratos apresentaram índice de seletividade (IS) acima de 3,5 contra o HHV-1 com destaque ao CDPA10 (Streptomyces sp) com IS=17,10. Frente ao FCV e o BVDV dois extratos foram considerados promissores: o LC22 (IS=11,00), identificado como Streptomyces sp e o CDPA27 (S. chartreusis) com IS=3,5, respectivamente. Os extratos que destacaram-se quanto aos valores e IS foram também avaliados em uma triagem de mecanismo de ação. Dos três extratos com IS acima de 3,5 frente ao HHV-1, um apresentou atividade antiviral no pós tratamento. Os outros,incluindo o CDPA10 agem como inativadores virais. O extrato LC22, ativo contra o FCV apresentou atividade no pós tratamento e também como inativador viral. Por fim, o extrato proveniente do S. chartreusis (CDPA27), agiu no pós tratamento frente ao BVDV. Esses três extratos, CDPA10, LC22 e CDPA27 foram selecionados para o fracionamento em coluna C18 fase
reversa em ordem crescente de metanol, originando seis frações. Todas as frações foram avaliadas contra seus respectivos vírus e como resultado foi possível observar que a fração 6 (100% metanol) foi a mais promissora dos três extratos. Essa fração do CDPA10 e do CDPA27, ativos contra o HHV-1 e BVDV respectivamente, apresentaram valor de PI=99%, enquanto a fração 6 do extrato LC22 (ativo contra o FCV) apresentou PI=90%. Nas avaliações quanto ao IS dessas frações promissoras, observou-se que os valores aumentaram consideravelmente tanto para o CDPA10 como para o CDPA27, já a fração do LC22 teve o valor de IS reduzido para 3,24. Finalmente, todos os extratos e suas frações promissoras foram analisados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-MS). Esta análise, quando comparada aos compostos já descritos na biblioteca NIST/2005, não permitiu a identificação dos compostos devido a baixa similaridade. Estudos mais detalhados devem ser realizados a fim de identificar as espécies bacterianas e seus respectivos compostos ativos. Os resultados obtidos revelam novas perspectivas para a pesquisa antiviral a partir de produtos naturais e demonstra o potencial antiviral de compostos produzidos por bacterias associadas ao cupim.
Palavras-chave: atividade antiviral, cupinzeiro, bactérias, HHV-1, BVDV, FCV, Streptomyces
ABSTRACT
Viral infections affect both humans and animals. Problems associated with a lack of vaccines and development of drug resistance stimulates the research for antiviral compounds. Bacteria are responsible for producing many compounds with important biological activities, so this study aimed to research for antiviral compounds produced by isolated associated bacteria. Extracts from different isolated termite associated bacteria were evaluated for in vitro antiviral activity against three important viruses to human and animal health: human herpesvirus type 1 (HHV-1), feline calicivirus (FCV) - surrogate model for human norovirus -and bovine viral diarrhea virus (BVDV) - surrogate model for hepatitis C virus. Of 90 extracts analyzed, 10% had percentage of inhibition (PI%) ≥ 98% against at least one virus: five were active against HHV-1, three showed activity against FCV and two were active against BVDV. Of the active species, six belong to Streptomyces genus, with one of them identified as S. chartreusis and four were identified as Achromobacter genus. Three extracts showed selectivity index (SI) above 3.5 against HHV-1, highlighting CDPA10 (Streptomyces sp) with SI = 17.10. Against the FCV and BVDV only two extracts were considered promising: LC22 (SI = 11.00), identified as Streptomyces sp and CDPA27 (S. chartreusis) with SI = 3.5, respectively. The extracts that stood out about the values of SI were also evaluated in a screening of mechanism of action. Of the three extracts with SI above 3.5 against HHV-1, only one showed antiviral activity in post-treatment, the others, including CDPA10 act as virus inactivation. The LC22, extract active against FCV, showed activity in the post-treatment as well as virus inactivation. Finally, the extract from S. chartreusis (CDPA27), acted in the post-treatment against BVDV. These three extracts CDPA10, LC22 and CDPA27 were then selected for fractionation on column C18 phase reverse with ascending
order of methanol, resulting in six fractions. All fractions were evaluated against the respective virus and as a result was observed that the fraction 6 (100% methanol) were the most promising of the three extracts. That fraction of CDPA10 and CDPA27, active against HHV-1 and BVDV respectively, presented value of PI = 99%, while the fraction 6 of LC22 extract (active against FCV) presented PI = 90%.The SI evaluations of these promising fractions showed that the values increased substantially for both CDPA10 and CDPA27; however the fraction of LC22 extract had reduced SI value to 3.24. Finally, all extracts and their promising fractions were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). This analysis, when compared to the compounds already described in the NIST / 2005 library, it was not possible to identify them due to low similarity. More detailed studies should be performed to identify the bacterial species and their active compounds.The result of the present study provide new information for antiviral research using natural sources and demonstratesantiviral potential of compounds produced by termite associated bacteria.
Keyword: antiviral activity, termite mounds, bacteria, HHV-1, BVDV, FCV, Streptomyces
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 13
1.1 HERPESVÍRUS HUMANO TIPO 1 (HHV-1) ... 13
1.1.1 Histórico... 13 1.1.2 Classificação e morfologia ... 14 1.1.3 Replicação viral ... 16 1.1.4 Manifestações clínicas ... 18 1.1.5 Epidemiologia ... 19 1.1.6 Profilaxia e tratamento ... 20
1.2 CALICIVÍRUS FELINO (FCV)( modelo para o Norovírus humano (NoV)) ... 21
1.2.1 Histórico... 21 1.2.2 Classificação e morfologia ... 22 1.2.3 Replicação viral ... 24 1.2.4 Manifestações clínicas ... 25 1.2.5 Epidemiologia ... 26 1.2.6 Profilaxia e tratamento ... 27
1.3 VÍRUS DA DIARRÉIA VIRAL BOVINA( modelo para o Norovírus humano (BVDV)).. ... 29 1.3.1 Histórico... 29 1.3.2 Classificação e morfologia ... 30 1.3.3 Replicação viral ... 32 1.3.4 Manifestações clínicas ... 33 1.3.5 Epidemiologia ... 35 1.3.6 Profilaxia e tratamento ... 36 1.4 PRODUTOS NATURAIS ... 37 2. OBJETIVOS ... 40 2.1 OBJETIVO GERAL ... 40 2.0 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 40 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 41
3.1 AMOSTRAS VIRAIS E LINHAGENS CELULARES ... 41
3.2 PREPARO DOS EXTRATOS ... 41
3.3 ENSAIO ANTIVIRAL ... 43
3.5 ENSAIO COLORIMÉTRICO COM SAL DE TETRAZOLIUM (MTT) ... 45
3.6 CÁLCULO DO ÍNDICE DE SELETIVIDADE (IS) ... 46
3.7 TRIAGEM DO MECANISMO DE AÇÃO ... 46
3.8 IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA ATRAVÉS DO GENE 16S DO rRNA ... 47
3.9 FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS ... 48
3.10 ANÁLISE EM CG-MS ... 49 4. RESULTADOS ... 51 5. DISCUSSÃO...66 6. CONCLUSÃO ... ....73 6.1 CONCLUSÃO GERAL ... 73 6.2 CONCLUSÕES ESPECÍFICAS...73 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 75
8. ANEXO I (''Actinobacteria from Termite Mounds Show Antiviral Activity against Bovine Viral Diarrhea Virus, a Surrogate Model for Hepatitis C Virus'’)... ...90
9. ANEXO II...101
1. INTRODUÇÃO
Os vírus são a entidade biológica mais abundante e mais diversificada da biosfera (Mokili et al.,2012) gerando anualmente diversos surtos que afetam tanto a saúde pública quanto animal.
Nos últimos anos foram registrados surtos associados ao vírus Ebola nos países ocidentais do continente Africano causando febre hemorrágica(Kadav et al., 2015) e outro com distribuição quase mundial relacionado ao vírus da síndrome respiratória do Oriente Médio, um coronavírus responsável por causar doença respiratória grave, febre, tosse e falta de ar (Jalal, 2015). Ambos provocaram diversas mortes e, até o momento, não apresentam vacinas nem tratamento antiviral disponíveis.
Os problemas relacionados aos vírus não se limitam somente a surtos, também existem aqueles que já estão estabelecidos mundialmente que causam graves problemas em grande parte da população animal e humana e que também não possuem vacinas nem tratamentos antivirais, como é caso dos herpesvírus, de algumas hepatites virais e dos norovírus, ainda que este último também seja responsável por surtos esporádicos.
Dentreos vírus já conhecidos e que ainda causam muitos problemas devido a ineficiência do tratamento, despertam interesse, devido ao grande pejuízo à saúde e alta prevalência: o herpesvírus humano tipo 1 (HHV-1) conhecido como herpes labial; o vírus da diarréia viral bovina (BVDV) que, além dos problemas gerados em bovinos também é utilizado como vírus modelo para o estudo da hepatite C (VHC) e, ainda, o calicivírus felino (FCV), causador de doenças em felinos e também utilizado como modelo para o estudo dos norovirus humano(NoV).
1.1 HERPESVÍRUS HUMANO TIPO 1 (HHV-1) 1.1.1 Histórico
Os herpesvírusafetam tanto vertebrados quanto invertebrados e convivem com os humanos desde a época do ancestral comum do homem com o chimpanzé (de Souza e Chiesse, 2014). Durante essa evolução, os vírus tornaram-se fortemente associados com seus hospedeiros e co-evoluíram com eles, o que justifica o seu alto grau de adaptação (Muylaert et al., 2011; Severini et al., 2013).
Os pimeiros registros documentados do HHV-1 foi por um médico grego Hipócrates(460/377 a.C.) que, ao observar o aspecto das vesículas na pele causadas pelo vírus, o batizou de herpes, do latim herpin significa rastejar.Pouco tempo depois, um historiador grego Heródoto (484/425 a.C.) nomeou a doença causada pelo herpes de herpes febrilis devido as lesões, como úlceras nos lábios, e o aparecimento de febre nos doentes (Miranda, 2002).
Já no século XX, demonstrou-se através de estudos histológicos a presença de células gigantes multinucleadas relacionadas à infecção, além disso, comprovou-se a natureza infecciosa dessas lesões através da inoculação de material de vesículas herpéticas em córnea de coelhos (Goodpasture e Teague, 1923). Ainda nesse mesmo período, descobriu-se que esse vírus afeta uma variedade de hospedeiros um meio de cultivá-lo in vitro (Miranda, 2002). Atualmente,o HHV-1 continua sendo muito estudado devido aos problemas que ele ainda causa na saúde humana, principalmente em pacientes imunodeprimidos (Zuckerman e Limaye, 2013), a fim de conhecer melhor seus mecanismos de infeção e também na busca por novos tratamentos visto o rápido aparecimento de estirpes virais resistentes as drogas (Alvarez et al., 2015).
1.1.2 Classificação e morfologia
Os herpesvírus são pertencentes a ordem Herpesvirales, família Herpesviridae (Tischer e Osterrieder, 2010). Essa família é subdividida em três subfamílias: Alphaherpevirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae, que diferenciam-se entre si quanto as propriedades biológicas, organização e conteúdo do genoma, tipo celular no qual estabelecem latência e na duração do ciclo replicativo (Pellett e Roizman, 2007; Tischer e Osterrieder, 2010).
O HHV-1 pertence a subfamília Alphaherpesvirinae que apresenta como características específicas: latência nos gânglios sensoriais e autonômicos; ciclo replicativo curto e ampla gama de hospedeiros (Fauquet et al., 2005; Pomeranz et al., 2005).Em 1968, esse vírus foi classificado como sendo do gênero Simplexvirus por Nahmias e Dowdle, devido as suas características antigênicas e biológicas.
As partículas virais do HHV-1, em escala macromolecular, possuem cerca de 125nm de diâmetro e em média 200 MM (massa molecular), sendo compostas por ~5000 moléculas de proteínas de diversos tipos diferentes (Cardone et al., 2012).
Na Figura 1, a estrutura do HHV-1 é representada. Esses vírions do HHV-1 apresentam uma organização em quatro camadas: (A) núcleo com DNA viral; (B) capsídeo icosaédrico que circunda o núcleo; (C) tegumento; (D) envelope externo (Scrima et al., 2015).
Figura 1: Estrutura do HHV-1. (A) Núcleo; (B) Capsídeo icosaédrico; (C) Tegumento; (D) Envelope externo, adaptado de www.bio.davidson.edu/people/sosarafova/assets/bio307/jehodge/page01.html
• (A) – O núcleo contém uma cadeia dupla linear de DNA com extensão que varia entre 150-153kb com 68% de G+C (Miranda, 2002). O material genético desses vírus vem sendo estudado desde o início dos anos 1980 e hoje já existem sequências de genoma completas (McGeoch et al., 2006). O genoma desse vírus é constituido por duas regiões únicas e dois grandes conjuntos de repetições invertidas. A estrutura completa, representada na Figura2, inclui uma região única longa (UL) e outra região única curta (US) ambas revestidas por grandes cópias invertidas repetidas conhecidas como terminais e internas. Na UL, essas regiões são denominadas TRL (terminais repetidas longas) e IRL (seqüências internas repetidas longas), enquanto a US possui as TRS (terminais repetidascurtas) e IRS(seqüências internas repetidas curtas) (Szpara et al., 2014).
• (B) – O caspídeo é composto de 162 capsômeros em simetria icosaédrica. A estrutura externa é formada por quatro proteínas virais estruturais: VP5 (a principal delas), VP26, VP23 e VP19 (Arduino e Porter, 2008).
• (C) – O tegumento é uma camada proteica não estruturada localizada entre o envelope e o capsídeo composto por pelo menos 20 proteínas virais sendo a mais notável delas a VP16, uma proteína viral transativadora e a VP22 que está associada a disseminação do vírus de uma célula para outra. Além dessas, também estão presentes no tegumento a VHS, com capacidade de degradar RNA mensageiro viral e das células hospedeiras (Roizman et al., 2007).
• (D) – O envelope externo possui de 600 a 750 espículas e é contituído por uma bicamada lipídica com cerca de 11 glicoproteínas sendo quatro delas (gD, gH, gL e gB) essenciais para a entrada do HHV-1 nas células (Arduino e Porter, 2008). Além disso, o envelope contém pelo menos duas proteínas intrínsecas não glicosiladas (Roizman et al., 2007).
1.1.3 Replicação viral
O HHV-1 pode infectar diferentes tipos de células epiteliais e estabelecer infecções latentes em gânglios neuronais. A infecção lítica, ou seja aguda, requer a ativação da transcrição viral, a replicação do DNA e a produção de progênie viral, juntamente com a inativação das defesas do hospedeiro (Deng et al.,2014). Já a infecção latente está relacionada com a interrupção do ciclo replicativo, em outras palavras, não ocorre expressão gênica significativa permanecendo o genoma viral no núcleo dos neurônios (Franco et al., 2012).A replicação ocorre no núcleo da célula do hospedeiro e o HHV-1 caracteriza-se por estabelecer latência.
A fase lítica inicia-se com a primeira exposição das células epiteliais do hospedeiro seguida pela replicação viral nestas células e nos neurônios sensoriais que inervam a pele. Nas mucosas ocorrem as manifestações clínicas da infecção que duram alguns dias. Esses sintomas da infecção lítica desaparecem, entretanto a infecção persiste em um estado de latência até que o vírus é reativado devido a uma variedade de estímulos como febres, queimaduras solares, inflamações e estresses fisiológicos e/ou psicológicos (Franco et al., 2012).
A primeira etapa do ciclo replicativo inicia-se com a adsorção e penetração dos vírus às células. Esses processos estão associados a diferentes proteínas do envelope viral que interagem com os receptores celulares do hospedeiro. A adsorção, propriamente dita, ocorre
através de glicosaminoglicanas (sulfato de heparan) que aumentam a concentração de vírus na supercífie celular para que os ligantes virais encontrem os receptores. Essa interação vírus e sulfato de heparan ocorre pela ação da glicoproteína C (gC) e, em seguida, a proteína gD liga-se a correceptores da membrana plasmática. Esliga-ses correceptores podem liga-ser da família de receptores do fator de necrose tumoral (TNF) como o HVEM, da família de receptores de poliovírus como as nectinas 1 e 2 ou ainda o receptor sulfato de heparina. Após as ligações, ocorre a fusão do envelope viral à membrana plasmática a partir da ação da gD, gH-gL e gB. Com essa fusão, algumas proteínas do tegumento se dissociam do nucleocapsídeo e permanecem no citoplasma da célula do hospedeiro enquanto outras se direcionam ao núcleo (Franco et al., 2012).
Já no interior da célula infectada, o nucleocapsídeo é transportado para próximo do núcleo a partir de microtúbulos celulares, onde se associam aos poros nucleares ocorrendo a desintegração e liberação do genoma viral dentro do núcleo celular. Nesse momento, o genoma viral circulariza-se e inicia-se a transcrição através da RNA polimerase II da célula.A transcrição imediata ocorre assim que o genoma é liberado no núcelo e envolve os genes α. Esse processo depende da proteínas VP16 (do tegumento) e os produtos são as proteínas ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 e ICP47 que tem a função de estimular a continuidade da transcrição pelos genes β(Franco et al., 2012).
Dos produtos dos genes β destacam-se as enzimas timidina quinase (TK) e o ribonucleotídeo redutase (RR) que catalizam a síntese de nucleotídeos trifosfato. Além disso, também são produzidas as proteínas de ligação ao DNA: a helicase (UL9) e a DNA polimerase viral, ou seja, a expressão dos genes β possibilita uma intensa síntese de nucleotídeos e a replicação do genona viral, propriamente dito (Franco et al., 2012).
Em seguinda, os genes β deixam de se expressar e os genes γ iniciam sua expressão originando principalmente as proteínas estruturais do núcleo, capsídeo e envelope para a formação das novas partículas virais. Juntamente com a expressão dessas três classes de genes , ocorre a inibição das atividades celulares do hospedeiro(Franco et al., 2012).
A saída dos vírions infecciosos para o citoplasma celular envolve um processo de desenvelopamento e reenvelopamento: o primeiro envelope é formado a partir do brotamento do nucleocapsídeo pela membrana nuclear interna, entretanto esse envelope é perdido pela fusão do mesmo com a membrana nuclear externa. O reenvelopamento ocorre no complexo de Golgi para então serem transportadas por vesículas derivadas desse complexo (TGN) para a superfície celular sendo liberadas das células por exocitose (Melancon et al., 2004).
A infecção latente, é estabelecida após a infecção primária e ocorre nos neurônios sensoriais. Essa infecção caracteriza-se pela ausência de transcrição do genoma viral com exceção do transcrito LAT. Ainda que existam estudos que questionam a essencialidade desse transcrito para a latência, sabe-se que ele está relacionado com a eficiência e capacidade de reativação a longo prazo. A ação do transcrito LAT está associada a sobrevivência dos neurônios infectados e a inibição dos genes α, que são fundamentais para que haja a replicação lítica (Nicoll e Efstathiou, 2013).
1.1.4 Manifestações clínicas
O herpes humano está associado a úlceras mucocutâneas recorrentes (Lee et al., 2015). No caso do HHV-1, devido ao tropismo, essas lesões ocorrem principalmente na região orolabial (Bedoui e Greyer, 2014). A maioria dos casos são autolimitados com presença de feridas e vesículas na região da face, boca e lábios (Reggiori et al., 2008). Entretanto, em alguns casos em pacientes imunocomprometidos, como recém nascidos, idosos ou portadores de doenças crônicas e transplantados, esse quadro pode ser agravado induzindo a situações clinicamente mais severas com manifestações neurológicas que podem ser fatais (Harden et al., 2009; Norberg, 2010).
Além disso, apesar da maioria dos casos de herpes genital estar associado ao herpes humano tipo 2 (HHV-2), cerca de 30% dos casos tem sido relacionados ao HHV-1 (Singh et al., 2005). Contudo, nesses casos, a infecção é menos severa e tem menor taxa de recorrência sintomática quando comparada ao HHV-2 (Azwa e Barton, 2009).
A infecção primária caracteriza-se por uma incubação de até 26 dias podendo ocorrer quadros de febre, náuseas, mal estar e dor de cabeça. O início da fase aguda é abrupta e, na mucosa afetada, desenvolvem-se vesículas. As lesões que apresentam-se mais brandas podem desaparecer em até 7 dias, mas em casos mais severos a recuperação pode durar até 3 semanas (Kolokotronis e Doumas, 2006). A partir desse momento, podem ocorrer reativações virais que são antecedidas por queimação, coceira e ou formigamento, em geral na região onde ocorreu a infecção primária, seguidas pela formação de vesículas até 48 horas após esses sintomas. Esse período tende a ser o de dor mais intensa. Em seguida, as vesículasse desenvolvem em úlceras na pele e posterior formação de uma crosta. O desaparecimento das manifestações clínicas se completa espontaneamente, na maioria dos casos, em até 10 dias após a infecção (Roizman et al., 2007).
O estabelecimento e a infecção latente propriamente dita não estão associados a sinais clínicosexistindo muitos casos de reativação viral que apresentam-se assintomáticos
(Simmons, 2002). Por outro lado, também podem ocorrer muitas outras doenças relacionadas ao HHV-1 como encefalite, herpes neonatal, meningite, entre outras. A mais comum, chamada de gengivomastite herpética caracteriza-se por lesões típicas na região que envolve a mucosa da faringe. Além disso,o HHV-1 pode levar também a um quadro de ceratite herpética,ainda que menos frequente trata-se de uma doença grave que afeta o epitélio da córnea, sendo a principal causa de cegueira nos países desenvolvidos (Schleiss, 2009).
1.1.5 Epidemiologia
A infecção pelo vírus do herpes labial afeta de 45% à 98% da população mundial (Xiang et al., 2008). Essa prevalência varia consideravelmente de acordo com o grupo racial, localização geográfica (diferentes países ou até mesmo entre regiões do mesmo país), situação socioeconômica e idade (Liesegang, 2001; Miranda et al., 2002). Na infância, por exemplo, a soroprevalência pode chegar à 39% aumentando na fase adulta quando cerca de 60% à 95% dos indivíduos são afetados (Fatahzadeh e Schwartz, 2007; Conrady et al., 2010; Memish et al., 2015).
No Brasil, a prevalência de anticorpos para o HHV-1 chega a 67,2% não havendo distinção em relação ao gênero, mas aumentando conforme a idade. Além disso, essa soroprevalência não é homogênea havendo variações em relação a localização geográfica (Clemens e Farhat, 2010).
O vírus é transmitido por contato direto da mucosa ou pele não íntegra com secreções que apresentam partículas virais, ou seja, a transmissão ocorre de um indivíduoexcretando vírus para um indivíduo suscetível a partir do contato íntimo e pessoal (Rácz, 2008). O vírus também pode ser transmitido por gotículas respiratórias ou exposição à secreções mucocutâneas de uma pessoa assintomática. Além disso, cerca de 67% dos indivíduos com herpes labial carregam o vírus em suas mãos indicando a possibilidade de transmissão horizontal, apenas por contato próximo, ainda que não íntimo(Fatahzadeh e Schwartz, 2007).
Por fim, os poucos casos de infecções fatais e a capacidade de estabelecer latência contribuem para que mais da metade da população mundial apresente infecções recorrentes e, consequentemente, seja capaz de transmitir o vírus (Roizman et al., 2007).
1.1.6 Profilaxia e tratamento
O tratamento das infecções causadas pelo HHV-1 inicia-se na prevenção a partir da educação das pessoas sobre a natureza contagiosa da doença. Uma vez que a erradicação viral não é uma alternativa, tendo em vista que os agentes antivirais existentes não curam as infecções, apenas alteram o curso clínico da doença através da inibição da replicação viral diminuindo o dano epitelial, medidas para diminuir a transmissão, suprimir as recorrências, atenuar a evolução clínica, a excreção viral e suas complicações são prioridade(Fatahzadeh e Schwartz, 2007).
Muitos indivíduos infectados pelo HHV-1 não requerem tratamento, sendo necessário apenas quando a taxa de recorrência é alta e nos pacientes imunodeprimidos. Ainda assim, todos os portadores do herpes labial devem ser cuidadosos nos aspectos de higiene a fim de evitar a contaminação de lugares e pessoas (Simón, 2012). Para os pacientes que necessitam, existem diversos antivirais para o tratamento do herpes labial. O mais conhecido deles é o Aciclovir (ACV®), um análogo da deoxiguanosina (guanina+molécula acíclica) que tem sua ação baseada na fosforilação do antiviral pela timidina quinase viral inibindo a síntese de DNA total. Outro antiviral muito usado por via oral e que apresenta uma biodisponibilidade maior é o Valaciclovir® que, após sua ingestão, é rapidamente convertido em aciclovir (Rácz, 2008). Entretanto, um dos maiores problemas relacionados ao tratamento do herpes labial é o aparecimento de cepas contendo mutações na timidina quinase e/ou na DNA polimerase, gerando estirpes virais resistentes a esses medicamentos (McClain et al., 2015).
Por outro lado, existem também o Foscarnet® e o Cidofovir®, que por apresentarem mecanismo de ação diferentes do ACV, podem ser uma alternativa no tratamento do herpes labial causado por cepas virais que possuem resistência ao aciclovir e seus derivados(Miranda, 2002). Infelizmente, ambostêm uma fraca biodisponibilidade oral, têm de ser administrados por via intravenosa e já foi relatado resistência viral (Andrei e Snoeck, 2013). Além disso, mesmo com a utilização da dose recomendada de todos esses antivirais, foram relatados inúmeros efeitos colaterais, principalmente associados a neurotoxicidade e disfunção renal (Mancini et al., 2009; McClain et al., 2015).
Com relação a vacinas, ainda que hajam muitos estudos em busca de uma vacina eficaz contra o herpes, não só labial causado pelo HHV-1 mas também pelo herpes genital, causado principalmente pelo HHV-2, até o momento não há nenhuma disponível contra esses vírus (Szpara et al., 2011).
Enfim, com toda essa problemática associada ao herpes labial, principalmente em pacientes imunodeprimidos, somado a resistência desse vírus contra os antivirais disponíveis comercialmente e a falta de vacinas, torna-se necessária a busca por novos compostos que apresentem atividade antiviral e que possam ser utilizados para a produção de novos fármacos, possivelmente com menores efeitos colaterais.
1.2 CALICIVÍRUS FELINO (FCV)
( modelo para o Norovírus humano (NoV)) 1.2.1 Histórico
Os calicivírus possuem um amplo espectro de hospedeiros acometendo uma grande variedade de animais, incluindo o ser humano. O primeiro relato de um calicívírus foido vírus do exantema vesicular dos suínos (VESV) em meados de 1930 devido a uma epidemia associada aos suínos, nos Estados Unidos. Os sintomas eram muito semelhantes ao da febre aftosa, ainda que o hospedeiro fosse outro. Posteriormente, verificou-se que se tratava de um novo agente viral (Thiel e König, 1999; Neill e Bauermann, 2012).
O calicivírus felino (FCV) foi isolado pela primeira vez em cultura celular em 1957 na Nova Zelândia e classificado como membro da família Picornaviridae. No entanto,tornou-se evidente que esse novo vírus era diferente dos picornavírus em relação a sua estrutura, estratégia de replicação e propriedades físico-químicas. Com isso, em 1978 o FCV foi retirado da família Picornaviridae (Green et al., 2000).
A doença causada pelo FCV também foi confundida com a panleucopenia felina (FPLV), vírus este membro da família Parvoviridae. Entretanto notou-se que o vírus isolado causava um efeito citopático em cultivos celulares em um período muito curto após a inoculação questionando a atribuição da doença ao FPLV. Dessa forma, o FCV foi classificado como sendo da família Caliciviridae(Neill e Bauermann, 2012).
Em humanos, o primeiro caso associado aos calicivírus humanos ficou conhecido como “winter vomiting disease” que ocorreu em uma escola primária em Norwalk em Ohio (Estados Unidos), mas na época não foi atribuído ao surto nenhum agente etiológico. Em 1972, Kapikian e seus colaboradores demostraram por imunoeletromicroscopia que o agente era um vírus que ficou conhecido como “Norwalk virus” (NoV) (Hutson et al., 2004). Em 1977, outro surto de gastroenterite ocorreu no Japão, na cidade de Sapporo e foi descoberto
um outro vírus muito semelhante ao NoV mas antigenicamente distinto, chamado de “Sapporo virus” (SV) (Santos, 2002).
Atualmente, sabe-se que os calicivírus em humanos são os principais responsáveis pelas epidemias de gastroenterites.Entretanto, não existe uma terapia antiviral específica para o tratamento dos pacientes infectados (Garcicoechea et al., 2015). Além disso, o calicivírus de felinos (FCV) é um patógeno extremamente contagioso e está presente mundialmente nas populações de felinos (Radford, 2009). Também para esta infecção, não existe nenhum tratamento antiviral específico (Fenimore et al., 2015).
1.2.2 Classificação e morfologia
Os calicivírus são membros da família Caliciviridae que é composta por cinco gêneros que diferenciam-se entre si pelas diferenças genéticas e antigênicas: Lagovirus, Vesivirus, Nebovirus, Sapovirus e Norovirus (Sandoval-Jaime et al., 2012). Desses gêneros, os três primeiros são responsáveis por causar doenças principalmente em animais e os dois últimos estão associados a doenças em humanos (Neill e Bauermann, 2012).
O FCV pertence ao gênero Vesivirus que tem como importante característica, diferentes dos outros vírusda mesma família, a capacidade de afetar ao mesmo tempo animais terrestes e marinhos possuindo uma ampla variedade de hospedeiros de diferentes classes como mamíferos, aves, répteis, peixes e anfíbios (Sandoval-Jaime et al., 2012; Martella et al., 2015). Além disso, os membros desse gênero tem a capacidade de se replicarem em cultivo celular causando um efeito citopático visível em microscopia óptica (Miao et al., 2015).
As partículas virais do FCV, assim como dos outros vírus da família Caliciviridae são pequenas com cerca de 27-40nm, com diâmetro de 35nm e não envelopadas. O nome “calivírus” vem da conformação da superfície das partículas virais que possui depressões em forma de cálice (Neill e Bauermann, 2012).
Os vírions do FCV apresentam duas estruturas: (A)núcleo com o RNA viral (B) capsídeo icosaédrico(Figura 3).
Figura 3: Estrutura do FCV com seu capsídeo e genoma de RNA destacados http://viralzone.expasy.org/all_by_species/197.html
• (A) – O genoma
comprimento de cerca de 7,7kb e possui uma proteína denominada VPg que liga através de uma ligação covalente na extremidade
extremidade 3’(Abente et al., 2010). Esse geno
(sequência aberta de leitura). A primeira delas (ORF 1) é responsável pela codificação das proteínas não estruturais (NS1
polimerase. A ORF 2 codifica a principal proteína do caspídeo
3 codifica outra proteína estrutural (VP2) (Radford et al., 2007; Abente et al., 2010). Sua organização genômica se assemelha muito aos norovírus (NoV) e por
incapaz de ser cultivado biologia e desenvolver novas virais para tratar águ
de doentes (Bae e Schwab, 200
semelhança da organização genônica do FCV
a
b
A
3: Estrutura do FCV com seu capsídeo e genoma de RNA destacados http://viralzone.expasy.org/all_by_species/197.html
O genoma é RNA de cadeia simples com polaridade positiva. Apresenta comprimento de cerca de 7,7kb e possui uma proteína denominada VPg que liga através de uma ligação covalente na extremidade 5’ e que é poliadenilada na
(Abente et al., 2010). Esse genoma possui
de leitura). A primeira delas (ORF 1) é responsável pela codificação das proteínas não estruturais (NS1-NS6/7), entre elas a protease
polimerase. A ORF 2 codifica a principal proteína do caspídeo (VP1)
outra proteína estrutural (VP2) (Radford et al., 2007; Abente et al., 2010). Sua organização genômica se assemelha muito aos norovírus (NoV) e por
incapaz de ser cultivadoin vitro, o FCV é amplamente utilizado desenvolver novas drogas antivirais frente ao NoV para tratar águas que podem estar contaminadas e, també
(Bae e Schwab, 2008; Shivanna et al., 2014). A organização genônica do FCV (a) e, abaixo, do NoV
B
3: Estrutura do FCV com seu capsídeo e genoma de RNA destacados. Adaptado de
RNA de cadeia simples com polaridade positiva. Apresenta comprimento de cerca de 7,7kb e possui uma proteína denominada VPg que liga-se 5’ e que é poliadenilada na três diferentes ORFs de leitura). A primeira delas (ORF 1) é responsável pela codificação NS6/7), entre elas a protease viral e a RNA (VP1). Por fim, a ORF outra proteína estrutural (VP2) (Radford et al., 2007; Abente et al., 2010). Sua organização genômica se assemelha muito aos norovírus (NoV) e por este ser amplamente utilizado para compreender a frente ao NoV, como inativadores também, para o tratamento ). A Figura 4 demonstra do NoV (b).
Figura 4:Organizações genômicas dos vírus FCV (A) e NoV (B), adaptado de Neille Bauermann, 2012
• (B) – O capsídeo é icosaédrico constituído por 90 dímeros da principal proteína estrutural (VP1) e cerca de 10 cópias de outra proteína estrutural (VP2) (Abente et al., 2010;Shivanna et al., 2014). A proteína VP1 é subdividida em seis regiões devido a diferenças quanto a conservação das sequências, sendo as regiões B, D e F as mais conservadas e as regiões C e E mais variáveis. Assim, a região E tem sido utilizada como base para diferenciar estirpes. Além disso, essas regiões hipervariáveis também estão associadas a ligação do vírus aos receptores celularespodendo definir as características antigênicas das diferentes cepas. Quanto a VP2, ainda não está muito clara a sua função, entretanto acredita-se que ela esteja envolvidacom a infectividade viral e, juntamente com a VP1, com a estabilidade do capsídeo. (Radford et al., 2007; Abente et al., 2010; Shivanna et al., 2014).
1.2.3 Replicação viral
A penetração das partículas virais nas células envolve consecutivas interações entre os fatores virais e a célula, entre elas estão: a ligação dos vírus às células, mediada por receptores, a liberação do genoma viral e o início da replicação (Shivanna et al., 2014).
A etapa da penetração ocorre por endocitose e é um processo pH dependente, ou seja, a entrada dos vírions de FCV nas células exige uma acidificação do pH (Kreutz and Seal, 1995). Quanto a liberação do genoma viral, pode ocorrer na membrana plasmática, em caso de penetração direta, ou nos endossomas ou ainda em outros compartimentos celulares (Shivanna et al., 2014).
A replicação ocorre em vesículas da membrana formadas no citoplasma das células infectadas e o RNA, sendo de polaridade positiva, funciona como RNA mensageiro (Santos, 2002; Bailey et al., 2010).
Inicialmente a tradução do genoma é mediada por interações entre a proteína VPg com a maquinaria celular. O RNA genômico, como citado anteriormente, possui três ORFs. A tradução da primeira delas (ORF 1) produz uma poliproteína que posteriormente será clivada pela protease formando as proteínas não estruturais, como a replicase viral, a protease de cisteína e a helicase de RNA. A primeira delas é responsável pela síntese de uma cópia do
RNA com polaridade negativa, ou seja no sentido antigenômico. Esse RNA antigenômico é utilizado como molde para a síntese deum RNA mensageiro subgenômico (mRNAsg). A ORF 2 depende da ação desse mRNAsg, originado pelo RNA antigenômico e, dessa forma, se produz a principal proteínaestrutural do capsídeo, aVP1. A terceira e última ORF (ORF 3) também será traduzida a partir do mRNAsg e codifica a VP2, outra proteína estrutural que também faz parte do capsídeo. O empacotamento do RNA viral, a maturação e a liberação dos vírions ainda não está elucido. (Green, 2007; Neill e Bauermann, 2012). Contudo, sabe-se que replicação do FCV é lítica, ou seja, induz a apoptose das células infectadas permitindo a liberação e consequente disseminação dos vírions que podem infectar novas células (Alvarez-Sanchez et al., 2015).
O FCV, sendo um vírus de RNA e por não possuir um mecanismo de correção de possíveis erros durante a replicação, apresenta um elevado grau de mutações e, consequentemente, uma garnde capacidade adaptativa, tornando ainda mais difícil seu controle (Radford et al., 2007).
1.2.4 Manifestações clínicas
A doença causada pelo FCV é comum em gatos domésticos, mas acomete toda a população de felinos (Radford et al., 2009). Na maioria dos casos as infeções são moderadas e auto-limitadas. Entretanto, com a grande variabilidade genética, as manifestações clínicas variam entre os diferentes isolados e, em geral,incluem conjutivite, ulceração oral, doença das vias respiratórias superiores e, nos casos mais graves, pode se estabelecer uma doença sistêmica virulenta por FCV associada a uma alta taxa de morbidade e mortalidade (Abente et al., 2010; Burmeister et al., 2015).
O principal sítio de replicação do FCV é a orofaringe e a viremia acontece cerca de 3 – 4 dias após a infecção, quando o vírus também pode ser detectado em diferentes tecidos. Nesse momento, ocorre a necrose das células epiteliais e as vesículas que surgem as margens da língua tornam-se úlceras. A cura completa ocorre, aproximadamente, após 2 ou 3 semanasmas os gatos ainda continuam sendo transportadores do vírus por tempo variável, desde meses até anos. Nos casos do estabelecimento da doença sistêmica virulenta por FCV, a manifestação ocorre como vasculite generalizada envolvendo diversos orgãos, além dos possíveis quadros de pirexia, edema cutâneo, dermatite ulcerativa, anorexia e icterícia. Essa doença sistêmica pode causar a morte de até dois terços dos gatos infectados. Nos gatos que
se recuperam, a doença aguda desaparece em cerca de 30 dias, mas eles continuam portadores dos vírus por muito mais tempo (Radford et al., 2009; Henzel et al., 2012).
Apesar das semelhanças que permitem a utilização do FCV como modelo para o estudo dos nororvírus, as manifestações clínicas que eles causam em seus respectivos hospedeiros são diferentes, sendo o primeiro mais associado a doenças no trato respiratório e o segundo a males no trato gastrointestinal (Bae e Schwab, 2008).
Nos casos do calicivírus humano, os norovírus (NoV) são a principal causa de casos esporádicos e surtos de gastroenterites no mundo todo (Cancio-Lonches et al., 2011; Alvarez-Sanchez et al., 2015). O NoV é altamente infeccioso, ou seja, uma baixa dose infecciosa, menos de 10-100 partículas virais, é capaz de infectar um indivíduo e causar a doença gerando sintomas como náuseas, cólicas abdominais, vômitos e diarréia (Chiu et al., 2015).
A infeção pelo NoV pode ser também assintomática, cerca de 15-35% dos casos, naquelas sintomáticas, os primeiros sinais podem aparecer entre 24-48 horas após a exposição viral e inicialmente, pode se desenvolver um quadro febril (Newman e Leon, 2015).A fase aguda do NoV geralmente dura de 1 a 3 dias. Nos casos de pacientes imunocompetentes a recuperação é rápida, ainda que seja possível detectar partículas virais até 30 dias após a infecção. Entretanto a doença pode ser mais grave e tornar-se fatal em idosos e pacientes imunocomprometidos podendo a excreção viral persistir por meses ou até anos (Garaicoechea et al., 2015)
Nos últimos anos têm-se associado o desenvolvimento de doenças como a síndrome do intestino irritado ou mesmo a piora nos quadros de doença inflamatória intestinalcomo possíveis sequelas da doença causada pelo NoV(Newman e Leon, 2015).
1.2.5 Epidemiologia
O FCV é um vírus comum na população de gatos e não possui hospedeiros alternativos. O homem não pode ser infectado por ele. A prevalência é proporcional a quantidade de gatos no mesmo ambiente e é ainda maior se esses gatos vivem agregados, ou seja, em gatos domésticos que vivem em pequenos grupos é cerca de 10%, enquanto que em grandes grupos, como em abrigos, a prevalência pode chegar a 40% (Radford et al., 2009).
A excreção viral ocorre principalmente por secreções nasais e orais durante a fase aguda da doença, apesar de muitos gatos continuarem transmitindo o vírus após a recuperação (Radford et al., 2009). A transmissão ocorre pelo contato direto entre os gatos que estão infectados e aqueles que são susceptíveis. Casos de transmissão indireta também podem ocorrer através de secreções de animais infectados que podem contaminar comedouros, bebedouros entre outros objetos(Henzel et al., 2012).
Os norovirus (NoV), por sua vez, são a causa mais comum de casos esporádicos e epidemias de gastroenterites não bacterianas no mundo. Nos EUA, o número estimado de casos de contaminação é de cerca de 5,5 milhões de indivíduos anualmente, enquanto que na Ingraterra esse número é de 2 milhões por ano(Newman e Leon, 2015; Phumpholsup et al., 2015). Nos países em desenvolvimento o número de hospitalizações é de cerca de 1,1 milhão de indivíduos anualmente e cerca de 200.000 mortes de crianças de até 5 anos de idade (Fioretti et al., 2014). Em países com ainda menos recursos, como a África e o Sudeste da Ásia, a gastroenterite causada pelo NoV e outros agentes são as principais causas de morbidade e mortalidade, principalmente em crianças (Newman e Leon, 2015).
No Brasil, os NoV são prevalentes em surtos de gastroenterites. A infecção por esse vírus é muito comum já que ele é amplamente disseminado em diversos ecossistemas aquáticos brasileiros, como águas residuárias urbanas e hospitalares no Rio de Janeiro, Florianópolis e em águas costeiras na regiao Sul (Prado e Miagostovich, 2014).
Os NoV podem ser transmitidos de forma direta de indivíduo para indivíduo ou a partir de fezes e vômito de pessoas infectadas ou através da ingestão de alimentos ou água contaminada. A contaminação de alimentos pode ocorrer pela manipulação e preparação deles sem os devidos cuidados de higiene, ou ainda, estar relacionado ao ambiente que também pode estar contaminado e, assim, a ingestão deles cru, como no caso de peixes, moluscos e saladas pode também ser responsável pela transmissão do vírus. Além disso, a transmissão também pode ocorrer a partir da ingestão de gelo feito com água ou material contaminado(Richards, 2012).
1.2.6 Profilaxia e tratamento
A principal forma de profilaxia contra o estabelecimento da infecção causada pelo FCV em gatos é a utilização de vacinas, já aplicada a mais de 20 anos (Abente et al., 2010).
No caso dos gatos de estimação que não vivem em grandes populações, essa vacinação tem se mostrado, na maioria das vezes, eficaz. Entretanto, quando os gatos vivem em grupos maiores a vacinação deve ser cuidadosamente acompanhada devido a possíveis falhas vacinais causadas pela ausência do estabelecimento de uma imunidade esterelizante (Radford et al., 2007; Abente et al., 2010).
Todas as vacinas licenciadas contra o FCV são baseadas em antígenos virais produzidos em cultura celular. São de aplicação parenteral ou intranasal, mas esta última menos frequente, e a maioria delas são monovalentes, ou seja, possuem apenas uma estirpe viral com o vírus inativado ou atenuado. Contudo, o maior problema das vacinas utilizadas atualmente é a varibilidade antigênica das estirpes do FCV, pois nenhuma vacina é eficaz para neutralizar todos os isolados, portanto, é provável a ocorrência de um escape viral (Radford et al., 2007).
Quanto ao tratamento daqueles animais que já tem a infecção estabelecida, não há antivirais específicos. Nos últimos anos, a utilização de interferons tem sido aplicada para o redução dos sinais clínicos, mas esse tratamento não está disponível mundialmente. Além disso, existem relatos da utilização desses antivirais que não foram eficazes nem para o tratamento, nem para evitar a excreção viral pelos animais portadores do vírus (Fenimore et al., 2015)
A situação para o controle e tratamento dos calicivírus em humanos, no caso os norovírus (NoV), é ainda mais complicada, já que não existem vacinas nem tratamentos antivirais disponíveis. Vacinas compostas de vírus recombinantes estão sendo avaliadas, entretanto, apesar da necessidade de uma vacina polivalente, o número de componentes antigênicos necessários para que haja uma ampla proteção ainda não está estabelecido . Além disso, essa vacina apresenta uma proteção de curto intervalo, até 60 dias. (Garaicoechea et al., 2015).
Atualmente, a melhor maneira de evitar a propagação do vírusé a descontaminação de superfícies e ambientes, cuidados no contato com pessoas infectadas e a higienização para manipulação de alimentos (Glass et al., 2009).
Em casos de infecção pelo NoV, o tratamento é sintomático, pois ainda não foram desenvolvidos agentes antivirais específicos. Em geral, recomenda-se reidratação com líquidos e eletrólitos, seja por via oral ou intravenoso, em casos mais graves. Medicamentos
anti-motilidade e anti-secretores também podem ser utilizados para reduzir o quadro de diarréia em situações mais críticas (Glass et al., 2009).
Finalmente, com todos os problemas de falhas vacinais e ausência de vacina para a prevenção do FCV e do NoV respectivamente, e a falta de tratamento específico para ambos calicivírus, a busca por compostos que podem vir a ser utilizados pela indústria para a formulação de drogas antivirais é essencial para que haja o tratamento dos pacientes, principalmente nos quadros mais graves.
1.3 VÍRUS DIARRÉIA VIRAL BOVINA (BVDV) (modelo para o vírus da Hepatite C (VHC)) 1.3.1 Histórico
O primeirorelato da doença causada pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) foi no ano de 1946, em um rebanho em NovaYork e foi descrito por Olafson e seus colaboradores como uma doença infecciosa e aguda de bovinos. Após esse episódio, uma doença semelhante, mas mais grave foi relatada no Canadá, sendo considerada a primeira descrição da doença das mucosas em bovinos. Em 1953, foi observado que a doença das mucosas tinha algumas características em comum com a doença causada pelo BVDV, mas ainda acreditava-se que se tratavam de doenças distintas.No ano de 1957,o agente causadorda doença das mucosas foi isolado em cultivo celular causando efeito citopático e, no mesmo ano, isolou-seo vírus causador da doença do BVDVque não produziu efeito citopático.Poucos anos depois, pesquisadores da Universidade de Cornell isolaram um BVDV com efeito citopático e na tentativa de esclarecer a natureza dos vírus causadores das duas doenças, diarréia viral e doença das mucocas, estudos de caracterização viral e propriedades físicas e antigênicas foram analisados emambos e foi estabelecida a similaridade entre eles (Goens, 2002; Deregt, 2008).
Mais tarde descobriu-se que essa dúvida sobre se tratarem de vírus diferentes foi devido a existência de dois biotipos diferentes:Um deles citopático e outro não citopático e pela capacidade do vírus de atravessar a placenta e estabelecer infecção e imunotolerância no feto que ao nascer continua infectado persistentemente (PI). Caso esses animais PI sofram uma nova infecção pelo BVDV, dessa vez citopático, o quadro se agrava e desenvolve-se a doença das mucosas. Nos casos onde não acontece essa infecção dos animais PI as
manifestações clinicas são mais brandas. De qualquer forma, o vírus responsável por ambas situações é oBVDV (Ridpath et al., 2012).
No Brasil, os primeiros estudos sorológicos foram realizados na década de 70, no Rio Grande do Sul, mas há relatos clínico-patológicos e sorológicos que confirmaram a presença do BVDV no país desde o final dos anos 60 (Flores et al., 2005).
Além de sua importância na veterinária, o BVDV apresenta grande similaridade quanto ao arranjo genômico com outro membro de sua família de muita importância para os seres humanos, o vírus da hepatite C (VHC)(Goens, 2002). Esse, por sua vez, só foi descoberto em 1989 após muitos anos de investigação que permitiu a identificação do seu genoma. O VHC foi o responsável por 80%- 90% das hepatites agudas e crônicas pós transfusionais não- hepatite A e não- hepatite B. Nesse mesmo ano, estabeleceu-se que o VHC possuia características biológicas peculiares que o diferenciava dos outros agentes hepatotrópicos (da Fonseca, 2010).
1.3.2 Classificação e morfologia
O BVDV pertence a família Flaviviridae, responsável por doenças clinicamente significativas tanto em animais como em humanos. Todos os membros dessa família compartilham similaridades quanto a estrutura dos vírions, organização genômica e estratégias de replicação (Finkielsztein et al., 2010). Essa família possui três gêneros: Flavivirus, que são transmitidos principalmente por insetos, como o vírus da febre amarela e a dengue;Pestivirus, do qual o BVDV faz parte; Hepacivirus que tem como único membro o VHC, vírus exclusivamente humano. Os dois últimos gêneros compartilham um alto grau de similaridade(Sako et al., 2008; Lattwein et al., 2012; Ridpath et al., 2012).
O gênero Pestivirus, inclui agentes patogênicos economicamente importantes exclusivamente de animais, entre eles, além do vírus da diarréia viral bovina (BVDV), também fazem parte o vírus da peste suína clássica (CSFV) e o vírus da doença da fronteira (BDV) (Wang et al., 2015). Todos esses vírus que compõe o genêro Pestivirus são antigenicamente relacionados ainda que a reatividade sorológica cruzada entre eles seja baixa, e isso pode acontecer também entre diferentes isolados do mesmo tipo de vírus (Ridpath et al., 2012).
O BVDV apresenta grande variabilidade antigênica e pode ser dividido em dois grupos genética e antigenicamente distintos: BVDV-1 e o BVDV-2 , o primeiro esta associado a baixa/moderada virulência e, além disso, mais comumente utilizado como referência para a produção de vacinas por ser o mais prevalente. O genótipo 2 (BVDV-2) está
mais relacionado aos surtos com doença aguda e hemorrágica (Ridpath et al., 2012; Anziliero et al., 2015).
As amostras do BVDV podem ainda ser classificados como citopatogênicos ou não-citopatogênicos, baseado nas suas características em cultura celular (Brodersen, 2014). Possuem em média diâmetro de 40-60nm, ou seja, são pequenos vírions e genomade RNA (Finkielsztein et al., 2010).
Esse vírions possuem organização em 3 camadas: (A) núcelo com o RNA viral; (B) capsídeo icosaédrico que circunda o núcleo; (C) envelope externo (Figura 5).
Figura 5: Estrutura do BVDV. (A) Núcleo; (B) Capsídeo; (C) Envelope externo. Adaptado de http://viralzone.expasy.org/all_by_species/39.html
• (A) –O núcleo contém o genoma de RNA em cadeia simples e senso positivo de aproximadamente 12,3kb de extensão. Os genes C, Erns, E1 e E2 sãoestruturais enquanto os NS são não estruturais (Rice, 1996). O RNA genômico contém somente uma sequência aberta de leitura (ORF) e não é poliadenilado na extremidade 3’, nem tem uma proteína viral na extremidade 5’. Nessas regiões existem extensões nucleotídicas que não são traduzidas (5’UTR e 3’ UTR), que se dobram e formam estruturas secundárias que interagem com proteínas virais e celulares e, dessa forma, regulam a transcrição do RNA e a tradução da ORF(Neill, 2013).Essa estrutura genômica é semelhante ao VHC, além de compartilharem um elevado grau de homologia quanto as estratégias de expressão de proteínas e replicação (Grassman et al., 2005).Como o VHC não replica-sede maneira eficiente em cultivo, o BVDV tem sido amplamente utilizado para a avaliação de novos compostos com propriedades antivirais (Buckwold et al., 2003). A semelhança entre os genomasdo BVDV (a) e
A B
VHC (b), i.e. a presença das UTRs e as regiões de codificação das proteínas NS, ilustrada na Figura 6.
Figura 6:Organizações genômicas dos vírus BVDV 2015
• (B) – O capsídeo viral
Apresenta-se como uma estrutura eletrodensa de diâmetro de aproximadamente 30 e simetria icosaédrica
Finkielsztein et al., 2010
• (C) – O envelope externo lipídica derivada
glicoproteínas associadas: E
glicoproteínas são as regiões de maior variabilidade e tem um papel importante nos estágios iniciais da infecção celular
funciona como âncora de também a mais variável dos vírions nas células (
liga a glicosaminoglicanos, característica que indica uma participação no primeiro contato do vírus com as células permissivas
1.3.3 Replicação viral
As proteínas estruturais do BVDV (C, E
saída das partículas virais da célula infectada.A primeira etapa da replicação, a adsorção viral, ocorre principalmente por meio da interação da glicoproteína E2 com receptores espec nas superfícies das células
a presença das UTRs e as regiões de codificação das proteínas NS, 6.
nizações genômicas dos vírus BVDV (a) e VHC (b), adaptado de
O capsídeo viral localiza-se em torno do RNA viral, no centro da partícula. se como uma estrutura eletrodensa de diâmetro de aproximadamente 30 simetria icosaédrica, composto por várias cópias da proteína
Finkielsztein et al., 2010).
envelope externo circunda o nucleocapsídeo e é constituido das membranas das células do hospedeiro
glicoproteínas associadas: Erns, E1 e E2(Ridpath, 2005; Ridpath et al., 2012
glicoproteínas são as regiões de maior variabilidade e tem um papel importante nos estágios iniciais da infecção celular(Ronecker et al., 2008
funciona como âncora de membrana para a glicoproteína E2, que é
m a mais variável e imunogênica. Juntas elas estão relacionadas a nas células (Toth et al., 1999; Fu et al., 2014). Já a glicoproteína E liga a glicosaminoglicanos, característica que indica uma participação no primeiro contato do vírus com as células permissivas (Wegelt et al., 2009)
1.3.3 Replicação viral
As proteínas estruturais do BVDV (C, Erns, E1 e E2) estão associadas a entrada e saída das partículas virais da célula infectada.A primeira etapa da replicação, a adsorção viral,
por meio da interação da glicoproteína E2 com receptores espec células permissivas(Fino et al., 2012).Em seguida, heterodímeros das
a presença das UTRs e as regiões de codificação das proteínas NS, está
), adaptado de Isken et al.,
do RNA viral, no centro da partícula. se como uma estrutura eletrodensa de diâmetro de aproximadamente 30 nm a proteína C (Ridpath, 2005;
nstituido por uma bicamada das membranas das células do hospedeiro possuindo três Ridpath, 2005; Ridpath et al., 2012).Essas glicoproteínas são as regiões de maior variabilidade e tem um papel importante nos (Ronecker et al., 2008).A glicoproteína E1 membrana para a glicoproteína E2, que é a mais abundante e . Juntas elas estão relacionadas a penetração Já a glicoproteína Erns se liga a glicosaminoglicanos, característica que indica uma participação no primeiro
).
estão associadas a entrada e saída das partículas virais da célula infectada.A primeira etapa da replicação, a adsorção viral, por meio da interação da glicoproteína E2 com receptores específicos Em seguida, heterodímeros das
glicoproteínas E1 e E2 tem ação direta para a penetração dos vírions nas células, enquanto a Erns parece não ser fundamental para esse processo (Ronecker et al., 2008). Essa penetração ocorre por endocitose e com a dimuição do pH nos endossomas, ocorre a fusão do envelope viral com a membrana do endossoma seguida da dissociação do capsídeo e liberação do RNA genômico no citoplasma (Ridpath et al., 2012).
Sendo o BVDV um vírus com genoma RNA de polaridade positiva, quando este é liberado no citoplasma, funciona como RNAm, portanto é imediatamente traduzido. No caso deste vírus, a tradução origina uma única poliproteína que devido a ação de proteases tanto celulares como virais, é clivada produzindo as proteínas estruturais e as não estruturais (NS) (Murray et al., 2008). Essas proteínas não estruturais estão envolvidas no processo de replicação do genoma viral agindo como proteases, helicase, cofatores e RNA polimerase. Dessa forma, ocorre a síntese de RNA complementar antigênico, ou seja, com polaridade negativa que, por sua vez, é utilizado como molde para a síntese dos RNA´s da progênie viral (Murray et al., 2008; Fino et al., 2012). Em seguida, inicia-se a montagem do nucleocapsídeo a partir da combinação das proteínas estruturais com o RNA genômico e a morfogênese viral, processo esse que ocorre em associação com o complexo de Golgi e retículo endoplasmático liso. Os novos vírions permanecem em vacúolos no citoplasma para então serem liberados por exocitose através da fusão desses vacúolos com a membrana celular (Ridpath et al., 2012)
O VHC, além da semelhança na organização genômica, também apresenta estratégias replicativas muito similares ao BVDV, já que ambos utilizam como receptor o LDL para penetrar nas células hospedeiras e utilizam um IRES (“internal ribossome entry site”) similares quanto sua função para a realização da tradução. Ademais, ambos tem uma helicase NS3/ATPase, utilizam um NS4A com sua protease homóloga NS3 e uma RNA polimerase dependente de RNA NS5B, todas semelhantes entre si. Por fim, as etapas finais da replicação, ou seja, a maturação e liberação dos vírions, também parecem ser equivalentes. Dessa forma, justifica-se novamente a utilização do BVDV na busca por compostos bioativos contra o VHC (Buckwold et al., 2003).
1.3.4 Manifestações Clínicas
A infecção causada pelo BVDV pode ter uma grande variedade de manifestações clínicas. Nos casos dos imunocompetentes, os quadros são clinicamente discretos com recuperação do animal naturalmente. Nos demais, as manifestações são mais graves podendo, por vezes, ser fatal (Nishine et al., 2014).
Além da condição imunológica do animal, infecções simultâneas com outros patógenos, a cepa viral ou biótipo e, no caso das fêmeas, a fase de gestação também determinam a severidade da infecção aguda (Ridpath et al., 2012).
Em geral, o vírus da diarréia viral bovina está associado a doença respiratória e reprodutiva, ainda que tenha sido inicialmente identificado em casos de doença gastroentérica (Flores et al., 2005). No caso de animais prenhes ocorre a infecção direta do feto e o dano da infecção será determinado pelo tempo de gestação. A infecção nos primeiros estágios são as que causam maior impacto reprodutivo (Ridpath, 2010).Nesses casos, podem ocorrer entre outras manifestações: reabsorção fetal, mumificação, mal formação congênita e desenvolvimento de animais PI (persistentemente infectado, portador do BVDV não citopático). O aborto pode ocorrer devido a infecção em qualquer momento da gestação e, no caso de infecções no terço final da gestação, em geral os bezerros nascem normais, livres do vírus e soropositivos (Ridpath et al., 2012).
Os bezerros que nascem PI geralmente são soronegativos, imunotolerantes e clinicamente normais, entretanto excretam uma grande quantidade de vírus de maneira contínua e, a maioria, morre nos primeiros meses de vida. Caso esse animal seja infectado também por outro biótipo do vírus (BVDV citopático) desencadeia-se a doença das mucosas que, por sua vez, é fatal (Ridpath et al., 2012; Flores et al., 2005).
No caso do vírus da hepatite C, o qual o BVDV é utillizado como modelo de estudo, os sinais clínicos são bem diferentes em humanos, espécie naturalmente hospedeira. Mesmo os sítios de replicação de cada um deles difere-se entre si, sendo que o BVDV tem como sítio de replicação as células do epitélio do trato respiratório superior, orofaringe e tecido linfóide regional, enquanto o VHC apresenta tropismo por hepatócitos e células mononucleares sangüíneas (Conte, 2000; Ridpath et al., 2012).
A infecção aguda por VHC, quando sintomática são comuns o surgimento de febre, náuseas, vômitos, dores absominais e icterícia (Santos, 2002). Contudo, na maioria das vezes, apresenta-se como benigna e assintomática, entretanto, dos infectados cerca de 70% desenvolvem a infecção crônica (Lavanchy, 2011). Apesar desta infecção crônicageralmente não apresentar manifestações clínicas inicialmente, ela é uma das principais responsáveis pela cirrose hepática, carcinoma hepatocelular e transplantes de fígado, a longo prazo, ou seja, com a evolução da doença (Echevérria et al., 2015).
