Marcação química de jundiás Rhamdia quelen com alizarina vermelha

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA. MARCAÇÃO QUÍMICA DE JUNDIÁS Rhamdia quelen COM ALIZARINA VERMELHA. Dissertação submetida ao Programa de PósGraduação em Aquicultura, Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito para a obtenção do título de mestre em Aquicultura. Orientador: Evoy Zaniboni Filho. ANA ROSA SANTÁNNA DE SÁ. Florianópolis 2014.

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(3) Marcação química de jundiás Rhamdia quelen com alizarina vermelha Por ANA ROSA SANT'ANNA DE SÁ Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de MESTRE EM AQUICULTURA e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura.. _____________________________________ Prof. Alex Pires de Oliveira Nuñer, Dr. Coordenador do Programa. Banca Examinadora: __________________________________________ Dr. Evoy Zaniboni Filho – Orientador __________________________________________ Dr. Alex Pires de Oliveira Nuñer __________________________________________ Dr. Giuliano Palemão Carlos Maia Huergo __________________________________________ Dra. Renata Maria Guereschi.

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(5) "Se não posso dançar, não é minha revolução" (Emma Goldman).

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(7) AGRADECIMENTOS Primeiro de tudo agradeço a minha mãe, Dona Vera, a mulher mais forte do mundo (em todos os aspectos), que sempre esteve ao meu lado “pra puxar a orelha” ou dar “aquele abraço”, por toda a força, amor e por fazer as melhores e mais deliciosas comidas. Mamãe, amo você! Aos meus “irmãos prediletos”, Renato e Renan, por me agüentarem triste/feliz/com raiva, sempre com as melhores piadas, as melhores palavras de conforto “vai estudar mandriona”, as pizzas, as brigas, considero vocês pra caramba!! Ao meu pai, que deixou saudades infinitas, muitas lembranças boas, que papai e Rufão sejam melhores amigos onde quer que estejam! Aos familiares que acreditaram nessa jornada, sempre dando apoio. Ao Carlos, companheiro, que viu essa jornada desde o início (nossa quanto tempo hein!), que me agüenta todos os dias, estando sempre ao meu lado, pelo amor e carinho, e por tornar essa caminhada mais prazerosa e alegre. Aos amigos “pombônicos”, pelo companheirismo, pelas risadas a mil, as melhores resenhas, a amizade, que guardarei para sempre. Aos amigos “do Cazé” que agora são meus também, sempre estiveram ali, a gente que não se enxergava. Agora tudo junto e misturado, aprendemos e compartilhamos tantas coisas que não trocaria vocês pelo filme do Pelé, jamais! À Samara e Prof. Evoy por toda a assistência, pelas orientações e sugestões, e pela experiência profissional. Para todos que estiveram presentes e de algum modo ajudaram e apoiaram nos meus estudos, eu agradeço de coração, sem vocês esse objetivo não seria possível, nem tão agradável e divertido..

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(9) RESUMO Desde a construção dos primeiros empreendimentos hidrelétricos grandes esforços têm sido empregados na tentativa de mitigar os impactos e manejar a ictiofauna. Ao desenvolver ações de repovoamento é necessário fazer uma avaliação destas atividades através de monitoramentos contínuos. Um pré-requisito fundamental antes de qualquer avaliação eficaz do sucesso das ações de estocagem é uma identificação confiável dos peixes introduzidos. A aplicação de marcas químicas é considerada uma técnica de grande potencial para monitoramento de estocagens, pois permite marcar grandes lotes de peixes nos variados estágios de vida. Diversos protocolos têm sido utilizados para a marcação química. A introdução do marcador pode ser feita através de injeção, ingestão alimentar e banho de imersão. O objetivo deste estudo foi definir os procedimentos de marcação química com Alizarina Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen. Foram testadas três concentrações de Alizarina Vermelha (30mg/L, 60mg/L e, 90mg/L) com tempo de imersão de 18 horas (banho longo), sendo divididos em dois grupos: a) com prévia indução osmótica salina, quando os peixes foram mantidos em solução a 30ppt de NaCl durante 10 minutos e imediatamente submetidos ao banho com o marcador; b) sem indução osmótica, quando os peixes foram diretamente submetidos ao banho com o marcador, e três concentrações de Alizarina Vermelha (90mg/L, 300mg/L e 700mg/L) com tempo de imersão de 10 minutos (banho curto), todos com prévia indução osmótica salina (solução aquosa de NaCl a 30ppt) durante 10 minutos. Todos os tratamentos apresentaram a marcação química após uma semana, sendo os melhores resultados obtidos nos tratamentos de 90mg/L com choque osmótico (banho longo) e o tratamento de 300mg/L realizado em banho curto. Na reavaliação das marcas, feita após três meses do banho imersão no marcador químico foi possível notar que todos os tratamentos continham marcas visíveis, tendo melhores resultados nos tratamentos submetidos ao choque osmótico, que apresentaram marcas mais intensas. A indução osmótica antes do banho de imersão no marcador químico Alizarina Vermelha resultou em uma maior intensidade nas marcações. A Alizarina Vermelha foi verificada com eficácia como marcador químico em banhos de imersão para jundiá Rhamdia quelen. Palavras-chave: Indução osmótica, banho de imersão, fluormarcador, nadadeira caudal..

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(11) ABSTRACT Since the construction of the first large hydropower developments many efforts have been employed in an attempt to mitigate the impacts and manage fish populations. When developing restocking actions it is necessary to evaluate these activities through continuous monitoring. A fundamental prerequisite before any effective evaluation of the success of these actions is a reliable identification of the introduced fish. The application of chemical marks is considered a technique of great potential for monitoring restocking actions because it allows large batches of fish in various stages of life. Several protocols have been used for chemical marking. The aim of this study was to define the procedures for chemical marking using Alizarin Red for the catfish Rhamdia quelen. Three concentrations of Alizarin Red (30mg/L, 60mg/L and 90mg/L) were tested with immersion time of 18 hours (long bath), divided into two groups: a) with a prior osmotic saline induction (30ppt) for 10 minutes; b) without osmotic induction: and three concentrations of Alizarin Red (90mg/L, 300mg/L and 700mg/L) with immersion time of 10 minutes (short bath), all of them with a prior osmotic saline induction (30ppt) for 10 minutes. All treatments showed the chemical marking after a week, with the best results for the 90mg/L treatment with osmotic shock (long bath) and for the 300mg/L treatment (short bath). On the reevaluation of the marks after three months it was possible to observe that all treatments contained visible marks, with the best results being in the treatments subjected to osmotic shock, which showed stronger marks. The osmotic induction before bath immersion in the chemical marker Alizarin Red resulted in a greater intensity in the labeling. The Alizarin Red was verified effectively as a chemical mark in immersion baths for catfish Rhamdia quelen.. Keywords: osmotic induction, immersion bath, chemical marking, caudal fin.

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(13) LISTA DE FIGURAS Figura 1: Raios da nadadeira caudal de jundiá R.quelen submetidos a marcação com Alizarina Vermelha e observados em Scanner CONFOCAL TCS SP5. ......................................................................... 30 Figura 2: Intensidade de fluorescência após uma semana do banho de imersão em Alizarina Vermelha. Banhos com duração de 18 horas nas concentrações de 30mg/L (a), 60mg/L (b) e 90mg/L (c), ou submetidos aos banhos com duração de 18 horas precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 30mg/L (d), 60mg/L (e) e 90mg/L (f). Banhos com duração de 10 minutos e precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 300mg/L (g), 700mg/L (h) e 90mg/L (i). ......................................... 32 Figura 3: Intensidade de Fluorescência dos raios das nadadeiras de jundiá depois de uma semana do banho de imersão em Alizarina Vermelha, (A) banho longo (18 horas), (B) banho em concentrações de 90 mg/L precedido pelo choque osmótico em banho curto (10 minutos ) e banho longo (18 horas), (C) banho curto (10 min).. ........... 33 Figura 4: Intensidade de fluorescência após três meses da aplicação do banho de imersão em Alizarina Vermelha. Banhos com duração de 18 horas nas concentrações de 30mg/L (a), 60mg/L (b) e 90mg/L (c), ou submetidos aos banhos com duração de 18 horas precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 30mg/L (d), 60mg/L (e) e 90mg/L (f). Banhos com duração de 10 minutos e precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 300mg/L (g), 700mg/L (h) e 90mg/L (i). ......................................... 34 Figura 5: Intensidade de Fluorescência dos raios das nadadeiras de jundiá depois de três meses da aplicação do banho de imersão em Alizarina Vermelha, (A) banho longo (18 horas), (B) banho em concentrações de 90 mg/L precedido pelo choque osmótico em banho curto (10 minutos ) e banho longo (18 horas), (C) banho curto (10 min).. ............................................................................................... 35.

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(15) LISTA DE TABELAS Tabela 1: Parâmetros de qualidade de água durante os banhos de imersão com Alizarina Vermelha. ......................................................... 31.

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(17) SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................... 19 OBJETIVO GERAL ............................................................................. 23 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................ 23 ABSTRACT .......................................................................................... 24 MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 28 RESULTADOS ..................................................................................... 31 DISCUSSÃO ......................................................................................... 36 CONCLUSÃO ...................................................................................... 39 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 40 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO GERAL .. 42.

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(19) 19. INTRODUÇÃO GERAL Desde a construção dos primeiros empreendimentos hidrelétricos grandes esforços têm sido empregados na tentativa de mitigar os impactos e manejar a ictiofauna, seja através da construção de mecanismos de transposição para peixes, da implantação de programas de estocagem ou da instalação de pisciculturas (Pelicice; Agostinho; Agostinho, 2009). A estocagem de peixes, também conhecida como repovoamento ou peixamento, é uma das ações de manejo mais aplicada em todo o mundo (Welcomme, 1988). As estocagens, como forma de manejo, podem ser classificadas, segundo Agostinho et al. (2007), em: introdução, utilizando espécies não nativas para estabelecer populações sustentáveis; manutenção, na qual as ações são repetidas anualmente visando manter uma espécie que não se reproduz naturalmente no novo ambiente (reservatório); suplementação, quando a ação busca aumentar a população ou melhorar a variabilidade genética de uma determinada espécie de peixe. Os dois últimos casos são usualmente chamados de repovoamento, pois tratam de ações de estocagem com espécies nativas. O repovoamento às vezes se faz necessário para recompor os estoques naturais e promover a preservação de uma espécie (Weingartner et al., 2008), sendo também amplamente utilizados para reabilitar espécies de peixes ameaçadas (Cowx, 1994). Ao desenvolver ações de repovoamento é necessário fazer uma avaliação destas atividades através de monitoramentos contínuos, que pode se dar por meio de pescas experimentais ou também do acompanhamento das atividades pesqueiras. Um pré-requisito fundamental antes de qualquer avaliação eficaz do sucesso das ações de estocagem é uma identificação confiável dos peixes introduzidos (Champigneullee, Cachera, 2003). Como forma de monitoramento e identificação dos indivíduos utilizados nas estocagens pode ser feita a marcação destes com marcas externas e internas, como PIT tags, DART tags, T-bars e outras, que apesar da fácil visualização, tem como principal problema a necessidade da marcação individual de grandes lotes de peixes, além da possibilidade de extravio destas marcas, impossibilitando assim a avaliação adequada dos resultados das estocagens. Para contornar essa problemática, tem sido utilizada a marcação química das estruturas ósseas dos peixes..

(20) 20. A Marcação Química A marcação química consiste em utilizar substâncias que se ligam aos tecidos calcificados dos peixes e quando expostas à luz ultravioleta (UV) ficam fluorescentes (Isben; Urist, 1964 apud Fielder, 2001). Segundo Taylor et al. (2005) a imersão em produtos químicos que apresentam fluorescência sob luz UV e ligam-se a extremidade crescente do osso permite a marcação de um grande número de juvenis com relativamente pouco esforço e, geralmente, resultam em uma boa retenção da marca ao longo do tempo associado a uma mortalidade mínima. Diversas substâncias fluormarcadoras têm sido utilizadas para marcação química como Alizarina Complexona (ALC), Oxitetraciclina (OTC), Alizarina Vermelha (ALZ) e Azul de Calceína, tendo resultados satisfatórios em Scophthalmus maximus (Iglesias; Rodriguéz-Ojea, 1997), em Perca flavescens (Unkenholz; Brown; Pope, 1997), em Sparus aurata (Sánchez-Lamadrid, 2001), Argyrosomus japonicus (Taylor et al., 2005), Coregonus lavaretus (Eckmann, 2003), Oncorhynchus mykiss e O. tshawytscha (Negus; Tureson, 2004), Acipenser sturio (Lochet; Jatteau, 2011) e Stizostedion vitreum (Brooks; Heidinger; Kohler, 1994). A introdução do marcador pode ser feita através de injeção, ingestão alimentar e banho de imersão (Lagardére, 2000). A marcação em banhos de imersão, quando o produto é aplicado em uma solução e absorvido através das brânquias, é a mais utilizada, pois apresenta maior custo-benefício, podendo ser administrada em grandes lotes de peixes, demandando menor tempo quando comparada aos outros métodos, reduzindo o manejo, o estresse e a mortalidade dos peixes (Nielsen, 1992). Diversos protocolos são utilizados para marcação química. Para marcação com OTC, Fielder (2001) sugeriu doses de 700mg/L em banhos de imersão de 8 horas; Iglesias e Rodriguéz-Ojea (1997) utilizaram ALC em doses de 60mg de em banhos de 24 horas, enquanto Lagardére, Thibaudeau e Anras (2000) recomendam doses de ALZ de 400mg/L em banhos de 24 horas. Taylor et al. (2005) encontraram resultados satisfatórios com ALC em doses de 30 -60mg/L e com OTC na concentração de 600mg/L em banhos de imersão de 6 a 12 horas. Uma técnica que permite uma redução considerável no tempo de contato entre os peixes e as soluções de marcação foi mostrada por Alcobendas et al. (1991), com a enguia européia Anguilla anguilla que.

(21) 21. mostrou uma rápida absorção de corantes fluorocromo quando imerso em uma solução hiperosmótica antes do banho de imersão na solução de marcação. Ao expor os peixes à água com alta salinidade, é gerada uma condição em que o ambiente externo é hiperosmótico em relação aos fluidos do corpo do peixe. Conte (1969) afirma que o meio salino provoca uma perda de água obrigatória através da pele, brânquias e rim (em menor grau), por causa das diferentes concentrações osmóticas. Subsequentemente, quando os peixes são abruptamente transferidos para uma solução de marcação, a diferença osmótica resulta em uma absorção rápida da solução, passando por osmose através da pele e brânquias, diminuindo o tempo do banho de imersão necessário para a inclusão de uma mesma quantidade do marcador. A visualização das marcas químicas é realizada através do microscópio de fluorescência com lâminas feitas a partir das estruturas calcificadas: escamas, otólitos e segmento da vértebra (Babaluk; Craig, 1990). O microscópio de fluorescência transmite um cone de luz de excitação que passa através dos filtros, por espelho dicróico específico e da lente objetiva padrão até a amostra. A luz é parcialmente absorvida ou refletida pela amostra. Segundo Maeda (2013) o efeito da fluorescência ocorre quando incide excitação eletromagnética no material. Os marcadores fluorescentes possuem espectros característicos exclusivos para absorção (ou excitação) e emissão de luz, portanto, é necessário escolher o filtro de luz apropriado para observar a luz fluorescente emitida por cada marcador (Lichtman; Conchello, 2005). A aplicação de marcas químicas é considerada uma técnica de grande potencial para monitoramento de estocagens, pois permite marcar grandes lotes de peixes nos variados estágios de vida (ovos, larvas e juvenis) (Tsukamoto; Umezawa, 1988; Secor; Houde, 1995) O Rhamdia quelen De nome popular jundiá, a espécie Rhamdia quelen pertence à seguinte divisão taxonômica: classe Osteichthyes, série Teleostei, ordem Siluriformes, família Heptapteridae, gênero Rhamdia (Silfvergrip, 1996). Esta espécie, segundo Baldisserotto et al. (2010), apresenta distribuição desde o sudeste do México ao centro da Argentina. Rhamdia quelen habita lagos e poços fundos dos rios, ambientes de águas mais calmas com fundo de areia e lama, junto às margens e.

(22) 22. vegetação. Abrigam-se entre pedras e troncos apodrecidos e à noite saem à procura de alimento (Guedes, 1980). Quanto a sua alimentação, o jundiá, na fase adulta apresenta hábito onívoro e sua preferência por um determinado alimento é decorrente da abundância do mesmo no local (Guedes, 1980; Meurer; Zaniboni Filho, 1997; Gomiero; Souza; Braga, 2007). De acordo com Guedes (1980), a observação dos organismos encontrados no conteúdo gastrointestinal da espécie, indica não serem restritos ao habitat bentônico, sugerindo que o Rhamdia quelen é generalista com relação à escolha de alimento. O Rhamdia quelen atinge a maturidade sexual no primeiro ano de vida (Baldisserotto, 2010). Seu período reprodutivo pode variar de um ano para outro, sendo que no sul do Brasil considera-se entre agosto e março (Gomes et al., 2000). A espécie é ovulípara, realiza migração lateral e, no habitat natural, quando estão prontos para desovar, grandes cardumes de jundiá procuram lugares de água rasa, limpa, com pouca correnteza e com fundo pedregoso. Acredita-se que há um sincronismo entre machos e fêmeas durante a desova, ocorrendo durante o amanhecer (Godinho et al., 1978; Andreatta, 1979). O jundiá, como integrante da ictiofauna de importantes bacias hidrográficas brasileiras, também é afetado pela construção de barragens ao longo do leito dos rios. Com o barramento de um rio, a hidrologia local é severamente alterada, levando a criação de novos habitats (Agostinho et al., 2007). Após o represamento, a comunidade de peixes a se constituir é primariamente dependente da fauna preexistente na região alagada. As adaptações e particularidades de cada espécie determinarão quais terão sucesso na exploração de novos habitats (Fernando; Holcík, 1982; Agostinho; Miranda; Bini; Gomes; Thomaz; Suzuki, 1999). De acordo com Agostinho et al. (2007), nos reservatórios, a natureza recente das interações entre a ictiofauna, a modificação nos habitats e os procedimentos operacionais nas barragens tornam esses ambientes altamente estocásticos e, portanto, sujeitos a maiores flutuações populacionais, tornando assim indispensável a utilização de ações ambientais. Como forma de monitoramento de ações de estocagens este trabalho visa contribuir com uma metodologia de marcação química com Alizarina Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen. O presente trabalho será submetido à publicação na revista Neotropical Ichthyology..

(23) 23. OBJETIVO GERAL Definir os procedimentos de marcação química com Alizarina Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen. OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Determinar o tempo ideal de imersão para a marcação química do jundiá Rhamdia quelen;  Definir a concentração ideal da Alizarina Vermelha para os banhos de marcação;.

(24) 24. Marcação química de Jundiás Rhamdia quelen com alizarina vermelha Ana Rosa SantÁnna de Sá1*, Samara Hermes-Silva1, Evoy ZaniboniFilho1 1. Laboratório de Biologia e Cultivo de Peixes de Água Doce – LAPAD/CCA/UFSC Rodovia SC 406, nº 3532, CEP 88066-000, Armação, Florianópolis/SC, Brasil. *Corresponding author: anarosa.sa@gmail.com ABSTRACT The need for proper technique for marking large batches of fish in a variety of sizes, species and detection intervals is a constant challenge for managers who wish to evaluate restocking actions. A marking tool which receives increasing attention is the group of chemical marks. Several protocols have been used for chemical marking. The aim of this study was to define the procedures for chemical marking using Alizarin Red for the catfish Rhamdia quelen. Three concentrations of Alizarin Red (30mg/L, 60mg /L and 90mg/L) were tested with immersion time of 18 hours (long bath), divided into two groups: a) with a prior osmotic saline induction (30ppt) for 10 minutes; b) without osmotic induction; and three concentrations of Alizarin Red (90mg/L, 300mg/L and 700mg/L) with immersion time of 10 minutes (short bath), all of them with prior osmotic saline induction (30ppt) for 10 minutes. All treatments showed the chemical marking after a week, with the best results for the 90mg/L treatment with osmotic shock (long bath) and for the 300mg/L treatment (short bath). On the reevaluation of the marks after three months it was possible to observe that all treatments contained visible marks, with the best results being in the treatments subjected to osmotic shock. The osmotic induction before bath immersion in the chemical marker Alizarin Red resulted in a greater intensity in the labeling. The Alizarin Red was verified effectively as a chemical mark in immersion baths for catfish Rhamdia quelen. Keywords: osmotic induction, immersion bath, chemical marking, caudal fin.

(25) 25. RESUMO A necessidade de uma técnica adequada para marcação de grandes lotes de peixes em uma variedade de tamanhos, espécies e intervalos de detecção é um desafio constante para órgãos gestores que desejam avaliar ações de estocagens. Uma ferramenta de marcação que recebe cada vez mais atenção é o grupo das marcas químicas. Diversos protocolos têm sido utilizados para a marcação química. O objetivo deste estudo foi definir os procedimentos de marcação química com Alizarina Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen. Foram testadas três concentrações de Alizarina Vermelha (30mg/L, 60mg/L e, 90mg/L) com tempo de imersão de 18 horas, sendo divididos em dois grupos: a) com prévia indução osmótica salina, quando os peixes foram mantidos em solução a 30ppt de NaCl durante 10 minutos e imediatamente submetidos ao banho com o marcador; b) sem indução osmótica, quando os peixes foram diretamente submetidos ao banho com o marcador. E três concentrações de Alizarina Vermelha (90mg/L, 300mg/L e 700mg/L) com tempo de imersão de 10 minutos, todos com prévia indução osmótica salina (solução aquosa de NaCl a 30ppt) durante 10 minutos. Todos os tratamentos apresentaram a marcação química após uma semana, sendo os melhores resultados obtidos nos tratamentos de 90mg/L com choque osmótico (banho longo) e o tratamento de 300mg/L realizado em banho curto. Na reavaliação das marcas, feita após três meses do banho imersão no marcador químico foi possível notar que todos os tratamentos continham marcas visíveis, tendo melhores resultados nos tratamentos submetidos ao choque osmótico. A indução osmótica antes do banho de imersão no marcador químico Alizarina Vermelha resultou em uma maior intensidade nas marcações. A Alizarina Vermelha foi verificada com eficácia como marcador químico em banhos de imersão para jundiá Rhamdia quelen. Palavras-chave: Indução osmótica, banho de imersão, fluormarcador, nadadeira caudal.

(26) 26. INTRODUÇÃO A necessidade de uma técnica adequada para marcação de grandes lotes de peixes em uma variedade de tamanhos, espécies e intervalos de detecção é um desafio constante para órgãos gestores que desejam avaliar ações de estocagens (Negus & Tureson, 2004). Uma das formas de monitoramento das estocagens é o uso de marcas externas e internas nos peixes (PIT tags, DART tags, T-bars e outras), no entanto, apesar da fácil visualização destas marcas, seu principal problema consiste na marcação de grandes lotes, além da possibilidade de extravio ou perda, prejudicando assim a avaliação adequada dos resultados das estocagens. Uma ferramenta de marcação que recebe cada vez mais atenção é o grupo das marcas químicas, que dependem de compostos fluormarcadores que rotulam tecidos ósseos ou calcificados dos peixes (Mohler, 2003), e que quando expostas à luz ultravioleta (UV) ficam fluorescentes (Isben; Urist, 1964 apud Fielder, 2001). Diversas substâncias fluormarcadoras têm sido utilizadas para marcação química, tais como Alizarina Complexona, Oxitetraciclina, Alizarina Vermelha e Azul de Calceína. O método mais comum de se fazer a marcação química consiste nos banhos de imersão, quando o produto é aplicado em uma solução e absorvido através das brânquias. Este método é o mais utilizado, pois apresenta maior relação custo-benefício, podendo ser administrado em grandes lotes de peixes, demandando menor tempo quando comparado aos demais métodos, reduzindo o manejo, o estresse e a mortalidade dos peixes (Nielsen, 1992). Muitos trabalhos têm empregado a Alizarina Vermelha como marcador químico em banhos de imersão (Campanella, 2013; Liu et al., 2009; Crook et al., 2007; Lagardére, 2000), sendo observadas marcas intensas em otólitos, raios da nadadeira caudal e espinhos peitorais em Odontesthes bonariensis, Paralichthys olivaceus, Macquaria ambígua, e Scophthalmus maximus. Uma técnica que tem sido utilizada para possibilitar uma redução considerável no tempo de contato entre os peixes e as soluções de marcação é aquela que associa aos banhos de imersão o choque osmótico prévio, que consiste em imergir os peixes em uma solução hiperosmótica antes da realização do banho de marcação. Ainda que diversos protocolos tenham sido utilizados para a marcação química, não há registro de estudos desenvolvidos com espécies nativas das bacias hidrográficas brasileiras. O jundiá, como.

(27) 27. integrante da ictiofauna de importantes bacias hidrográficas brasileiras, também é afetado pela construção de barragens ao longo do leito dos rios. Esta espécie, segundo Baldisserotto et al. (2010), apresenta distribuição desde o sudeste do México ao centro da Argentina, habita lagos e poços fundos dos rios, ambientes de águas mais calmas com fundo de areia e lama, junto às margens e vegetação. Abrigam-se entre pedras e troncos apodrecidos e à noite saem à procura de alimento (Guedes, 1980). Devido à necessidade de marcar grandes lotes de peixes e a ausência de estudos desta técnica em peixes nativos do Brasil, o objetivo deste estudo foi definir os procedimentos de marcação química com Alizarina Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen, em diferentes concentrações e tempos de imersão associados ao choque osmótico..

(28) 28. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no Laboratório de Biologia e Cultivo de Peixes de Água Doce (LAPAD) do Departamento de Aqüicultura (CCA - Centro de Ciências Agrárias) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Os 334 juvenis de Rhamdia quelen utilizados foram provenientes da reprodução induzida, realizada em março de 2013, de indivíduos do plantel de reprodutores oriundos da bacia do rio Uruguai. Os juvenis foram mantidos em 28 tanques de 20 litros ligados ao sistema de recirculação de água (salinizado com NaCl a 2,5ppt), sendo alimentados manualmente três vezes ao dia com náuplios de artêmia e ração farelada. Marcação dos Juvenis Os procedimentos para os testes de marcação foram realizados com juvenis de aproximadamente 40 mm + 210 mm de comprimento total, mantidos em uma biomassa de 9g/L por tanque (7 litros de volume útil). Foram testadas três concentrações de Alizarina Vermelha (30mg/L, 60mg/L e, 90mg/L) com tempo de imersão de 18 horas (banho longo), sendo divididos em dois grupos: a) com prévia indução osmótica salina, quando os peixes foram mantidos em solução a 30ppt de NaCl durante 10 minutos e imediatamente submetidos ao banho com o marcador; b) sem indução osmótica, quando os peixes foram diretamente submetidos ao banho com o marcador, e três concentrações de Alizarina Vermelha (90mg/L, 300mg/L e 700mg/L) com tempo de imersão de 10 minutos (banho curto), todos com prévia indução osmótica salina (solução aquosa de NaCl a 30ppt) durante 10 minutos. Todos os testes foram realizados com três repetições e um tanque controle, sendo monitorados os valores de oxigênio dissolvido, temperatura e pH. No preparo das soluções de Alizarina Vermelha para os banhos de marcação, para garantir a estabilização do pH, foi utilizada uma solução de 20% NaOH afim de manter o ph entre 6,5 e 7,5. Durante os banhos de choque osmótico e com a solução de marcação os peixes permaneceram em jejum, e sem troca de água. Para o choque osmótico foram realizados testes preliminares até uma concentração de 30g/L (30ppt) com banho de 10 minutos. Após os banhos de imersão, todos os peixes foram transferidos aos tanques de 20 litros mantidos ligados ao sistema de recirculação de água do laboratório..

(29) 29. Observação das Marcas A observação das marcas foi realizada uma semana após os tratamentos, sendo que a permanência destas marcas foi reavaliada três meses depois da marcação. Foram analisados três peixes por tanque (nove peixes por tratamento). As lâminas para a observação das marcas foram confeccionadas com uma amostra da nadadeira caudal colocada entre lâmina e lamínula e lacrada com esmalte incolor. Para a visualização e registro das marcas, as lâminas foram analisadas sob um microscópio LEICA DMI6000 B com filtro UV na faixa de 405 a 660nm, sob aumento de 50x; o registro fotográfico foi obtido a partir do Scanner CONFOCAL TCS SP5 acoplado ao microscópio utilizando-se o software CONFOCAL LEICA LAS AF lite. Todas as imagens foram obtidas utilizando-se o mesmo aumento e tempo de exposição. As imagens foram avaliadas quanto à presença ou ausência da marca e sua intensidade avaliada em uma escala de 0 a 255 em Valores de Cinza (VC) a partir de uma área amostral igual para todas as imagens obtidas (figura 1). Para medição da intensidade da marcação, foi selecionada a área com a maior intensidade de fluorescência de cada imagem. Análise Estatística A intensidade de fluorescência dos diferentes tratamentos foi avaliada através de uma Análise de Variância (ANOVA), seguido do teste de Tukey, quando necessário. Todas as análises foram realizadas utilizando-se o programa STATISTICA 7.0. Para essas análises, foi utilizado o valor médio obtido pela leitura da intensidade obtida em cada um dos três peixes de cada repetição. Foram comparados os tratamentos submetidos aos banhos longos, aos banhos rápidos e para a concentração de 90mg/L (com choque osmótico) entre os diferentes tempos de exposição ao banho de marcação. Para todas as análises foi utilizado 0,05 como o nível de significância estatística..

(30) 30. Figura 1: Raios da nadadeira caudal de jundiá R.quelen submetidos a marcação com Alizarina Vermelha e observados em Scanner CONFOCAL TCS SP5. Em detalhe elipse que indica a região selecionada para mensurar a intensidade da marcação e quadro contendo os valores da intensidade de fluorescência medida em valores de cinza..

(31) 31. RESULTADOS Durante os banhos de marcação não houve nenhuma mortalidade e a qualidade da água foi mantida próxima ao conforto da espécie (tabela 1). Tabela 1: Parâmetros de qualidade de água durante os banhos de imersão com Alizarina Vermelha. Duração do Banho 18 h 10 min. Temperatura (°C). Salinidade (ppt). Dureza (mgCaCO3/L). pH. 24,8 26,4. 0,24 0,26. 197 197. 7,60 7,02. Oxigênio Dissolvido (mg/L) 6,51 7,37. Todos os tratamentos apresentaram a marcação química nos raios das nadadeiras após uma semana da aplicação (figura 2). Na avaliação entre os tratamentos de banho longo a concentração de 90mg/L e 60mg/L, ambos precedidos pelo choque osmótico, proporcionaram marcas mais intensas e que apresentaram diferença significativa em relação aos outros tratamentos, que apresentaram marcas mais tênues. Na análise entre os tratamentos com a mesma concentração (90mg/L) e tempos diferentes (18 horas e 10 min.), o tratamento de banho longo apresentou melhor absorção da Alizarina Vermelha e resultou na formação de marcas mais intensas em comparação ao tratamento de banho curto. Entre os tratamentos de banho curto, as concentrações de 300mg/L e 700mg/L não mostraram diferenças entre si, embora tenham produzido marcas mais intensas que as obtidas com o tratamento de 90 mg/L (figura 3). Na reavaliação das marcas, realizadas três meses depois do banho de imersão, foi observado que todos os tratamentos ainda apresentavam a marcação química (figura 4). Não houve diferença quanto à intensidade das marcas entre os tratamentos de banho longo. Quando comparados os tratamentos de 90mg/L aplicados em diferentes tempos de exposição (banho longo e curto), ambos precedidos do choque osmótico, não foram observadas diferenças significativas na intensidade da marca. Na avaliação entre as concentrações aplicadas em banho curto, o tratamento de 300mg/L produziu marcas mais intensas e que apresentaram diferença significativa em relação aquelas produzida pelo tratamento de 90mg/L, mas não apresentou diferença aquelas produzidas pelo tratamento de 700mg/L (figura 5)..

(32) 32. Figura 2: Intensidade de fluorescência após uma semana do banho de imersão em Alizarina Vermelha. Banhos com duração de 18 horas nas concentrações de 30mg/L (a), 60mg/L (b) e 90mg/L (c), ou submetidos aos banhos com duração de 18 horas precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 30mg/L (d), 60mg/L (e) e 90mg/L (f). Banhos com duração de 10 minutos e precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 300mg/L (g), 700mg/L (h) e 90mg/L (i)..

(33) 33. Figura 3: Intensidade de Fluorescência dos raios das nadadeiras de jundiá depois de uma semana do banho de imersão em Alizarina Vermelha, (A) banho longo (18 horas), (B) banho em concentrações de 90 mg/L precedido pelo choque osmótico em banho curto (10 minutos ) e banho longo (18 horas), (C) banho curto (10 min). Letras iguais correspondem médias iguais (P>0,05)..

(34) 34. Figura 4: Intensidade de fluorescência após três meses da aplicação do banho de imersão em Alizarina Vermelha. Banhos com duração de 18 horas nas concentrações de 30mg/L (a), 60mg/L (b) e 90mg/L (c), ou submetidos aos banhos com duração de 18 horas precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 30mg/L (d), 60mg/L (e) e 90mg/L (f). Banhos com duração de 10 minutos e precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 300mg/L (g), 700mg/L (h) e 90mg/L (i)..

(35) 35. Figura 5: Intensidade de Fluorescência dos raios das nadadeiras de jundiá depois de três meses da aplicação do banho de imersão em Alizarina Vermelha, (A) banho longo (18 horas), (B) banho em concentrações de 90 mg/L precedido pelo choque osmótico em banho curto (10 minutos ) e banho longo (18 horas), (C) banho curto (10 min). Letras iguais correspondem médias iguais (P>0,05)..

(36) 36. DISCUSSÃO Diversos estudos foram realizados para avaliar marcadores químicos em peixes, em sua maioria foi analisada a marcação química produzida em otólitos e escamas, sendo que o primeiro caso um método destrutivo que exige o sacrifício do peixe, além de necessitar de um tempo adicional para o preparo dos otólitos para a observação em lâminas, fatores que dificultam sua utilização e impedem a reavaliação contínua destas marcas. A utilização das escamas para análise da marcação fica excluída dos peixes de couro, como o jundiá, devido à ausência dessas estruturas nos Siluriformes. Stewart & Long (2011) ao avaliarem marcação química com Oxitetraciclina em Ictalurus punctatus nos otólitos e espinhos peitorais, observaram erosão nos anéis dos espinhos peitorais, relatando a difícil visualização das marcas, fator que impediu uma reavaliação adequada. Campanella et al. (2013) ao avaliar marcação química em Odontesthes bonariensis, nos otólitos, escamas e nadadeira caudal, verificaram que após 1 ano do banho de imersão apenas as marcas da nadadeira caudal continuavam visíveis. O presente estudo avaliou a marcação química nos raios da nadadeira caudal dos peixes, sendo coletadas sem a necessidade do sacrifício dos indivíduos. Na avaliação das marcas feita após uma semana do banho de imersão, foi observado que as marcas localizaram-se nas extremidades dos raios da nadadeira caudal. Na avaliação feita depois de três meses da marcação, essas marcas estavam localizadas mais distante da extremidade dos raios, evidenciando que o crescimento dos raios ocorrido ao longo dos três meses não impediu a visualização das marcas. Os resultados deste trabalho mostram a eficácia da Alizarina Vermelha para marcação química em banhos de imersão, semelhante ao observado por Eckmann (2003), Crock et al (2007), Liu et al. (2009) e Campanella et al. (2013), que obtiveram sucesso na marcação química de peixes com Alizarina Vermelha. Apesar das variações observadas na intensidade das marcas, essa marcação dos raios da nadadeira caudal do jundiá foi confirmada em todos os tratamentos, tanto na análise feita depois de uma semana quanto aquela realizada depois de três meses da aplicação do banho de imersão. Esses resultados mostram que a Alizarina Vermelha pode ser usada para a marcação química do jundiá em banhos de imersão, confirmando o seu potencial de uso na pesquisa biológica e na avaliação de programas de estocagem, atendendo aos.

(37) 37. requisitos preconizados por alguns autores (Liu et al., 2009, Crook et al., 2007, Campanella et al., 2013). A indução osmótica realizada antes do banho de imersão no marcador químico Alizarina Vermelha resultou em uma maior intensidade nas marcações observadas neste trabalho. Resultados semelhantes foram observados por Mohler (2003) que utilizou Calceína como marcador para Salmão do Atlântico, e Campanella et al. (2013) que aplicaram a Alizarina Vermelha para marcação de Odontesthes bonariensis. Ao expor os peixes a uma solução contendo uma alta salinidade, é criada uma condição em que o ambiente externo fica hiperosmótico em relação aos fluidos corporais do peixe, induzindo a perda de água pelos peixes promovida pelo diferencial osmótico (Conte, 1969), assim quando os peixes são posteriormente transferidos para a solução de marcação, a situação se inverte e os fluidos corporais dos peixes passam a ser hiperosmóticos em relação ao meio. Essa diferença osmótica resulta em uma absorção rápida da solução de marcação que passa por osmose através da pele e brânquias, diminuindo assim o tempo do banho de imersão necessário para a absorção de uma mesma quantia do marcador. O tempo de duração do banho e a concentração de sais utilizada no choque osmótico variam de acordo com a tolerância de cada espécie utilizada. Neste estudo foram realizados testes preliminares até uma concentração de 30g/L (30ppt) com banho de 10 minutos, quando foi verificado que os peixes apresentaram perda de equilíbrio e natação errática, sendo que poucos minutos depois que retornaram a água doce apresentaram sinais de completa recuperação. No decorrer do choque osmótico nenhuma mortalidade foi constatada. Procedimento semelhante para a definição do choque osmótico foi adotado por Negus & Tureson (2004) para trabalho com Oncorhynchus mykiss, utilizando banhos de 3,5 minutos com 50ppt de salinidade, e por Campanella et al. (2013) para marcação de Odontesthes bonariensis, que usaram banhos de 10 minutos numa solução salina a 22ppt. Na reavaliação das marcas realizada após três meses do banho imersão no marcador químico foi possível notar que todos os tratamentos mantinham marcas visíveis, tendo os melhores resultados de intensidade de marcação registrados nos tratamentos submetidos ao choque osmótico. Resultados semelhantes foram observados por Crock et al. (2007) para Macquaria ambígua após 100 dias do banho de imersão, por Mohler (2003) para Salmo salar após 120 dias do banho de imersão e por Campanella et al. (2013) depois de 1 ano do banho de imersão para Odontesthes bonariensis..

(38) 38. A partir desta pesquisa vemos o potencial da Alizarina Vermelha como marcador químico em banhos de imersão para Rhamdia quelen associados ou não a técnica da indução osmótica, porém, há a necessidade de se avaliar a qualidade dessas marcas nos peixes expostos à luz solar. Como relatado por Bashey (2004) para Poecilia reticulata marcadas com Alizarina Vermelha, quando os peixes foram expostos à luz solar houve fotodegradação das marcas e uma redução da qualidade das marcas, dificultando sua observação. Embora o presente estudo confirmasse que as marcas eram claramente visíveis após três meses do tratamento, com os peixes mantidos sob iluminação artificial nos tanques, é prescrito um estudo mais aprofundado em longo prazo para avaliar a estabilidade das marcas por um tempo maior e em animais exposta às condições de campo. A marcação de peixes por imersão envolve um compromisso entre custo, concentração, período de imersão, salinidade, mortalidade causada pelo tratamento e retenção da marca ao longo do tempo, como critério para definir melhor procedimento de marcação (Taylor et al., 2005). Como relatado por Crock et al. (2007), a técnica de marcação química com Alizarina Vermelha pode reduzir o trabalho necessário para marcar grandes lotes de peixes, além disso, a indução osmótica pode reduzir o tempo necessário para a exposição do peixe ao marcador químico e a concentração da Alizarina Vermelha exigida nos banhos de imersão. O efeito do choque osmótico foi claramente evidenciado neste estudo com Rhamdia quelen. A recomendação dos procedimentos de marcação química do jundiá com Alizarina Vermelha podem seguir duas estratégias: 1) quando há tempo para manter os peixes sobre o banho de imersão, uma menor concentração do marcador é exigida, sendo recomendados banhos de imersão com duração de 18 horas numa solução de 90mg/L de Alizarina Vermelha, precedido pela indução osmótica que consiste na imersão por 10 minutos em solução salina a 30ppt. 2) quando é escolhido um menor tempo de exposição dos peixes ao banho de marcação, situação comumente encontrada em trabalhos realizados à campo, é necessária uma maior concentração do marcador no banho de imersão, sendo proposto banhos de imersão por 10 minutos numa solução contendo 300mg/L de Alizarina Vermelha, igualmente precedido pelo choque osmótico de10 minutos em solução salina a 30ppt..

(39) 39. CONCLUSÃO A Alizarina Vermelha é marcador químico eficaz quando utilizada em banhos de imersão para jundiá Rhamdia quelen. Essa marcação química dos raios das nadadeiras se manteve visível mesmo depois de três meses da aplicação do banho de imersão. O estudo mostrou que o choque osmótico que precede o banho de imersão proporciona melhores resultados na intensidade das marcas químicas e permite reduzir o tempo de duração do banho de imersão. Esta técnica mostrou-se eficaz para obtenção de marcas químicas com um baixo custo e eficiente para proporcionar a marcação de grandes lotes de peixes. A partir desta pesquisa são recomendados dois métodos que podem ser utilizados para a marcação química com Alizarina Vermelha em jundiás submetidos a banhos de imersão, de acordo com a disponibilidade de tempo para a realização do banho de imersão e da quantidade do marcador químico a ser consumida: a) em banhos de imersão de 18 horas em concentração de 90mg/L; b) em banhos de 10 minutos em concentrações de 300mg/L. Em ambos os casos, a marcação deve ser precedida pelo choque osmótico, quando os peixes são mantidos por 10 minutos numa solução salina a 30ppt..

(40) 40. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alcobendas, M., F. Lecomte, J. Castanet, F. J. Meunier, P. Maire, and E. M. Holt. 1991. Mass labeling of elvers with fast balneation in fluorochromes. Application to tetracycline labeling of 500kg of elvers. Bulletin Français de la Peche et de la Pisciculture 321:43–54. Bashey, F. 2004. A comparison of the suitability of alizarin red S and calcein for inducing a nonlethally detectable mark in juvenile guppies. Transactions of the American Fisheries Society 133:1516–1523. Conte, F. P. 1969. Salt secretion. Pages 241–292 in W. S. Hoar and D. J Randall, editors. Fish physiology, volume 1. Academic Press, New York. Crook, D. A., D. O. Mahony, B. M. Gillanders, A. R. Munro & A. C. Sanger. 2007. Production of external fluorescent marks on Golden Perch fingerlings through osmotic induction marking with Alizarin Red S. North American Journal of Fisheries Management, 27: 670-675. Eckmann, R. 2003. Alizarin marking of whitefish, Coregonus lavaretus otoliths during egg incubation. Fisheries Management Ecology, 10: 233239. Campanella D., Gárriz A., Colautti D. C., Somoza G. M. & Miranda L. A. 2013. Osmotic induction marking with Alizarin Red S on Odontesthes bonariensis. Neotropical Ichthyology, 11(1):95-100. Fielder, David G. 2001. Methodology for Immersion Marking Walleye Fry and Fingerlings in Oxytetracycline Hydrochloride and Its Detection with Fluorescence Microscopy. Michigan: Michigan Department Of Natural Resources, 23 p. Lagardere, F., K. Thibaudeau & M. L. Begout Anras. 2000. Feasibility of otolith markings in large juvenile turbot, Scophthalmus maximus, using immersion in alizarin-red S solutions. Journal of Marine Science, 57: 1175-1181..

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(42) 42. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO GERAL Agostinho, A.A.; Gomes, L.C.; Pelicice, F. M. 2007. Ecologia e manejo de recursos pesqueiros em reservatórios do Brasil. Maringá: EDUEM, 501p. Agostinho, A. A.; Miranda, L. E.; Bini, L. M.; Gomes, L. C.; Thomaz, S. M.; Suzuki, H. I. 1999. Patterns of colonization in neotropical reservoirs, and prognoses on aging. Pp. 227-265. In: Tundisi, J. G.; Straskraba, M. (Ed.). Theoretical reservoir ecology and its applications. São Carlos: International Institute of Ecology; Leiden, The Netherlands: Backhuys Publishers; Rio de Janeiro: Brazilian Academy of Sciences. Alcobendas, M., F. Lecomte, J. Castanet, F. J. Meunier, P. Maire, and E. M. Holt. 1991. Mass labeling of elvers with fast balneation in fluorochromes. Application to tetracycline labeling of 500kg of elvers. Bulletin Français de la Peche et de la Pisciculture 321:43–54. Babaluk, J.A.; Craig, J.F. 1990. Tetracycline marking studies with pike, Esox lucius L. Aquaculture and Fisheries Management, v.21, p. 307315. Baldissertotto B., Neto J. R., Barcellos L. G., 2010. Jundiá (Rhamdia SP). In: Baldissertotto, B.; Gomes, L. de C. Espécies nativas para piscicultura no Brasil . Santa Maria: UFSM, p.301 – 333. Brooks, R. C., R. C. Heidinger, and C. C. Kohler. 1994. Mass-marking otoliths of larval and juvenile walleyes by immersion in oxytetracycline, calcein, or calcein blue. North American Journal of Fisheries Management 14:143–150. Champigneulle, A.; Cachera, S. 2003. Evaluation of large-scale stocking of early stages of brown trout, Salmo trutta, to angler catches in the French-Swiss part of the River Doubs. Fisheries Management and Ecology, v. 10, p.79-85..

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