UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ALAINE MARIA DOS SANTOS SILVA
NANOPARTÍCULAS BIODEGRADÁVEIS E BIOCOMPATÍVEIS PARA LIBERAÇÃO MODIFICADA DE BENZNIDAZOL
NATAL/RN 2019
ALAINE MARIA DOS SANTOS SILVA
NANOPARTÍCULAS BIODEGRADÁVEIS E BIOCOMPATÍVEIS PARA LIBERAÇÃO MODIFICADA DE BENZNIDAZOL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Ciências Farmacêuticas (Área de concentração: Bioanálises e Medicamentos).
Orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior
NATAL/RN 2019
Silva, Alaine Maria dos Santos.
Nanopartículas biodegradáveis e biocompatíveis para liberação modificada de benznidazol / Alaine Maria dos Santos Silva. -2019.
103f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2019.
Orientador: Arnóbio Antônio da Silva Júnior.
1. Benznidazol - Tese. 2. Trypanosoma cruzi - Tese. 3.
Nanopartículas poliméricas - Tese. 4. Sonda fluorescente - Tese. 5. Eficácia in vivo - Tese. I. Silva Júnior, Arnóbio Antônio da. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 615.283 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Cada pessoa deve trabalhar para o seu aperfeiçoamento e, ao mesmo tempo, participar da responsabilidade coletiva por toda a humanidade Marie Curie
Acima de tudo, agradeço a Deus por mais esta realização.
Dedico a minha família, de forma especial a minha mãe Maria de Fátima, amigos e ao professor Arnóbio por toda colaboração e paciência no desenvolvimento deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
A Deus, nosso pai e criador de todas as coisas. Sua força divina me deu sustento e coragem para questionar realidades e propor sempre um novo mundo de possibilidades. À minha mãe Fátima, por ser tão companheira e amiga. Seu amor, fé e apoio me deram mais confiança para nunca desistir mesmo diante as tribulações. Meu agradecimento pelas horas em que ficou ao meu lado, orando e me mostrando que sou capaz de chegar onde desejo e, sem dúvidas, foi quem me deu o maior incentivo para conseguir concluir esse trabalho.
Ao meu pai Arlindo, por todo amor e orgulho que sempre teve comigo, mesmo diante os diversos problemas de saúde, meu eterno agradecimento pelos momentos em que esteve ao meu lado, dando-me apoio e fazendo-me acreditar que nada é impossível.
Ao meu irmão Arlendell e à minha prima-irmã Maria Clara. Tenho a certeza de que ser irmão está além da convivência mútua, e sim estarmos unidos pelos eternos laços de amor.
Ao meio afilhado e filho de coração, Davi, por me trazer tanta alegria aos meus finais de semana. Uma pequena criança com curiosidade e engenhosidade de um futuro cientista.
Aos meus tios-avôs Antônio e Trindade, por estar sempre torcendo e orando para que meus objetivos fossem alcançados.
Ao meu avô José Mariano (in memoriam) por ser uma pessoa que sonhava em ver essa minha conquista e que mostrou muitas vezes que um gesto marca mais que muitas palavras. Sua última frase pra mim foi: Faça algo que possa me curar! Morreu com suspeita de Doença de Chagas e, embora não consegui curá-lo, pesquiso para que essa cura chegue a outras milhares de pessoas.
Ao meu namorado Petrúcio, pessoa com quem partilhei grande parte desse meu trajeto. Com você me senti mais viva. Obrigada pelo carinho, amor, paciência e por sua capacidade de me trazer paz e alegria em meio a grandes turbulências.
Ao professor Dr. Arnóbio Antônio por sua dedicação, paciência e confiança ao longo dos seis anos de supervisão, desde o mestrado até a concretização desse trabalho. É um exemplo de orientador, pesquisador, professor, amigo e pai. Que Deus sempre o abençoe!
À Lília Basílio, Polyanne, Karla e Ariane, por todo apoio e incentivo ao longo desses anos. Levarei sempre comigo cada conhecimento científico e conselho que vocês me passaram e passam até hoje. Sem vocês muitas coisas não teriam fluido. Realmente são amigas que levarei para o resto da vida.
A minha amiga-irmã, Tássia Dantas pela amizade, confiança e paciência em todos os momentos, principalmente nas centésimas vezes que eu respondia suas mensagens apenas com uma frase: estou escrevendo e depois falo. Cada batalha que vencemos individualmente sempre comemoramos como uma vitória coletiva.
Às minhas companheiras de apartamento Bruna e Fernanda pela paciência ao durante esse período. O longo período dentro do laboratório impedia que nos encontrassemos com frequência, mesmo dividindo o mesmo teto. Mulheres honestas e inteligentes que admiro muito. Fiz uma amizade sincera e ainda conseguir uma afilhada de crisma (Fernanda) que terei um laço divino para o resto da vida.
Aos meus amigos e colegas da SEDIS pelo grande aprendizado no período de tutoria. Pude dividir cada vitória com vocês e hoje, mesmo distante, criamos um laço tão fraterno. Aprendi muito com todos vocês.
À Rosane (Bozena), Isabela (Kitéria), Fernanda (Sócya) e demais meninas da República Maria Malagueta que me acompanhando na durante o estágio em Ouro
Preto-Á Cláudia Moreno por todo aprendizado e paciência durante o período de estágio em Montevideu, no Uruguai. Sem você muita coisa necessária não teria acontecido. Não ficamos apenas amigas, mas criamos um alço fraterno.
Á Clara, Anne e Lucas por tanta preocupação e carinho. Podem ter certeza que a admiração que vocês dizem sentir por mim é mais do que recíproca. Amo arengar com vocês; é uma das formas de demostrar o todo o meu sentimento. Só tenho a agradecer por tudo.
Aos meus amigos e companheiros de laboratório TecBioFar, dos quais cito de forma especial aos pós-graduandos da equipe nano (NBT TEAM): Anne, Arthur, Clara, Edilamar, Ednaldo, Emanuell, Lucas, Olavo, Tábata, e aos alunos de iniciação científica Carol, Cleane, Daniele, Emersom, Edilton, Izabelle, Lucas, Mariana, Milena e Rafaela por toda ajuda e troca de conhecimento ao longo desses anos.
Aos meus companheiros do Equipe Veneno, na pessoa de professor Matheus Pedrosa, de forma especial a Manoela, Allanny, Arthur, Alessandra, Menilla, Fiamma,
Karla, Adriana, Nathália, Nayara, Júlia, Bruno, Sarah, Diana e a todos os demais companheiros cientistas do TECBIOFAR pela força, companheirismo e compreensão
conclusão desse trabalho e, consequentemente, para minha formação profissional. À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.
Ao Laboratório de Sistemas Dispersos (LASID), do departamento de Farmácia/UFRN, na pessoa do professor Sócrates Egito que gentilmente cedeu o equipamento para análises do tamanho de partícula e potencial zeta.
Ao Laboratório de Caracterização de Materiais, do departamento de Engenharia de Materiais (DEMAT-UFRN), na pessoa de Igor Damasceno, pelas análises de MFA.
Ao Laboratório Escola de Farmácia Industrial (LEFI), na pessoa de professor Túlio e pelo técnico Ednaldo, pelas análises de infravermelho (FTIR-ATR).
Ao Laboratório de Zoonoses da Escola de Medicina da UFOP (EMED-UFOP), na pessoa da professora Terezinha Bahia, e seus alunos Suianne, Ana Lia, Karoline e Álvaro por todo aprendizado durante o estágio e pela realização das análises com células amastigotas.
Ao Laboratório de Biologia dos Parasitos (LaBioPar), na pessoa de Professora Antônia Cláudia Jácome pelas análises in vivo. Muito obrigada pela sua dedicação e todos os seus alunos de pós-graduação e iniciação científica, de forma especial a George por ser meu companheiro em todos os momentos, inclusive quando foi preciso passar quase 24h no laboratório e indo aos sábados para que eu pudesse concluir meus experimentos, e a Vicente Toscano pela companhia nos experimentos in vitro na UFOP e auxílio nos experimentos in vivo. A vocês meu muito obrigada.
Aos funcionários da secretaria do PPgCF, Fábia e Gibson e à equipe da limpeza por toda gentileza e paciência de nos atender tão prontamente.
À equipe do biotério, em especial a veterinária Tamires e os funcionários Dona Ana e Washington auxílio com os animais. Obrigada pela ajuda e apoio quando precisei. Ao Institut Pasteur de Montevideo, no Urugai, na pessoa do professor Carlos Robello por me acolher durante o período de estágio na instituição, bem como as pesquisadoras Paula Faral, Florencia Díaz, Dolores Piñero, Adriana Parodi e demais pesquisadores por toda receptividade, paciência e troca de conhecimentos na realização dos experimentos in vitro com os parasitos e pela análise de monitoramento pelo microscopia de confocal.
Ao Departamento de Morfologia, na pessoa do professor Raimundo Fernandes e sua aluna Ana Luíza Cabral pela realização dos experimentos in vitro com as células cancerígenas.
Aos membros da banca por terem aceito o convite.
Por fim, gostaria de agradecer aos meus demais amigos e familiares, pelo carinho e pela compreensão nos momentos em que a dedicação aos estudos foi exclusiva.
Tudo o que aparece em nosso caminho faz parte do processo evolutivo de cada indivíduo. A vida não faz nada sem nenhuma finalidade. Todos os fatos que ocorrem, a cada momento, independentemente da situação, são porque temos condições de aproveitar e amadurecer. Tudo tem sua hora certa. E é com muita felicidade e força daqueles que me acompanharam nessa jornada que dedico com carinho meus sinceros agradecimentos.
RESUMO
O Benznidazol (BNZ) é o fármaco de escolha para o tratamento de pacientes com infecção por Trypanosoma cruzi. Apesar de seu amplo uso, esta molécula apresenta problemas de eficácia devido à alta toxicidade, além da baixa solubilidade em meio aquoso. As nanopartículas apresentam capacidade comprovada de atravessar a maioria das barreiras biológicas e direcionamento intracelular de fármacos, principalmente quando ligantes de superfície são inseridos para aumentar a eficácia do fármaco em células infectadas. O objetivo deste trabalho foi fazer um desenho estrutural e o monitoramento de nanopartículas funcionalizadas e fluorescentes de poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) para liberação modificada do benznidazol. As partículas foram produzidas pelo método emulsificação com evaporação do solvente. O desenvolvimento da formulação e parâmetros de obtenção foram otimizados por medidas de tamanho médio de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, microscopia de força atômica (MFA), microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia confocal (MC), espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de fourier (FTIR-ATR), eficiência de encapsulação, estudos in vitro e in vivo. Nanopartículas poliméricas esféricas e estáveis abaixo de 250 nm foram obtidas, com a eficiência de encapsulação maior que 95%. A cinética de liberação in vitro do fármaco demonstrou uma liberação lenta do fármaco e a melhoria da atividade biológica de nanopartículas contendo BNZ. Ensaios in vitro em células normais (Hek 293), células tumorais (Hep G2 e HT-29), amastigotas (cepas H9c2 e Dm28c) e com epimastigotas (cepas Y, CL-Brenner e Dm28c) mostraram um aumento na potência das nanopartículas contendo BNZ sobre o BNZ livre. A análise por microscopia confocal mostrou que as nanopartículas entram no parasito com alta eficiência, principalmente as funcionalizadas com ácido siálico e colesterol. Testes in vivo revelaram que as nanopartículas contendo BNZ apresentaram efeito semelhante ao BNZ livre, mesmo usado em concentração 20 vezes inferior. Assim, o presente trabalho aborda de forma sistemática, o desenvolvimento de um sistema nanotecnológico com potencial inovador para o aumento da eficácia do benznidazol em células infectadas com Trypanosoma cruzi.
Palavras-chave: Benznidazol. Eficácia in vivo. Nanopartículas poliméricas. Sonda fluorescente. Trypanosoma cruzi.
ABSTRACT
Benznidazole (BNZ) is the drug of choice for the treatment of patients with infection by Trypanosoma cruzi. Despite its wide use, this molecule presents efficacy problems due to high toxicity, in addition to low solubility in aqueous medium. The nanoparticles have proven ability to traverse most biological barriers and intracellular targeting of drugs, especially when surface binders are inserted to increase the efficacy of the drug in cells infected. The aim of this work was to make a structural design and monitoring of functionalized and fluorescent nanoparticles of poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) for modified release of benznidazole. The particles were produced by the emulsification solvent evaporation method. The development of the formulation and parameters of obtaining were optimized by measurements of particle size, polydispersity index, zeta potential, atomic force microscopy (MFA), scanning electron microscopy (SEM), confocal microscopy (MC), fourier transform infrared absorption spectroscopy (FTIR-ATR), encapsulation efficiency, in vitro and in vivo studies. Spherical and stables polymeric nanoparticles below 250 nm were obtained, with encapsulation efficiency greater than 95%. The in vitro release kinetics of the drug showed a slow release of the drug and the improvement of the biological activity of nanoparticles containing BNZ. In vitro assays in normal cells (Hek 293), tumor cells (Hep G2 and HT-29), amastigotes (strains H9c2 and Dm28c) and with epimastigotes (strains Y, CL-Brenner and Dm28c) showed an increase in the potency of the nanoparticles containing BNZ over the free BNZ. The confocal microscopy analysis showed that the nanoparticles come in the parasite with high efficiency, especially those functionalized with sialic acid and cholesterol. In vivo tests revealed that the nanoparticles containing BNZ had similar effect to the free BNZ, even used in 20-fold inferior concentration. Thus, the present work systematically discusses the development of a nanotechnological system with innovative potential to increase the efficacy of benznidazole in cells infected with Trypanosoma cruzi.
Keywords: Benznidazole. Efficacy in vivo. Polymeric nanoparticles. Fluorescent probe. Trypanosoma cruzi.
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo de vida e mecanismo de infecção do Trypanosoma cruzi ... 26 Figura 2: Representação da estrutura química e mecanismos de ação propostos para o
benznidazol. ... 30 Figura 3: Estrutura do poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) ... 35 Figura 4: Diâmetro médio e potencial zeta em função da concentração (A) do tensoativo PVA; (B) concentração de diferentes tensoativos; (C) concentração do polímero PLGA; e (D) relação volume / volume de diclorometano (DCM) / acetona (ACE), na fase orgânica. ... 62 Figura 5: Espectros de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR ATR): a) dos compostos isolados e b) das NP (NP sem fármaco), NPBNZ (NP com BNZ), NPAS (NP com BNZ e AS), NPCOL (NP com BNZ e COL). ... 66 Figura 6: Microscopia de Força Atômica (MFA) em 3D e Microscopia de Eletrônica de Varredura (MEV) em 2D, respectivamente, das nanopartículas. A) NP, B) NP BNZ, C) NP BNZ AS, D) NP BNZ COL e E) NP BNZ AS COL ... 68 Figura 7: Avaliação da estabilidade física das NPs por 6 semanas para NP, NP BNZ, NP BNZ AS e NP BNZ COL NP BNZ AS COL). ... 69 Figura 8: Perfil cinético de liberação in vitro do BNZ livre e nas nanopartículas ... 70 Figura 9: Ensaio de citotoxicidade para A) células Hek; B) Células Hep G2; C) Células HT-29. Valores indicados de média e desvio padrão (n =3). *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001. . 74 Figura 10: Atividade hemolítica do BNZ e dos sistemas nanoparticulados contendo BNZ ... 75 Figura 11: Viabilidade celular e porcentagem de inibição do crescimento do parasito BNZ dos sistemas de nanopartículas (NP BNZ, NP BNZ COL, NP BNZ AS e NP BNZ AS COL). A) Viabilidade em células H9c2 em 72h; B) Porcentagem de inibição do crescimento na cepa amastigota Y em células H9c2 em 72h. ... 78 Figura 12: Fotomicrografias em microscópio óptico, respectivamente: A) NP, B) BNZ, C)NP BNZ, D) NP BNZ AS, E) NP BNZ COL e F) NP AS COL. ... 80 Figura 13: Microscopia confocal de epimastigotas não tratadas (NP) e tratadas 24h com BNZ
.. 82 Figura 14: Microscopia confocal de epimastigotas não tratadas (NP) e tratadas 24h com BNZ
.. 83 Figura 15: Avaliação do crescimento parasitário in vivo durante um tratamento por 24h com PBS, BNZ (10mg/kg), NP BNZ, NP BNZ AS, NP BNZ COL a uma concentração de 0,5 mg/kg de BNZ, por via oral. ... 84 Figura 16: Avaliação do crescimento parasitário in vivo A) durante um tratamento por via oral, por 5 dias com PBS, BNZ (10mg/kg), NP BNZ, NP BNZ AS, NP BNZ COL a uma
por via intraperitoneal, por 5 dias com PBS, BNZ (10mg/kg), NP BNZ, NP BNZ AS, NP BNZ COL a uma concentração de 0,5 mg/kg de BNZ, em até 12 dias após a infecção. ... 85 Figura 17: Avaliação do crescimento parasitário in vivo durante um tratamento por via
intraperitoneal, por 5 dias com PBS, BNZ (10mg/kg), NP BNZ, NP BNZ AS, NP BNZ COL a uma concentração de 1,0 mg/kg de BNZ, em até 12 dias após a infecção. ... 87
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1: Efeito da funcionalização da superfície da nanopartículas ... 65 Tabela 2: Parâmetros de adequação de diferentes modelos cinéticos para liberação de
nanopartículas de BNZ em diferentes valores de R ... 72 Tabela 3: Valores de IC50 em M do BNZ livre e das nanopartículas contendo BNZ ... 76
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de variância
ATR - FTIR Attenuated Total Reflectance Fourier Transforms Infrared
Spectroscopy (Espectroscopia do Infravermelho com Transformada de Fourrier e Reflectancia Total Atenuada)
BNZ Benznidazol
Cepa Y Cepa clone de T.cruzi (TcII)
CLB Cepa clone de T. cruzi CL-Brener (TcIV) CPRG Clorofenol vermelho - -D-galactopiranósido
DAPI -diamino-2- fenilindole
Dm28c Cepa clone de T. cruzi (TcI)
DMEM Meio de Eagle Modificado por Dulbecco
DLS Dymanic Light Scatering
DNDI Drugs for Neglected Diseases initiative
DSC Differential Scanning Calorimeter (Calorimetria Exploratória Diferencial)
DST Doenças Sexualmente Transmissíveis
DTU Discrete Typing Unit
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay FDA Food and Drug Administration
Hek 293 Células da linhagem normais de rim humano
HAI Hemaglutinação indireta
HT-29 Células de câncer colo retal humano H9c2 Células neonatas de cardiomiócitos Hep G2 Células de carcinoma hepático humano IIF Imunofluorescência Indireta
IPd Indice de polidispersão LIT Liver Infusion Triptose
MEV-FEG Microscopia Eletrônica de Varredura por Emissão de Campo MFA Microscopia de Força Atômica
Min. Minutos
MC Microscopia confocal
NP Nanopartícula sem fármaco NP BNZ Nanopartícula com benznidazol
NP BNZ AS Nanopartícula com benznidazol e ácido siálico NP BNZ COL Nanopartícula com benznidazol e colesterol
NP BNZ AS COL Nanopartícula com benznidazol, ácido siálico e colesterol PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) PBS Phosfate Buffer Saline (Solução salina tamponada com fosfato)
PLA Poli (ácido-lático)
PLG Poli (ácido-glicólico)
PLGA Poli (ácido lático- co-glicólico)
RBC Red blood cells (Células vermelhas do sangue) SDS Dodecil sulfato de sódio
SBF Soro Bovino Fetal
Tg Temperatura de transição vítrea
Vero Células epiteliais de rins de macaco verde africano WHO World Health Organization
-gal -galactosidade
2D Segunda dimensão
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 19
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 23
2.1 Doença de Chagas e heterogeneidade do T. cruzi ... 23
2.1.1 Ciclo de vida do T. cruzi 2.1.2 Evolução Clínica da doença de Chagas 2.1.3 Diagnóstico da doença de Chagas 2.2 Quimioterapia na doença de Chagas ... 29
2.2.1 Benznidazol 2.3 Nanopartículas para vetorização ... 31
2.4 Polímeros biodegradáveis ... 34
2.4.1 Poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) 2.5 Métodos de obtenção das nanopartículas e de caracterização das nanopartículas ... 37
2.6 Estratégias para o aumento do targeting ... 38
3 OBJETIVOS ... 42 3.1 Objetivo Geral ... 42 3.2 Objetivos Específicos ... 42 4 JUSTIFICATIVA ... 43 5 MATERIAL E MÉTODOS ... 44 5.1 Materiais ... 44
5.2 Obtenção das nanopartículas de PLGA ... 44
5.3 Preparação das nanopartículas funcionalizadas com ácido siálico e colesterol ... 45
5.4 Preparação das nanopartículas de PLGA-FTIC ... 45
5.5 Preparação das nanopartículas contendo siRNA ligado ao Cy5 ... 45
5.6 Caracterização das nanopartículas... 46
5.6.1 Determinação do tamanho de partícula e do potencial zeta 5.6.2 Eficiência de encapsulação e carga do fármaco 5.6.3 Microscopia de Força Atômica (MFA) 5.6.4 Microscopia Eletrônica de Varredura por Emissão de Campo (MEV-FEG) 5.6.5 Análise de espectroscopia na região do infravermelho 5.7 Experimentos in vitro ... 48
5.7.1 Cinética de liberação in vitro do fármaco ... 48
5.7.2 Cultivo de células Vero 5.7.3 Cultivos de células Hek 293, Hep G2 e HT-29 5.7.4 Cultivos de células H9c2 5.7.5 Ensaio de viabilidade celular para Vero, Hek 293, Hep G2 e HT-29 5.7.6 Obtenção do parasito 5.7.6.1 Cultivo das formas epimastigotas 5.7.6.2 Obtenção de formas tripomastigotas metacíclicas 5.7.6.3 Obtenção de formas tripomastigotas em células H9c2 5.7.6.4 Obtenção de formas tripomastigotas em células Vero 5.7.7 Ensaios de citotoxicidade 5.7.8 Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos sistemas nanoparticulados contendo benznidazol sobre formas amastigotas em células H9c2 5.7.9 Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos sistemas nanoparticulados contendo benznidazol sobre formas amastigotas em células Vero 5.7.10 Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos sistemas nanoparticulados contendo benznidazol sobre formas epimastigotas 5.7.11 Análise de microscopia confocal 5.7.12 Atividade hemolítica 5.8 Avaliação da eficácia dos sistemas in vivo ... 57
5.8.1 Infecção ... 57
5.9 Estabilidade físico-química ... 58
5.10 Análise estatística ... 58
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 59
6.1 Obtenção e caracterização das nanopartículas ... 59 6.1.1 Concentração do tensoativo
6.1.2 Tipo de tensoativo
6.1.3 Concentração do polímero 6.1.4 Influência do tipo de solvente 6.1.6 Eficiência de Encapsulação
6.1.7 Análise de espectroscopia na região do infravermelho
6.1.8 Microscopia de Força Atômica (MFA) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 6.1.9 Avaliação da Estabilidade Física
6.1.11 Viabilidade celular 6.1.12 Atividade hemolítica
6.1.14 Avaliação da atividade anti-T. cruzi para as formas Epimastigotas (cepas Y, CLB, Dm28 -gal) e amastigotas dos sistemas avaliados utilizando células Vero infectadas pelas cepas
-gal)
6.1.15 Avaliação da atividade anti-T. cruzi para as formas amastigotas dos sistemas avaliados utilizando células H9c2 infectadas pela cepa Y
-gal) com nanopartículas marcadas com FITC e siRNA marcadas com Cy5
7 CONCLUSÕES ... 88
8 PERPECTIVAS ... 89
PRODUÇÃO CIENTÍFICA ... 90
1 INTRODUÇÃO
A Nanotecnologia farmacêutica é a ciência de sistemas em escala nanométrica, na qual a manipulação do tamanho e composição destes sistemas permite modificar algumas funções específicas no organismo. Frequentemente, estes sistemas de liberação de
fármacos drug delivery systems
vantagens quando comparados a outras formas de administração convencional, como por exemplo o aumento da eficiência de fármacos, permitindo o melhor aproveitamento de moléculas com propriedades indesejáveis, como baixa solubilidade, toxicidade e ação inespecífica (HASMAM et al., 2009; PEZZINI; SILVA; FERRAZ, 2007).
Entre os sistemas para a veiculação de fármacos, destacam-se os sistemas coloidais, como as emulsões múltiplas e inversas, micro e nanogéis, lipossomas e nanopartículas. Dentre estes, as nanopartículas se destacam por apresentarem propriedades interessantes, como o tamanho em escala nanométrica, capacidade de manipulação de suas propriedades físico-químicas de acordo com a composição dos monômeros constituintes e assim interagir com fármacos hidrofílicos, lipofílicos, neutros ou com carga. Essas características permitem ao sistema atravessar barreiras biológicas, direcionar o fármaco para certos tipos de células ou para determinados locais intracelulares, além de permitir uma liberação prolongada quando administrado em determinados tecidos, como epitelial, conjuntivo, muscular e nervoso (BAMRUNGSAP et al., 2012; MISHRA; PATEL; TIWARI, 2010).
As nanopartículas têm sido amplamente utilizadas para administração intravenosa de diversos agentes terapêuticos, incluindo ferramentas de imagem, diagnóstico e tratamento (ACHARYA; SAHOO, 2011; KIM et al., 2005; YANG, 2010). Entretanto, esses sistemas nanoparticulados podem se acumular em locais específicos, como órgãos-alvo ou mesmo em tumores depois da administração sistêmica. Sua biodistribuição é largamente determinada pelas suas propriedades físico-químicas, tais como o tamanho das partículas, natureza do polímero e do fármaco e características de superfície de partícula. Isto se deve, em parte, às barreiras fisiológicas e celulares que as partículas encontram em cada órgão (CARTIER; RESZKA, 2006). O efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR), por exemplo, é basicamente controlado por tamanho, o que determina o direcionamento passivo e a biodistribuição no tecido e na fenestração capilar (BICKER et al., 2014).
Para algumas doenças, a administração via parenteral é mais eficiente, sendo então promissora a administração das nanopartículas por essa via, almejando uma distribuição mais seletiva e, assim, um aumento do índice terapêutico. Este grupo de doenças inclui o câncer e algumas infecções, dentre as quais podem ser citadas as parasitoses intracelulares, em que nem sempre a concentração de fármaco disponível na circulação sistêmica consegue atingir de forma eficaz o parasito intracelular (PRAMANICK; SINGODIA; CHANDEL, 2013).
A doença de Chagas é uma dessas parasitoses e caracteriza-se por ser uma doença infecciosa febril e crônica causada por parasitos do gênero Trypanosona, sendo a maior incidência pelo parasito Trypanosoma cruzi (T. cruzi), um protozoário flagelado que penetra no sangue humano a partir do contato com as fezes do inseto triatomíneo, popularmente conhecido barbeiro ou kissing bug, com mucosa do olho ou alimentos contaminados. O parasito possui um complexo ciclo biológico, que envolve um hospedeiro invertebrado e outro vertebrado (DIAS et al., 2009).
O único agente terapêutico disponível no Brasil para o tratamento da infecção é o benznidazol (BNZ) (MEJIA et al., 2012). Além de não ser totalmente eficaz na fase crônica da doença, este fármaco pode provocar efeitos colaterais graves, como perturbações neurológicas, miocardite, alterações eletrocardiográficas, linfadenopatia e até hepato-esplenomegalia (COURA; BORGES-PEREIRA, 2010; RONCO et al., 2011). No entanto, apesar desses efeitos, autópsias revelam vasos sanguíneos em invejável estado, sem resquícios de placas de colesterol (DIAS et al., 2009; FERREIRA et al., 2010; SOARES SOBRINHO et al., 2011). Esse fato é explicado devido ao parasito utilizar a transialidase, proteína presente no T. cruzi, para captar ácido siálico (N-acetil-neuramínico-Neu5Ac) da membrana das células humanas e, junto a ele, captura também o colesterol. Isso porque o parasito necessita do ácido para sobreviver, mas não é capaz de produzir em seu metabolismo. No entanto, o ácido siálico da membrana das células humanas também costuma servir como um gancho molecular que bactérias utilizam para se prender à parede interna dos vasos, fato que pode estar associado à piora das condições nos pacientes com colesterol alto (DIAS et al., 2009).
Desta forma, a modificação da superfície de nanopartículas biodegradáveis funcionalizadas com ácido siálico e colesterol pode ser uma forma promissora para atrair o parasito, melhorar as propriedades de superfície do sistema, além de melhorar a
biodisponibilidade do BNZ na fase crônica da doença (BARZEGAR-JALALI et al., 2012).
Para que esses sistemas sejam capazes de vencer estas barreiras celulares, a compreensão da internalização e localização celular é essencial. Algumas estratégias encontradas na literatura para observar a captação e distribuição intracelular de nanopartículas poliméricas são: utilizar polímeros marcados com uma sonda fluorescente, utilizar partículas inorgânicas capazes de emitir fluorescência (dots) ou utilizar polímeros que apresentem fluorescência intrínseca (HORISAWA et al., 2002). As nanopartículas quando carregadas com um corante fluorescente podem ser usadas em estudos in vitro/in vivo e sua localização celular pode ser visualizada por microscopia de fluorescência e/ou microscopia confocal (FREICHELS et al., 2011).
Neste contexto, a sonda fluorescente mais citada na literatura é o isotiocianato de fluoresceína (FITC), fluoróforo derivado da fluoresceína, no qual se introduziu um grupo isotiocianato. A presença desse grupo funcional permite a formação de uma ligação covalente entre o FITC e aminas primárias e secundárias do polímero, que produz uma fluorescência de cor verde quando irradiado por luz ultravioleta. Os comprimentos de onda máximos de excitação e emissão do FITC são de aproximadamente 495 e 521 nm, respectivamente (SILVA et al., 2013). O Desta forma, a reação de ligação do corante fluorescente ao polímero dependerá do tipo de grupo terminal presente no polímero e dos grupos funcionais presentes no corante fluorescente (FREICHELS et al., 2011).
Portanto, o presente trabalho consiste na obtenção de nanopartículas biodegradáveis e biocompatíveis, marcadas com sondas fluorescentes, funcionalizadas com ácido siálico e colesterol, para a liberação modificada do BNZ, para garantir maior biodisponibilidade e eficiência de internalização do fármaco em células infectadas por Trypanosoma cruzi, e passagem pelas membranas biológicas.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Doença de Chagas e heterogeneidade do T. cruzi
A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma doença potencialmente fatal causada por parasitos do gênero Trypanosona, sendo a maior incidência pelo parasito Trypanosoma cruzi (T. cruzi), agente etiológico da doença (KEAN, 1977; PELIZZARO-ROCHA et al., 2010; RASSI JR; RASSI; MARIN-NETO, 2010).
T. cruzi pertence à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae (RASSI; MARIN-NETO, 2010). Esta ordem caracteriza-se pela presença de um flagelo e uma mitocôndria única, contendo o cinetoplasto, que retém o material genético, denominado DNA do cinetoplasto (kDNA). No ciclo evolutivo do parasito são reconhecidas três formas morfogenéticas e a transição de uma forma para outra envolve modificações morfológicas tanto na expressão gênica quanto no ciclo celular (TELLERIA et al., 2006; VAGO et al., 1996). As formas tripomastigotas sanguíneas e amastigotas são encontradas no hospedeiro mamífero e as epimastigotas no hospedeiro invertebrado onde se dividem e diferenciam-se em tripomastigotas metacíclicas (RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012; TYLER; ENGMAN, 2001).
A doença de Chagas foi descoberta em 1909 em Minas Gerais, por Carlos Chagas, médico e pesquisador brasileiro, e tornou-se objeto de uma larga tradição de pesquisa no Brasil e no exterior (KROPF, 2005; PARKER; SETHI, 2011).
Segundo a World Health Organization (WHO) (2017), a doença de Chagas foi classificada como uma doença negligenciada, por ser mais prevalente em países em desenvolvimento e apresentar poucas alternativas de tratamento (WHO, 2017). Dados do Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDI) estima-se que mais de 10 mil pessoas morram todos os anos de manifestações clínicas da doença de Chagas, 8 milhões de pessoas estejam infectadas em 21 países da América Latina, mais de 6 milhões no mundo e calcula-se que 70 milhões de pessoas estejam em risco de contrair a doença (KANEKO, 2011; SINGH, 2005; WHO, 2017).
No Brasil, os principais focos desta infecção encontram-se em parte de Goiás, sul de Tocantins, Bahia, norte do Rio Grande do Sul e no sudeste do Piauí (VINHAES; DIAS, 2000). No Rio Grande do Norte um surto da doença de Chagas aguda foi encontrado na
mesorregião Oeste Potiguar. Foram confirmados mais 18 casos de doença de Chagas apenas em 2015, além da identificação de dois novos antígenos com grande potencial de aplicação no diagnóstico da fase crônica da doença de Chagas (ANDRADE et al., 2015; VARGAS et al., 2018).
O controle de triatomíneos na região Nordeste é um problema atual e futuro. Essa região possui alta concentração de Triatoma brasiliensis e, no Brasil, é o centro de dispersão vetorial que é de difícil controle. Além disso, ainda possui fatores preocupantes, uma vez que a região permanece deprimida socialmente e possui residências que podem ser adequadas para a colonização de triatomíneos, além de apresentar predomínio de vetores de difícil controle e baixo nível de cobertura operacional do Programa de Controle da Doença de Chagas (PCDCh) (BRITO et al., 2012; COURA; DE CASTRO, 2002).
A nomenclatura heterogênea do T. cruzi é baseada no agrupamento das populações em seis unidades de tipagem discretas (ZINGALES et al., 2009). As características epidemiológicas dos dois grupos permitiram a associação do grupo TcI ao ciclo silvestre e TcII a predominar no ciclo doméstico, sendo frequentemente encontrado na população humana (BRISSE; BARNABÉ; TIBAYRENC, 2000). Recentemente, propôs-se uma revisão da nomenclatura onde cada grupo passou a ser classificado como um grupo independente designado DTU (Discrete Typing Unit). As cepas de T. cruzi foram reclassificadas em seis DTUs (TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV e TcVI) de acordo com prospetiva biológica e associação com o hospedeiro, uma vez que apresentam aspectos evolucionários e epidemiológicos distintos (MORENO, 2015; ZINGALES et al., 2009, 2012).
Um estudo de Barbosa-Silva et al (2016), por meio de avaliação soroepidemiológica, mostrou alta soro prevalência para os municípios das mesorregiões oeste e central do Estado do Rio Grande do Norte (RN), e os estudos de genotipagem identificaram T. cruzi I (TcI) em T. brasiliensis e TcIII (anteriormente denominado TcIIc) em tatus, TcI e TcII em humanos, TcII e TcIII em T. brasiliensis e TcIII em P. lutzi (BARBOSA-SILVA et al., 2016).
A variação genotípica entre as diferentes linhagens de T. cruzi, de diferentes regiões geográficas, pode explicar a frequente variabilidade na virulência, suscetibilidade à resposta imunitária do hospedeiro, taxas de infeções subclínica, sintomas clínicos na doença de Chagas e na suscetibilidade aos fármacos (COURA; BORGES-PEREIRA, 2010; ZINGALES, 2017; ZINGALES et al., 2012). Esta mudança na classificação
proporciona maior compreensão sobre a estrutura populacional e aspetos emergentes no genoma do parasito, o que permite uma abordagem integrada e direcionada, sem deixar de considerar a descoberta de fármacos e/ou uso de novas tecnologias, para a melhoria na estratégia de controle da doença de Chagas.
2.1.1 Ciclo de vida do T. cruzi
O T. cruzi é transmitido principalmente por insetos triatomíneos hematófagos, da ordem Hemiptera, sendo os gêneros considerados mais importantes o Triatoma, Rhodnius e Panstrongylus, vulgarmente denominados de ou kissing bugs (TEIXEIRA; NASCIMENTO; STURM, 2006). Quase 150 espécies de triatomíneos, potenciais vetores do T. cruzi, são conhecidos. A grande maioria vive em meio a aves e mamíferos, em ambientes silvestres. Tem importância em saúde pública devido sua capacidade de domiciliação e antropofilia as seguintes espécies: Triatoma brasiliensis, Triatoma infestans, Rhodnius prolixus, Triatoma dimidiata, Panstrongylus megistus, Triatoma pseudomaculata, Triatoma sórdida, Triatoma maculata, Triatoma phylosoma e Rhodnius palescens, pelo fato de colonizarem no peri ou intradomicílio. As restantes espécies não domiciliadas promovem a circulação de T. cruzi em mamíferos que vivem em ambientes silvestres (COURA; DE CASTRO, 2002).
O triatomíneo, hospedeiro invertebrado no ciclo, infecta-se pela ingestão de formas tripomastigotas sanguíneas durante o repasto sanguíneo. No tubo digestivo do inseto estas formas transformam-se em epimastigotas que aderem à superfície do intestino médio, onde se multiplicam por fissão binária. Em seguida, os epimastigotas migram para o intestino posterior atingindo o reto diferenciando-se em tripomastigotas metacíclicas, as formas infetantes para hospedeiros vertebrados, eliminadas nas fezes do inseto (MORILLO et al., 2015; RASSI; MARIN-NETO, 2010).
No hospedeiro vertebrado, os parasitos tripomastigotas metacíclicos penetram na pele, ficam na corrente sanguínea até chegar as células e causar infecção, onde transformam-se para a forma amastigota. Quando as células estão repletas de parasitos, eles novamente multiplicam-se e alteram para a forma tripomastigota. Por estarem com grande quantidade de parasitos, as células se rompem e os protozoários atingem a corrente sanguínea, atingindo outros órgãos (RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012).
O mecanismo de transmissão do T. cruzi não se dá apenas por meio do vetor, onde a infecção ocorre pela penetração do T. cruzi na forma de tripomastigotas metacíclicos, durante o hematofagismo, eliminados pelas fezes ou pela urina dos triatomíneos, em solução de continuidade da pele ou mucosa íntegra. Além deste mecanismo, a transfusão sanguínea, transmissão congênita, acidentes de laboratório, transmissão oral e os transplantes, também podem ser citados como formas de transmissão secundária desta endemia (RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012). O ciclo de vida do parasito e seu mecanismo de infecção pode ser observado Figura 1.
Figura 1: Ciclo de vida e mecanismo de infecção do Trypanosoma cruzi
Fonte: Adaptado de Camazine and Stock, 2014
O protozoário, T. cruzi apresenta alto grau de variabilidade intraespecífica detectada por marcadores biológicos, bioquímicos, imunológicos, genéticos e clínicos. A diversidade genômica de T. cruzi e a multiplicidade de genótipos e fenótipos é muito bem descrita e reconhecida na literatura (BRISSE; BARNABÉ; TIBAYRENC, 2000; ZINGALES, 2011). Esta diversidade pode estar associada à sua adaptação e sobrevivência em diferentes hospedeiros.
2.1.2 Evolução Clínica da doença de Chagas
A infecção chagásica humana é caracterizada por uma fase aguda sucedida de uma fase crônica, que tipicamente se prolonga por toda a vida do hospedeiro (TELLERIA et al., 2011). A fase inicial da infecção, denominada aguda, ocorre quando o parasito se encontra no sangue periférico do hospedeiro vertebrado, com a duração de quatro a oito semanas. Os tripanossomas, eliminados pelo barbeiro e introduzidos nos tecidos da região, determinam uma inflamação que marca a "porta de entrada" da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005). Nesta fase, manifestações locais na pele (chagoma de inoculação) ou na conjuntiva (sinal de Romaña persistindo durante cerca de dois meses, com uma mortalidade global de 2 a 8%, principalmente entre as crianças) são apresentados (RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012; RASSI JR; RASSI; MARIN-NETO, 2010).
A gravidade da infecção depende de vários fatores, como a virulência da cepa do parasito e a suscetibilidade do paciente afetado (TEIXEIRA; NASCIMENTO; STURM, 2006). Na maioria dos casos, a fase aguda é assintomática, principalmente em adultos, podendo manifestar-se como doença febril autolimitada. Em crianças ocorre principalmente, na primeira década de vida, podendo levar à morte ocasionalmente, devido a complicações decorrente da miocardite ou meningoencefalite grave, ou ambos (MORILLO et al., 2015; RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012).
As manifestações agudas da doença resolvem-se espontaneamente em 90% dos casos de pacientes infetados, mesmo na ausência de tratamento (RASSI; MARIN-NETO, 2010). Destes, aproximadamente 60-65% nunca desenvolverão a doença clinicamente aparente (MORILLO et al., 2015). Estes pacientes provavelmente apresentam a forma indeterminada crônica, em que a doença de Chagas progride silenciosa e sub-repticiamente caracterizada pela reatividade serológica, a presença de anticorpos contra T. cruzi no soro. A fase indeterminada pode persistir por toda a vida do indivíduo (RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012; TEIXEIRA; NASCIMENTO; STURM, 2006).
Na fase crônica, a maioria dos pacientes permanece assintomática (de 10 a 30 anos), com cerca de 20% dos casos desenvolvendo doença digestiva, perturbações neurológicas, miocardite, alterações eletrocardiográficas, linfadenopatia e hepato-esplenomegalia (SOARES SOBRINHO et al., 2011).
Alguns dos pacientes infetados podem desenvolver subsequentemente a forma crônica grave da doença, resultando em aproximadamente 45.000 mortes por ano. Esta forma é caracterizada pelo comprometimento cardíaco (cardiomiopatia chagásica) e lesões que afetam o sistema gastrointestinal, podendo surgir complicações digestivas severas como megaesófago e megacólon e/ou a doença cardiodigestiva. As manifestações neurológicas são observadas numa pequena percentagem, aproximadamente 5% dos doentes (RASSI; MARIN-NETO, 2010).
A infecção humana pelo T. cruzi deflagra um conjunto de reações que levam ao reconhecimento do parasito e o desenvolvimento de uma resposta imune específica muitas vezes capaz de controlar a carga parasitária por toda a vida do indivíduo (JORGE & CASTRO, 2000). Nas últimas décadas, evidências experimentais suportam duas hipóteses explicativas para a patogênese da doença Chagásica crônica, a persistência do parasito e a ocorrência de fenômenos autoimunes dirigidas a tecidos (COURA; DE CASTRO, 2002). A hipótese que ainda não foi totalmente elucidada é que o parasito penetra as células do hospedeiro e multiplica-se sob a forma amastigota surgindo pseudocistos.
2.1.3 Diagnóstico da doença de Chagas
O diagnóstico preciso da infecção ainda se constitui um desafio. As infecções agudas são dificilmente reconhecidas pela inespecificidade dos sintomas e, em caso de suspeita, considera-se útil a realização de exame a fresco ou corado de esfregaço de sangue para observação direta do parasito por meio da microscopia com identificação da forma tripomastigota em esfregaço de sangue periférico, microhematócrito e pesquisa de anticorpos da classe IgM (MORILLA; ROMERO, 2015).
No entanto, na fase crônica, devido ao declínio da parasitemia sanguínea, o diagnóstico é realizado com pesquisa de anticorpos IgG anti-T. cruzi, por meio de pelo menos dois testes sorológicos diferentes, como por exemplo ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay), Imunofluorescência Indireta (IIF), Hemaglutinação Indireta (HAI) (PARKER; SETHI, 2011; WHO, 2017). Estas técnicas permitem o diagnóstico de infeções crônicas em mais 95% dos casos. Além do diagnóstico clínico, estes métodos são utilizados no controle de doadores em bancos de sangue e em estudos epidemiológicos.
A técnica do diagnóstico molecular, reação em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reaction - PCR), utilizada para a detecção do parasito pode ser aplicada na fase aguda ou crônica da infecção (ZINGALES et al., 2012). Os exames utilizados para avaliação do comprometimento de órgãos e evolução da doença de Chagas são o eletrocardiograma (ECG), e por métodos imagiológicos, principalmente direcionados para a detecção de patologia cardíaca e digestiva (RASSI JR; RASSI; MARIN-NETO, 2010).
2.2 Quimioterapia na doença de Chagas
Alguns compostos eram utilizados experimentalmente há mais de 100 anos, em ensaios clínicos, para o tratamento da doença de Chagas. O Atoxyl (arsênico), a tintura de fucsina, o tártaro emético e o cloreto de mercúrio foram os primeiros compostos desenvolvidos experimentalmente para o tratamento específico da doença de Chagas, porém todos estes compostos se mostraram ineficazes no tratamento proposto (COURA; DE CASTRO, 2002).
Por volta do início da década de 70, surgiram dois compostos com novas perspectivas, tanto pela eficácia na fase aguda quanto pela tolerância: o Nifurtimox, um derivado dos nitrofuranos (NFX; Lampit®, Bayer) e o Benznidazol, um derivado
nitroimidazol (BNZ; Rochagan®, Roche) (DIAS et al., 2009).
No entanto, na década de 1980, o nifurtimox teve seu uso interrompido no Brasil seguido de outros países da América do Sul, por apresentar muitos efeitos adversos secundários e pelo desenvolvimento de cepas resistentes. Embora, amplamente utilizada por mais de três décadas, a descontinuação deveu-se a elevada toxicidade do fármaco, considerado genotóxico, além de levar ao desenvolvimento de cepas resistentes, gerando desinteresse dos laboratórios farmacêuticos devido à comercialização não lucrativa (MEZENCEV et al., 2009; SOARES SOBRINHO et al., 2007).
No ano de 2003, os direitos e a tecnologia de fabricação do BNZ foram cedidos pela Roche®, sendo produzido desde então pelo Laboratório Farmacêutico do Estado de
Pernambuco (LAFEPE) (SCHOFIELD; JANNIN; SALVATELLA, 2006; SOARES SOBRINHO et al., 2008). O BNZ é produzido apenas em dois países, no Brasil pela LAFEPE e na Argentina pela companhia farmacêutica ELEA (Abarax®). A doença de
apenas o NFX e BNZ terem sido aceitos para o tratamento da doença, com base em considerações éticas e de eficiência, por ainda ser frequente em países em desenvolvimento. Os fármacos foram desenvolvidos para administrados por via oral e absorvidos a partir do trato gastrointestinal com a eliminação do metabolito, predominantemente renal (COURA; BORGES-PEREIRA, 2010).
2.2.1 Benznidazol
A molécula de Benznidazol (N-benzyl-2-nitroimidazol acetamida) apresenta caráter limitante devido a sua alta toxicidade e baixa biodisponibilidade. A molécula é formada por um grupo imidazol, um grupo benzeno e um grupo central acetamida (Figura 2). De acordo com o sistema de classificação biofarmacêutica é considerado um fármaco de classe II (reduzida solubilidade e alta permeabilidade), fracamente solúvel em água e nos fluidos aquosos (0,306 mg/mL), além de apresentar absorção limitada pela velocidade de dissolução e solubilidade. Há, portanto, um interesse considerável no desenvolvimento de estratégias para melhorar a taxa de dissolução do benznidazol e, eventualmente, aumento da sua biodisponibilidade (PALMEIRO-ROLDÁN et al., 2014).
Figura 2: Representação da estrutura química e mecanismos de ação propostos para o benznidazol.
Fonte: Autoria própria (ChemSketch 12.0)
Alguns estudos indicam que o BNZ atua por meio da formação de radicais livres e/ou metabólitos eletrofílicos (URBINA, 2010). O grupo nitro (NO2) presente nesta
molécula é reduzido ao grupo amino (NH2) pela ação de enzimas do tipo nitroredutases,
que atuam especificamente em sistemas moleculares do tipo R-NO2, levando à formação
de um intermediário nitro radicalar (R-NO2-), com subsequente formação de
hidroxilamina (R-NHOH). O radical nitro formado estaria envolvido com o efeito tripanocida do BNZ, por meio da formação de ligações covalentes com macromoléculas do T. cruzi (DNA e citocromo P450). O BNZ também aumenta a fagocitose e lise celular do T. cruzi por meio de um mecanismo dependente de interferon-gama
(IFN-crescimento do T. cruzi por meio da enzima NADH-fumaratoredutase (DIAS et al., 2009). Comercialmente, o BNZ está disponível na forma de comprimidos de 100 mg, sendo usualmente recomendada a dose de 5-7 mg/kg/dia durante o período de tratamento entre 30 e 60 dias. Em crianças com menos de doze anos de idade, especialmente aquelas na fase aguda da doença, recomenda-se doses de 5 a 10 mg/kg de peso corporal, divididas em duas doses diárias, durante 60 dias também sem interrupção (SALOMON, 2012). Absorvido por via oral, atinge a concentração máxima sanguínea em 2 a 4 horas, com meia vida de 12 horas, sendo seus metabólitos eliminados pela urina e fezes. No entanto, este fármaco apresenta algumas restrições, como a baixa eficácia na fase crônica da doença, significativas variações regionais na eficácia, devido ao surgimento de resistência ao T. cruzi, alta taxa de abandono do tratamento, devido aos efeitos colaterais causados e longo período de tratamento (MEZENCEV et al., 2009).
Devido aos inconvenientes do BNZ, pode dificultar a interação de seus metabólitos com componentes celulares e sua baixa biodisponibilidade, pode dificultar a sua passagem através das barreiras biológicas. Com o desenvolvimento de sistemas de liberação modificada, este fármaco tem sido o alvo de alguns pesquisadores na área de tecnologia farmacêutica com a finalidade de melhorar suas propriedades e seu direcionamento para as células (COURA; BORGES-PEREIRA, 2010; SALOMON, 2012).
2.3 Nanopartículas para vetorização
A eficácia do tratamento com BNZ nos pacientes com infecção com T. cruzi aparenta ser variável e depende da fase clínica da doença. O tratamento da fase aguda da infecção é eficaz com taxas de cura aproximadamente de 100% em crianças e 70% em adultos (COURA; DE CASTRO, 2002). Contudo, o efeito benéfico do BNZ durante a
fase crônica estabelecida continua a não ser o mais desejável. Nestes pacientes chagásicos, a taxa de cura é apenas de 20% e a melhoria da cardiopatia ocorre em 50%. Por isso o tratamento nestes pacientes deve ser realizado ponderando os riscos e benefícios, os custos, a aceitação ou recusa do doente e a avaliação clínica do médico (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018).
As razões para tais diferenças na eficácia antiparasitária entre as fases aguda e crônica, podem estar relacionadas com a suscetibilidade ao fármaco das diferentes cepas do parasito, bem como as propriedades farmacocinéticas desfavoráveis do BNZ, como capacidade de penetração tecidual limitada e o tempo de semivida relativamente curto (URBINA, 2010). Durante o processo do metabolismo do BNZ, cerca de 80% a 90% do fármaco sofre efeito da primeira passagem, conduzindo a reduzida biodisponibilidade do fármaco. Consequentemente sucede a geração de importantes níveis de metabólitos ativos produzidos pelo fígado, durante a biotransformação, que não possui nenhuma atividade antiparasitária e que pode aumentar o risco da toxicidade. A farmacocinética do BNZ reflete a sua baixa solubilidade aquosa como tal é um fator que condiciona a absorção gastrointestinal e a necessidade da administração de elevadas doses do fármaco para obtenção de uma resposta terapêutica desejada (ALTCHEH et al., 2010; SCARIM et al., 2018).
O uso de sistemas de liberação permite um aumento da eficiência de fármacos, permitindo o melhor aproveitamento de moléculas com propriedades indesejáveis como baixas solubilidades, toxicidade e ação inespecífica (PEZZINI; SILVA; FERRAZ, 2007). O uso de sistemas nanocarreadores envolve uma ampla área de estudo e tem reunido muitos esforços, os quais estão representados pelas novas estratégias para a veiculação de fármacos Entre as estratégias inclui o uso de sistemas coloidais como as emulsões múltiplas e inversas, micro e nanogéis, lipossomas e as nanopartículas biodegradáveis (PALMEIRO-ROLDÁN et al., 2014).
Dentre estes sistemas de liberação de fármacos, destacam-se os sistemas matriciais poliméricos amplamente aplicados na forma de nanopartículas, que apresentam propriedades interessantes como o tamanho em escala nanométrica (geralmente desejável em abaixo de 300 nm), permitindo a modificação de propriedade dos materiais, como a capacidade de atravessar barreiras biológicas, o direcionamento para certos tipos de células ou para determinados locais intracelulares, além de permitir uma liberação prolongada quando administradas em determinados tecidos.
Estruturalmente, as nanopartículas podem ser classificadas como nanocápsulas ou nanoesferas, as quais diferem entre si segundo a composição e organização estrutural e podem ser obtidas de acordo com o método de preparo (ARAÚJO, NATHALIE FERREIRA SILVA DE MELO; RENATO; HENRIQUE; ANDRÉ DE, 2010; SCHAFFAZICK et al., 2003)
As nanocápsulas constituem os chamados sistemas do tipo reservatórios, nas quais é possível se identificar um núcleo diferenciado, que pode ser sólido ou líquido envolto por um invólucro polimérico, podendo o fármaco estar dissolvido neste núcleo e/ou adsorvido à parede polimérica. Por outro lado, as nanoesferas são formadas por uma matriz polimérica, onde o fármaco pode ficar disperso ou solubilizado no seu interior (PALMEIRO-ROLDÁN et al., 2014)
Desta forma obtém-se um sistema monolítico, onde não é possível identificar um núcleo diferenciado. Ambas apresentam propriedades bastante interessantes, tais como: o tamanho nanométrico, que possibilita atravessar a membrana e acumular no interior das células; a possibilidade de alterar a carga e a constituição de sua superfície, o que está diretamente relacionado com a especificidade de sua interação com a membrana celular (ARAÚJO, NATHALIE FERREIRA SILVA DE MELO; RENATO; HENRIQUE; ANDRÉ DE, 2010; DAVIS; CHEN; SHIN, 2008).
As nanopartículas preparadas a partir de polímeros biodegradáveis ocupam posição de destaque, as quais apresentam a vantagem de manipular suas propriedades físico-químicas de acordo com a composição dos monômeros constituintes e assim interagir com fármacos hidrofílicos ou lipofílicos, neutros ou com carga. Isto permite uma diversidade de aplicações como o tratamento de tumores, câncer, AIDS, diabetes, malária e tuberculose (DAVIS; CHEN; SHIN, 2008). As características destes materiais permitem sua aplicação em formulações de uso oral, oftálmico, sistemas bioadesivos e principalmente parenteral (HASMAM et al., 2009).
As vantagens da utilização de nanopartículas incluem a liberação controlada e/ou prolongada da substância nelas incorporadas, a redução de efeitos adversos associados à substância, a proteção de compostos da inativação antes de atingirem o local de ação, o aumento da penetração intracelular e o aumento da atividade farmacológica (HANS; LOWMAN, 2002; ROMERO; MORILLA, 2010).
2.4 Polímeros biodegradáveis
Materiais biodegradáveis são naturais ou de origem sintética e são degradadas in vivo, quer enzimaticamente ou não enzimaticamente, ou ambos, para produzir sub-produtos biocompatíveis e toxicologicamente seguros que são mais eliminados pelas vias metabólicas normais. O número de tais materiais que são utilizados em ou como adjuntos na liberação controlada de fármacos tem aumentado dramaticamente na última década. A categoria de base de biomateriais utilizados na entrega de fármacos pode ser amplamente classificadas como (1) polímeros sintéticos biodegradáveis, que inclui materiais relativamente hidrofóbicos, tais como os ácidos alfa-hidroxi (uma família que inclui poli (ácido lático-co-glicólico), PLGA), polianidridos, e outros, e (2) os polímeros que ocorrem naturalmente, tais como açúcares complexos (hialuronano), quitosana e inorgânicos (hidroxiapatite) (ANDERSON; SHIVE, 2012; NAIR; LAURENCIN, 2007; UHRICH et al., 1999).
O alento dos materiais utilizados na liberação do fármaco surge a partir da multiplicidade de doenças, gama de dosagem e requisitos especiais que podem ser aplicados. A biocompatibilidade é claramente importante, embora seja importante notar que a biocompatibilidade não é uma propriedade intrínseca de um material, mas depende do ambiente biológico e a tolerabilidade que existe com respeito a interações específicas fármaco/polímero de tecidos (ANDERSON; SHIVE, 2012).
Poliéster PLGA é um copolímero de ácido poli lático (PLA) e poli ácido glicólico (PGA). É o melhor biomaterial definido disponível para entrega de fármacos em relação ao design e desempenho. O ácido poli lático -carbono assimétrico, que é geralmente descrito como a forma D ou L, em termos estereoquímicas clássicos e, por vezes, como R e forma S, respectivamente. Alguns sistemas de liberação controlada utilizando PLGA já estão disponívies para o tratamento do câncer. Alguns exemplos desses sistemas disponíveis no mercado são: o Zoladex®, que consiste em um implante
de PLGA contendo gosserrelina, um análogo sintético da LHRH (Hormônio Liberador do Horônio Luteinizante) utilizado no tratamento do câncer de próstata; o Lupron Depot®
(acetato de leuprorida), Suprecur® MP (acetato de buserelina), Decapeptyl® e Trelstar Tm
depot (pamoato de triptorelina) também desenvolvidos para tratamento de câncer de próstata; e Depocyte®, sistema polimérico para liberação controlada da citarabina no
Trelstar Tm depot (pamoato de triptorelina) também desenvolvidos para tratamento de câncer de próstata; e Depocyte®, sistema polimérico para liberação
controlada da citarabina no tratamento de leucemias.
Como o benznidazol também atua nas espécies reativas de oxigênio, assim como os demais quimioterápicos já disponíveis no mercado para o câncer, sua inserção em nanopartículas possivelmente terá um efeito tanto para as células cancerígenas, quanto para a doença de chagas.
2.4.1 Poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA)
A fim de conceber um melhor dispositivo de liberação controlada, é essencial compreender as propriedades físicas, químicas e biológicas do PLGA. Este é formado por dois monômeros, o PGA que é desprovido de quaisquer grupos laterais metilo e mostra a estrutura altamente cristalina, e o PLA, como mostrado na Figura 1. PLGA pode ser transformado em praticamente qualquer forma e tamanho, e podem encapsular moléculas de praticamente qualquer tamanho. É solúvel em ampla gama de solventes comuns, incluindo solventes clorados, tetra-hidrofurano, acetona ou acetato de etilo(HOUCHIN; TOPP, 2009; SIEGEL et al., 2006). Em água, PLGA degrada-se por hidrólise das suas ligações éster (Figura 3).
Figura 3: Estrutura do poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA)
A presença de grupos laterais de metilo em PLA torna mais hidrofóbico do que o PGA e, portanto, copolímeros de PLGA são menos hidrofílicos, absorvem menos água e, subsequentemente, degradam-se mais lentamente. Devido à hidrólise do PLGA, os parâmetros que são tipicamente considerados descrições invariantes de uma formulação sólida pode alterar com o tempo, tal como a temperatura de transição vítrea (Tg), teor de humidade e peso molecular. O efeito destas propriedades do polímero sobre a taxa de liberação do fármaco a partir de matrizes poliméricas biodegradáveis tem sido amplamente estudado. A mudança nas propriedades de PLGA durante a biodegradação do polímero influencia as taxas de liberação e degradação de moléculas de fármaco incorporada. Propriedades físicas de PLGA têm sido demonstradas que dependem de múltiplos fatores, incluindo o peso molecular inicial, a proporção de ácido lático para glicólico, o tamanho do dispositivo, a exposição a água (forma de superfície) e temperatura de armazenamento (HOUCHIN; TOPP, 2009).
A resistência mecânica do PLGA é afetada por propriedades físicas, tais como peso molecular e índice de polidispersão. Estas propriedades também afetam a capacidade de ser formulados como um dispositivo de liberação de fármacos e podem controlar a taxa de degradação do dispositivo e hidrólise. Estudos recentes descobriram, no entanto, que o tipo de fármaco também desempenha um papel na definição da taxa de liberação (SIEGEL et al., 2006).
A resistência mecânica, o comportamento de intumescimento, a capacidade de se submeter a hidrólise e subsequentemente a taxa de biodegradação do polímero é diretamente influenciada pelo grau de cristalinidade do PLGA, que é mais dependente do tipo e proporção molar dos componentes monoméricos individuais da cadeia de copolímero. PGA cristalino, quando co-polimerizado com o PLA, reduz o grau de cristalinidade de PLGA e, como resultado aumentar a taxa de hidratação e de hidrólise. Como regra, maior teor de PGA leva a taxas mais rápidas de degradação com uma exceção de 50:50 de PLA / PGA, que exibe a degradação mais rápida, com maior teor de PGA levando ao aumento do intervalo de degradação inferior a 50%. O grau de cristalinidade e o ponto de fusão dos polímeros são diretamente relacionados com o peso molecular do polímero. A Tg dos copolímeros PLGA são relatados para estar acima da temperatura fisiológica de 37 ° C e, portanto, são de natureza vítrea, apresentando, assim, a estrutura da cadeia bastante rígida. Foi ainda relatado que a Tg de PLGA diminuir com a diminuição do teor de lático na composição de copolímero e com uma diminuição no
peso molecular (PASSERINI; CRAIG, 2001). Os polímeros de PLGA comercialmente disponíveis são normalmente caracterizados em termos de viscosidade intrínseca, que está diretamente relacionada com os seus pesos moleculares.
2.5 Métodos de obtenção das nanopartículas e de caracterização das nanopartículas
Existe uma diversidade de métodos são empregados para a preparação de nanopartículas poliméricas, como a nanoprecipitação, salting-out, emulsificação com difusão do solvente e emulsificação com evaporação de solvente (DOMINGUES, 2005; SCHAFFAZICK et al., 2003). A emulsificação com evaporação de solvente é certamente o mais consolidado, permitindo usar a quase emulsificação, emulsificação simples ou dupla de acordo com a solubilidade do princípio ativo e do polímero, assim como a razão fármaco/polímero e via de administração (HASMAM et al., 2009).
Este método geralmente inclui o uso de uma fase orgânica contendo um solvente apolar em que o polímero é dissolvido, a qual é emulsificada no interior de uma fase aquosa contendo um agente tensoativo, seguida da evaporação com a co-preciptação das partículas e eliminação dos resíduos de solvente ou tensoativos. Os fármacos não polares são adicionados na fase orgânica, enquanto os fármacos hidrofílicos, peptídeos ou proteínas podem ser adicionados em uma primeira emulsão água em óleo (dupla emulsão) ou adsorvidos na superfície das partículas formadas. Por esta técnica é possível apenas a formação de nanoesferas, pois o fármaco fica disperso na matriz polimérica (ARAÚJO, NATHALIE FERREIRA SILVA DE MELO; RENATO; HENRIQUE; ANDRÉ DE, 2010; SOUTO; SEVERINO; SANTANA, 2012).
Desta forma algumas variáveis importantes devem ser padronizadas na obtenção de nanopartículas por emulsificação com evaporação de solvente como o tipo de polímero, tipo de solvente, razão fármaco/polímero, razão fase interna/ fase externa e o tipo de tensoativo e concentração utilizada. Dentre alguns agentes tensoativos estão o álcool polivinílico (PVA), os poloxâmers ou ainda polissorbatos, monoesteres do sorbitano e os fosfolipídeos (SOUTO; SEVERINO; SANTANA, 2012). O PVA, os polaxamers e os fosfolipídeos possuem a vantagem de uso parenteral devido a menor toxicidade (ARAÚJO, NATHALIE FERREIRA SILVA DE MELO; RENATO; HENRIQUE; ANDRÉ DE, 2010).
Para solubilizar os polímeros por essa técnica, geralmente são utilizados solventes clorados, como o cloreto de metileno (diclorometano), clorofórmio ou mistura destes solventes com outros menos apolares devido a capacidade de solubilização, apolaridade e ao seu baixo ponto de ebulição. A maior desvantagem destes solventes orgânicos reside na sua toxicidade, os quais devem ser removidos totalmente do sistema (SCHAFFAZICK et al., 2003).
A caracterização das nanopartículas é muito importante para prever o comportamento das partículas in vivo e também para se ter conhecimento da sua estabilidade.(HOFFMANN et al., 1997; SCHULZE ISFORT; ROCHNIA, 2009). Diversos fatores podem interferir no modo de liberação da substância ativa, tais como o diâmetro da partícula, o modo de associação do ativo com a matriz polimérica, valor do potencial zeta, tipo tensoativos utilizados. Algumas caracterizações de nanopartículas realizadas são de espectroscopia de absorção UV-VIS; tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta, por meio de Dynamic Ligth Scaterring (DLS); técnicas de microscopia como força atômica (MFA) que fornece informações da estrutura tridimensional e imagens topográficas em escala nanométrica. Para caracterização das nanopartículas sólidas utiliza-se, na maioria das vezes, técnicas de Difração de Raios-X (DRX) para avaliar a cristalinidade do sistema; Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) para avaliar se há interação entre os componentes dos sistemas. Além destas técnicas clássicas, recentemente outras técnicas, como espectroscopia de Raman, eletroforese capilar, potenciometria, calorimetria de titulação isotérmica, dicroísmo circular, entre outras, também vem sendo utilizadas.
2.6 Estratégias para o aumento do targeting
Para determinados tecidos o direcionamento do fármaco pode ocorrer de forma passiva e/ou ativa. O direcionamento passivo ou natural pode ocorrer quando o sistema é reconhecido como um xenobiótico e assim é captado por tipos celulares específicos, permitindo o direcionamento ao sistema fagocítico mononuclear. Outro exemplo é o fato de alguns tecidos possuírem capilares fenestrados, com espaços intercelulares epiteliais maiores que capilares normais, os quais permitem a passagem e o acúmulo destes sistemas quando injetados na corrente circulatória em determinados tecidos, como no caso de alguns tumores (DAVIS; CHEN; SHIN, 2008).
O direcionamento ativo geralmente envolve a funcionalização dos sistemas, a qual pode ocorrer pela inclusão de determinados ligantes à superfície das partículas e assim pode alterar o perfil de distribuição devido ao reconhecimento por receptores das células alvo (BRUXEL et al., 2012). Outra estratégia de direcionamento ativo inclui o chamado
fundamentais para a estruturação de novas células em desenvolvimento como por exemplo ácido fólico, colesterol ou triglicerídeos que, as quais são utilizadas na síntese de DNA, e lipoproteínas sendo captadas mais rapidamente por células com alto anabolismo como o caso de células cancerígenas ou infectadas (SHIOKAWA et al., 2005).
Na doença de Chagas, substâncias promissoras para a funcionalização são o ácido siálico e o colesterol. O mais comum dos ácidos siálicos é o ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac), considerado o precursor dos outros membros da família como, por exemplo, do ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) e do ácido 2-deoxi-2,3-didehidro-N-acetilneuramínico (Neu5Ac2en) (BLUME et al., 2007; SCHAUER, 2004).
Em T. cruzi o ácido siálico foi primeiramente descrito na superfície de formas epimastigotas por meio do uso de lectinas e métodos colorimétricos. A presença de ácido siálico em formas epimastigotas foi comprovada por cromatografias em camada delgada e gás-líquida e espectrometria de massas. Há duas décadas, Pereira et al (1983) observaram a capacidade de tripomastigotas liberarem Neu5Ac de eritrócitos humanos e de glicoproteínas plasmáticas, descrevendo uma atividade, estágio específica, neuraminidásica (COURA; BORGES-PEREIRA, 2010).
Em 1985, Previato et al caracterizaram, pela primeira vez, a capacidade de formas epimastigotas de incorporarem ácido siálico em moléculas de superfície do parasito, utilizando como substrato doador sialoglico conjugados exógenos e sugeriram que a incorporação do ácido siálico às glicoproteínas da superfície do T. cruzi não se processava pela via convencional, onde o CMP-Neu5Ac é o substrato doador de ácido siálico. Esses resultados sugeriram, fortemente, que, em T. cruzi, a sialilação de glicoproteínas ocorria por uma nova rota metabólica, envolvendo reações de trans-glicosilação para ácido siálico. A capacidade de incorporação de ácido siálico em tripomastigotas foi demonstrada in vitro e in vivo. Nos estudos in vivo foi demonstrada a incorporação de Neu5Gc à superfície de formas tripomastigotas obtidas de camundongos infectados. Finalmente, a atividade trans-glicosilase para ácido siálico foi caracterizada como a
