5.6 Caracterização das nanopartículas
5.7.2 Cultivo de células Vero
Células da linhagem normais epiteliais obtidas de rim de macacos verdes africanos, Vero (American Type Culture Collection, ATCC: CCL-81), foram semeadas nos poços de placas de poliestireno, contendo as amostras de nanopartículas e em poços sem amostras, usados como referência (controle). Foi utilizada solução DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) com L-glutamina e 10% de soro fetal bovino (SFB), como suplementação adicional nos poços. O sistema foi incubado à 37°C com 5% de CO2. Após quatro horas de cultivo, foram retirados os sobrenadantes e repostos com
DMEM, complementada com L-glutamina e 10% de SFB, a fim de nessas condições proceder com os testes de viabilidade celular.
5.7.3 Cultivos de células Hek 293, Hep G2 e HT-29
Células da linhagem normais de rim humano Hek 293 (American Type Culture Collection, ATCC: CRL-1573); células de carcinoma hepático humano Hep G2 (American Type Culture Collection, ATCC: HB-8065); células de câncer colo retal humano HT-29 (American Type Culture Collection, ATCC: HTB-38) foram obtidos a
partir da coleção de Cultura da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Coleção RJCB, Rio de Janeiro, RJ). As células Hek 293 foram incubadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino (CULTILAB LTD, Brasil), e as células Hep G2 e HT-29 em Roswell Park Memorial forma Instituto 1640 (RPMI) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino (CULTILAB LTD, Brasil). Ambas as condições num recipiente de atmosfera úmida contendo 5% de CO2 à
temperatura de 37 °C. Manutenção de células e meio de troca de subcultura acordo com as necessidades de cada cepa foi feita a cada 3 dias. Após atingir uma densidade de células adequada para o experimento, 80% de confluência, as células tripsinizadas com Tripsina / EDTA, contados com uma câmara de Neubauer e plaqueadas em placas de 96 poços.
5.7.4 Cultivos de células H9c2
Células da linhagem H9c2 (American Type Culture Collection, ATCC: CRL 1446), células de cardiomiócito, provenientes do coração de ratos neonatos foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de SFB, 1% de glutamina 2 mM e 0,2% de gentamicina 200 µg/ml. Foi semeada em poços de placas de poliestireno de 96 poços. Garrafas de cultura de 75 cm2 contendo estas células foram mantidas em estufas a
37 oC e 5% de CO
2 e tripsinizadas semanalmente ou quando atingiam confluência para
manutenção constante ou quando utilizadas em experimentos.
5.7.5 Ensaio de viabilidade celular para Vero, Hek 293, Hep G2 e HT-29
A viabilidade de células Vero, Hek 293, HEP e HT-29 contra solução de benznidazol (BNZ), nanopartículas contendo BNZ (NP BNZ), nanopartículas contendo BNZ e ácido siálico (NP BNZ AS), nanopartículas contendo BNZ e colesterol (NP BNZ COL), nanopartículas contendo BNZ, ácido siálico e colesterol (NP BNZ AS COL) e nanopartículas livres de fármaco (NP), foi feita pelo ensaio de MTT (3-metil- [4,5- dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). As células viáveis detêm a capacidade para reduzir o MTT a succinato desidrogenase devido a atividade enzimática encontrada nas mitocôndrias. Todas as linhagens celulares foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5x103 células / poço. Após 24 h, as amostras foram filtradas por meio de
com DMSO a 1%. Foram utilizadas as seguintes concentrações de BNZ: 250 µg/mL, 125 µg/mL, 62,5 µg /mL, 31,25 µg /mL e 15,625 µg /mL. As mesmas concentrações foram utilizadas para NP BNZ, e NP BNZ AS, NP BNZ COL e NP BNZ AS COL. Após a incubação de 24 e 48 horas, o sobrenadante foi removido e 100 µL de recipiente do meio contendo MTT foi adicionado (concentração final de 5 mg/mL) a cada poço. A placa foi colocada numa estufa a 37 ° C e CO2 a 5% durante 4 horas. Após este tempo, o MTT contido em meio de cultura foi removido e 100 µL de etanol foram adicionados a cada poço. As placas foram protegidas da luz, sob agitação durante 15 min. A absorbância foi medida a 570 nm usando leitor de microplacas ELISA (modelo Biotek®, Epoch).
5.7.6 Obtenção do parasito
5.7.6.1 Cultivo das formas epimastigotas
As formas epimastigotas das cepas Y foram cultivadas de forma axênica utilizando meio LIT (Liver Infusion Triptose), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), mantidas em estufa BOD, a 28ºC. Para o crescimento exponencial, foi adicionado o meio de cultura, a cada 2 dias, em cada cultura e estas então submetidas a um repique semanal. Com objetivo de manter as características biológicas de cada cepa, após cerca de oito semanas, os parasitos foram homogeneizados em meio LIT contendo 10% de glicerina (Sigma) e submetidos à criopreservação em nitrogênio líquido.
5.7.6.2 Obtenção de formas tripomastigotas metacíclicas
As formas tripomastigotas metacíclicas da cepa Y foram obtidas a partir de formas epimastigotas mantidas em meio LIT. Cinco mililitros de cultura, em fase exponencial,
foram adicionados a 15 mL de mei Sigma), pH 7,0. Essa
suspensão de parasitos foi mantida em garrafa de cultura (75 cm3), a 28 ºC, por 12 dias.
Após esse período o sobrenadante foi coletado e centrifugado a 2100g, 4 ºC, por 15 min. Determinou-se o número de parasitos por meio de contagem em câmara de Neubauer e a percentagem de formas metacíclicas foi avaliada após confecção de um esfregaço da cultura, fixação com metanol por 5 minutos e coloração pelo Giemsa (10% em água
destilada). No mínimo, 200 parasitos foram contados em cada lâmina. Nessas condições, em geral observa-se cerca de 65% de metaciclogênese.
5.7.6.3 Obtenção de formas tripomastigotas em células H9c2
As formas tripomastigotas da cepa Y utilizadas para infectar as células H9c2 foram obtidas a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas. Para isso, células H9c2 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de SBF. Ao atingir cerca de 70% de confluência, a cultura foi infectada, na proporção de 10 parasitos por célula, com tripomastigotas sanguíneos oriundos do sangue de camundongos infectados pela cepa Y, no pico de parasitemia, que corresponde ao 8o dia de infecção. Após 24 horas de
incubação a 37 ºC, 5% de CO2, o meio de cultura foi removido e os parasitos não
internalizados, bem como detritos celulares, foram retirados por meio de sucessivas lavagens com PBS. Às células, foi adicionando meio DMEM suplementado com 10% de SBF, e novamente incubadas a 37º C por 72 a 96 horas, quando o sobrenadante é coletado e centrifugado, a 600 rpm, 24 ºC, por 2 minutos, para remoção dos debris celulares. Posteriormente, o sobrenadante, rico em parasitos, foi centrifugado a 3000 rpm, 4 ºC, 15 min. e o sedimento ressuspendido em meio de cultura para posterior utilização nos experimentos. Apenas parasitos recém-liberados das células foram utilizados nos experimentos, uma vez que o sobrenadante é periodicamente coletado e meio de cultura fresco é novamente adicionado.
5.7.6.4 Obtenção de formas tripomastigotas em células Vero
As formas tripomastigotas da cepa Y -gal) e CL-Brener utilizadas para infectar as células Vero foram obtidas a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas. Para isso, células Vero foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de SBF. Ao atingir cerca de 70% de confluência, a cultura foi infectada, na proporção de 10 parasitos por célula, com tripomastigotas sanguíneos, no pico de parasitemia, que corresponde ao 8o dia de infecção. Após 24 horas de incubação a 37 ºC,
5% de CO2, o meio de cultura é removido e os parasitos não internalizados, bem como detritos celulares, foram retirados por meio de sucessivas lavagens com PBS. Às células, foi adicionando meio DMEM sem soro, e novamente incubadas a 37º C por 72 horas,
quando o sobrenadante é coletado e centrifugado, a 3000 rpm, 24 ºC, por 8 minutos e o sedimento ressuspendido em meio de cultura para posterior utilização nos experimentos. Apenas parasitos recém-liberados das células foram utilizados nos experimentos, uma vez que o sobrenadante é periodicamente coletado e meio de cultura fresco é novamente adicionado.
5.7.7 Ensaios de citotoxicidade
Para avaliar os efeitos tóxicos do BNZ e das nanopartículas sobre as culturas de células H9c2 não infectadas por T. cruzi foram tratadas com concentrações de fármacos muito superiores aos valores de IC50 para BNZ, no Laboratório de Zoonoses da Escola de Medicina da UFOP (EMED-UFOP). Duzentos microlitros de suspensão das células H9c2, na concentração de 5x103 /mL, foram pipetados em placas de 96 poços e incubados
a 37º, 5% de CO2, por 24 horas. O meio de cultura foi removido e substituído por 200 µL
de meio contendo ou não concentrações decrescentes de BNZ (6 diluições 1:2, a partir de 300µM) isoladamente e nas nanopartículas, e a placa novamente incubada por 72 horas. Foram adicionados à cada placa: controles negativos (meio+resazurina), controles negativos (meio), controles positivos (meio+células), controles para avaliar o potencial dos fármacos (meio+BNZ, na ausência de parasitos) ou do DMSO (meio+DMSO) em reduzir o corante. A fim de avaliar a eficácia do método em detectar a morte celular, foram utilizadas concentrações decrescentes de DMSO que são sabidamente tóxicas para as células (3% e 30%). Após as 72 horas de incubação a 37ºC, foram adicionados 20 µL de resazurina 1mM a cada poço e a placa foi lida em leitor de microplacas (570 nm e 600nm). A porcentagem de inibição da proliferação induzida pelos compostos foi calculada utilizando-se a fórmula abaixo:
Nessa fórmula, A570= Absorbância a 570nm, A600= Absorbância a 600nm, Controle + é o poço contendo células, meio e resazurina, na ausência do fármaco. R0 é o fator de correção, calculado a partir dos valores de absorbância do controle negativo (C- ), ou seja, apenas meio de cultura e resazurina na ausência de células [Ro = (A570/A600)C-].
5.7.8 Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos sistemas nanoparticulados contendo benznidazol sobre formas amastigotas em células H9c2
A avaliação do efeito do tratamento com as nanopartículas contendo benznidazol sobre amastigotas da cepa Y foi realizada em células H9c2 infectadas. Foram plaqueadas 1x104 células por poço, sobre lamínulas esféricas de 13 mm de diâmetro, em placas de 24
poços e incubadas por 24 horas a 37 ºC, 5% CO2. Formas tripomastigotas originadas de
cultura de células, obtidas conforme descrito na seção 5.8.6.3, foram utilizadas para infecção em uma razão de 20:1 (parasitos:células). Após 24 horas de interação, o sobrenadante é removido e cada poço é lavado no mínimo três vezes com PBS estéril, a fim de remover os parasitos não internalizados. Meio de cultura fresco contendo ou não sistemas nanoparticulados, em diferentes concentrações, é adicionado a cada poço, em um volume total de 1 mL. As células foram novamente incubadas por 72 h, a 37 ºC. As concentrações iniciais de cada sistema são definidas a partir de experimentos preliminares.
Em todos os experimentos foram utilizados controles, que corresponderam a células não infectadas e tratadas, não infectadas e não tratadas, infectadas e não tratadas. As lamínulas contendo as células foram lavadas com PBS, fixadas com metanol por cinco minutos e em seguida, coradas pela solução de Giemsa (10% em água destilada). Após secas, lamínulas contendo as células foram coladas em lâminas de vidro com Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha). Foram quantificados o número de células infectadas e o número de amastigotas por célula utilizando microscópio óptico. As imagens das células, visualizadas pela objetiva de 40x, foram digitalizadas por meio de microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite,versão 2.4.0 R1) (MONTEIRO et al., 2015).
A determinação do efeito de cada uma das concentrações dos fármacos isoladamente é feita utilizando o índice do endocítico, que corresponde à média da percentagem de células infectadas multiplicada pelo número médio de amastigotas por célula. O índice endocítico observado nas células incubadas com os diferentes fármacos isoladamente ou em combinação foi utilizado para calcular o percentual de inibição da infecção com relação às células infectadas e não tratados.
A partir desses valores foram construídas as curvas de dose-efeito e cálculo da IC50 com auxílio dos softwares Graph Pad Prism 5 e CalcuSyn. Todos os experimentos com amastigotas foram realizados em duplicatas, com no mínimo 2 repetições.
5.7.9 Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos sistemas nanoparticulados contendo benznidazol sobre formas amastigotas em células Vero
As células Vero foram plaqueadas em placas de 96 poços (Corning Inc.) por 24 horas e foram infectadas com tripomastigotas da cepa -gal). Os tripomastigotas -galactosidase derivada de células foram colhidos e tratados com diferentes concentrações de compostos (NP, NP BNZ, NP BNZ AS, NP BNZ COL e NP BNZ AS COL) variando de 40 µM a 0,3125 µM por 4 h, usando placas de 96 poços. Depois 24 e 48 h pós-infecção (5% de CO2 a 37ºC de atmosfera umidificada), os poços
foram lavados com PBS 1X e adicionado o Clorofenol vermelho- -D-galactopiranósido (CPRG), como substrato colorimétrico (PAULA et al., 2013). Poços com células infectadas com tripomastigotas incubados por 4 h, sem amostras de fármaco ou nanopartículas, foram considerados como 100% de referência para infecção por tripomastigotas. A absorbância foi medida a 595 nm com um leitor de microplacas (Bio- Tek ELx800).
5.7.10 Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos sistemas nanoparticulados contendo benznidazol sobre formas epimastigotas
-gal), CL-Brener e Y na fase logarítmica de crescimento foram semeadas em placas de 96 poços em uma concentração final de 6 x 106 /mL e incubadas com diferentes concentrações de nanopartículas sem fármaco (NP)
e nanopartículas carregadas com BNZ (NP BNZ), nanopartículas carregadas com BNZ e AS (NP BNZ AS), nanopartículas carregadas com BNZ e COL (NP BNZ COL) e nanopartículas carregadas com BNZ, AS e COL (NP BNZ AS COL). A cultura de crescimento foi feita em meio LIT suplementado com 10% de SBF, em que o meio de cultura nunca excedeu uma concentração final de 0,5%. Condições de controle como parasitos sem fármacos e meio sem parasitos foram incluídos. A placa foi incubada
durante 72 h a 28 ºC (PAULA et al., 2013). A resazurina foi adicionada a uma concentração final de 100 mM e foi incubada a 28 ºC com os parasitos durante 4 h. A absorbância foi medida a 490 e 595 nm com um leitor de microplacas (Bio-Tek ELx800). Os dados foram analisados conforme descrito por Rolón e colaboradores, e a viabilidade de parasitos em relação às condições de controle (100% de viabilidade) foi determinada (ROLÓN et al., 2006).
5.7.11 Análise de microscopia confocal
-gal) foram incubadas com alíquotas de 40 µM de compostos (NP, NP BNZ, NP BNZ AS, NP BNZ COL e NP BNZ AS COL), marcadas com a sonda fluorescente FITC (isotiocianato de fluoresceína), por 24 h. A mesma análise foi feita para as nanopartículas contendo siRNA marcados com Cy5, porém em dois tempos de incubação (3h e 24h). Após cada etapa, os parasitos foram centrifugados a 3000 rpm por 10 min. O pellet foi suspenso com PBS (1X, pH 7,4) e novamente centrifugado a 3000 rpm durante 10 min. O pellet de parasitos foi fixado com paraformaldeído a 4% (Sigma) por 40 min e novamente centrifugado por 10 min. O novo pellet obtido foi suspenso em 10 µL de PBS 1X e estocado a 4º C. As lâminas foram montadas usando polilisina, para a aderência celular e com o reagente ProLong® Antifade
-diamino-2- fenilindole) (Invitrogen), que cora núcleo e cinetoplasto dos parasitos. Os parasitos foram analisados usando um microscópio confocal ZEISS LSM 800, óleo 63x / 1.4, localizado no Institut Pasteur de Montevideo-UY, usando o software de imagem ZEN 2.3 para microscopia.
5.7.12 Atividade hemolítica
Amostras de sangue, de bolsas vencidas de concentrado de hemácias doadas pelo Hemonorte Natal (1,5 mg EDTA: 1 mL de sangue), foram lavadas três vezes com soro fisiológico e submetidas a centrifugação a 800 g por 10 minutos entre cada lavagem, das quais 20% (RBC) de suspensão foi preparada. Diluições seriadas da fração F 1.0 (50- 1000 µg) foram adicionadas separadamente à cada microtubo contendo 1 mL de suspensão de RBC a 0,2% e incubadas a 37 °C por 1 h. Os tubos foram centrifugados durante 10 min a 800 g e o grau de lise de eritrócitos foi avaliado medindo a densidade
óptica do sobrenadante a 540 nm de comprimento de onda. Os resultados foram comparados com controle negativo não tratado e um controle positivo (100% de lise) em que a solução salina normal foi substituída pelo detergente Triton X-100 (100% de lise) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).
5.8 Avaliação da eficácia dos sistemas in vivo