6.1.1 Concentração do tensoativo
O efeito da concentração de tensoativo no tamanho de partícula, IPD e potencial zeta foram investigadas por meio da preparação de uma série de amostras com uma concentração fixa de PLGA (0,5%) e do tensoativo polimérico PVA (0,5%) a uma velocidade de agitação de 20.000 rpm.
O tipo de tensoativo não-iônico usado teve um impacto significativo no diâmetro e na distribuição de tamanho de partícula dos sistemas formados (Figura 4 A). As menores NPs, com a distribuição mais estreita, foram formadas nos sistemas apresentando um diâmetro 285,5 ± 4,2 nm e IPD 0,087 ± 0,1 nm, enquanto que os maiores NPs com a distribuição mais ampla foram formadas nos sistemas preparados utilizando 2,0% de PVA, apresentando um diâmetro de 530,3 ± 8,6 nm e IPD 0,204 ± 0,02 nm.
Como observado na Figura 4 A, o diâmetro inicialmente decresceu com o aumento da concentração de tensoativo (0,25 a 0,5%). Esta observação tem sido atribuída a vários fenômenos físico-químicos dependendo do mecanismo que foi proposto para formar as nanopartículas. Em primeiro lugar, tem sido atribuída a um aumento da adsorção de moléculas de tensoativo fase orgânica / interface fase aquosa que conduzem a uma diminuição da tensão interfacial, o que provoca a formação de partículas menores (ANTON; VANDAMME, 2009). Em segundo lugar, tem sido atribuída a uma maior quantidade de moléculas de tensoativo difundindo a partir da fase orgânica para a fase aquosa, conduzindo assim à formação de menor diâmetro NP (LAMAALLAM et al., 2005).
Quando a concentração de tensoativo foi aumentada ainda mais (1,0 a 2,0%) observou-se um aumento no diâmetro médio das partículas, o que também foi relatado em outros estudos (ANTON; VANDAMME, 2009; ARAÚJO, NATHALIE FERREIRA SILVA DE MELO; RENATO; HENRIQUE; ANDRÉ DE, 2010). Postulou-se que o tamanho das gotículas aumentam acima de uma determinada concentração de tensoativo devido à formação de uma fase líquida altamente viscosa, que faz separação espontânea entre as fases (WANG et al., 2009). Além disso, Lebouille et al (2013) atribui este
comportamento da superfície das nanopartículas poliméricas que são bastante e pode facilmente fundir e formar partículas mais grosseiras (LEBOUILLE et al., 2013).
O IPD segue a mesma tendência que o diâmetro das partículas, diminuindo o valor até a concentração de 0,5%, e aumentando após 1,0% de PVA. Na concentração de 0,5% do PVA, o valor do potencial zeta foi de -37,7 mV, levando em consideração o sistema de estabilidade relativa. No entanto, os valores do potencial zeta, após a otimização do solvente, diminuíram de valores próximos a -30 mV para valores próximos a -2 mV.
Sabe-se que valores de potencial zeta elevado ~ 30 mV, positivos ou negativos, levam a partículas com estabilidade coloidal aumentada devido à repulsão eletrostática entre partículas de mesma carga, o que impede sua agregação e, consequentemente fenômenos de instabilidade (BHATTACHARJEE, 2016). No entanto, como o polímero é aniônico e tem tendência a ter cargas próximas de zero, um monitoramento periódico é necessário para garantir e avaliar a estabilidade dos sistemas.
6.1.2 Tipo de tensoativo
Diferentes tensoativos foram testados na concentração de 0,50%, que foi a melhor concentração encontrada para o PVA. Para isso, partiu-se de uma concentração de 0,50% de PLGA, usando a rotação de 20.000 rpm, usando um ultra-turrax T18. Pelos resultados obtidos, o tensoativo em que foi possível obter o menor tamanho de partícula foi o PVA, sendo o único com tamanho inferior a 300 nm, como mostra na Figura 4B.
O PVA é um tensoativo polimérico que permite melhor estabilizar a formulação. A estrutura química da PVA explica essa diminuição de tamanho de partícula quando organiza a matriz polimérica das partículas(IQBAL et al., 2015; POOJA et al., 2016). É um tensoativo polimérico, aniônico, hidrofílico, biodegradável, capaz de promover maior resistência química as nanopartículas (OSUNTOKUN; AJIBADE, 2016). Rosenblatt e Bunjes (2009) obtiveram com sucesso de NP utilizando PVA como agente tensoativo para a estabilização de nanopartículas, apresentando elevada estabilidade (ROSENBLATT; BUNJES, 2009).
sua estrutura que contém o grupo hidroxila ligado e que pode servir como uma fonte de ligação que permite a formação de nanopartículas homogêneas e estáveis (OSUNTOKUN; AJIBADE, 2016).
6.1.3 Concentração do polímero
Um parâmetro importante para as características de tamanho e superfície das nanopartículas é a concentração de polímero. Para este parâmetro foi utilizado nanopartículas com uma concentração fixa de PVA (0,5%) a uma velocidade de agitação de 20.000 rpm. Este efeito é mostrado na Figura 4 C.
A variação da concentração de copolímero PLGA na fase orgânica na gama de 0,25 a 1,0 % (m/v) contribuiu para uma sucinta diminuição no tamanho de partícula de 0,25% a 0,5% (370,4 nm 285,0 nm). Nas concentrações de 1,0% (312,1 nm) não houve diferença significativa quando comparado com o de 0,5% (p<0,05). A fim de melhor a eficiência de encapsulação, a concentração de 1,0 % foi escolhida por conter maior quantidade de polímero que fornecia um menor tamanho. A partir de 1,5% (347,1 nm) o diâmetro de partícula já começa a aumentar. Isto ocorreu provavelmente devido não somente ao aumento de concentração do soluto nas gotículas de solventes orgânicos, mas também ao aumento da viscosidade da fase dispersa (solução de polímero no solvente orgânico), resultando na formação de gotículas maiores (CAÑADAS et al., 2016).
Além disso, a associação de polímero de cadeia conduz a uma resistência de transferência de massa, diminuindo difusão solvente resultando em nanopartículas maiores (DE OLIVEIRA et al., 2013; JANA et al., 2014). Esta dependência direta do tamanho de NP com a concentração do polímero também foi observado por outros autores para Eudragit, PLA e quitosana (CHORNY et al., 2002; KWON et al., 2001).
O potencial zeta negativo (-11 mV) é atribuído à carga do polímero. Não houve diferença significativa no potencial zeta entre diferentes concentrações de polímero (p>0,05), mas um ligeiro aumento é sugerido, devido à maior quantidade de polímero (JANA et al., 2014).
Neste passo, a concentração de 1,0% (m/v) de polímero foi fixada, a fim usar uma quantidade razoável de polímero, uma vez que esta concentração mostrou-se satisfatória na produção de partículas de tamanhos menores. A polidispersão da dispersão também foi menor que nas demais concentrações, apresentando um valor médio de 0,084 ± 0,0215 nm.
6.1.4 Influência do tipo de solvente
O efeito do tipo e proporção do solvente sobre a formação de pequenas partículas pelo método de emulsificação com evaporação solvente foi investigada por meio da preparação de NP com concentração fixa de PLGA (1,0%) e concentração de PVA fixa (0,5%) a uma velocidade de agitação de 20.000 rpm.
Pode ser observado na Figura 4 que diâmetro médio e o IPD das NPs formadas foram afetados pelos diferentes solventes. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP) (n = 3).
O solvente miscível em água, a acetona (cerca de constante dielétrica 20,6) foi misturada com diclorometano (cerca de constante dielétrica de 9,1) em diferentes proporções (100:0, 75:25; 50:50 e 25:75, 0:100). O tamanho das partículas diminuiu de forma significativa (p <0,05) quando utilizado nesta combinação de solventes, a 25:75 em comparação com DCM puro (Figura 4 D).
Solventes de elevada polaridade como acetona são relatados para formar nanopartículas de pequeno tamanho (ARAÚJO, NATHALIE FERREIRA SILVA DE MELO; RENATO; HENRIQUE; ANDRÉ DE, 2010; LEGRAND et al., 2007; THIOUNE et al., 1997), promovendo a difusão rápida da fase orgânica para a fase aquosa (GUHAGARKAR; MALSHE; DEVARAJAN, 2009; MU; FENG, 2002). Isso justifica o menor tamanho de partícula ser obtido com DCM: ACE na proporção 25:75, apresentando um diâmetro de 209,1 ± 2,03 nm e IPD 0,137 ± 0,009 nm.
Mainardes et al (2005) em estudo de otimização de nanopartículas de PLGA contendo praziquantel, utilizando o PVA como tensoativo e mesmo solvente não polar (DCM), pelo método de emulsificação com evaporação solvente, obteve tamanho de partículas em torno de 248 nm. Isto prova a importância de associação de solventes mais polares com DCM para reduzir o tamanho de partícula.
Partículas em escala nanométrica apresentam as vantagens de melhorar a captação intracelular, proteger o ativo, prolongar a biodisponibilidade e a meia-vida, promovendo uma liberação sustentada, consequentemente com a redução da frequência e dose de determinados fármacos e biomolécula (DOMBU; BETBEDER, 2013; RAGUSA et al., 2018).
Figura 4: Diâmetro médio e potencial zeta em função da concentração (A) do tensoativo PVA; (B) concentração de diferentes tensoativos; (C) concentração do polímero PLGA;
e (D) relação volume / volume de diclorometano (DCM) / acetona (ACE), na fase orgânica.
6.1.5 Funcionalização da superfície das partículas
A fim de modificar a superfície das partículas para melhorar o direcionamento ao órgão-alvo, foram adicionados ao sistema ácido siálico e colesterol, tanto separadamente constituindo sistemas distintos, bem como juntos num só sistema. A princípio, cada sistema foi avaliado a 50 µg.mL-¹ (concentração já otimizada em trabalhos anteriores do
grupo). O resultado pode ser observado na Tabela 1.
O aumento do tamanho das partículas (~250 nm) nos sistemas funcionalizados com ácido siálico e colesterol é um indicativo de que houve realmente a modificação da superfície das partículas (MOBARAK; SALAH; ELKHESHEN, 2014). Pode-se
-¹,
embora tenham sofrido uma ligeira modificação em suas características físicas, seus valores ainda eram adequados para tamanho (< 300nm), IPD (< 0,300nm)e apresentaram valores de potencial zeta em torno de -5 mv.
A funcionalização das partículas é uma etapa de extrema importância, pois permite as nanopartículas adquirirem variadas características, entre elas, o aumento da adsorção de moléculas negativas, retardamento da captação celular por células do sistema imunológico, superando as barreiras biológicas, facilitando assim a entrega de constituintes e do fármaco (MESQUITA et al., 2017; LAZARUS; SINGH, 2016).
6.1.6 Eficiência de Encapsulação
A eficiência de carga de fármaco foi investigada por diferentes razões fármaco:copolímero (1:5, 1:10 e 1:20 m/m). O BNZ foi encapsulado com êxito nas nanopartículas, mesmo para as amostras com a porcentagem de fármaco mais elevada. A melhor eficiência de encapsulação para o BNZ (95%) foi observada para a razão fármaco:copolímero de 1:10, que corresponde a cerca de 10% da carga de fármaco.
Nesta mesma razão foi avaliada a EE% das nanopartículas funcionalizadas com ácido siálico e colesterol. É possível também observar que houve uma diminuição do tamanho de partículas funcionalizadas com colesterol, após a incorporação do BNZ. A do Ácido Siálico (231,6 ± 6,5 nm) e de colesterol (224,7 ± 18,7 nm) e a de ácido siálico e colesterol (245,9 ± 1,7 nm) como mostrado na Tabela 1.
A eficiência de encapsulação também foi calculada para esses sistemas, ambos contendo 10% de BNZ, que foi o melhor valor obtido na EE% da nanopartícula otimizada.
Tabela 1: Efeito da funcionalização da superfície da nanopartículas
Nanoparticulas Diametro (nm) ± SD IPd ± SD PZ (mV) ± SD (EE%) (DL%)
NP 209,1 ± 2,03 0,137 ± 0,01 -1,0 ± 0,2 - -
NP BNZ 248,0 ± 1,7 0,145 ± 0,03 -2,0 ± 0,2 95,1 8,75 NP BNZ AS 231,6 ± 6,5 0,155 ± 0,04 -1,9 ± 0,1 65,6 8,99 NP BNZ COL 224,7 ± 18,7 0,081 ± 0,01 -2,1 ± 0,1 75,0 8,99 NP BNZ AS COL 245,9 ± 1,7 0,215 ± 0,21 -3,2 ± 0,4 72,1 9,05
Em concordância com os valores de menor tamanho de partícula, foi expressa uma maior eficiência de encapsulação para os sistemas contendo ácido siálico (50 µg.mL-¹),
colesterol (50 µg.mL-¹) e ácido siálico e colesterol (25 µg.mL-¹ cada) (65,6 EE%, 75,0
EE% e 72,1 EE%, respectivamente). Isso confirma o menor diâmetro caracterizar uma maior superfície de contato, o que acarreta a uma encapsulação mais eficiente (MOBARAK; SALAH; ELKHESHEN, 2014). Como essas substâncias podem estar competindo pelo substrato do polímero junto ao fármaco, os valores de eficiência são menores quando comparados com dos sistemas contendo apenas o fármaco, levando a uma diminuição na eficiência de encapsulação do fármaco e um ligeiro aumento da carga de fármaco quando comparado com as nanopartículas sem funcionalização (KUMARI; YADAV; YADAV, 2010). A adição de colesterol causou uma mudança muito menor na eficiência de encapsulação em relação ao ácido siálico. Possivelmente, o colesterol interagiu mais fortemente com o polímero (LEE et al., 2016).
6.1.7 Análise de espectroscopia na região do infravermelho
A análise do Infravermelho foi realizada para verificar se houve interação entre os componentes da matriz polimérica e o fármaco. Por meio dessa análise foi possivel perceber as interações moleculares entre os constituintes das nanopartículas.
A Figura 5 A mostra as comparações dos espectros de ATR-FTIR de compostos individuais (PVA, PLGA, BNZ, AS e COL) e na Figura 5 B das nanopartículas de PLGA (NP), das nanopartículas de PLGA contendo o fármaco (NP BNZ) e das nanopartículas de PLGA contendo o fármaco funcionalizadas (NP BNZ AS, NP BNZ AS COL), com
10% de BNZ. Tais análises mostraram os números de onda expressos nas substâncias isoladas e posteriormente inseridas nos sistemas obtidos, permitindo a análise orgânica qualitativa de todos os compostos.
Figura 5: Espectros de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR ATR): a) dos compostos isolados e b) das NP (NP sem fármaco), NPBNZ (NP com BNZ), NPAS (NP com BNZ e AS), NPCOL (NP com BNZ e COL).
Assim, esses espectros foram ampliados para observar os sinais mais relevantes dos grupos funcionais de BNZ nas amostras de nanopartículas. No espectro de NP BNZ, as bandas na região de 1530 cm-1 e 1730 cm-1 corresponderam às vibrações de deformação
axial e angular das ligações C-H presentes no grupo aromático do fármaco, enquanto aquelas na região de 3600 - 3800 cm-1 são devido às vibrações de alongamento de N-H.
Para todos os sistemas nanoparticulados são evidentes os bandas características do copolímero PLGA (1750 cm-1 e 1100 cm-1). Uma redução na intensidade desta banda nas
NP BNZ AS e NP BNZ COL foi observada. O alongamento das bandas é mais evidente em nanopartículas sem funcionalização e com mistura de AS e COL.
Os resultados do ATR-FTIR corroboram com as bandas de BNZ encontradas em estudos anteriores com BNZ encapsulado em partículas de ciclodextrinas (DE MELO et al., 2013). Para todos os sistemas de nanopartículas são evidentes as bandas características do copolímero, demonstrando que a estrutura química da superfície das nanopartículas é semelhante à do PLGA, porém com intensidade mais forte. Uma redução na intensidade desta banda nas NP BNZ AS e NP BNZ COL pode ser associada ao alongamento da vibração de C=O e a vibrações de deformação do C-N aromático, respectivamente. O alongamento destas bandas é mais evidente em nanopartículas sem funcionalização e com mistura de AS e COL. Os resultados sugerem que o BNZ, bem como as substâncias de funcionalização foram incorporadas nas nanopartículas. A interação entre o fármaco/ copolímero e substâncias de funcionalização comumente leva a mudanças identificáveis nos padrões de FTIR nas nanopartículas (ZHANG et al., 2013).
6.1.8 Microscopia de Força Atômica (MFA) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura foram obtidas para avaliar a forma e a superfície das partículas. Por MFA e MEV provou-se que as nanopartículas produzidas apresentaram estrutura levemente esférica e superfície lisa e aspectos homogêneos (Figura 6).
Comparações das imagens 3D (MFA) e 2D (MEV) mostram que as nanopartículas de PLGA, mesmo com a adição de BNZ, ácido siálico e colesterol não afetaram a forma (esférica) e tamanho (menor que 300 nm) das nanopartículas. O tamanho mediano de
partícula lateral para todos os sistemas foi de aproximadamente 174-255 nm, próximo aos valores encontrados pelo DLS (Tabela 1).
Um estudo sobre a nanoencapsulação do benznidazol em carbonato de cálcio mostrou partículas de tamanho reduzido por MFA, na imagem 2D (TESSAROLO et al., 2018). No entanto, foi possível ver a presença de aglomerados dos sistemas sem fármaco, o que não ocorre em nosso trabalho. Montasser et al. (2012) também observaram a aparência esférica de nanopartículas lipídicas sólidas e sua homogeneidade por MFA, mostrando que esse sistema de nanopartículas é bastante organizado (DEWIDAR, 2012).
Figura 6: Microscopia de Força Atômica (MFA) em 3D e Microscopia de Eletrônica de Varredura (MEV) em 2D, respectivamente, das nanopartículas. A) NP, B) NP BNZ, C) NP BNZ AS, D) NP BNZ COL e E) NP BNZ AS COL
6.1.9 Avaliação da Estabilidade Física
Os dados experimentais demonstraram a excelente estabilidade de todas as nanopartículas, incluindo o funcionalizado (Figura 7). As formulações permaneceram estáveis (diâmetro de cerca de 230 nm) com potencial zeta de cerca de -2,0 mV ao longo de todo o intervalo de estudo (seis semanas).
Figura 7: Avaliação da estabilidade física das NPs por 6 semanas para NP, NP BNZ, NP BNZ AS e NP BNZ COL NP BNZ AS COL).
Estudos publicados com nanopartículas geralmente não relatam a estabilidade física das formulações propostas ou apenas consideram intervalos pequenos, como poucas horas ou dias. As nanopartículas coloidais são essencialmente termodinamicamente instáveis, devido à ocorrência favorável de fenômenos de instabilidade (BINDER; VIRNAU; STATT, 2014; GROUCHKO et al., 2014). Este fato também foi apoiado pelo potencial zeta, que é um parâmetro frequentemente usado para monitorar a estabilidade de dispersões coloidais contra floculação, detonando, sedimentação ou coalescência (TERAYAMA et al., 2003; LEMARCHAND et al, 2003a, 2003b, COURNARIE et al., 2004; DALE et al., 2005).
Uma razão para essa estabilidade é a presença do tensoativo polimérico, PVA Em um estudo de Mu e Feng (2002) sobre Vitamina E TPGS, como um emulsionante para a produção de nanoesferas poliméricas nas quais o PVA foi usado, indica que o tensoativo foi muito importante para estabilizar as gotículas da fase dispersa, já que a linha superior da superfície da gota gera mais partículas esféricas, promovendo a estabilidade e diminuindo a energia livre na interface entre as duas fases. Assim, a estabilização estérica induzida pelo tensoativo polimérico PVA associado à estabilização eletrostática foi capaz de induzir formulações estáveis por um longo período, mesmo após o carregamento do fármaco (MU; FENG, 2002).
Um estudo de Vandervoort & Ludwig (2002), mostrou um desenho fatorial para preparação de nanopartículas de PLGA e identificou também que o PVA foi capaz de melhor estabilizar o sistema, corroborando com nosso resultado.
6.1.10 Cinética de liberação in vitro
A Figura 8 mostra o perfil de liberação de formulações distintas dos sistemas contendo benznidazol.
O sucesso do aprisionamento de fármaco nas nanopartículas de PLGA, demonstrado em experimentos anteriores do grupo, assegurou a taxa de liberação lenta desejada para todas as formulações (DOS SANTOS-SILVA et al, 2019). As nanopartículas apresentaram uma taxa de liberação, respectivamente, de 44,9%, 46,5%, 36,2% e 32,1% (NP BNZ, NP BNZ COL, NP BNZ AS e NP BNZ AS COL), apresentando um perfil de liberação lento, sustentável, prolongando com capacidade de liberação do fármaco por até 600 minutos. Diferentemente das nanopartículas, a liberação do BNZ livre foi muito rápida, tendo uma taxa de liberação de 100% em 480 min.
O comportamento de liberação do fármaco a partir de nanopartículas foi consistente com as propriedades físico-químicas homogêneas. Esta capacidade do portador coloidal de manter o fármaco retido na matriz polimérica no meio de liberação potencialmente assegurou a atividade biológica desejada. Este fato evita a liberação do fármaco antes que as nanopartículas cheguem às células-alvo (SAJEESH et al., 2014; SEJU; KUMAR; SAWANT, 2011).
Além disso, os dados foram a quatro diferentes modelos cinéticos lineares de difusão, que incluem o modelo de primeira ordem, o modelo de Bhaskar, o modelo de Freundlich modificado e o modelo parabólico (QI; ZHANG; LI, 2013).
Os parâmetros calculados são mostrados na Tabela 2.
O modelo de Bhaskar ajustou muito melhor a liberação de BNZ de todas as nanopartículas, dando um coeficiente de correlação linear superior a 0,93 (R = 0,93 a 0,98). Tal modelo explica que a taxa de liberação do fármaco se fundamenta na teoria de liberação por difusão controlada (BHASKAR et al., 1986).
Nanopartículas poliméricas são consideradas sistemas de liberação modificada que foram desenvolvidas com o objetivo de favorecer a condução, retenção e liberação de fármacos ou biomoléculas no local de ação em doses adequados e por um período prolongado (DOS SANTOS-SILVA et al., 2017; LANGER, 1990).
Tabela 2: Parâmetros de adequação de diferentes modelos cinéticos para liberação de nanopartículas de BNZ em diferentes valores de R
Nota:Valores da constante de liberação (a); (R) expressa em média ± DP (n=3).
A análise do perfil de liberação in vitro fornece informações a respeito dos efeitos físico-químicos da composição e dos mecanismos que influenciam a taxa de liberação de substâncias (MESQUITA et al., 2015). O perfil de liberação de uma substância depende principalmente do diâmetro da partícula, que afeta a dissolução do fármaco e, consequentemente, a sua biodisponibilidade. Partículas de tamanho pequeno têm uma maior área de superfície disponível para dissolução, proporcionando cinética de liberação mais rápida (SILVA-JÚNIOR et al., 2007).
6.1.11 Viabilidade celular
O ensaio de viabilidade celular foi realizado para avaliar a possível melhora da eficácia do fármaco pelas nanopartículas poliméricas. Para todos os sistemas (solução de BNZ livre, NP, NP BNZ, NP BNZ AS, NP BNZ COL e NP BNZ AS COL), a viabilidade celular foi avaliada para três linhagens (Hek 293, Hep G2, HT-29) de células foram
Formulação Modelos Cinéticos
a (R ± DS)
Primeira ordem
Bhaskar Freundlich Difusão Parabólica NP BNZ 0,0051 h -1 (0,74 ± 0,04) 0,4103 h0.65 (0,97 ± 0,02) 72,21 h (0,85 ± 0,02) 0,5697 h-0.5 (0,56 ± 0,03) NP BNZ COL 0,0045 h-1 (0,72 ± 0,02) 0,1842 h0.65 (0,98 ± 0,02) 38,66 h (0,72 ± 0,01) 0,4276 h-0.5 (0,79 ± 0,01) NP BNZ AS 0,0088 h-1 (0,33 ± 0,03) 0,3363 h0.65 (0,93 ± 0,02) 22,68 h (0,66 ± 0,02) 1,1325 h-0.5 (0,65 ± 0,03) NP BNZ AS COL 0,0075 h-1 (0,38 ± 0,03) 0,3603 h0.65 (0,98 ± 0,02) 24,55 h (0,62 ± 0,02) 1,051 h-0.5 (0,78 ± 0,03)
determinados por ensaio de MTT de maneira dependente da concentração, após incubação de 48 h (Figura 9).
A NP BNZ inibiu o crescimento celular mais do que o BNZ livre. As nanopartículas carregadas com fármaco induziram a viabilidade celular da Hek 293 a um valor inferior a 30% em 48 h, em concentrações abaixo de 62,5 -1. Concentrações
superiores a esta foi observada uma inibição de até 50%. As nanopartículas isentas de fármacos demonstraram ser biocompatíveis para células normais (Hek 293), pois não se observou inibição do crescimento celular superior exceto nas nanopartículas contendo maiore concentrações de fármaco (125 -1 e 250 -1). Nota-se que a
concentração intracelular aumentada de partículas induziu a citotoxicidade para as células tumorais. Estes resultados corroboraram com o desempenho de nanopartículas nos estudos de liberação in vitro do fármaco.
Na faixa de concentração testada, o BNZ livre foi incapaz de induzir citotoxicidade considerável nas células Hep G2 e HT-29 (Figuras 9 B e 9 C) quando comparado com as nanopartículas contendo o fármaco. Os dados mostraram que as células cancerosas são mais suscetíveis a nanopartículas contendo BNZ. Os efeitos das espécies reativas do oxigênio são acentuados em sistemas poliméricos (HALL; WILKINSON, 2012). Este fato foi mais evidente nas nanopartículas funcionalizadas contendo colesterol.
Estudos prévios mostram que o colesterol vem sendo empregado para o