EFEITO SINERGÍSTICO DA PRÓPOLIS
TIPIFICADA CONTRA Enterococcus
faecalis
Karine Cristina dos Santos Araújo
1e Maria Cristina Marcucci
11Universidade Bandeirante de São Paulo, Programa de Mestrado Profissional em Farmácia, São
Paulo, Brasil.
Endereço para correspondência
Universidade Bandeirante de São Paulo,
Rua Maria Cândida, 1813, São Paulo, SP, 02071-013, Brasil E-mail: cris.marcucci@yahoo.com.br
RESUMO
A própolis é constituída por uma série de substâncias resinosas, gomosas e balsâmicas, recolhida de brotos e cascas de árvores ou de outras partes do tecido vegetal, pelas abelhas, que a transportam até a colméia, onde adicionam secreções próprias como a cera e secreções salivares. Possui importantes atividades como antimicrobiana e antiinflamatória entre outras. Estudos realizados relatam a ação inibitória in vitro da própolis principalmente em micro-organismos Gram-positivos e em menor escala nos Gram-negativos. Este trabalho teve como objetivo estudar a atividade antibacteriana da própolis vermelha e verificar o sinergismo entre esta e o antibiótico Vancomicina contra Enterococcus faecalis. Foi constatada a atividade antibacteriana da própolis vermelha e a ação sinergística quando associada ao antibiótico Vancomicina.
Palavras-chave: Própolis vermelha, Vancomicina, Sinergismo, Enterococcus faecalis; Resistência
microbiana.
ABSTRACT
Propolis is a resinous substance containing a number of resins, balsam and gum, collected by bees from buds and bark of trees or other parts of plant. The bees collected this resin and carry up to the hive mixing it with wax and salivary secretions. It has important activities such as antimicrobial and anti-inflammatory, and others. Studies related the propolis effectiveness in vitro with an inhibitory action against Gram-positive microorganisms and a minor activity against Gram-negative. The purpose of this work was to evaluate the antibacterial activity of red propolis and verify the synergism between the ethanolic extract of this resin and Vancomycin against Enterococcus faecalis. We concluded that there is an antibacterial activity of red propolis and the synergist action in association with Vancomycin.
Key-words: Red Propolis, Enterococcus faecalis, Antimicrobial Resistance, Synergistic effect.
RPIF
2011
03
INTRODUÇAO
A própolis é uma substância resinosa, obtida pelas abelhas através da coleta de resinas dos vegetais da região e que são modificadas pela adição de enzimas contidas em sua saliva (Marcucci et al., 1998;
Coutinho
, 2004; Junior et al., 2006, Rubio et al., 2007). Apresenta cor variável: amarelada, esverdeada clara ou pardo escuro de acordo com a origem botânica, sabor de suave balsâmico a forte, amargo e picante e sua consistência varia do maleável a ligeiramente rígida, quando em temperatura ambiente e rígida em temperaturas abaixo de 20ºC (Pintoet al.,
2001).A palavra "propolis" vem do grego: ["pro” =em favor de] + ["polis"=cidade], que significa “defesa de uma cidade”, no caso, a colméia (Miorin, 2003).
A própolis é utilizada para as mais variadas funções na colméia, como proteção contra intrusos e do frio, mantendo a temperatura ideal para o desenvolvimento das larvas, fechamento de frestas, impedindo a entrada de micro-organismos; desinfeta o interior da colméia e os alvéolos onde a abelha rainha faz a postura dos ovos. Quando um intruso é abatido e não pode ser retirado do interior da colméia, as abelhas o mumificam com própolis, evitando que sua putrefação contamine o ninho (Pinto et al., 2001).
A própolis é conhecida como um poderoso antibiótico natural. Atualmente, é utilizada com maior frequência na prevenção e tratamento de lesões e infecções da via oral, de gengivites, também como antimicótico e cicatrizante. Vários estudos relatam suas
atividades antimicrobiana, antifúngica,
antivirótica, antiprotozoário, bactericida e
bacteriostática, anestésica, anti-inflamatória,
antioxidante, cicatrizante, anti-séptica e
hipotensiva, hepatoprotetora, imunoprotetora, antitumoral e anti-HIV (Miorin, 2003).
Em toda a Ásia, especialmente no Japão, a
própolis conquistou um status maior,
provavelmente como parte da milenar tradição de privilegiar alimentos e remédios naturais. Lá, a própolis é empregada no desenvolvimento de medicamentos hepatoprotetores e para a inibição de tumores cancerígenos. Além disso, a população é estimulada a consumir sucos e outras bebidas com uma pequena porção de própolis, como um elixir da saúde. O produto também encontrou aplicação em outras áreas, como a
cosmética, em uma completa linha de produtos, desde loções tônicas para a limpeza da pele até sabonetes capazes de combater acnes. A própolis revelou-se também um poderoso conservante de alimentos, incluindo peixes, muito consumidos na dieta japonesa (Bastos, 2003).
Apesar do trânsito diário das abelhas dentro da colméia verifica-se a proteção contra
micro-organismos pela manutenção da
esterilidade dos favos, o que comprova a atividade antimicrobiana da própolis (Miorin, 2003).
A ação antimicrobiana da própolis é devida à presença de um conjunto de princípios ativos como flavonóides e ácidos fenólicos, sendo este último considerado o mais potente como antimicrobiano (Pinto et al., 2001; Junior et al., 2006). A propriedade antibacteriana permanece estável mesmo após a própolis ser submetida à temperatura de 100 ºC por meia hora (Miorin, 2003).
A atividade antimicrobiana varia de acordo com o local e época em que a amostra de própolis é produzida. Estudos geográficos podem ser elaborados correlacionando-se as regiões produtoras com as propriedades biológicas (Oliveira et al., 1996; Junior et al., 2006).
A maioria dos relatos mostra que os diversos tipos de extratos de própolis possuem acentuada ação inibitória in vitro, sobre micro-organismos Gram-positivos e, em menor escala, sobre Gram– negativos (Pinto, 2001).
No Brasil, um novo tipo de própolis popularmente conhecida como própolis vermelha é coletada nas regiões do nordeste, porém este tipo de própolis é considerado típico de Cuba (Trusheva et al., 2006).
A própolis vermelha possui composição química distinta da própolis verde e das outras própolis estudadas até o momento. (Trusheva et al., 2006) analisaram vinte frações de própolis vermelha do nordeste brasileiro e identificaram
catorze compostos, dentre eles: fenóis,
triterpenóides, isoflavonóides, benzofenonas
preniladas e a naftoquinonas.
Segundo Trusheva et al. (2006), a própolis vermelha possui atividade antimicrobiana contra
Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans e apresentou também atividade
antioxidante, anti-inflamatória, anticarcinogênica e antiprotozoária (Trusheva et al., 2006; Ayres et al., 2007).
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Os Enterecoccus faecalis, atualmente, são causa de infecções urinárias em pacientes internados em hospitais, comportando-se, muitas vezes, como agente oportunista em infecções hospitalares, devido principalmente, a sua resistência a agentes antimicrobianos (Menezes et al., 2002).
Apesar da natureza não patogênica dos enterococos com relação a pessoas sadias, o surgimento em 1988 dos primeiros casos de resistência destas bactérias causou alarme.
A resistência do E. faecalis aos
antimicrobianos pode ser de dois tipos: intrínseca, derivada de genes cromossômicos, e extrínsecos, como resultado de uma disseminação clonal, ou plasmídica, e se deve normalmente a produção de enzimas que inativam o agente antimicrobiano e seus sítios (Hernandez et al., 2005). Esta resistência ocorre basicamente pela produção de precursores de peptideoglicano na parede celular que se ligam pobremente à vancomicina, impedindo assim sua ação no bloqueio da síntese de parede celular (Furtado et al., 2005). No Brasil, enterococos resistente à Vancomicina (VRE) têm sido descritos como patógenos hospitalares, desde 1998 (Furtado et al., 2005).
Apesar da recente incidência de
resistência de enterococos e estafilococos a antibióticos glicopeptídicos, a vancomicina ainda é considerada como um dos recursos mais adequados para tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-positivas. Da mesma maneira que os antibióticos penicilínicos, a vancomicina afeta o metabolismo de construção da parede celular das bactérias. Para tanto, ela liga-se na porção terminal D-Ala-D-Ala de um pentapeptídeo encontrado em precursores de
peptidoglicano, interferindo na etapa de
transpeptidação (Oliveira et al., 2001).
O sinergismo é a associação de fármacos administrados simultaneamente proporcionando um efeito maior do que em cada um deles separadamente (Tortora, 1993).
Os antimicrobianos apesar de serem eficazes na maioria das vezes contra
micro-organismos causam efeitos colaterais
principalmente quando se trata de uso prolongado. Para a diminuição destes efeitos é sugerido que se reduza a dose clínica de determinados antibióticos e se associe a produtos de ação antimicrobiana natural, fazendo com que diminua a incidência de efeitos colaterais e ao mesmo tempo potencializar a antibioticoterapia
no tratamento de infecções em que a resistência bacteriana torna-se fator determinante (Marshall, 1995; Pinto et al., 2001). Segundo (Pinto et al., 2001) a combinação de extratos de própolis com antimicrobianos apresenta efeito sinergístico.
Este trabalho teve como objetivo estudar a atividade antibacteriana da própolis vermelha e o sinergismo entre esta e o antibiótico Vancomicina contra Enterococcus faecalis.
MATERIAIS E MÉTODOS
A amostra de própolis avaliada foi proveniente de Maceió (Alagoas) cedida pelo apicultor José Marinho de Lima.
Avaliação da atividade antimicrobiana da própolis vermelha
Micro-organismos
O micro-organismo utilizado para os ensaios da atividade antimicrobiana da própolis vermelha foi o Enterococcus faecalis ATCC 29212 (American Type Culture Colection).
A cepa de Staphylococcus aureus ATCC 29213 foi utilizada como controle de qualidade da
Vancomicina para os procedimentos
microbiológicos envolvendo a concentração inibitória mínima (CIM).
Extração alcoólica de própolis
O extrato etanólico da própolis foi preparado da seguinte maneira: aproximadamente 30 g da resina bruta moída foi extraída com 100 mL de etanol PA (Ecibra). O material foi deixado em mesa agitadora (Shaker) por 24 horas, filtrado e concentrado em rotaevaporador até a eliminação total do etanol obtendo-se o extrato etanólico seco (EEP). Após a extração, uma alíquota de 5 mL foi seca em estufa para se efetuar o cálculo da porcentagem do extrato na solução. Desta forma, o extrato etanólico de própolis (EEP) obtido foi avaliado quanto a sua concentração em porcentagem (peso/volume). Este valor foi levado em conta no cálculo da concentração inibitória mínima (CIM) e também em outros experimentos.
Método de diluição em ágar
O método de diluição em ágar, descrito pelo CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) foi utilizado para determinação da CIM da própolis. As concentrações finais do extrato etanólico de
própolis a partir do estoque a 1%, foram: 0,010%, 0,025%, 0,050%, 0,075. 0,1%, 0,15%, 0,175%,
0,200%. Essas concentrações foram
individualmente diluídas em meio de cultura ágar Muller-Hinton (Merck). O inóculo foi preparado através de suspensão direta de colônias com turvação equivalente a 0,5 da escala de McFarland em 5,0 mL de solução salina a 0,85%. Em seguida foi diluído 1/10 para ser obtido uma concentração de 107 UFC/mL. 1 μL do inóculo foi colocado na superfície do ágar, sendo que a
concentração final do inóculo foi
aproximadamente 104 UFC. Uma placa contendo
meio de cultura e o inóculo bacteriano foi utilizada como controle. Todas as placas foram incubadas a 35 °C por 20 h. A CIM foi determinada a partir da placa em que não houve crescimento bacteriano.
Estudo da associação de antibiótico com própolis (sinergismo)
Foi utilizado um extrato etanólico da própolis vermelha a 1% (m/V) para determinar a CIM da amostra estudada. A vancomicina (Biosintética) foi preparada com uma concentração de 200 μg/mL. A solução estoque do antibiótico foi preparada segundo Isenberg (1992) através do cálculo:
Peso (mg) = volume (mL) x concentração (µg/mL) x fator de correção potência
onde:
volume (mL) da solução final, concentração (µg/mL) da solução final.
O fator de correção foi fixado em 110 % ou 1,1 e a potência foi fornecida pelo fabricante do antimicrobiano. A utilização do fator de correção visa corrigir a perda de potência que ocorre no período entre a diluição e a realização do teste. O valor em miligramas obtido pela fórmula foi pesado em balança analítica de precisão (Marte). A potência ou atividade do antimicrobiano fornecida pelo fabricante foi a seguinte: vancomicina, 1220,05 μg/mL .
Associação da própolis e antibiótico
Após se estipular a CIM da amostra bacteriana com a própolis e o antibiótico, foi utilizado o método da macrodiluição em agar para realizar a associação da própolis com o antimicrobiano. Nesse procedimento metade da CIM do antibiótico vancomicina foi associado com metade da CIM da própolis vermelha.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A resistência microbiana é um problema que vem aumentando em todo o mundo, principalmente no ambiente hospitalar diminuindo a eficácia dos antibióticos. Essa problemática relacionada à resistência faz com que se procure por novos agentes terapêuticos para aumentar a eficácia dos antimicrobianos, e diminuir a sua toxicidade e também os custos, pois, a antibioticoterapia é um tratamento bastante oneroso.
Há inúmeros relatos a respeito das importantes atividades biológicas da própolis.
Dentre estas se destaca a atividade
antibacteriana, principalmente contra bactérias Gram-positivas. O E.faecalis é um coco gram-positivo que vem apresentando resistência aos antimicrobianos mais comumente utilizados, tem-se relatado o aparecimento de cepas resistentes à vancomicina.
Neste trabalho, propusemos a associação da própolis vermelha, um novo tipo de própolis oriunda do nordeste brasileiro, com o antibiótico vancomicina, para avaliar um possível sinergismo da atividade antibacteriana.
Os antimicrobianos apesar de serem
eficazes na maioria das vezes contra
microrganismos causam efeitos colaterais
principalmente quando se trata de uso prolongado. Para a diminuição destes efeitos é sugerido que se reduza a dose clínica de determinados antibióticos e se associe a produtos de ação antimicrobiana de origem natural, fazendo com que diminua a incidência de efeitos colaterais e ao mesmo tempo potencializar a antibioticoterapia no tratamento de infecções em que a resistência bacteriana torna-se fator determinante (Marshall, 1995; Pinto et al., 2001).
Miorin (2002) avaliou o sinergismo da
própolis associada aos antimicrobianos
vancomicina e oxacilina constatando a ação sinergística antibacteriana desta associação contra cepas resistentes de Staphylococcus
aureus.
Foi realizada inicialmente a avaliação da atividade antibacteriana do extrato etanólico da própolis vermelha a 1%, em E. faecalis, ATCC 29212, para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). A própolis vermelha inibiu o crescimento do E. faecalis em uma concentração 50μg/mL (Figura 1).
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Figura 1. Método da macrodiluição em ágar
realizado para E. faecalis. A: Presença de
crescimento microbiano. B: Inibição do
crescimento microbiano.
Posteriormente, foi avaliada a atividade
antimicrobiana da vancomocina contra E. faecalis, obtendo-se uma concentração inibitória mínima de 1µg/mL.
Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) da
Vancomicina, da própolis e da associação (Vancomicina e própolis) contra E. Faecalis.
Substância CIM (µg/mL)
Vancomicina 1,0
Própolis 50,0
Vancomicina +Própolis 25±0,5
Para a avaliação da atividade sinergística da própolis vermelha associada à vancomicina, foi utilizada a metade da concentração inibitória mínima da vancomicina (0,5µg/mL) e metade da concentração da própolis (25µg/mL) as quais não apresentaram inibição do crescimento do E.
faecalis (Tabela 1). Quando associadas essas duas
concentrações observou-se a inibição do micro-organismo comprovando a ação sinergística.
CONCLUSÃO
A própolis vermelha possui atividade
antibacteriana contra E.faecalis. O antibiótico vancomicina associado à propolis vermelha
apresentou atividade antibacteriana
demonstrando que essa associação possui atividade sinergística.
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