UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
Correlação da função antioxidante com a energia de
ligação O-H em compostos fenólicos.
Ana Rita Raimundo Gomes
Dissertação
Mestrado em Química Química
UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
Correlação da função antioxidante com a energia de
ligação O-H em compostos fenólicos.
Ana Rita Raimundo Gomes
Dissertação orientada por
Prof. Doutor Benedito José Costa Cabral Prof. Doutora Maria Tereza Neves Fernandez
Mestrado em Química Química
Agradecimentos
i
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Agradecimentos
Este trabalho resultou graças ao apoio que um conjunto de pessoas que estiveram comigo não só ao longo da execução do mesmo, mas também ao longo da minha vida.
Por isso, em primeiro lugar, gostaria de agradecer à Professora Doutora Maria Tereza Fernandez e ao Professor Doutor Benedito Cabral, por terem confiado em mim para a realização deste trabalho e por toda ajuda e motivação que me deram durante estes longos meses.
No grupo de Espectrometria de Massa, agradeço especialmente ao Paulo por ter sido um terceiro orientador. Tenho também que agradecer ao Pedro, Tiago e à Kristina por todas as músicas, todos os intervalos, por todos os cafés e pelas piadas que me animaram nas alturas de desespero.
No grupo de Química Computacional, agradeço em especial ao Nuno Galamba, mas também à Margarida, à Sílvia e ao Hugo por me ajudarem a ultrapassar todos os pânicos.
Um agradecimento especial aos meus pais e à minha família que sempre tentou compreender tudo o que eu estava a fazer.
Por fim, tenho que agradecer a todas as pessoas que me acompanharam durante estes anos. Assim, agradeço em especial, às minhas amigas e aos meus amigos que estiveram sempre comigo ao longo destes meses que me fizeram rir.
Resumo
iii
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Resumo
Um grande número de antioxidantes são compostos fenólicos que têm a capacidade de neutralizar e inibir a acção oxidativa dos radicais livres. Existem vários mecanismos de acção antioxidante que têm o mesmo resultado final, a transferência do átomo de hidrogénio do grupo O-H para o radical livre, inactivando-o. Assim, a função antioxidante está relacionada com a energia de dissociação da ligação O-H. Relacionando a energética, a estrutura e a reactividade de compostos fenólicos podemos obter informação útil na síntese de novos antioxidantes. Este estudo, experimental e teórico, incidiu sobre três antioxidantes fenólicos, o ácido cafeico, o trolox e o α-tocoferol.
A entalpia de dissociação da ligação O-H (BDE) pode ser determinada através da afinidade protónica (ΔacH) do anião fenóxido, da afinidade electrónica (EA) do radical
fenoxílo e da energia de ionização (IE) do átomo de hidrogénio, que é conhecida.
Experimentalmente, determinou-se o valor de ΔacH, utilizando o método cinético de
Cooks, na sua forma restrita e a estendida. Para tal foi necessário implementar o método cinético estendido em dois espectrómetros de massa diferentes.
Teoricamente, foi possível determinar afinidade protónica (ΔacH) do anião fenóxido, a
afinidade electrónica do radical fenoxílo (EA) e a entalpia de dissociação da ligação O-H. Neste estudo teórico, recorreu-se a um método DFT/B3LYP associado a uma base cc-pVTZ.
Concluíu-se que o composto com menor acidez é o α-tocoferol e com maior é o ácido cafeico, sendo que neste último, o protão fenólico que se encontra em posição para é o mais acídico. No trolox, a desprotonação deverá ocorrer no grupo carboxílico. O α-tocoferol deve ser o antioxidante mais activo, pois dos três compostos fenólicos estudados é o que apresenta os valores mais baixos de BDE’s.
Palavras-chave: Compostos Fenólicos, Entalpia de dissociação da ligação O-H, Espectrometria de massa, Método Cinético de Cooks, Cálculos DFT’s.
Abstract
v
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Abstract
A great number of antioxidants are phenolic compounds which are able to inhibit oxidative action of free radicals. The final result, of various antioxidant mechanisms, is the inactivation of free radicals by hydrogen atom transfer from the O-H group. Thus, the antioxidant action is related with the O-H bond dissociation enthalpy. The information obtained from the energetics, structure and reactivity correlation, in phenolic compounds, can give insights for new antioxidant synthesis. In the present study three phenolic antioxidant, caffeic acid, trolox and α-tocopherol, were investigated.
The O-H bond dissociation enthalpy (BDE) can be determined with three thermodynamic functions, the phenoxide anion proton affinity (ΔacH), the phenoxyl radical
electron affinity (EA) and the ionization energy (IE) of the hydrogen atom which is known. ΔacH values were determined experimentally with the Cooks kinetic method, using
both the restricted and extended versions. Furthermore, the extended kinetic method was implemented in two distinct mass spectrometers (ion trap and FTICR).
In order to complement the experimental data, the phenoxide anion proton affinity (ΔacH), the phenoxyl radical electron affinity (EA) and the O-H bond dissociation enthalpy
(BDE) were determined using the DFT/B3LYP method in association with the cc-pVTZ basis set.
α-tocopherol was found to have the lowest gas-phase acidity while caffeic acid had the highest. For caffeic acid it was found that the phenolic proton in para position is more acidic, and that deprotonation in trolox should occur at the carboxylic group. Of the three compounds under study, α-tocopherol is expected to be the most active antioxidant since it has the lowest BDE value.
Keywords: Phenolic Compounds, Bond Dissociation Enthalpy, Mass Spectrometry, Cooks Kinetic Method, DFT calculations.
Lista de Abreviaturas
vii
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Lista de Abreviaturas
ArOH Compostos fenólicos RH Composto de Referência
∆
H° Variação de entalpia padrão∆
G° Variação de energia de Gibbs padrão∆
S° Variação de entropia padrão GB Basicidade em fase gasosa PA Afinidade Protónica∆
acG Acidez em fase gasosaΔacH Afinidade protónica de anião
PTR Reacções de Transferência Protónica IE Energia de Ionização
EA Afinidade electrónica
ETE Entalpia de transferência electrónica Do (ArOH) Entalpia de dissociação da ligação OH
BDE Entalpia de dissociação da ligação HAT Transferência do átomo de hidrogénio
SPLET Perda sequêncial de um protão e de transferência de electão SEP-PT Transferência de um electrão seguido pela transferência do protão k Constante de velocidade
R Constante dos gases perfeitos = 8,314 J/K.mol
T Temperatura (K)
Keq Constante de Equilíbrio
Teff Temperatura Efectiva
viii
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
MS Espectrometria de massa ou 1ª análise de massa (full scan) MS2 2ª Análise de massa (MS/MS)
MSn Espectrometria de massa tandem CID Dissociação Induzida por Colisão ESI Ionização por electrospray
ES Electrospray
CI Ionização Química EI Electroionização
API Ionização à pressão atmosférica
APCI Ionização Química à pressão atmosférica APPI Fotoionização à pressão atmosférica
TOF Tempo de Vôo
FAB Bombardeamento com átomos/iões rápidos MALDI Ionização/Desadsorção Laser Assistida por Matriz
FTICR Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier AC Corrente Alterna
Rf Radiofrequências
NCE Energia de Colisão Normalizada Vp-p Voltagem pico a pico
DFT Teoria do funcional da densidade
Índice Geral
ix
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Índice Geral
Agradecimentos i
Resumo iii
Abstract v
Lista de Abreviaturas vii
Índice Geral ix
Índice de Tabelas xi
Índice de Figuras xiii
1. Introdução 1
1.1. Antioxidantes 1
1.1.1. Compostos Fenólicos 2
1.1.2. Entalpia de dissociação da ligação O-H em fase gasosa 5
1.2. Método Cinético de Cooks 7
1.3. Espectrometria de Massa 12
2. Parte Experimental 21
2.1. Reagentes 21
2.2. Procedimento Experimental 24
2.2.1. Preparação das soluções 24
2.2.2. Condições Experimentais para aplicação do Método Cinético 25 3. Apresentação e Discussão de Resultados Experimentais 29
3.1. Ácido Cafeico 29
3.1.1. Aplicação do Método Cinético Restrito 29
3.1.2. Aplicação do Método Cinético Estendido 37
3.1.2.1. Aplicação do Método Cinético Estendido na Ion Trap 39 3.1.2.2. Aplicação do Método Cinético Estendido na célula do ICR 41
x
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3.1.3. Comparação dos Resultados obtidos entre o Método Cinético Restrito
e o Estendido 43
3.2. Trolox 45
3.2.1. Aplicação do Método Cinético Restrito 45
3.2.2. Aplicação do Método Cinético Estendido 48
3.2.2.1. Aplicação do Método Cinético Estendido na Ion Trap 48 3.2.2.2. Aplicação do Método Cinético Estendido na célula do ICR 50 3.2.3. Comparação dos Resultados obtidos entre o Método Cinético Restrito
e o Estendido 52
3.3. α-Tocoferol 53
4. Química Teórica e Computacional 57
4.1. Introdução 57
4.2. Detalhes computacionais 61
5. Apresentação e Discussão de Resultados Teóricos 63
5.1. Cálculo da acidez em fase gasosa, ΔacHᵒ 66
5.2. Cálculo da afinidade electrónica, EA 67
5.3. Cálculo da entalpia de dissociação da liagação O-H, BDE 69 6. Comparação dos Resultados Experimentais com os Resultados Teórico 71
6.1. Ácido Cafeico 71
6.2. Trolox 72
6.3. α-Tocoferol 73
7. Conclusão e Perspectivas Futuras 75
8. Bibliografia 77
Índice de Tabelas
xi
Índice de Tabelas
Tabela 2.1 – Características dos compostos em estudo. 21
Tabela 2.2 – Características dos compostos de referência utilizados neste estudo. 22
Tabela 3.1 – Compostos de Referência utilizados com o respectivo valor de ∆acH e
∆acG. 31
Tabela 3.2 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico,
para cada referência. 36
Tabela 3.3 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico,
para cada referência, a uma determinada voltagem pico a pico (Vp-p). 39
Tabela 3.4 – Valores obtidos através das 1ª representações gráficas. 40 Tabela 3.5 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico,
para cada referência, a uma determinada frequency Offset. 41 Tabela 3.6 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas. 42 Tabela 3.7 – Valores de ΔacH obtidos através da aplicação das diferentes formas do
método cinético. 43
Tabela 3.8 – Referências utilizadas com o respectivo valor de ∆acH e ∆acG. 45
Tabela 3.9 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o trolox, para
cada referência, utilizando o método cinético restrito. 46 Tabela 3.10 – Valores obtidos através da razão das intensidades entre a referência e
o trolox. 48
Tabela 3.11 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas. 49 Tabela 3.12 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico, para cada referência, a uma determinada frequency Offset. 50 Tabela 3.13 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas. 51
xii
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Tabela 3.14 – Valores de ∆acH obtidos através da aplicação das diferentes formas do
método cinético. 52
Tabela 3.15 – Referências utilizadas com o respectivo valor de acidez relativa em
função do fenol. 54
Tabela 5.1 – Valores de teóricos de ΔacHᵒ, EA e a BDE para o fenol. 63
Tabela 5.2 – Comparação entre os resultados experimentais e teóricos para o fenol. 64
Tabela 5.3 – Valores de afinidade protónica (ΔacHᵒ). 66
Tabela 5.4 - Valores de afinidade electrónica (EA). 67
Tabela 5.5 - Valores da entalpia de dissociação da ligação (BDE). 69
Tabela 6.1 – Comparação entre os resultados experimentais e teóricos para o ácido
cafeico 71
Índice de Figuras
xiii
Índice de Figuras
Figura 1.1 – Estrutura molecular da quercitina. 3
Figura 1.2 – Estrutura molecular do α-tocoferol. 3
Figura 1.3 – Estrutura do ácido hidroxibenzóico (a), estrutura do ácido
4-hidroxicinâmico (b). 4
Figura 1.4 – Estrutura molecular do Ácido Cafeico. 4
Figura 1.5 – Estrutura molecular do Trolox. 4
Figura 1.6 – Gráfico ln [BH+/BiH+]vs ΔH(Bi), que permite a determinação da afinidade
protónica do composto desconhecido através do método cinético restrito. 9 Figura 1.7 – 2ª Representação gráfica do método cinético estendido, ΔGapp/RTeff vs
1/RTeff, que permite a determinação da afinidade protónica do composto
desconhecido. 10
Figura 1.8 – Diagrama Esquemático de um espectrómetro de massa comum. 12 Figura 1.9 – Diagrama Esquemático de uma fonte de ionização de um electrospray
(ESI). 14
Figura 1.10 – Modelo de carga residual. 15
Figura 1.11 – Modelo de evaporação iónica. 15
Figura 1.12 – Representação Esquemática de uma ion trap. 16
Figura 1.13 – Representação Esquemática de um FTICR. 17
Figura 1.14 – Movimentos naturais do ião, onde νm é a frequência do magnetrão, νc é a frequência ciclotrónico e νT é a frequência por aprisionamento. 18 Figura 1.15 – Três forma de aplicar a excitação. Esquerda: aceleração dos iões até uma
trajectória espacialmente coerente e detectável. Centro: Aumento da energia cinética acima do limite para a dissociação activada por colisão ou reacção. Direita: ejecção dos
xiv
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Figura 3.1 – Espectro MS da solução 10-4 de ácido cafeico, obtido em modo negativo. 29 Figura 3.2 – a) Espectro ESI-MS2 do ião do ácido cafeico (m/z 179) à energia de colisão normalizada de 20% b) Espectro ESI-MS3 do fragmento m/z 135 do ácido
cafeico à energia de colisão normalizada de 30%. 30
Figura 3.3 – Esquema de fragmentação do ácido cafeico. 30
Figura 3.4 - a) Espectro ESI-MS do heterodímero do ácido cafeico com ácido 2,5-dihidróxibenzóico(m/z 333) b) Espectro ESI-MS2 do heterodímero m/z 333 à energia de
colisão normalizada de 7,50%. 33
Figura.3.5 - Espectros MS2 dos diferentes heterodímeros formados pelo ácido cafeico e
as respectivas referências. 35
Figura 5.1 - Estruturas do ácido cafeico optimizadas. a) Ião/Radical A – desprotonação do grupo fenólico em posição meta. b) Ião/Radical B – desprotonação do grupo fenólico em posição para. c) Ião/Radical C – desprotonação do grupo carboxílico. 64 Figura 5.2 - Estruturas do trolox optimizadas. a) Ião/Radical A – desprotonação do grupo fenólico. b) Ião/Radical B – desprotonação do grupo carboxílico. 65
1. Introdução 1.1. Antioxidantes
1
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1.
Introdução
1.1.Antioxidantes
Os antioxidantes estão presentes numa grande variedade de alimentos, como as hortaliças, frutas, cereais, ovos, carnes, legumes e frutos secos. O termo antioxidante significa “que inibe os efeitos da oxidação”, foi primeiramente observado por Claude Berthollet em 1797, sendo depois esclarecido por Humphry Davy em 1817.[1] Os antioxidantes impedem o efeito prejudicial dos radicais livres que surgem nas reacções metabólicas do nosso organismo ou que se formam através de factores exógenos, como as radiações ionizantes.[2]
O termo radical livre refere-se a um átomo ou molécula altamente reactivo, que contém número impar de electrões na última camada electrónica. É este não-emparelhamento de electrões na última camada que confere alta reactividade a esses átomos ou moléculas.[3] Os radicais livres (OH, ROO,R) formados numa cadeia de reacções (1-3) são responsáveis por várias doenças crónicas e degenerativas como o Alzheimer, o Parkinson, a diabetes e doenças cardiovasculares.[4, 5]
RH → R• (1) R• + O2 → ROO• (2)
ROO• + RH → ROOH + R• (3) O stress oxidativo é causado pelo desequilíbrio entre os mecanismos de defesa antioxidante e o aumento da produção de radicais livres.[6] A produção contínua de radicais livres (1-3), durante os processos metabólicos, levou ao desenvolvimento de mecanismos de defesa antioxidante para limitar os níveis intracelulares e impedir a indução de danos. [7] De seguida, vamos apresentar alguns destes mecanismos.
Os metais, como o cobre e o ferro, têm um papel importante na formação dos radicais livres, formações essas que são descritas nas reacções de Fenton (4-6) e de Haber-Weiss. [8, 9]
Fe2+ + O2 → Fe3+ + O2- (4)
2 O2- + 2H+ → O2 + H2O2 (5)
2
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Embora o cobre possa também catalisar as reacções de Haber-Weiss, o ferro é o metal pesado mais abundante no organismo e está biologicamente mais capacitado para catalisar as reacções de oxidação de biomoléculas. Assim, um mecanismo de defesa contra os radicais livres baseia-se na complexação do ferro e do cobre que participam nas reacções em cadeia (4-6).[3] Esta complexação pode ser efectuada por determinados antioxidantes como por exemplo os flavonoides. [10]
Grande número de compostos fenólicos (ArOH) desempenham um papel muito importante na intercepção e reacção com os radicais livres (ROO e R), gerados pelo metabolismo celular ou fontes exógenas, a uma taxa mais rápida do que o substrato, neste caso o lípido RH. Desta forma, levam à inactivação dos radicais livres formados na reacção (1) ou nas reacções (2 e 3) do stress oxidativo, iniciação e propagação, respectivamente. Através da transferência do átomo de hidrogénio do grupo fenólico (mecanismo HAT) a estas moléculas, a reacção em cadeia é interrompida.
ROO + ArOH → ROOH + ArO (7) R + ArOH → RH + ArO (8) O átomo de hidrogénio activo do antioxidante é capturado pelos radicais livres (ROO e R) com maior facilidade do que dos hidrogénios alílicos das moléculas insaturadas. Assim, formam-se espécies inactivas para a reacção em cadeia e um radical (ArO) procedente do antioxidante. Este radical, estabilizado por ressonância, não tem a capacidade de iniciar ou propagar as reacções oxidativas por ser muito menos reactivo.[2, 5, 11] Será sobre este mecanismo que vai incidir o presente estudo.
Finalmente, existem ainda outros antioxidantes cuja acção se manifesta por reparação das lesões causadas pelos radicais.[12] É de realçar a ocorrência de efeitos sinergísticos resultantes da acção de diferentes agentes antioxidantes.
1.1.1.Compostos Fenólicos
As propriedades antinflamatórias, antialérgicas, antiosteoporóticas, anticancerígenas e antienvelhecimento dos compostos fenólicos resultam das suas propriedades antioxidantes. A actividade antioxidante dos compostos fenólicos manifesta-se através de vários mecanismos, sendo o mais importante a inactivação de radicais livres e de outras espécies oxidantes.
1. Introdução 1.1. Antioxidantes
3 Os antioxidantes fenólicos (ArOH) dividem-se em: flavonóides, tocoferóis e ácidos fenólicos. Os flavonóides são constituídos por dois anéis aromáticos (um grupo benzoil e um grupo cinanoil) e uma pirona. A figura 1.1. representa um exemplo de um flavonóide, a quercetina.
Figura 1.1 – Estrutura molecular da quercetina.
A vitamina E encontra-se em grande quantidade nos lípidos, sabe-se que esta vitamina impede ou minimiza os danos provocados pelos radicais livres, tendo a capacidade de impedir a propagação das reações em cadeia induzidas por esses radicais nas membranas biológicas e na peroxidação lipídica em sistemas biológicos. [12, 13] A vitamina E é constituída por um grupo de oito compostos lipossolúveis que incluem os tocoferóis e tocotrienóis.[14] Podem-se apresentar em quatro formas diferentes α, β, γ e δ-tocoferol (tal como os tocotrienóis), sendo o α-tocoferol (α-TOH – figura 1.2) a forma antioxidante amplamente distribuída nos tecidos e no plasma. In vivo, o radical α-tocopheroxyl (α-TO•) é regenerado por reacção com a vitamina C, de modo a que a reacção em cadeia causada pela peroxidação lipídica seja quebrada e que exista continuamente uma fonte regenerada de α-TOH disponível. O α-TOH reage com os radicais peroxilo mais depressa que os radicais peroxilo reagem com os lipídios (RH).[15]
Figura 1.2 – Estrutura molecular do α-tocoferol .
Os ácidos fenólicos apresentam um grupo funcional carboxilo e são divididos em duas classes: os ácidos hidroxibenzóicos e os ácidos hidroxicinâmicos.[16] Na figura 1.3, estão representadas duas estruturas químicas pertencentes a cada classe o ácido 4-hidroxibenzóico (figura 1.3.a) e o ácido 4-hidroxicinâmico (figura 1.3.b).[17]
4
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos. Figura 1.3 – Estrutura do ácido 4- hidroxibenzóico (a), do ácido 4-hidroxicinâmico (b).
Os ácidos hidroxicinâmicos e os seus derivados são ingredientes alimentares bioactivos das plantas, exibindo actividade antioxidante in vitro. O ácido cafeico, ácido 3,4-dihidroxicinâmico (figura 1.4), é um antioxidante natural existente no café. Além de actuar como um inibidor cancerígeno, também actua em sinergismo na protecção das células e tecidos, pois foi demonstrado ser um protector do α-tocoferol em lipoproteínas de baixa densidade (LDL).[18, 19]
Figura 1.4 – Estrutura molecular do Ácido Cafeico.
Os ácidos hidroxibenzóicos são componentes das complexas estruturas dos taninos
hidrolisáveis e são menos abundantes nos vegetais consumidos pelos humanos. Assim, têm
sido realizados estudos para pesquisar, desenvolver e substituir esses antioxidantes de origem natural por antioxidantes sintéticos, como é o caso do trolox (figura 1.5). O trolox é um antioxidante sintético, que deriva da vitamina E (figura 1.3). Sendo que trolox é o nome comercial para o ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametiloxano-2-carboxílico.[20]
Figura 1.5 – Estrutura molecular do Trolox.
Para utilizar os antioxidantes na indústria alimentar e farmacêutica é necessário avaliar a sua actividade antioxidante. O mecanismo antioxidante mais relevante é aquele em que radicais livres são inactivados por doação de um átomo de hidrogénio. A actividade antioxidante está relacionada, portanto, com a energia da ligação O-H que pode determinar-se, em fase gasosa, por medição da acidez de fenóis e das afinidades electrónicas dos respectivos radicais fenoxilo. Recorrendo às equações 7 e 8, verifica-se facilmente que
b) a)
1. Introdução 1.1. Antioxidantes
5 quanto menor for a energia da ligação O-H, maior será o potencial para neutralizar os radicais livres.[15, 21]
Assim, neste trabalho propõe-se a determinação experimental e teórica da acidez, em fase gasosa, de alguns fenóis substituídos, como o trolox, ácido cafeico e a vitamina E, bem como da afinidade electrónica teórica de radicais fenoxilo correspondentes. O objectivo final é a determinação da entalpia de dissociação da ligação O-H, DHᵒ (ArO-H), naqueles compostos.
1.1.2.Entalpia de dissociação da ligação OH em fase gasosa
A transferência do átomo de hidrogénio para o radical livre é o mecanismo principal de inactivação dos radicais livres e tem sido associado ao mecanismo (HAT). [22] No entanto este resultado também pode ser conseguido através do mecanismo da perda sequêncial de um protão e de transferência de electrão (mecanismo SPLET) ou pelo o mecanismo da transferência de um electrão seguido pela transferência do protão (mecanismo SET-PT). No mecanismo SPLET, os termos energéticos relevantes são a afinidade protónica do anião fenóxido, ΔHᵒ (ArO-), variação de entalpia da reacção 9, e a afinidade electrónica do radical fenoxílo, EA (ArO). No segundo, o SET-PT, os termos energéticos relevantes são a energia de ionização do composto fenólico, IE (ArOH) e a afinidade protónica do radical fenoxílo, PA (ArO). [23]
Neste trabalho, considerou-se o mecanismo SPLET para a determinação de DHᵒ (ArOH). Para essa determinação necessitamos da afinidade protónica do anião fenóxido e da afinidade electrónica da radical fenoxilo como se vê abaixo (9-12). A variação da energia de Gibbs (ΔG°) da reacção (9) é definida como a acidez em fase gasosa de ArOH. Na verdade tanto ΔacHᵒ(ArOH) como ΔacG°(ArOH), que são variações da entalpia e da energia Gibbs da
reacção (9), estão relacionadas com a acidez de ArOH e são frequentemente usadas indistintamente na literatura como acidez de ArOH.
ArOH → ArO – + H + ΔacHᵒ (ArOH) (9)
ArO –→ ArO + e – EA (ArO) (10)
H + + e – → H IE (H) (11) ArOH → H + ArO DHᵒ (ArOH) (12)
6
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Neste ciclo termoquímico de iões negativos, podemos relacionar a entalpia de dissociação da ligação OH (12), DHᵒ(ArOH), em fase gasosa, com os seguintes parâmetros termodinâmicos, a energia de ionização (IE) do átomo de hidrogénio, a afinidade electrónica (EA) do ArO e a afinidade protónica (Δ
acHᵒ) de ArO-.[24-27]
DHᵒ (ArO-H) = ΔacHᵒ (ArOH) + EA (ArO) – IE (H) (13)
A energia de ionização (IE) do átomo de hidrogénio (11) é conhecida, tendo o valor de 1312 kJ/mol. Para determinar a afinidade electrónica (EA) do radical fenoxílo (10) recorre-se usualmente à espectroscopia de fotoelectrões de iões negativos [28, 29], mas também pode ser determinada por espectrometria de massa. A entalpia da reacção de desprotonação (ΔacH) do neutro (9) pode ser determinada através da espectrometria de massa.[24]
A determinação da entalpia de dissociação da ligação O-H (BDE) em compostos fenólicos estruturalmente diferentes, pode ajudar-nos a compreender como é que a força de ligação O-H e a sua actividade antioxidante são afectadas pela natureza, a posição, e o número de substituintes.[30, 31] Este aspecto é importante na orientação da síntese de novos antioxidantes.
Apesar da maioria dos estudos sobre a actividade antioxidante serem realizados em solução, os estudos em fase gasosa são importantes pois permitem-nos explorar a reactividade das moléculas e dos iões sem os efeitos do solvente. Além disso, a diferença que existe entre as entalpias de dissociação da ligação O-H, em fase gasosa e em solução é menor que 5 kJ/mol para um grande número de fenóis substituídos.[32] Anteriormente, neste grupo de investigação, já foram realizados estudos de compostos fenólicos: flavonóides, fenóis dissubstituídos e cromanol, em que se determinou a sua acidez em fase gasosa.[23,
32-34]
Assim, existem vários métodos para determinar estas grandezas termodinâmicas em fase gasosa, podendo ser utilizados os métodos de equilíbrio, de bracketing ou cinético.[35] O método escolhido para esta determinação foi o último.
1. Introdução 1.2. Método Cinético de Cooks
7 1.2.Método Cinético de Cooks
O interesse nas propriedades fundamentais e na reactividade dos iões tem aumentado, principalmente nas biomoléculas. De entre os dados termoquímicos que descrevem essas propriedades dos iões salientam-se a basicidade em fase gasosa (GB) e a afinidade protónica (PA). São propriedades intrínsecas por serem determinadas na ausência do solvente.[36-38] GB e PA são definidas como o negativo da variação de energia de Gibbs (-ΔGro) e da variação de entalpia (-ΔHro), respectivamente, na seguinte reacção
+ → GB = - ΔGro
PA = - ΔHr0 (14)
Estas propriedades começaram por determinadas através do método de bracketing. Considerava-se que as reacções de transferência protónica (PTR) eram exotérmica (ΔGro˂0).
Assim, se quisessemos determinar a basicidade do composto B e usassemos duas bases de referência A e C, se a reacção 15 ocorresse
+ → + (15)
+ → (16)
e a 16 não, obtinhamos um intervalo para o valor de GB(B), isto é, GB(C) ˃ GB(B) ˃ GB(A).[39] Este método ainda é útil quando, por exemplo, as medições de equílibrio da transferência protónica não pode ser aplicada. O método de equilíbrio baseia-se na medição de constantes de equilibrio (Keq) para equações reversíveis de transferência protónica (17).[35, 38]
+ + (17)
Este método é de limitada aplicação, pois não se pode utilizar amostras impuras ou não voláteis, necessitando de instrumentos especializados, enquanto que no método cinético podemos utilizar os espectrómetros de massa comerciais desde que estes sejam capazes de fazer MS2.[40]
O método cinético, introduzido por Cooks, começou por ser deduzido para a determinação de basicidade e afinidades protónicas de compostos e portanto apresentaremos essa versão. Este método baseia-se nas velocidades de dissociação competitiva de um heterodímero. Como o formalismo do método foi feito para determinar a basicidade e afinidade protónica de compostos, o heterodímero tem de ser formado por um composto (B), que tem uma basicidade desconhecida (GB), e outro (Bi), que tem uma
8
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
+ ← … … → + (18)
A fragmentação do heterodímero vai originar bases protonadas individuais pela clivagem da ligação de hidrogénio, sendo que o monómero que tiver maior basicidade em fase gasosa vai ficar com o protão. Na equação 18, k e ki são as constantes de velocidade
para a dissociação competitiva de um ião comum, o heterodímero, que leva à formação de BH+ e BiH+, respectivamente.[35] Considerando a teoria das velocidades absolutas[42], pode
relacionar-se as constantes de velocidade com as grandezas termodinâmicas de interesse. Assim estabelece-se o formalismo do método, onde o logaritmo da razão das constantes de velocidade pode ser expresso em [35, 43]
= ln
≈
+
∆
!"## (19)
onde Q≠ e Qi≠ são as funções de partição do estado de transição dos dois canais de
dissociação, termo ∆$% é a diferença entre as energias de activação para os dois canais de dissociação e o termo Teff é a temperatura efectiva. Existe uma discussão contínua em volta
do termo Teff, pois apesar de ser chamada uma temperatura, não é uma verdadeira
temperatura termodinâmica, pois depende não só da energia interna do sistema como também depende das condições experimentais no espectrómetro de massa.[44, 45] Apesar disso, este termo contínua a ser utilizado, pois representa a temperatura da fracção de iões heterodímeros activados, que sofrem fragmentações competitivas na janela de tempo dos instrumentos.[40, 46]
Na sua forma mais simples, o método cinético é baseado num conjunto de condições experimentais:
Não existam energias de activação das reacções inversas (ou a diferença entre ela é desprezável);
Não existam reacções competitivas;
Ambos os compostos, B e Bi, sejam estruturalmente semelhantes (Δ(ΔS) = 0);
Não ocorram formas isoméricas do heterodímero.[35, 38, 47]
Não existindo energias de activação das reacções inversas, o termo ln(Q≠/Qi≠) é o
equivalente à variação de entropia, Δ(ΔS), entre os dois canais de dissociação e o termo ∆$% pode ser substituido por Δ(ΔH). Desta forma, convertemos a equação 19 em
1. Introdução 1.2. Método Cinético de Cooks
9
=
= −
∆'∆()+
∆'∆) !"##= −
∆'∆()+
∆') !"##−
∆')
!"##
(20)
Onde é ∆H(Bi) são as afinidades protónicas conhecidas, ∆H(B) é a afinidade protónica
(PA) do desconhecido e Teff é a temperatura efectiva. Se ambas as espécies (a referência e a
desconhecida) forem estruturalmente semelhantes, o termo entrópico, Δ(ΔS), pode ser cancelado. Logo, se o termo Δ(ΔS) for igual a zero, então Δ(ΔH) vai ser igual a Δ(ΔG). E assim, chegamos à forma restrita do método cinético (21), que relaciona a razão das abundâncias iónicas com a variação das afinidades protónicas (ΔPA = Δ(ΔH)).
=
=
!∆'∆)"##=
!∆'∆*)"##(21)
Traçando um gráfico de ln [BH+/BiH+] vs PA(Bi), Bi conjunto de referências, vamos
obter uma relação linear
+
,',' ))- = ./'0) + 1
(22)onde o declive (m) vai ser de - 1/RTeff e a intercepção (b) vai ser PA(B)/RTeff (figura 1.6).[35, 47]
Assim, podemos determinar o valor da afinidade protónica, PA(B)= ΔH(B), do composto desconhecido (B).
Figura 1.6 – Gráfico ln [BH+/BiH+]vs ΔH(Bi), que permite a determinação da afinidade protónica do composto
desconhecido através do método cinético restrito.
Quando os compostos de referência (Bi) escolhidos são estruturalmente diferentes
do composto desconhecido (B), o termo entrópico (Δ(ΔS)) não desprezável e a aproximação usada na versão restrita do método não é válida. Nesta situação, para determinarmos estas grandezas termodinâmicas, temos de aplicar o método cinético estendido (20). Para tal,
-4 -3 -2 -1 0 1 1373 1378 1383 1388 1393 ln [B H +/B i H +] PA(Bi)
10
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
define-se uma basicidade aparente, ∆Gapp, para o composto desconhecido (23).
Reconhece-se que o termo entálpico ΔH(B)/RTeff = PA(B)/RTeff resultante do gráfico da Figura 1.6 não é
realmente uma entalpia mas uma energia de energia de Gibbs visto que o termo entrópico não é desprezável. Considerando
∆*233') !"##
=
∆') !"##−
∆'∆() (23)Para se obter um verdadeiro valor de ΔH(B), a partir da equação 23, fez-se uma representação gráfica de ∆Gapp(B)/RTeff vs 1/RTeff. Primeiramente, através de um conjunto de
gráficos, do tipo do gráfico 1.6, conseguímos obter os vários valores de basicidade aparente (∆Gapp(B)) com várias temperaturas efectivas (Teff) associadas. Para tal, foi necessário realizar
uma série de experiências em diferentes condições, como por exemplo, a diferentes energias de colisão para termos diferentes Teff.
Um segundo gráfico, ∆Gapp(B)/RTeff vs 1/RTeff, é construído a partir do negativo os
declives (m) vs as intercepções (b), que resultaram do primeiro gráfico (figura 1.6). O valor de afinidade protónica do desconhecido, ∆H(B), correspondem ao declive, m’ (figura 1.7). A variação de entropia, Δ(ΔS), vai ser obtida através do valor da ordenada na origem (b’) da mesma figura. [47]
Figura 1.7 – 2ª Representação gráfica do método cinético estendido, ΔGapp/RTeff vs 1/RTeff, que permite a
determinação da afinidade protónica do composto desconhecido.
O método cinético tem-se mostrado uma alternativa ao método de equilíbrio e de bracketing na determinação de um grande número de grandezas termoquímicas em fase gasosa como a acidez, basicidade, energia de ionização, afinidades protónica e electrónica,
300 325 350 375 400 425 450 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 ∆∆∆∆ Ga p p /R Teff 1/RTeff
1. Introdução 1.2. Método Cinético de Cooks
11 bem como a afinidade para iões metálicos. Para cada caso o formalismo tem sofrido as adaptações necessárias.
Este método tem sido bastante utilizado, pois:
é sensível a pequenas variações nos valores termodinâmicos.
pode ser aplicado em qualquer espectrómetro de massa com capacidade de realizar experiências de espectrometria de massa tandem.[35]
pode ser aplicado a compostos não-voláteis e termicamente instáveis.
Neste trabalho, como se utiliza um ciclo termoquímico de iões negativos (13) necessitamos do valor da acidez em fase gasosa (∆acH), para determinar a energia de
dissociação de ligação OH (12), que é decisivo para conhecer o valor da acidez dos compostos fenólicos e relacionar-lo com a sua função antioxidante.[15, 24] Assim, o heterodímero é constituído a partir de um composto fenólico que tem uma acidez desconhecida (ArOH) e outro que tem uma acidez conhecida (RH).[23, 33, 34]
45 + 06
← 45 … … 06 → 456+ 0 (24)
A acidez em fase gasosa de ArOH, ΔacG(ArOH) e afinidade protónica de ArO-,
ΔacH(ArO-), podem ser obtidas experimentalmente através da aplicação do método cinético
12
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1.3.Espectrometria de Massa
A espectrometria de massa é uma técnica que envolve a produção de iões em fase gasosa a partir dos compostos a analisar, sendo depois separados de acordo com a sua razão massa/carga (m/z). Esta análise pode fornecer-nos informação qualitativa, estrutural e quantitativa sobre as moléculas de analito.[48] Os espectrómetros de massa, em geral, são constituídos pelo sistema de introdução de amostra, fonte de ionização, analisador de massa e detector (Figura 1.8).[49]
Figura 1.8 – Diagrama esquemático de um espectrómetro de massa comum.
O aparelho é mantido sob vácuo de modo a aumentar o número de iões que conseguem atravessar o instrumento sem qualquer interferência.[50] No esquema da figura 1.8, a fonte está incluída no sistema de vácuo mas isso não acontece nas técnicas de ionização que operam à pressão atmosférica, como por exemplo ESI, APCI e APPI.Os iões produzidos na fonte de ionização são transferidos posteriormente para o analisador do espectrómetro de massa onde são separados de acordo com m/z.[51] Existem vários tipos de analisadores de massa:
• quadrupolo (englobando os quadrupolos simples e triplos)[52]; • ion trap[53];
• orbitrap[54];
• sectores (magnético e electrostático)[50]; • tempo de vôo (TOF);
• ressonância ciclotrónica de iões com transformada de Fourier (FTICR)[49].
Fonte de
Ionização
Analisador
Detector
Sistema de dados
(Tratamento de
dados)
Sistema de
Introdução da
Amostra
1. Introdução 1.3. Espectrometria de Massa
13 O detector é o último elemento do espectrómetro de massa e consiste geralmente num multiplicador de electrões.
1.3.1.Ionização
Existem vários métodos de ionização, sendo que os mais utilizados são a ionização electrónica (EI), a ionização química (CI), a ionização por electrospray (ESI), a ionização química à pressão atmosférica (APCI), o bombardeamento com átomos/iões rápidos (FAB) e a ionização/desadsorção laser assistida por matriz (MALDI).[51, 55] Para cada amostra e tipo de estudo existe um método de ionização adequado, onde o sistema de introdução da amostra pode variar. [56]
1.3.1.1.Ionização por Electrospray
A ionização por electrospray (ESI) é uma técnica de ionização suave que permite a preservação, em fase gasosa, das interacções não-colaventes entre moléculas que existem em solução.[57] Existem quatro tipos normalmente referidos de interações não-covalentes que são as ligações de hidrogénio, as ligações iónicas, as forças de van der Waals e as interações hidrofóbicas. Neste trabalho a técnica de ionização utilizada foi o electrospray (ES), pois esta técnica permite estudar um heterodímero, que se trata de um ião constituido por dois aniões resultantes de compostos diferentes, neste caso, do composto em estudo e da referência ligados por um protão.[33]
A ESI distingue-se por:
• Ter a capacidade de produzir iões multiplamente carregados com um número de carga elevado, reduzindo a razão m/z, tornando possível analisar compostos de elevada massa molecular, mesmo em espectrómetros de massa com um mass range limitado.
• As amostras a analisar devem ser introduzidas em solução, o que faz com que seja possível o acoplamento com muitas técnicas de separação.
• Como a técnica de ionização é suave permite que as interacções não-colaventes entre moléculas que existem em solução sejam preservadas em fase gasosa.[58]
14
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
A ionização por electrospray (ESI) é compatível com todos os tipos de cromatografia, mas neste estudo não foi necessário aplicar uma técnica hifenada, fazendo-se a injecção directa da solução em estudo.
No caso da ionização por electrospray (ESI), a fonte encontra-se à pressão atmosférica e a evaporação do solvente é potenciada por um fluxo contra corrente de um gás (azoto). Os iões gerados à pressão atmosférica são depois transferidos para o analisador de massa que se encontra em vácuo.[59]
A produção de iões em electrospray divide-se essencialmente em dois passos, na dispersão de gotas altamente carregadas e na evaporação da gota. Inicialmente, a amostra é introduzida em solução através de um capilar de aço inoxidável. A ponta do capilar, onde o analíto em solução é introduzido e pulverizado, é mantido a um potencial relativamente elevado em relação a um contra-eléctrodo, levando à formação de gotas pequenas e altamente carregadas (figura 1.9). Posteriormente, as moléculas do analíto são separadas do solvente, na forma de iões.[57, 59, 60]
Figura 1.9 – Diagrama esquemático de uma fonte de ionização de um electrospray (ESI).
A formação de iões é provavelmente a parte menos compreendida do processo de electrospray.[59] Existem alguns modelos propostos para a formação de iões, sendo os principais o modelo de carga residual e modelo de evaporação iónica.[59, 61]
No modelo de carga residual, os iões são formados a partir de gotas carregadas, este modelo envolve três passos: (1) a densidade de carga aumenta com a evaporação do solvente, levando (2) a que as forças de repulsivas de Coulomb entre as cargas superficiais
1. Introdução 1.3. Espectrometria de Massa
15 ultrapassem a tensão superficial, originando (3) a divisão da gota inicial. Este processo continua até que cada gota contenha apenas uma única molécula, que terá parte da carga inicial, formando os iões (figura 1.10).
Figura 1.10 – Modelo de carga residual.
No modelo de evaporação iónica, os iões formam-se em três passos: (1) a dispersão de um spray fino de gotículas carregadas, seguidas pela (2) a evaporação do solvente e (3) a ejecção de iões a partir das gotículas altamente carregadas. Este mecanismo foi aplicado por Fenn (figura 1.11).
Figura 1.11 – Modelo de evaporação iónica.
Assim, a solução que emerge do capilar é dispersa num aerossol com gotículas carregadas por acção do campo eléctrico acima referido e de um gás nebulizador (azoto). As gotículas diminuem a sua dimensão através da evaporação assistida pelo gás de secagem ou contra-corrente.Sendo a amostra convertida maioritariamente em iões livres de solvente. Os iões passam por um skimmer(s) para uma zona de pressão inferior à pressão atmosférica. O(s) skimmer(s) são cone(s) com um orifício pequeno (figura 1.9), que permitem estabelecer um gradiente de pressão entre a fonte iónica e o analisador.[59] O skimmer actua também como um separador de momento, separando os iões amostra, mais pesados, das moléculas, mais leves, do solvente e do gás. Posteriormente, os iões são transferidos para o analisador onde são medidas as razões m/z.
1.3.2.Analisador
Os analisadores utilizados neste estudo foram a ion trap e o FTICR (Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier).
16
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1.3.2.1.Ion trap
A ion trap é constituída por três eléctrodos aos quais são aplicados potenciais, formandouma rede de captura que aprisiona as partículas carregadas ou os iões gasosos. Dois desses eléctrodos são os eléctrodos endcap, que apresentam uma geometria hiperbólica (figura 1.12). Um dos eléctrodos endcap tem pequenos orifícios através dos quais os iões passam periodicamente para o analisar, enquanto que o outro tem vários orifícios pequenos que estão dispostos centralmente e pelos quais os iões passam em direcção ao detector. O terceiro eléctrodo é um eléctrodo anelar, que está posicionado entre os dois eléctrodos endcap.[62, 63]
Figura 1.12 – Representação esquemática de uma ion trap.
Assim, os iões produzidos na fonte entram na ion trap, onde são aplicadas várias voltagens entre os eléctrodos, de modo a aprisionar e ejectar os iões de acordo com as suas razões massa/carga (m/z).[49]
As voltagens aplicadas têm duas componentes, a corrente alterna (AC) e as radiofrequências (rf). Ao entrarem num campo eléctrico, os iões oscilam e, a uma determinada radiofrequência, os iões de uma determinada massa estão num estado de oscilação que os leva a descrever uma trajectória estável que lhes permite atravessar a ion trap e chegar ao detector. Dentro destas condições nem todas as massas alcançam um estado de oscilação que lhe permita ter uma trajectória estável, ficando retidas nas paredes da ion trap, permitindo que haja separação de massas.[51, 53, 62]
A voltagem da AC é alterada para variar a resolução. Se a voltagem AC estiver desligada, a ion trap opera apenas em modo rf.[52] Neste caso, a ion trap não está a ser
1. Introdução 1.3. Espectrometria de Massa
17 utilizada como analisador, mas antes como célula de colisão, permitindo a execução de espectrometria de massa tandem.[53, 64]
1.3.2.2.FTICR
O FTICR (Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier) envolve a acção simultânea do campo eléctrico e magnético para confinar os iões numa região finita do espaço e aí os analisar e detectar. Toda a experiencia de FTICR ocorre numa célula de confinamento de iões formada por três pares de pratos em oposição que têm funções específicas de confinamento, excitação e detecção dos iões a serem analisados (figura 1.13).[49, 65, 66]
Figura 1.13 – Representação esquemática de um FTICR.
A célula está colocada na zona homogénea do campo magnético confinando cada ião radialmente, obrigando-o a descrever um movimento ciclotrónico com uma frequência que é função da respectiva razão massa/carga, enquanto o campo eléctrico gerado por um potencial electrostático é aplicado nos pratos de confinamento mantendo o ião num fosso de potencial na direcção de z, que corresponde ao campo magnético da figura 1.13.[46, 67]
Os três movimentos naturais do ião são o movimento ciclotrónico, o movimento do magnetrão e a movimento por aprisionamento (figura 1.14). No entanto, as frequências do magnetrão e do movimento por aprisionamento são muito mais baixas que as frequências ciclotrónicas, não sendo geralmente detectadas.[65, 67]
18
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Figura 1.14 – Movimentos naturais do ião, onde νm é a frequência do magnetrão, νc é a frequência ciclotrónico e νT é a frequência por aprisionamento.
O movimento ciclotrónico só por si não é muito útil. Deste modo, todas as aplicações se baseiam na excitação por aplicação de um campo eléctrico espacialmente uniforme com frequência igual, ou próxima, à frequência ciclotrónica dos iões de uma dada razão massa/carga. A excitação em FTICR é usada de três formas (figura 1.15):
• para acelerar coerentemente os iões até trajectórias com raios maiores, tornando possível a sua detecção;
• para aumentar a energia cinética do ião acima do limite de dissociação iónica e/ou para a reacção ião-molécula;
• para acelerar os iões até trajectórias com raio superior ao raio da célula de modo a removê-los (ejecção).[46, 67, 68]
Figura 1.15 – Três forma de aplicar a excitação. Esquerda: aceleração dos iões até uma trajectória espacialmente coerente e detectável. Centro: Aumento da energia cinética acima do limite para a dissociação
activada por colisão ou reacção. Direita: ejecção dos iões de uma dada razão massa/carga.
Desta forma, os iões presentes na célula, são sujeitos a um campo eléctrico oscilante de radiofrequências (rf), transmitido através dos pratos de excitação. Quando as radiofrequências entram em ressonância com as frequências de ciclotrão dos iões, há absorção de energia que obriga os iões a deslocarem-se para uma órbita com maior raio, aproximando-se dos pratos de detecção, induzindo aí uma corrente.[65, 67] Essa corrente é
1. Introdução 1.3. Espectrometria de Massa
19 uma sobreposição das frequências de ciclotrão dos diferentes iões sujeitos a excitação, com amplitudes que são proporcionais ao número de iões. O sinal trasiente é convertido numa voltagem, digitalizado e sujeito a uma transformada de Fourier, a qual revela as frequências e intensidades que são depois convertidas em massas e abundâncias iónicas (figura 1.13).[65,
69]
O FTICR-MS foi acoplado a todos os tipos de fontes iónicas, onde se observou que a maioria funcionava melhor fora do campo magnético. Assim, foram desenvolvidos vários métodos para conduzir os iões, gerados externamente, para a célula.
Tal como na ion trap é possível realizar experiências de espectrometria de massa tandem, na célula do ICR.[46, 70]
Como pudemos observar ambos usaram a mesma técnica de ionização, sendo ela, o electrospray (ES). A distinção entre os dois espectrómetros, foi o analisador, sendo que um tinha a ion trap e o outro o FTICR. Apesar dos dois analisadores serem diferentes, ambos são capazes de funcionar como câmaras de colisão permitindo realizar espectrometria de massa tandem, que foi vital para efectuarmos a determinação experimental dos parâmetros termoquímicos, em fase gasosa, descritos em capítulos anteriores.
1.3.3.Detectores
O detector é o último elemento do espectrómetro de massa, onde se converte a corrente iónica em electrões ou fotões. Existem vários tipos de detectores, sendo um dos mais comuns o multiplicador electrónico ou o fotomultiplicador.[48]
O detector da ion trap utilizada neste trabalho é um multiplicador de electrões.[71] O multiplicador de electrões utiliza uma tensão de aceleração sobre os iões levando-os a embater num dínodo de conversão produzindo uma emissão secundária de electrões, que sofre multiplicação por embate nos estágios seguintes do multiplicador. A corrente iónica é, assim, convertida em corrente eléctrica que é amplificada e susceptível de ser medida.
1.3.4.Espectrometria de massa tandem com dissociação induzida por colisão (CID)
A espectrometria de massa tandem consiste na activação de um ião primário, “ião percursor”, que é dissociado ou reage, dando origem a um ião ou mais iões secundário que são analisados, “iões produto”. Para realizar espectrometria de massa tandem, um
20
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
espectrómetro de massa deve ser constituído, normalmente, por dois ou mais analisadores. No primeiro analisador, selecciona-se e isola-se um ião com uma razão m/z, que é transferido para uma câmara de colisões onde é excitado e sofre posterior fragmentação. A fragmentação é realizada habitualmente através de dissociação induzida por colisão (CID) com um gás. Seguidamente, faz-se a análise de massa dos iões fragmento num segundo analisador de massa.[49, 72, 73]
Neste trabalho experimental, utilizaram-se equipamentos com um único analisador, uma ion trap e um FTICR, que pode funcionar como célula de colisões e realizar várias análises de massa sucessivas. Estes passos ocorrem com separação temporal. Na ion trap, a CID é realizada, geralmente, na própria ion trap que funciona como câmara de colisões, onde um gás inerte (hélio ou outro) presente na célula de colisão, bombardeia os iões seleccionados da amostra, causando a sua fragmentação. No FTICR, a CID é realizada, geralmente, na célula do ICR funcionado como câmara de colisões colidindo com um gás, onde é aplicada uma frequência que vai excitar os iões seleccionados, causando a sua fragmentação. A CID de uma espécie iónica isolada, tanto na ion trap como no FTICR, é uma técnica poderosa para a determinação da estrutura de iões.[73] No entanto, neste estudo, esta técnica, CID, irá permitir o estudo da decomposição do heterodímero, para aplicação do método cinético.[23, 34]
Uma das vantagens da espectrometria de massa tandem é que podemos utilizar compostos sem purificação prévia, pois podemos selecionar e isolar o ião de interesse.
Como foi referido anteriormente, para além da determinação experimental da acidez em fase gasosa de alguns fenóis substituídos, também se fez o estudo teórico desses mesmos compostos. A termoquímica de fase gasosa utiliza os cálculos teóricos na confirmação dos valores obtidos e também na informação estrutural que é dificilmente obtida por espectrometria de massa.
O objectivo final é determinar da entalpia de dissociação da ligação O-H, DHᵒ (ArO-H), nesses mesmos compostos. Assim, este estudo vai dividir-se em duas partes, num estudo da acidez e num estudo das afinidades electrónicas. O estudo teórico da acidez vai complementar o trabalho experimental, pois vamos obter um valor que deve confirmar o valor obtido experimentalmente, para além de esclarecer o grupo funcional em que ocorre a desprotonação. O estudo teórico das afinidades electrónicas foi feito apenas teóricamente, dada a dificuldade de o obter experimentalmente.
2. Parte Experimental 2.1 Reagentes
21
2.
Parte Experimental
2.1.Reagentes
Os compostos em estudo foram o 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)propenoic acid (ácido cafeico) e o (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (trolox), que foram obtidos na Sigma-Aldrich e utilizado sem purificação prévia. Também o
α
,α
,α
-tocopherol (vitamina E), obtido na Acros Organics, foi objecto de estudo e utilizado sem purificação prévia. As principais características dos compostos em estudo encontram-se descritas na tabela seguinte (tabela 2.1).O solvente escolhido foi o metanol, obtido no VWR com uma pureza de 99,8%. A selecção do solvente é importante, pois tem que ser capaz de dissolver a amostra completamente, caso contrário, a amostra pode precipitar e bloquear o capilar da fonte de ionização utilizada.
Tabela 2.1 – Características dos compostos em estudo.
Composto Fórmula estrutural
Fornecido por (grau de pureza) Massa Molecular (Da) Razão m/z da molécula desprotonada [R-] Trolox (C14H18O4) Sigma-Aldrich (97,0%) 250,29 249 Ácido Cafeico (C9H8O4) Sigma-Aldrich (98,0%) 180, 16 179
α
,α
,α
-tocopherol (C29H50O2) Acros Organics (98,0%) 430,71 429Os compostos utilizados como referências para este estudo foram o fenol, o fluorofenol, o clorofenol, o ácido benzóico, o 3-(Trifluorometil)fenol, o 4-(Trifluorometil)fenol, o ácido nicotínico, a 4-hidroxiacetofenona, o ácido 4-hidroxibenzóico, o 4-hidroxibenzoato de metilo, o ácido 4-cianobenzóico, o ácido 2-hidroxibenzóico, o ácido
22
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
2,5-dihidroxobenzóico, o ácido 2,4,6-trihidroxiacetofenona e o ácido pícrico. Estas referências foram obtidas de diferentes fornecedores (tabela 2.2), tendo sido utilizadas sem qualquer purificação.
Tabela 2.2– Características dos compostos de referência utilizadas neste estudo.
Compostos de Referência Fórmula estrutural Fornecido por (grau de pureza) Massa Molecular (Da) ∆acH (kJ/mol) ∆acG (kJ/mol) 3,4-Dimetilfenol (C8H10O) Sigma-Aldrich (98,0%) 122,16 1467 1436 4-Metilfenol (C7H8O) Sigma-Aldrich (98,0%) 108,14 1465 1437 Cromanol (C14H20O) Sigma-Aldrich (99,0%) 221,13 1465 1434 4-Etilfenol (C8H10O) Sigma-Aldrich (98,0%) 122,16 1463 1435 3,4-Dimetóxidofenol (C8H10O3) Sigma-Aldrich (98,0%) 154,16 1462 1431 Fenol (C6H6O) Sigma-Aldrich (98,0%) 94,11 1462 1431 4-Fluorofenol (C6H5OF) Sigma-Aldrich (99,0%) 112,10 1451 1422 4-Clorofenol (C6H5OCl) Sigma-Aldrich (99,0%) 128,56 1435 1407
2. Parte Experimental 2.1. Reagentes
23
Tabela 2.2 – Continuação das características dos compostos de referência utilizadas neste estudo.
Composto de Referência Fórmula estrutural Fornecido por (grau de pureza) Massa Molecular (Da) ∆acH (kJ/mol) ∆acG (kJ/mol) 3-(Trifluorometil) fenol (C7H5F3O) Sigma-Aldrich (99,0%) 162,11 1419 1391 4-Hidroxibenzoato de metilo (C8H8O3) Panrec (99,8%) 152,15 1410 1382 4-(Trifluorometil) fenol (C7H5F3O) Sigma-Aldrich (99,0%) 162,11 1410 1381 Ácido 4-hidroxibenzóico (C7H6O3) Acros Organics (99,8%) 138,12 1405 1376 4-hidroxi- acetofenona (C8H8O2) Acros Organics (99,8%) 136,15 1404 1375 Ácido Nicotínico (C6H5NO2) Acros Organics (99,8%) 123,15 1399 1370 Ácido 4-cianobenzóico (C8H5NO2) Acros Organics (99,0%) 147,13 1372* 1342 Ácido 2-hidroxibenzóico (C7H6O3) Sigma-Aldrich (99,0%) 138,12 1362 1330 Ácido 2,5-dihidroxibenzóico (C7H6O4) Fluka (98,0%) 154,12 1360* 1329
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Correlação da função antioxidante a com energia de ligação O-H em compostos fenólicos. Tabela 2.2 – Continuação das características dos compostos de referência utilizadas neste estudo.
Composto de Referência Fórmula estrutural Fornecido por (grau de pureza) Massa Molecular (Da) ∆acH (kJ/mol) ∆acG (kJ/mol) Ácido 2,5-dihidroxibenzóico (C7H6O4) Fluka (98,0%) 154,12 1360* 1329 Ácido pentafluoro Benzóico (C8H8O4) Sigma-Aldrich (99,0%) 212,07 1354 1325 Ácido 2,4,6-trihidroxibenzóico (C8H8O4) Acros Organics (98,0%) 168,15 1353 1324 Ácido Pícrico (C6H3N3O7) Sigma-Aldrich (99,0%) 229,10 1298 1267
* Valores calculados utilizando uma relação da literatura.[23]
2.2.Procedimento Experimental 2.2.1.Preparação das soluções
Neste estudo de compostos fenólicos em fase gasosa recorreu-se ao uso de soluções com concentração de 10-4 M. Para tal, começou-se por pesar o composto em estudo (por exemplo 0,02519g de trolox, ou 0,01801g de ácido cafeico ou 0,04301g de vitamina E) numa balança Sartorius CP225D, que foi dissolvido em 1000 µl de metanol, originando uma solução de 10-1 M. Essa solução sofreu diluições sucessivas até originar uma solução de 10-3 M. Para a preparação da referência utilizou-se o mesmo método, alterando-se apenas a massa de composto de acordo com a referência a utilizar.
Deste modo, preparou-se uma solução de 10-3 M do composto em estudo e da referência. De seguida, retirou-se uma alíquota de 100 µl de cada solução, que se juntaram, formando uma solução com 200 µl que foi completa com metanol para originar uma solução de 1000 µl com uma concentração da ordem dos 10-4 M.
2. Parte Experimental 2.2. Procedimento Experimental
25 Depois de preparadas as soluções, introduziram-se no espectrómetro de massa com o fim de serem analisadas.
2.2.2.Condições Experimentais para aplicação do Método Cinético
Quando introduzimos a solução no espectrómetro temos de selecionar as condições experimentais de modo observar os iões na forma aniónica ou catiónica. Para estudar a acidez necessitamos que se formem aniões, para tal o modo que vai se empregue neste estudo vai ser o modo negativo. Com este modo, é possível observar os aniões resultantes da dissociação do ácido em estudo, originando o ião do ácido (AcO-) e o protão (H+), isto é,
75 → 756+ (25)
Após as soluções serem preparadas, contendo o composto em estudo e uma referência, injectaram-se directamente no espectrómetro de massa, através de uma bomba de seringa (a velocidade constante de 5 µl/min). Os espectrómetros de massa utilizados para aplicar o método cinético foram o LCQ Duo Thermoquest da Finnigan e o FTICR (Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier) da Bruker Daltonic.
O LCQ Duo Thermoquest da Finnigan é constituído por um analisador de massa ion trap e equipado com uma fonte de ionização electrospray, estando acoplado a um computador equipado com o software Xcalibur, que permite o controlo do aparelho e a aquisição, armazenamento e processamento de dados.[71] Neste espectrómetro de massa, foi aplicado o método cinético restrito e o método cinético estendido.
Para aplicar o método cinético, todos os parâmetros do espectrómetro de massa foram optimizados para cada experiência para melhorar as razões sinal/ruído para os iões de interesse. Assim, houve parâmetros que se mantiveram constantes em todas as experiências como a voltagem aplicada ao spray na fonte que foi de 4,5 kV e a temperatura que foi de 200ᵒC. De modo a maximizar a abundância do heterodímero, optimizou-se a voltagem aplicada no capilar e no tube lens offset.
O gás nebulizador e o gás auxiliar utilizado foi em ambos os casos o azoto. A pressão medida durante as experiências no skimmer foi de 1,21 Torr e a pressão no ion trap com a adição de hélio foi de 2,33x10-5 Torr.
Fez-se um estudo do comportamento dos compostos em estudo (trolox, ácido cafeico e α-tocoferol) em modo negativo e positivo, observando os iões mais abundantes
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Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
em cada caso. Também se fez um estudo da concentração e do solvente a utilizar, para obter o melhor sinal para os iões em estudo.
Finalmente, fez-se a determinação da acidez em fase gasosa dos mesmos compostos em modo negativo, logo na sua forma aniónica. Para tal, variaram-se as energias de colisão aplicadas, após isolarmos o ião heterodímero. Variaram-se as energias de colisão normalizada no intervalo de 5 a 20%, tendo sido feito em média 5 ensaios a cada energia de colisão normalizada.[74] Como se pode observar, estas energias de colisão normalizadas (NCE) vêm expressas em percentagem, logo têm de ser transformadas em voltagens pico a pico (Vp-p), através da seguinte equação
8
969=
:;<=%× ? × '. @
⁄ ) + 1
(26)
Onde m/z é a razão massa/carga, a e b são pârametros experimentais.[75, 76]
O FTICR tem a capacidade de aplicar dois métodos de ionização distintos, a ionização por electrospray (ES) e por MALDI (Ionização/ Desadsorpção da Matrix Assistida por Laser), sendo que nesta experiência utilizou-se a ionização por electrospray (ES). O analisador de massa deste espectrómetro é a célula de ICR (Ressonância Ciclotrónica de Iões), onde foram realizadas as experiências de SORI-CID (Irradiação Fora de Ressonância Sustentada - Dissociação Induzida por Colisão). O FTICR-MS está acoplado a um computador equipado com o software Apex , que permite o controlo do aparelho e a aquisição, armazenamento e processamento de dados.[77] Neste espectrómetro de massa, foi realizado apenas o método cinético estendido.
Todos os parâmetros do FTICR-MS foram optimizados para cada experiência de modo a melhorar as razões sinal/ruído para os iões de interesse. Assim, houve parâmetros que se mantiveram constantes em todas as experiências como as voltagens aplicada no capilar que foram de 4,5 / 4 kV e a temperatura do gás de secagem que foi de 200ᵒC. Mas para aplicar o método cinético estendido e maximizar a abundância do heterodímero foi necessário alterar certos parâmetros. Para aplicar o método cinético estendido na célula de ICR, foram realizadas as experiências de SORI-CID (Irradiação Fora de Ressonância Sustentada - Dissociação Induzida por Colisão). No SORI, o ião percursor (o ião heterodímero) é excitado a uma frequência ligeiramente superior à sua frequência ciclotrónica. Deste modo, os iões sofrem múltiplos ciclos de aceleração/desacelaração, que dão origem a um grande número de colisões com o gás inerte, o Argon. Este fenómeno, faz com que o ião percursor (o ião
2. Parte Experimental 2.2. Procedimento Experimental
27 heterodímero) absorva cada vez mais energia, até causar sua dissociação e formar os iões produto. Para tal, tem que se alterar certos parâmetros.[77, 78] Primeiramente, tem-se de ajustar a pressão do gás de colisões através de um conjunto de válvulas, até chegar aos 8 mbar de pressão. Depois, fez-se o isolamento do ião na célula de ICR. Ao isolarmos o ião na célula de ICR, vão aparecer novos parâmetros que têm de ser optimizados. Finalmente, fragmenta-se o ião seleccionado através do SORI-CID, sendo necessário ajustar parâmetros como a frequency offset, a duração do pulso rf e a potência de SORI a aplicar. Ao utilizar diferentes valores para frequency offset e a potência de SORI, vamos influenciar a oscilação do ião. Variou-se a frequency offset de 0Hz a 300Hz e a variou-se a potência de SORI de 0 a 0,03 %.
