• Nenhum resultado encontrado

Comparação de protocolos de extração de DNA genômico de Capsicum spp. / Comparison of genomic DNA extraction protocols of Capsicum spp.

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2020

Share "Comparação de protocolos de extração de DNA genômico de Capsicum spp. / Comparison of genomic DNA extraction protocols of Capsicum spp."

Copied!
16
0
0

Texto

(1)

Comparação de protocolos de extração de DNA genômico de Capsicum spp.

Comparison of genomic DNA extraction protocols of Capsicum spp.

DOI:10.34117/bjdv6n5-191

Recebimento dos originais: 10/04/2020 Aceitação para publicação: 11/05/2020

Lucas de Oliveira Lima

Mestrando pelo Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (UENF-CCTA). Avenida Alberto Lamego, nº 2000, Parque Califórnia. Campos dos

Goytacazes – RJ, Brasil (CEP 28.013-602). E-mail: lucasoliveira0303@gmail.com

Mayara Rodrigues e Silva

Graduanda em Licenciatura em Ciências Biológicas. Universidade Federal do Piauí (UFPI). BR 343, Km 3,5, Bairro Meladão, Campus Amílcar Ferreira Sobral. Floriano – PI, Brasil (CEP

64.808-605).

E-mail: mayararodrigues13@outlook.com

Leandra Oliveira Magalhães

Mestranda pelo Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC). Rodovia Jorge Amado, Km 16, bairro Salobrinho, Campus Soane

Nazaré de Andrade. Ilhéus – BA, Brasil (CEP 45.662-900). E-mail: leandra09oliveira@outlook.com

Gabriela Corrêa Morais

Mestranda pelo Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas. Universidade Federal de Goiás – Escola de Agronomia (UFG-EA). Avenida Esperança, s/n,

Campus Samambaia. Goiânia – GO, Brasil (CEP: 74.690-900). E-mail: gabrielacorreamorais@gmail.com

Raimundo Nonato Oliveira Silva

Doutor em Genética e Melhoramento de Plantas pelo Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas. Universidade Estadual do Norte Fluminense. Atualmente professor do

curso de Graduação em Licenciatura em Ciências Biológicas. Universidade Federal do Piauí (UFPI). BR 343, Km 3,5, Bairro Meladão, Campus Amílcar Ferreira Sobral. Floriano – PI, Brasil

(CEP 64.808-605). E-mail: jraio@ufpi.edu.br

RESUMO

As espécies do gênero Capsicum possuem ampla diversidade genética e grande versatilidade de aplicações. Para estudo da diversidade diferentes tipos de caracteres podem ser utilizados, como os moleculares. Considerando que técnicas que envolvem caracteres moleculares requerem, inicialmente, a extração do DNA. O presente trabalho teve por objetivo comparar protocolos de extração DNA vegetal para Capsicum spp. Foram comparados quatro métodos de extração: P1 detergente Brometo de Cetiltrimetilamônio (CTAB), sem uso de nitrogênio líquido; P2 detergente

(2)

Kruskal-Wallis. Dentre os protocolos analisados, P3 destaca-se na obtenção de amostras íntegras e P1 na possibilidade de aquisição de grandes quantidades de DNA. O protocolo P4 é o mais indicado, por fornecer amostras em boa quantidade e qualidade.

Palavras-chave: CTAB; Dodecil Sulfato de Sódio; Pimentas. ABSTRACT

Capsicum species have wide genetic diversity and great versatility of applications. To study diversity different types of characters can be used, such as molecular ones. Considering that techniques involving molecular characters initially require DNA extraction. The present study aimed to compare protocols for plant DNA extraction for Capsicum spp. Four extraction methods were compared: P1 Cetyltrimethylammonium bromide detergent (CTAB), without using liquid nitrogen; P2 Dodecyl Sodium Sulphate (SDS) detergent, without using liquid nitrogen; P3 SDS detergent, using liquid nitrogen and P4 CTAB detergent, using liquid nitrogen. Regarding DNA concentration, there was a significant difference (p <0.05) between the methods analyzed, using the Kruskal-Wallis test. Among the protocols analyzed, P3 stands out in obtaining intact samples and P1 in the possibility of acquiring large amounts of DNA. The P4 protocol is the most suitable, as it provides samples in good quantity and quality.

Keywords: CTAB; Sodium Dodecyl Sulfate; Peppers.

1 INTRODUÇÃO

O gênero Capsicum pertence à família Solanaceae (PICKERSGILL, 1971) e possui aproximadamente 38 espécies, sendo somente seis delas consideradas domesticadas: C. annuum, C.

assamicum, C. baccatum, C. chinense, C. frutescens e C. pubescens (LEE, 2019).

As plantas pertencentes ao gênero Capsicum estão entre as olerícolas mais populares e amplamente cultivadas em todo o mundo (MAHMOUD; EL-ESLAMBOLY, 2015), destacando-se por possuir apreço no âmbito culinário (PINTO et al., 2013; MELO et al., 2014). As diferentes espécies de Capsicum spp. são também utilizadas sob a forma de condimentos, para a fabricação de medicamentos, além de serem uma rica fonte de compostos bioativos (EMBUSCADO, 2015; SHAHIDI; AMBIGAIPALAN, 2015). Além disso, são amplamente utilizadas nas indústrias farmacêutica e cosmética (CARVALHO et al., 2006) e são reconhecidas por possuírem grande variação genética dentro do gênero, sendo perceptível pela grande quantidade de espécies existentes (MOREIRA et al., 2006).

Para estudos de diversidade genética em Capsicum spp. diferentes tipos de caracteres podem ser utilizados tais como fenotípicos, agronômicos e moleculares. Alguns estudos vêm sendo feitos abordando espécies pertencentes ao gênero fazendo utilização de caracteres moleculares (CARVALHO et al., 2017; LIMA et al., 2017; JESUS et al., 2019). Tais ferramentas tornam-se viáveis por detectarem variações genéticas, independente da expressão fenotípica, diminuindo assim uma parcela do erro experimental (SILVA, 2014).

(3)

Existem três categorias de marcadores moleculares: aqueles que são baseados no processo de hibridização, os que fazem uso de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e aqueles voltados para o sequenciamento (ZOLET et al., 2017). Estudos com marcadores moleculares desenvolvidos através de PCR, em sua grande maioria, necessitam de DNA de alta qualidade e com baixo grau de impureza, uma vez que modificações nestes aspectos afetam a ação da Taq DNA polimerase (OLIVEIRA et al., 2010). Outro ponto crítico é a quantidade de DNA requerida, que variedade marcador para marcador (LEITE et al., 2008; ULHOA et al., 2014; SOUZA et al., 2011).

O procedimento de extração de DNA é requisito fundamental para obtenção de alta eficiência de amplificação em abordagens que utilizam PCR (ROMANO; BRASILEIRO, 1999). Alguns protocolos para obtenção de material genômico já foram estabelecidos, sendo os mais utilizados aqueles que contém CTAB em sua constituição (DEVI et al. 2013), sendo este detergente responsável por atuar no rompimento da membrana celular que resulta na exposição do seu material genético (ROMANO; CARNEIRO, 1998). Outro tipo de detergente que pode ser utilizado no preparo da solução tampão é o SDS, descrito por Dellaporta et al. (1983), que assim como o CTAB, desempenha a função de promover a lise da membrana celular, além de auxiliar na inibição de algumas enzimas indesejáveis. Grande parte desses protocolos fazem uso de nitrogênio líquido em suas etapas, gerando bons resultados (SILVA, 2010; SCHMITT et al. 2014, CARDOSO et al. 2019).

Nesse contexto, o presente trabalho teve por objetivo comparar protocolos de extração DNA vegetal para Capsicum spp.

2 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido na Universidade Federal do Piauí, Campus Amílcar Ferreira Sobral (UFPI – CAFS) entre os meses de janeiro e setembro de 2019, sendo os quatro genótipos cultivados em triplicata em casa de vegetação do CAFS. Foram coletados cerca de 3 a 6 folhas, mantendo-as em recipiente com gelo e encaminhando-as para o Laboratório de Ecologia, Recursos Genéticos e Evolução (LABERGE) do CAFS, onde foram realizadas as etapas de extração. As amostras foliares foram mensuradas em valores uniformes (~260 mg para métodos que utilizam nitrogênio e ~ 350 mg para métodos com maceração direta no tampão) de acordo com o método e em seguida maceradas com auxílio de almofariz e pistilo em presença e ausência de nitrogênio líquido.

Utilizou-se quatro métodos de extração, baseados em protocolos originais de Doyle e Doyle (1990) e Dellaporta et al. (1983). Foram avaliados: processo de maceração do tecido foliar vegetal (sendo direto no tampão utilizado ou com auxílio de nitrogênio líquido); e tipo de detergente presente

(4)

As folhas foram coletas no telado e levadas para o LABERGE em recipiente refrigerado tiveram seus limbos recortados e acomodados em um almofariz devidamente higienizado e refrigerado.

Posteriormente foram levadas ao banho maria (SL 155/22) a uma temperatura de 65° C por 1 hora, sendo realizada inversão dos tubos a cada 10 minutos para homogeneização. Ao final do banho maria, foram adicionados 600 μL de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) e realizada inversão por cinco minutos e posteriormente levadas a centrifuga (centrifuge 5424) por 10 minutos com configuração ajustada para 12000 RPM. Em seguida foram separadas de cada amostra 450 μL de sobrenadante, e então transferidos para microtúbulos devidamente etiquetados.

A estas amostras foram adicionados 400 μL de isopropanol gelado (-20°C) a cada microtúbulo e realizada uma inversão lenta de um minuto. As amostras permaneceram em freezer a -20° C por 1 hora, sofrendo inversões a cada 15 minutos. Após finalização do tempo estimado, as amostras foram novamente centrifugadas, agora por 15 minutos a 12000 RPM para formação do pellet.

Em seguida, descartou-se cuidadosamente o isopropanol (deixando apenas o pellet no microtúbulo), e se iniciou o processo de lavagem do DNA, que se dividiu em três etapas: a primeira e segunda foram iguais e ocorreram com a adição de 1000 µL de álcool 70%, desprendimento do

pellet do fundo do microtúbulo e então centrifugação por cinco minutos a 12000 RPM. Após as duas

lavagens com álcool 70%, repetiu-se o mesmo procedimento com álcool absoluto.

Os microtúbulos foram deixados sobre a bancada para que ocorresse a secagem do pellet em temperatura ambiente. Após 10 horas de secagem, foi realizada a resuspensão do DNA extraído com auxílio de solução composta por TE (Tris - HCl 1M e EDTA 0,5 M; pH = 8,0) e RNAse (10 μg/mL). As amostras foram então levadas ao banho maria a 37° C por 1 hora.

Das etapas que se diferenciam nos protocolos utilizados, pode-se ressaltar a maceração, que se distinguiu entre os protocolos a seguir:

Protocolo 1 (P1): maceração do tecido foliar diretamente no tampão CTAB. Foi adicionado ao almofariz com material foliar 700 µL de tampão (CTAB) 2%, e em seguida realizado o rompimento de sua parede celular através de maceração mecânica manual com auxílio do pistilo. Posteriormente foram adicionados em microtúbulos com volume de 1,5 mL, um valor de 350 mg do material resultante da maceração. Após mensuração de todas amostras foram adicionados mais 150 µL do tampão pré-aquecido e contendo 1 µL de β-mercaptoetanol para cada microtúbulo.

Protocolo 2 (P2): maceração do tecido foliar diretamente no tampão SDS. Possui o mesmo procedimento de P1, exceto pelo uso do SDS na composição do tampão.

Protocolo 3 (P3): maceração do tecido foliar utilizando nitrogênio líquido e tampão SDS 20%. Adicionou-se nitrogênio líquido ao almofariz com as amostras e então realizou-se o rompimento da parede celular através da maceração mecânica manual com auxílio do pistilo. Após maceração, foram

(5)

adicionados aos microtúbulos (1,5 mL) 260 mg de massa foliar, e então adicionadas as mesmas 700 µL de tampão SDS 20% juntamente com 1 µL de β-mercaptoetanol para cada indivíduo diferente em cada microtúbulo.

Protocolo 4 (P4): maceração do tecido foliar utilizando nitrogênio líquido e tampão CTAB 2%. Possui o mesmo procedimento de P3, exceto pelo uso do CTAB na composição do tampão utilizado. As etapas de quantificação e análise de integridade ocorreram no Campus Ministro Petrônio Portela da UFPI, nos laboratórios do Núcleo Integrado de Morfologia e Pesquisas com Células-Tronco (NUPCELT) e no Laboratório de Fitopatologia, respectivamente. A quantificação foi realizada em NanoDrop® ND-2000 (Manual NanoDrop ND-2000).

A análise da integridade das amostras foi realizada por meio eletroforese com gel de agarose a 1% com adição de 5µL de brometo de etídio. Os géis foram preparados com tampão TBE 0,5 X.

Foram adicionadas a cada poço do gel um mix contendo 4 µL de água mili-q, 3 µL de corante azul de bromotimol e 3 µL de DNA. O resultado da corrida foi visualizado com auxílio de luz ultravioleta e fotografada através de máquina fotográfica L.Pix.

Foram utilizados os testes Kruskal – Wallis, a nível de significância de 5%, seguido do teste de Dunn. As análises estatísticas foram realizadas no programa R (R Development Core Team, 2019).

3 RESULTADO E DISCUSSÃO

No que se refere a integridade do DNA os métodos P1 e P2 não se mostraram eficientes, apresentando material genético com arrasto vertical no gel (Figura 1), indicando contaminação causado por DNAses ou mesmo por quebra mecânica do material durante a extração (ROMANO; BRASILEIRO, 1999).

(6)

Figura 1: Amostras extraídas sem auxílio de Nitrogênio líquido. Protocolo 1: maceração direto no tampão CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio) 2%; Protocolo 2: maceração direto no tampão SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) 20%.

A contaminação presente em P1 e P2 é decorrente da oxidação dos compostos fenólicos e outros tipos de compostos secundários presentes nas espécies do gênero Capsicum. Vale ressaltar que muitos membros da família Sonalaceae apresentam esses compostos, tal como a espécie Solanum

ferrugineum, descrita por Medrano et al. (2017) como uma grande portadora de compostos

secundários como ácidos fenólicos e flavonoides. A presença desses compostos dificulta a extração de um DNA de boa qualidade para posteriores estudos com amplificação de PCR (BRESSAN et al., 2014, RAIMUNDO et al., 2018).

A prevalência aparente de P1 em relação a P2 no que se refere a quantidade de DNA obtida é decorrente do tampão utilizado, uma vez que em trabalhos como o de Ostrowska (1998), é relatada a superioridade do detergente CTAB em relação ao SDS no momento da extração. Conforme o referido autor, enquanto o CTAB auxilia tanto na lise celular quanto na precipitação do material genético a ser extraído, o SDS realiza apenas a quebra da membrana celular. No entanto, estudos como o de Jhala (2015) apontam o detergente SDS como um forte inibidor de contaminantes quando em conjunto com outros reagentes como o Triton X-100, tornando-o uma possibilidade a ser analisada, haja vista que não são necessárias grandes quantidades de DNA para estudos moleculares.

(7)

Em relação aos métodos P3 e P4 é perceptível uma maior qualidade do DNA em ambos, com pouca incidência de arrasto (Figura 2). Os resultados obtidos por tais protocolos mostraram-se equivalentes. Assim, mesmo sendo os detergentes diferentes, o uso de nitrogênio torna o processo mais equitativo.

Figura 2: Amostras extraídas com maceração utilizando Nitrogênio líquido. Protocolo 3: maceração com nitrogênio líquido e tampão SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) 20%; Protocolo 4: maceração com nitrogênio líquido e tampão CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio) 2%.

Tanto P3 quanto P4 apresentaram bandas com arrastos verticais. Tais resultados são decorrentes da fragmentação do DNA, que de acordo com Romano & Brasileiro (1999) pode ser oriunda de contaminação ou decorrente de quebras mecânicas. Todavia, com P3 podem ser visualizadas bandas mais densas e menos nítidas que as geradas com P4, que embora tenha exibido bandas mais visíveis, foi evidente também a formação de aglomerados do material nas proximidades dos poços, uma possível consequência de contaminação por proteínas (ROMANO; BRASILEIRO, 1999).

Ressaltamos que o uso de nitrogênio líquido é sem dúvida um grande diferencial no processo de extração, uma vez que P3 e P4 mostraram bandas mais nítidas e com pouca incidência de contaminação quando comparados com P1 e P2 (Figura 3).

(8)

Figura 3: Géis de agarose resultantes das extrações utilizando os quatro tipos de protocolo. Protocolo 1: maceração direto no tampão CTAB (Dodecil Sulfato de Sódio) 2%; Protocolo 2: maceração direto no tampão SDS (Brometo de Cetiltrimetilamônio) 20%; Protocolo 3: maceração com nitrogênio líquido e tampão SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) 20%; Protocolo 4: maceração com nitrogênio líquido e tampão CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio) 2%.

O nitrogênio líquido é um forte contribuinte para a obtenção de amostras íntegras de DNA e em boa quantidade, acelerando a etapa de maceração, o que diminui o tempo de exposição das folhas a compostos fenólicos e evita degradação do material genético (DALBOSCO et al., 2015). A utilização dessa substância nas etapas de extração de DNA vegetal é uma prática que surgiu nas últimas décadas e vem sendo bastante utilizado pelos pesquisadores (KOTCHONI; GACHOMO, 2009). Isso ocorre principalmente pela facilidade e segurança gerada no momento da quebra mecânica da parede celular das células vegetais.

Ao serem analisados os protocolos que utilizam o mesmo detergente na presença e ausência do nitrogênio líquido, foi notória a diferença na integridade das amostras geradas. O método mais indicado dentre os quatro utilizados é o P3, uma vez que dentre aqueles estudados, este foi o que apresentou DNA mais íntegro ao ser analisado em gel de agarose.

Houve diferença entre valores médios de concentração de DNA para os métodos de extração utilizados (Tabela 1; Figura 4), e também para as razões de absorbâncias (A260/280 e A260/230), que frequentemente são utilizados como indicadores de contaminação das amostras contra Polissacarídeos e RNA (VARNA et al. 2007).

Tabela 1: Valores médios de DNA e absorbância (260/280), (260/230) para os genótipos em cada protocolo e para os protocolos, mensurados via NanoDrop ND-2000.

Média de DNA por genótipo Média 260/280 por genótipo Média 260/230 por genótipo Média de DNA por método Média 260/280 por método Média 260/230 por método P1 A1 2999,4 1,93 2,0 3137,5 1,91 1,70 B1 6630,7 1,98 2,1

(9)

C1 699,8 1,87 1,0 D1 2220,3 1,86 1,7 P2 A2 1099,4 1,94 1,1 1249,9 1,97 1,17 B2 1975,8 1,90 2,0 C2 702,0 2,03 0,8 D2 1222,5 2,02 0,8 P3 A3 1141,0 2,07 1,5 910,1 1,97 1,76 B3 1349,2 1,97 2,0 C3 564,1 1,90 1,9 D3 586,0 1,92 1,7 P4 A4 1838,9 1,93 2,0 1200,4 1,86 1,95 B4 1930,9 1,95 2,2 C4 482,8 1,72 1,6 D4 549,1 1,86 2,0

P1 e P2 foram os dois mais eficientes no que se refere a quantidade de DNA extraído. Tais protocolos possuem a ausência de nitrogênio líquido em comum e o fato de terem se sobressaído sobre os demais pode ser decorrente do maior volume que se é colocado das amostras nos microtúbulos no momento da maceração, uma vez que estas são adicionadas juntamente com o tampão.

Todavia, dentre os protocolos que fazem uso de nitrogênio líquido, P4 apresentou amostras mais concentradas em DNA. Dessa forma, é perceptível que o detergente CTAB de modo geral é superior ao SDS no que tange à concentração de DNA. Paul (2019), encontrou resultados semelhantes ao analisar protocolos de extração em tomateiros e pimenteiras, no qual o CTAB sobressaiu-se em quantidade de material genético obtido.

(10)

Figura 4: Boxplot dos valores mínimos, máximos e mediana relacionados à quantidade de DNA extraído com quatro protocolos de extração diferentes. P1) Direto do CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio); P2). Direto no SDS (Dodecil Sulfato de Sódio); P3) Nitrogênio com SDS (Dodecil Sulfato de Sódio); P4) Nitrogênio com CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio).

Quanto aos protocolos utilizados é possível a observação da variação existente entre a quantificação de DNA de cada método quando analisados ao teste de Kruskal Wallis. É perceptível também que o teste concorda com os valores tabelados, onde P1 é nitidamente superior em quantidade de DNA quando comparado aos demais.

Os protocolos que utilizam CTAB em sua composição (P1 e P4) obtiveram maior quantidade de DNA. Tal resultado corrobora com o estudo de Cardoso (2007), onde foi constatado que a utilização de detergente CTAB a 2% mostra-se superior a tratamentos como o de SDS no que se refere à quantidade de DNA.

Foi possível observar diferenças estatisticamente significativas entre os métodos P1 e P3, bem como entre P1 e P4 (Tabela 2). Entre P1 e P3 é nítido a diferença entre quantidade de DNA, o que pode ser explicada pela distinção entre os detergentes empregados e presença de nitrogênio líquido. Já entre P1 e P4 (ambos com CTAB) a diferença significativa pode ser decorrente da superioridade em quantidade de DNA de P1.

(11)

Tabela 2: Comparação entre os protocolos de extração a 5% de significância em relação a quantificação de DNA obtido através de NanoDrop (ND-2000). P1) Direto do CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio); P2). Direto no SDS (Dodecil Sulfato de Sódio); P3) Nitrogênio com SDS (Dodecil Sulfato de Sódio); P4) Nitrogênio com CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio).

Protocolos / Protocolos p-valor

P1 – P2 0,1327 P1 – P3 0,0317 P1 – P4 0,0374 P2 – P3 0,2289 P2 – P4 0,2520 P3 – P4 0,4704

Tais resultados estão de acordo com os trabalhos de Li et al. (2013), onde os protocolos estudados que não faziam uso de nitrogênio líquido alcançaram melhores resultados para quantificação. Dentre os protocolos testados neste trabalho, P1 é o mais indicado para se obter grandes concentrações de DNA.

P1 e P4 foram eficientes no que diz respeito a obtenção de amostras livres de contaminação de proteínas, uma vez que o valor da absorbância de (A260/280) destes métodos estão entre a faixa tida como ótima, conforme Arruda (2017) (1,8 – 2,0).

Todos os métodos apresentaram valores muito abaixo dos obtidos por Arruda (2017) para absorbância A260/230 (2,0 – 2,2). Esses índices mostram que os protocolos são ineficientes no que diz respeito a purificação das amostras em relação a RNAs, o que explica a concentração de material no final do gel ao término da corrida. Entretanto, os métodos não devem ser desconsiderados de antemão, fazendo-se necessário estudos posteriores otimizando a etapa de resuspensão do DNA, visto que é nela que se adiciona a RNAse.

A identificação de qual protocolo é o mais eficiente para extração de espécies do gênero

Capsicum e se há diferença na extração com ou sem nitrogênio líquido, é de fundamental importância

para desenvolvimento de pesquisas futuras, uma vez que possibilita alternativas para estudo de ácidos nucleicos em laboratórios sem grande quantidade de equipamentos ou reagentes.

Entretanto, futuros trabalhos devem ser feitos com resultados destes protocolos utilizando PCR, haja vista que todos os métodos obtiveram quantidades de DNA suficientes para estudos com

(12)

4 CONCLUSÕES

Todos os protocolos testados neste trabalho mostraram-se eficientes no que diz respeito à quantidade de DNA obtido. O método P4 destaca-se por alcançar amostras em grande quantidade e com formação de bandas com qualidade.

A adição de nitrogênio líquido nas etapas de extração influencia no aumento de DNA extraído, e contribui para maior integridade das amostras quando analisadas.

A utilização de CTAB foi mais eficiente para obtenção de maior quantidade de DNA, enquanto SDS obteve melhores resultados na integridade do DNA com e sem nitrogênio líquido.

AGRADECIMENTOS

A Universidade Federal do Piauí pelo apoio e auxilio no desenvolvimento das pesquisas, ao Colégio Técnico de Floriano por ceder material para o plantio do experimento e ao Núcleo Integrado de Morfologia e Pesquisas com Células-Tronco por ter cedido o espaço e os equipamento para obtenção de parte dos resultados deste trabalho.

REFERÊNCIAS

ARRIEL, N.H.C., UNÊDA-TREVISOLI, S. H., CAPELOTO, A., MAURO, S. M. Z.; MAURO, A. O. Comparative analysis of four genomic DNA extraction protocols in sesame. Revista Brasileira

de Oleaginosas e Fibrosas, v.6, n. 2, p.525-535, 2002.

ARRUDA, S. R.; PEREIRA, D. G.; CASTRO, S. M. M.; BRITO, M. G.; WALDSCHMIDT, A. M. Na optimized protocol for DNA extraction in plants with a high content of secondary metabolites, based on leaves of Mimosa tenuiflora (Willd). Genetics and Molecular Research, Ribeirão Preto – SP, v. 16, n. 3, p. XX, 2017. https:// doi.org/10.4238/gmr16039063

BRESSAN, E. A.; ROSSI, M. L.; GERALD, L. T. S.; FIGUEIRA, A. Extraction of high-quality DNA from ethanol-preserved tropical plant tissues. BMC Research Notes, v. 7, p. 268 – 272, 2014. https://doi.org/10.1186/1756-0500-7-268

CARDOSO, E. S.; LIMA, J. S.; FARIAS, C. B. M.; DARDENGO, J. F. E.; ROSSI, A. A. B. DNA de Solenidium lunatum (Lindl.) Kraenzl (Orchidaceae). Revista Verde, Pombal – PB, v. 14, n. 2, p. 246 – 251, 2019. https:// doi.org/10.18378/rvads.v14i2.6072

(13)

CARDOSO, R. D. L. Caracterização morfológica e citológica de gérbera: Subsídio para o

melhoramento genético. Passo Fundo: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da UPF,

Passo fundo – RS, p.189., 2007.

CARVALHO, S. I. C.; BIANCHETTI, L. B.; RIBEIRO, C. S. C.; LOPES, C. A. Pimentas do

Gênero Capsicum no Brasil. Embrapa Hortaliças, Brasília – DF, ISBN 1415-2312, 2006.

CARVALHO, S. L. C.; BIACHENTTI, L. B.; RAGASSI, C. F.; RIBEIRO, C. S. C.; REIFSCHNEIDER, F. J. B.; BUSO, G. S. C.; FALEIRO, F. G. Genetic variability of a Brazilian

Capsicum frutescens germplasm collection using morphological characteristics and SSR markers. Genetics and Molecular Research, Ribeirão Preto – SP, v. 16, n. 3, p. 1 – 18, 2017.

https://doi.org/10.4238/gmr16039689

DALBOSCO, E. Z.; SILVA, C. G.; MELHORANÇA, E. A. L.; MIRANDA, A. F.; SILVA, C. A. Otimização de protocolo para extração de DNA Genômico de Epidendrum viviparum Lindl (Orchidaceae). Enciclopédia Biosfera, Centro Científico Conhecer, Goiânia – GO, v. 11, n. 21, p. 3236 - 3248 2015.

DELLAPORTA, S.L.; WOOD, J.; HICKS. J. B. A plant DNA minipreparation: version II. Plant

Molecular Biology Report. v. 1, n. 4, p. 19 – 20, 1983. https://doi.org/10.1007/BF02712670

DEVI, K. D.; PUNYARANI, K.; SINGH, N. S.; DEVI, H. S. An efficient protocol for total DNA extraction from the members of order Zingiberales – suitable for diverse PCR based downstream applications. Springer Plus, v. 2, n. 1, p. 669 - 676, 2013. https://doi.org/10.1186/2193-1801-2-669

DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolaton of plant DNA from fresh tssue. Focus, v.12, n. 1, p. 13-15, 1990.

EMBUSCADO, M. E.; J. Spices and herbs: Natural sources of antioxidants – a mini review. Journal

of Functional Foods, v. 18, p. 811, 2015. https://doi.org/10.1016/j.jff.2015.03.005

JESUS, R.; SANTOS, G. N.; PICCIN, A. S.; BALSALOBRE, T. W. A.; SALA, F. C.; CARNEIRO, M. S. Characterization of pepper accessions using molecular markers linked to pungency and SSR.

Horticultura brasileira, Recife – PE, v.37, n. 2, p. 152 – 160, 2019.

https://doi.org/10.1590/s0102-053620190205

JHALA V. M.; MANDALIYA V.B.; THAKER V. Simple and efcient protocol for RNA and DNA extraction from rice (Oryza sativa L.) for downstream applications. International Research Journal

(14)

KOTCHONI, S.O.; GACHOMO, E.W. A rapid and hazardous reagent free protocol for genomic DNA extraction suitable for genetic studies in plants. Molecular Biology Reports, Camden – USA, v. 36, n. 6, p. 1633 – 1636, 2009. https://doi.org/ 10.1007/s11033-008-9362-9

LEE, J. Development and Evolution of Molecular Markers and Genetic Maps in Capsicum Species.

Biochemistry and Cell Biology of Ageing, Basileia – Suíça, v. 5, p. 85 – 103, 2019. https://doi.org/

10.1007/978-3-319-97217-6_5

LEITE, D. L.; ANTHONISEN, D.; BARBIERI, R. L. Caracterização da variabilidade genética de

populações locais de pimenta dedo-de-moça, utilizando marcadores RAPD. Embrapa Clima

Temperado, Pelotas – RS, 2008.

LI, H.; LI, J.; CONG, X. H.; DUAN, Y. B.; LI, L.; WEI, P. C.; LU, X. Z.; YANG, J. B. A high-throghput, higth-quality plant genomic DNA extraction protocol. Genetics and Molecular

Research, Ribeirão Preto – SP, v.12, n. 4, p. 4526 – 4539, 2013. http://dx.doi.org/10.4238/2013.October.15.1

LIMA, M. F.; CARVALHO, S. L. C.; RAGASSI, C. F.; BIACHENTTI, L. B.; FALEIRO, F. G.; REIFSCHNEIDER, F. J. B. Characterization of a pepper collection (Capsicum frutescens L.) from Brazil. Genetics and Molecular Research, Ribeirão Preto – SP, v. 16, n. 3, p. 1 – 18, 2017. https://doi.org/10.4238/gmr16039704

MAHMOUD, A. M. A., El-ESLAMBOLY, A. S. A. Production and Evaluation of High Yielding Sweet Pepper Hybrids under Greenhouse Conditions. American Eurasian Journal of Agricultural

e Environmental Sciences, v. 15, n. 4, p. 573 – 580, 2015.

MEDRANO, J. R. M.; QUIÑONES, M. D. M.; BANUET, J. I. V.; SÁNCHEZ, M. V.; BERNAL, D. A.; LUNA, E. V. Determination and quantification of phenolic compounds in methanolic extracts of Solanum ferrugineum (Solanaceae) fruits by HPLC-DAD and HPLC-ESI – MS/TOF. Journal of

Liquid Chromatography & Related Techologies, Londres – Inglaterra, v. 40, n. 17, p. 900 – 906,

2017. https://doi.org/10.1080/10826076.2017.1382376

MELO, A. M. T.; NASCIMENTO, W. M.; FREITAS, R. A. Produção de Sementes de Pimenta. In: NASCIMENTO, W. N. (Ed.). Produção de Sementes de Hortaliças. Embrapa, Brasília – DF, 2014. https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CNPH-2009/30295/1/ct_35.pdf

MOREIRA, G. R.; CALIMAN, F. R. B.; SILVA, D. J. H.; RIBEIRO, C. S. Espécies e variedades de pimenta. Informe Agropecuário, Belo Horizonte – MG, v. 27, n. 235, p. 16 – 29, 2006.

(15)

OLIVEIRA, L. V. R.; FARIA, R. T.; RUAS, C. F.; RUAS, P. M.; SANTOS, M. O.; CARVALHO, V. P. Genetic Analysis of Species in the Genus Catasetum (Orchidaceae) using RAPD Markers.

Brazilian Archives of Biology and Technology, Curitiba – PR, v.53, n. 2, p.375 – 387, 2010.

https://doi.org/10.1590/S1516-89132010000200017

OSTROWSKA, E.; MURALITHARAN, M.; CHANDLER, S.; VOLKER, P.; HETHERINGTON, S.; DUNSHEA, F. Optimizing conditions for DNA isolation from Pinus Radiata. In Vitro Cellular

& Developmental Biology – Plant, Londres – Inglaterra, v. 34, n. 2, p. 108 – 111, 1998.

https://doi/org/10.1007/BF02822773

PAUL, R.; SAVILLE, A. C.; HANSEL, J. C.; YE, Y.; BALL, C.; WILLIAMS, A.; CHANG, X.; CHEN, G.; GU, Z.; RISTAINO, J. B.; WEI, Q. Extraction of Plant DNA by Microneedle Patch for Rapid Detection of Plant Diseases, ACS Nano, Washington – USA, v. 13, n. 6, p. 6540 – 6549, 2019. https://doi.org/10.1021/acsnano.9b00193

PICKERSGILL, B. Relationship between weedy and cultivated forms in some species of chilli peppers (Genus Capsicum). Evolution, Basileia – Suíça, v. 25, n. 4, p. 683 – 691, 1971. https://doi.org/10.2307/2406949

PINTO, C. M. F; PINTO, C. L. O; DONZELES, S. M. L. Pimenta Capsicum: propriedades

químicas, nutricionais, farmacológicas e medicinais e seu potencial para o agronegócio. v.3,

p.108 – 120, dez. 2013. https://doi.org/10.22533/at.ed.25919090816

R CORE TEAM. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2019.

RAIMUNDO, J.; REIS, C. M. G.; RIBEIRO, M. M. Rapid, simple and potentially universal method for DNA extracrtion from Opuntia spp. fresh cladode tissues suitable for PCR amplification.

Molecular Biology Reports, Camden – USA, v. 45, n. 5, p. 1405 – 1412, 2018.

https://doi.org/10.1007/s11033-018-4303-8

ROMANO, E. Extração de DNA de tecidos vegetais. In: BRASILEIRO, A. C. M.; ROMANO, E.; BRASILEIRO, A.C.M. Extração de DNA de plantas. Biotecnologia, v.2, p.40-43, 1999.

ROMANO, E. Extração de DNA de tecidos vegetais. In: BRASILEIRO, A. C. M.; CARNEIRO, V. T. C. ed. Manual de transformação genética de plantas. EmbrapaSPI/Embrapa- CENARGEN, p.163-177, 1998.

(16)

SCHMITT, K. F. M.; SILVA, B. M.; ROSSI, A. A. B.; SANDER, N.; SILVA, C. J. Estabelecimento e otimização de protocolo para extração e Amplificação de DNA em tecido foliar de Curcuma longa L. Centro Científico Conhecer, Goiânia – GO, v.10, n. 18, p. 1560, 2014.

SHAHIDI, F.; AMBIGAIPALAN, P.; J. Funct. Journal of Functional Foods, v. 18, p. 820, 2015. http://www.conhecer.org.br/enciclop/2014a/AGRARIAS/estabelecimento.pdf

SILVA, M. N. Extração de DNA genômico de tecidos foliares maduros de espécies nativas do cerrado. Revista Árvore, Viçosa – MG, v.34, n. 6, p.973-978, 2010.

SILVA, E. H. Variabilidade genética e fisiológica de populações de Meloidogyne incognita e

identificação de QTLs de uma nova fonte de resistência do algodoeiro (Gossypium spp.) a esse nematoide. Tese (Doutorado em Fitopatologia) Universidade de Brasília, Brasília- DF 162p., 2014.

https://doi.org/10.1590/S0100-67622010000600002

SOUZA, I.G. B. Caracterização morfológica e molecular do bacurizeiro (Plantonia insignis

Mart.). 2011. 110 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento). Teresina, Universidade

Federal do Piauí, 2011.

ULHOA, A. B.; PEREIRA, T. N.; SILVA, R. N.; RAGASSI, C. F.; RODRIGUES, R.; PEREIRA, M. G.; REIFSHNEIDER, J. B. Caracterização molecular de linhagens de pimenta do tipo Jalapeño amarelo. Horticultura Brasileira, Recife – PE, v. 32, n. 1, p. 35-40, 2014. https://doi.org/10.1590/S0102-05362014000100006

VARNA, A.; PADH, H.; SHRIVASTAVA, N. Plant Genomic DNA Isolation: An Art or a Science.

Biotechnol, v. 2, n. 3, p. 386 – 392, 2007. https://doi/org/10.1002/biot.200600195

ZOLET, A. C. T.; TURCHETTO, C.; ZANELLA, C. M.; PASSAIA, G. Marcadores Moleculares

Imagem

Figura 1: Amostras extraídas sem auxílio de Nitrogênio líquido. Protocolo 1: maceração direto no  tampão CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio) 2%; Protocolo 2: maceração direto no tampão SDS  (Dodecil Sulfato de Sódio) 20%
Figura 2: Amostras extraídas com maceração utilizando Nitrogênio líquido. Protocolo 3: maceração com  nitrogênio líquido e tampão SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) 20%; Protocolo 4: maceração com nitrogênio  líquido e tampão CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamôn
Figura 3: Géis de agarose resultantes das extrações utilizando os quatro tipos de protocolo
Figura 4: Boxplot dos valores mínimos, máximos e mediana relacionados à quantidade de DNA extraído  com quatro protocolos de extração diferentes
+2

Referências

Documentos relacionados

It is possible to conclude that the exposure to cigarette smoke promoted heavy metal contamination both in surface and in depth, the smoke exposure increased the

Based on field observations and the literature (Zurita et al., 2006; Volpato et al., 2010), we classified species into three groups according to their forest dependence: (1)

• No haga funcionar este equipo si está dañado, presenta cambios en su patrón de trabajo, tiene daños en cables y conductores de electricidad (cable roto, agrietado, pelado, etc.)

Para obter informações sobre como mudar o local padrão do repositório de conteúdo em um servidor Windows, consulte “ Content Repository ” (Repositório de conteúdo) na

(2) Atualmente, você está fazendo uso de medicamento prescrito por médico para pressão alta (hipertensão arterial)? Dessa forma, não estariam contemplados os

Proteínas Cry1A.105 e Cry2Ab2, proteína 5- enolpiruvil-chiquimato-3- fosfato sintase (CP4 EPSPS), _ Milho geneticamente modificado resistente a insetos, evento MON 89034