UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
SIMONI HELENA AVANSINI
ESTUDOS MOLECULARES NAS DISPLASIAS CORTICAIS FOCAIS
MOLECULAR STUDIES IN FOCAL CORTICAL DYSPLASIAS
CAMPINAS 2017
SIMONI HELENA AVANSINI
ESTUDOS MOLECULARES NAS DISPLASIAS CORTICAIS FOCAIS
MOLECULAR STUDIES IN FOCAL CORTICAL DYSPLASIAS
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências
Doctorate thesis presented to the School of Medical Sciences of the University of Campinas to obtain the Ph.D. grade in Sciences
ORIENTADOR: PROFA. DRA. ISCIA TERESINHA LOPES CENDES COORIENTADORES: PROF. DR. ANDRÉ SCHWAMBACH VIEIRA PROF. DR. FÁBIO ROSSI TORRES
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA SIMONI HELENA AVANSINI, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. ISCIA TERESINHA LOPES CENDES.
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
SIMONI HELENA AVANSINI
ORIENTADOR: ISCIA TERESINHA LOPES CENDES
COORIENTADORES: ANDRÉ SCHWAMBACH VIEIRA E FÁBIO ROSSI TORRES
MEMBROS:
1. PROF(A). DR.(A) ISCIA TERESINHA LOPES CENDES
2. PROF(A). DR.(A) JADERSON COSTA DA COSTA
3. PROF(A). DR.(A) ANDRÉ LUIS FERNANDES PALMINI
4. PROF(A). DR.(A) MONICA BARBOSA DE MELO
5. PROF(A). DR.(A) MARCONDES CAVALCANTE FRANCA JUNIOR
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
(...) Nada do que fazia antes representava um vínculo de dedicação plena, uma relação intensamente pessoal com o trabalho. Cumpria com o devido zelo o que me competia, mas não havia entrega. Meu envolvimento com o ensino e os estudos literários era antes profissional que passional. Foi só depois do tumor que vim a saber por experiência própria o que significa ser arrebatado por uma genuína paixão intelectual – o que é despertar para um enigma que nos obceca e diz agudo respeito, o que significa embrenhar-se por um ramo do saber, munido de sete estômagos famintos e insaciáveis no cérebro, à caça de pistas e respostas, chaves secretas e explicações, o que é fazer da aventura do conhecimento uma devoção e um destino. ” (In: Eduardo Giannetti, A Ilusão da alma: biografia de uma ideia fixa)
Dedico esse trabalho ao meu irmão Roni e a todos os nossos pacientes, que tiveram e tem suas vidas marcadas pela
AGRADECIMENTOS
Chegar até aqui não foi fácil, mas o caminho se fez mais pavimentado, a caminhada mais leve e alegre com a ajuda de MUITA gente, como sou grata por tudo isso!
A todos os pacientes e familiares, por acreditarem (e acreditam) tanto nosso trabalho e por toda a esperança depositada!
À minha família, que todo esse tempo tem me apoiado: aos meus pais, que com muita paciência tem entendido as minhas ausências e o meu mau humor. Ao meu irmão Edson, por tanto carinho, pelas broncas e por ter me dado as maiores alegrias da minha vida: Miguelito (meu little Japa) e Murilo (meu branquinho) e a minha cunhada Renata.
À Profa. Iscia por acreditar no meu trabalho e por fé nas minhas ideias!
Aos meus pais científicos, Fábio e André, pela paciência todos esses anos, por TODO suporte (e olha que não importunei pouco: sábado, domingo, feriado, dia ou noite). É bem verdade que fui uma filha rebelde e que minha teimosia sempre falou mais alto! Talvez essas palavras não alcancem a intensidade dos meus sentimentos, mas minha gratidão é grande (por demais!). A Dany, por todo acolhimento, carinho e incentivo!
Às técnicas: Marilza pelas nossas conversas matinais e todo seu apoio e carinho. Luciana, por todo acolhimento e palavras certas (“Todos nós nascemos pra sermos felizes”). Paty Aline, que aos poucos foi chegando e trazendo a paz, o colo (ah esse vester blot!) e pelos incentivos (“Deus cuida!”). A inoxidável Madá, quanto carinho vem de você!
A todos os amigos do laboratório de Genética Molecular, de Citogenética e do LabZeb: Patrícia, Fernando, Beatriz, Mariana, Marina, Zé-bola, Alexandre, Tânia, Ilária, Tisgo, Karina, Tati, Cynthia, Marcella, Amanda Donatti, Amanda do Canto, Camila, Laiara, Ana, Miriam, Jair, Marília, Ste, Roby Will, Lu, Helena, Vanessa, Mirian, Maria, João Pedro, Marieli, Juliane e tantos que sempre com um sorriso, um gesto de generosidade fizeram meu caminho mais perfumado!
Ao pessoal da bioinformática e da bioestatística, meu pai adotivo Secolin, ao Benilton que com toda a paciência desse mundo me ajudou com as análises, pelas nossas conversas e por todo incentivo, ao Murilo (me desculpe por importuná-lo tanto!), Wellington, Cris e Elisabete. Ao Depto de Genética Médica: às secretárias Claudinha e Ro, sem palavras para agradecer por tudo o que já fizeram (até o que não podiam) por mim! Ao Caio, Profa. Carmem, Profa. Cláudia, Prof. Carlos, Profa. Vera, Profa. Denise, Prof. Társis, à Joana e todos os residentes. Ao Departamento de Neurologia: Prof. Fernando, Profa. Marilisa, Prof. Marcondes, Carol, Clarissa, Marcinha, André, Tátila, Denise, Renata, Lu, Marina, Lucilene, Solaine, D. Cida, Gi, Soninha, e a todos os residentes e secretárias do ambulatório. Prof. Enrico, Prof. Helder e em especial minha gratidão e respeito à Profa. Anamarli, que sem saber, inspirou-me nesta trajetória cientifica!
Aos amigos e funcionários do Departamento de Anatomia Patológica, por me permitirem fazer parte dessa família! Ao Prof. Luciano, por quem tem um carinho e admiração enormes; ao Fábio Rogério, meu parceiro e “ponta-firme” pra todas as horas! Lu, pelos conselhos, Claudinha, Ana, Arethusa, Felipe, D. Rita, Ana Paula, Mayara, Vivi, Verinha, Mari, Fábio e todos os residentes.
Ao pessoal do Áudio Visual da FCM: Mercedes, que com tanto carinho e paciência me ajudou e tem me ajudado com as figuras, pôsteres. “Seo” Mário, Oscar, Leo, Rafa, Fran, Marcelo e Péricles.
Aos amigos que fiz na Universidade da Califórnia (UCSD), Prof. Alysson Muotri, por todo acolhimento e carinho! Á Isa, Lila e Sara minha enorme gratidão por todo conhecimento compartilhado.
Aos meus amigos de todas as horas, por todo suporte emocional nos momentos mais tensos: Claudia, Bete, Marquinho, Vó João, Vó Antônia, Rita, Gi, Cidinha, Rô, Moniquinha, Marlene, Tati, Dany, Roque, D. Maria, “Seo” Geraldo, Tici e D. Beatriz.
À Gisa, que com suas sábias palavras sempre me fez acreditar no meu potencial!
A todos os amigos e a família que construí na Universidade Federal de São Carlos – Profas. Sandra, Silvana e Lucinha.
Ao Laboratório da Profa. Sarita e do Prof. Mário Saad.
A CAPES, The Company of Biologists e INTERNATIONAL BRAIN RESEARCH ORGANIZATION (IBRO) pela concessão das bolsas de estudos.
RESUMO
As displasias corticais focais (DCFs) são uma importante causa de epilepsia refratária às drogas antiepilépticas e nossos objetivos neste trabalho foram ajudar a elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na DCF tipo II e, identificar e validar biomarcadores não invasivos para serem utilizados no diagnóstico desta malformação cortical, usando para essas duas abordagens os microRNAs. Foi utilizado o tecido cerebral de pacientes com DCF tipo II submetidos à cirurgia para controles das crises epilépticas e tecido cerebral de indivíduos controles; além de plasma sanguíneo desses mesmos pacientes e de pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial, bem como de indivíduos normais. Foram utilizadas as seguintes técnicas neste trabalho: microarranjos de microRNAs, PCR quantitativa, hibridização in situ, ensaios de gene repórter e sequenciamento de nova geração. Identificamos três microRNAs, let-7f, miR-31 e hsa-miR-34a, com a expressão diminuída nos tecidos dos pacientes. Em contrapartida, observamos um aumento da expressão de um fator de transcrição envolvido na diferenciação neuroglial, NEUROG2. Também encontramos o gene RND2, um alvo de NEUROG2, com a expressão aumentada, e sabe-se que tem um papel fundamental na migração radial dos neurônios corticais. Experimentos in vitro mostraram que NEUROG2 é regulado na região 5’ não traduzida por hsa-miR-34a. Além disso, foi observada uma forte expressão nuclear de NEUROG2 em células aberrantes presentes neste subtipo da DCF. Juntos, esses achados indicam que provavelmente há uma falha na regulação pós-transcricional da expressão de NEUROG2 e que isso tem uma repercussão em cadeia, levando a falhas tanto no processo de diferenciação neuroglial como de migração neuronal na DCF tipo II, o que pode explicar a presença de células aberrantes e a epileptogênese nesta malformação cortical. Outro achado importante, em nosso estudo, consistiu da identificação do hsa-miR-134 como potencial
biomarcador não invasivo para ajudar no diagnóstico de pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial. Este microRNA circulante no plasma sanguíneo é capaz de discriminar o grupo de pacientes do grupo de controles com uma área sob a curva (AUC) de 0.75, independentemente da sua resposta ao tratamento medicamentoso ou à presença de sinais de esclerose hipocampal nos achados de ressonância magnética. Com isso, por meio dos microRNAs, foi possível sugerir um mecanismo molecular envolvido na DCF tipo II, bem como identificar um microRNA circulante com potencial uso no diagnóstico de epilepsia do lobo temporal.
Palavras-chaves: Malformações do Desenvolvimento Cortical, epilepsia, microRNAs,
ABSTRACT
Focal cortical dysplasias (FCDs) are an important cause of drug-resistant epilepsy and our goals were to help elucidate the molecular mechanisms involved in FCD type II and to identify and validate reliable non-invasive biomarkers to be used in diagnosis of epilepsy related with this cortical malformation, using for these two approaches microRNAs as a molecular tool. We used brain tissue from patients with FCD type II and normal controls, besides blood plasma was used from patients with FCD type II, patients with mesial temporal lobe epilepsy (MTLE), as well as controls individuals. Microarrays of microRNAs, quantitative PCR, in situ hybridization, luciferase reporter assays and exome sequencing were performed to validate and further explore our data. We identified hsa-let-7f, hsa-miR-31 and hsa-miR34a were downregulated in tissue from FCD type II, whereas a transcription factor involved in neuronal and glial fate specification, NEUROG2, was found upregulated. We also found RND2 gene, a NEUROG2-target, upregulated, which has a key role in radial migration of cortical neurons. In vitro experiments showed that hsa-miR-34a downregulates NEUROG2 by binding to its 5'-untranslated region. Moreover, we observed strong nuclear expression of NEUROG2 in aberrant cells present in FCD type II, balloon cells and dysmorphic neurons. Together, these findings indicate that a faulty coupling in neuronal differentiation and migration mechanisms may explain the presence of aberrant cells and intrinsic epileptogenesis in this cortical malformation. Another important finding, in our study, was the identification of the downregulation of hsa-miR-134 as a potential non-invasive biomarker to support the diagnosis of patients with MTLE. This circulating microRNA could be used to discriminate MTLE patients with an area under the curve (AUC) of 0.75, regardless of their response to pharmacotherapy or the presence of MRI signs of hippocampal sclerosis. Together, these
findings allowed us to suggest a potential molecular mechanism involved in FCD type II, due to microRNAs, as well to identify a circulating microRNA as biomarker of epilepsy.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Representação esquemática de um córtex cerebral humano normal e de um córtex
com DCF tipo II...23
Figura 2. Achados histopatológicos de uma paciente com DCF tipo IIb de 21 anos...24
Figura 3. Biogênese dos microRNAs ...27
Figura 4. MicroRNAs envolvidos na regulação do desenvolvimento do córtex cerebral...29
Figura 5. Mecanismos de liberação celular e sistemas extracelulares de transporte de microRNAs...31
Capitulo I Figure 1. Flair MRIs and histopathological findings in FCD type II………...66
Figure 2. Expression levels of microRNAs, NEUROG2 and RND2 genes in human brain tissue with FCD type II………..67
Figure 3. (A) Schematic representation of human NEUROG2 mRNA depicting the putative hsa-miR-34a binding site in the 5′-untranslated region (UTR) and the putative hsa-miR-31 binding site in the 3′UTR………..68
Figure 4. H&E stain and representative distribution of NEUROG2 ………...69
Figure 5. Schematic representation of hypothetical molecular mechanism involved in failure of cell fate specification and migration in FCD type II………71
Capitulo II Figure 1. Plasma levels of the three candidates microRNAs quantified in the first cohort of patients (discovery phase)………87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação das displasias corticais focais, de acordo com Blümcke et al, 2011(18). ... 22
Capitulo I
Table 1. Clinical and neuropathological findings in 17 patients with FCD type II included in the present study. ... 72
Table 2. Clinical characteristics of individuals from whom control samples were obtained .... 73
Table 3. MicroRNAs selected for qPCR validation,... 74
Capitulo II
Table 1. Clinical findings in patients with FCD, MTLE and control individuals enrolled in both phases of the study. ... 82
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DCFs: displasias corticais focaisDAE´s : drogas antiepilépticas
RNAm : RNA mensageiro 3’UTR: região 3’não traduzida
5'UTR: região 5’não traduzida
AGO: argonauta
HDL: lipoproteínas de alta densidade
ILAE: The International League Against Epilepsy
H&E: hematoxilina e eosina
FDR: false discovery rate
FC: Fold-change
LNA: locked nucleic acid
ELTM: epilepsia do lobo temporal mesial
AUC: área sob a curva
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 19
1.1 Desenvolvimento do Córtex Cerebral Humano... 19
1.1.1 Os genes proneurais ... 20
1.2 Displasias corticais focais... 20
1.3 MicroRNAs ... 26
1.3.1 MicroRNAs no desenvolvimento do córtex cerebral humano ... 28
1.3.2 MicroRNAs Circulantes ... 30
2. OBJETIVOS ... 33
2.1 OBJETIVO GERAL ... 33
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS DE CADA ARTIGO ... 33
3. METODOLOGIA ... 34
3.1. Metodologias utilizadas no artigo I ... 34
3.1.1. Aspectos éticos e casuísticos ... 34
3.1.2. Coleta de tecidos e extração de RNA ... 35
3.1.3. Análise de microarranjos de microRNAs ... 35
3.1.4. Análises de bioinformática de alvos de RNAm... 36
3.1.5. PCR quantitativo em tempo real ... 36
3.1.6. Experimento de co-transfecção e ensaios de luciferase e microRNA ... 38
3.1.7. Hibridização in situ ... 39
3.1.8. Análise dos genes da via PI3K/AKT/mTOR ... 39
3.1.9 Análise Estatística... 40
3.2. Metodologias utilizadas no artigo II ... 40
3.2.1. Pacientes e desenho de estudo ... 40
3.2.2. Coleta de sangue e extração de RNA ... 41
3.2.3. Transcrição reversa e PCR quantitativo em tempo real ... 42
3.2.4. Análise estatística ... 43
4. RESULTADOS (ARTIGOS) ... 43
Capitulo II. MicroRNA hsa-miR-134 is a circulating biomarker for mesial temporal lobe epilepsy... 76 5. DISCUSSÃO GERAL ... 97 6. CONCLUSÃO ... 102 7. REFERÊNCIAS ... 103 8. ANEXOS ... 114
1.INTRODUÇÃO
1.1DESENVOLVIMENTO DO CÓRTEX CEREBRAL HUMANO
O desenvolvimento embrionário do córtex cerebral é um processo altamente dinâmico e complexo, envolvendo movimentos bem orquestrados de bilhões de células, controladas por uma série de vias bioquímicas que são submetidas a um refinado controle da expressão gênica (1). Didaticamente pode ser subdividido em três fases que se sobrepõem (2) e resumidamente elas são descritas aqui: durante a primeira fase, as células-tronco localizadas nas zonas ventricular (ZV) e subventricular do telencéfalo, um tecido epitelial especializado que reveste os ventrículos cerebrais, proliferam e diferenciam-se em precursores neuronais ou células da glia (3). A primeira onda de células que deixam a ZV forma uma estrutura chamada preplaca, que acabará por formar a camada I do córtex.
Durante a segunda fase, os neurônios migram radial ou tangencialmente (3). A maioria dos neurônios migra radialmente da ZV através da zona intermediária, utilizando para isto as fibras das células radiais glias como suporte para atingir as camadas superficiais da placa cortical (4) e formar uma estrutura laminar ordenada. Os neurônios recém-chegados à placa cortical ultrapassam os neurônios mais antigos, acumulando-se progressivamente em camadas mais superficiais, num processo padrão "de dentro para fora" de deposição dos neurônios. O neocórtex é, então, organizado em seis camadas (5).
Após a conclusão da migração neuronal, a terceira e última fase do desenvolvimento cortical envolve uma série de eventos apoptóticos e sinaptogênicos destinados a regular o número de neurônios maduros e as suas ligações, levando a formação de circuitos corticais (6). Alterações nos
genes reguladores destas vias, especialmente durante o desenvolvimento pode levar a malformações do córtex cerebral (7).
1.1.1OS GENES PRONEURAIS
Durante a corticogênese nos mamíferos, o primeiro passo envolve a expressão dos fatores de transcrição proneurais pertencentes a classe de fatores hélice-alça-hélice (do inglês bHLH, basic-helix-loop-helix) (8), que incluem os genes Ascl1 (ou Mash1), Neurog1 e Neurog2. Esses genes são expressos quase exclusivamente em células progenitoras, principalmente em células radiais glias, e tem como função especificar os destinos neuronais e iniciar a diferenciação (9) além de servirem como '' linkers '' conectando a neurogênese com a migração neuronal (10). As principais funções desses três genes são: regular o processo de diferenciação através da decisão do destino neuronal versus glial; de especificar os fenótipos neuronais glutamatérgicos e gabaérgicos; regular a migração radial, bem como definir a morfologia dendrítica e projeção axonal (11). Durante o desenvolvimento ambos têm funções que se sobrepõem com poucas particularidades que são descritas a seguir: Neurog1 e Neurog2 são expressos exclusivamente no telencéfalo dorsal e são essenciais para a projeção de neurônios excitatórios, diferentemente de Ascl1 que é expresso no telencéfalo ventral, e que tem papel no desenvolvimento de oligodendrócitos e na especificação dos interneurônios (11).
1.2DISPLASIAS CORTICAIS FOCAIS
A displasia cortical focal (DCF) é um tipo de malformação do desenvolvimento cortical em que a principal manifestação clínica é a epilepsia de difícil controle ao tratamento medicamentoso (12).
Assim como a DCF, as malformações do córtex cerebral (MCC) têm sido frequentemente apontadas como causa de epilepsia (13) e existem pelo menos três mecanismos
principais pelos quais as MCC podem se desenvolver e que refletem as etapas embriológicas de formação do córtex: (1) anormalidades secundárias à proliferação e diferenciação de neurônios e das células da glia, bem como apoptose; (2) anormalidades secundárias à migração neuronal e (3) distúrbios secundários ao desenvolvimento pós-migratório (14). Um dos distúrbios que podem ocorrer na fase de proliferação celular é a DCF (14).
A DCF representa a causa mais prevalente de epilepsia resistente a drogas antiepilépticas (DAE´s) em crianças (15) e pode ser considerada a segunda ou terceira causa mais comum em adultos (16). Microscopicamente, a DCF é caracterizada como um espectro de anormalidades da estrutura laminar do córtex cerebral, associada com características citopatológicas que incluem neurônios gigantes, dismórficos e células em formato de balão (12).
Até o momento, não há dados consistentes sobre a incidência da DCF, Hirabayashi et al (1993) (17) relatam que a incidência pode variar entre 2 e 36% em pacientes submetidos à cirurgia para tratamento da epilepsia.
Atualmente, a classificação das DCF´s é baseada na caracterização eletroclínica, nos exames de imagens e no exame neuropatológico de espécimes cirúrgicos, e dividida em três grupos (Tabela 1) :
Tabela 1. Classificação das displasias corticais focais, de acordo com Blümcke et al, 2011(18). Tipo I, lesão isolada Tipo Ia: anormalidades na laminação cortical radial Tipo Ib: anormalidades na laminação cortical tangencial
Tipo Ic: anormalidades na laminação cortical radial e
tangencial
Tipo II, lesão
isolada
Tipo IIa: anormalidades arquiteturais com neurônios
dismórficos
Tipo IIb: anormalidades arquiteturais com neurônios dismórficos e células em balão.
Tipo III, associada à lesão principal Tipo IIIa: anormalidades arquiteturais associada a lesão no lobo temporal e esclerose hipocampal Tipo IIIb: anormalidades arquiteturais adjacentes à tumor glial ou glioneural Tipo IIIc: anormalidades arquiteturais adjacente à malformação vascular Tipo IIId: Anormalidade arquiteturais adjacente a qualquer lesão adquirida na infância: trauma, isquemia, encefalite
Nosso estudo foi realizado na DCF tipo II, que é diagnosticada entre 29-39% de todos os pacientes com DCF e está relacionada com um amplo espectro de apresentações clínicas, que dependem do tamanho da lesão, da localização e da idade do início das crises epiléticas (19). Este subtipo de DCF é mais frequente nos lobos frontal e parietal, pode ser observado em áreas quase invisíveis do fundo do sulco ou em regiões maiores abrangendo mais de um giro (20), e é composto por aberrações celulares (Figura 1) que, curiosamente são derivadas de células radiais progenitoras da zona ventricular (21) e, que serão descritas com mais detalhes a seguir.
Figura 1. Representação esquemática de um córtex cerebral humano normal e de um córtex com
DCF tipo II. (A) Citoarquitetura cortical normal com a presença das seis camadas bem delimitadas. (B) Córtex com DCF tipo II em que se evidencia completa indefinição das seis camadas, presença de células aberrantes, tais como neurônios dismórficos, neurônios hipertróficos e células em formato de balão, além de indefinição da transição córtico-subcortical. Adaptado de Sisodiya, et a., 2009 (19).
Neurônios dismórficos (Figura 2A) são células com orientação, tamanho e estrutura citoesquelética anormais (22). Eles possuem núcleo e citoplasma gigantes (18) além de demonstrarem imunofenótipo diferenciado por apresentarem intensa marcação de proteínas neurofilamentares, em geral expressão de NeuN, um marcador de maturidade neuronal (19). Estas células podem apresentar-se com fenótipos de neurônios piramidais ou interneurônios e são encontrados tanto na camada cortical quanto nas proximidades da substância branca (18). Um aumento nos receptores de neurotransmissores também tem sido observado em neurônios displásicos, juntamente com uma perda de controle da homeostase iônica que pode estar relacionada com a alta epileptogênese dos tecidos displásicos (23).
Figura 2. Achados histopatológicos de uma paciente com DCF tipo IIb de 21 anos com crises
epilépticas refratárias as DAES´s desde os 11 anos. A: neurônio dismórfico (seta); B: células em balão (seta). Coloração: hematoxilina e eosina.
As células em balão (Figura 2B) possuem citoplasma vítreo e eosinófilo, membrana plasmática fina, com núcleos múltiplos e excêntricos (18). Estão presentes em todas as camadas corticais, mas tendem a se concentrar na camada molecular e na substância branca (24). Elas são consideradas células imaturas ou intermediárias por expressarem marcadores neuronais e gliais, além
de CD133 e CD34, marcadores conhecidos de células tronco ou de células precursoras, sugerindo que uma falha durante diferenciação celular ou manutenção de pluripotência pode ter ocorrido durante o desenvolvimento (25). Elas não possuem espinhas dendríticas e axônios visíveis (26), nem recebem contatos sinápticos (27).
Os mecanismos moleculares envolvidos na etiologia desta malformação cortical ainda não são claros, do mesmo modo ainda não se sabe como o desenvolvimento cortical anormal pode contribuir para a geração das crises epilépticas (28). Barkovich e colaboradores (2012) (14) sugerem que a DCF tipo II consiste de uma malformação cortical que ocorreu na fase de proliferação celular durante o desenvolvimento cerebral intrauterino. Estudos recentes têm evidenciado o envolvimento de mutações em mosaicismo na via PI3K/AKT/mTOR na DCF tipo II (29, 30). Uma mutação germinativa nesta mesma via, no gene DEPDC5, também foi detectada em pacientes com DCF tipo IIb (31). Além disso, uma associação com papiloma vírus humano foi recentemente proposta como agente causal na DCF (32), muito embora esses dados continuem controversos.
Da mesma forma, a epileptogênese da DCF também é pouco conhecida. Alguns estudos apoiam o papel das alterações do equilíbrio entre excitação e inibição (27, 33). A deficiência do ácido gama-aminobutirico foi sugerida como um possível mecanismo (34), além de um envolvimento de processos inflamatórios (35).
É grande a proporção de pacientes refratários às DAE´s existentes e cuja lesão não pode ser completamente removida por encontrar-se em áreas eloquentes do córtex cerebral, daí a importância de se conhecer os mecanismos moleculares que desencadearam essas alterações durante o desenvolvimento embrionário, bem como os mecanismos epileptogênicos deste tecido para o desenvolvimento de novas terapias para controle das crises sem aumentar o risco de déficits neurológicos.
1.3MICRORNAS
Os microRNAs são uma classe de RNAs endógenos de fita simples não codificadores de proteínas que desempenham papel importante na regulação da expressão gênica (36). Possuem aproximadamente 22 nucleotídeos que atuam após a transcrição, induzindo silenciamento e, provavelmente, a expressão de seus genes alvo (37).
As moléculas de microRNAs atuam de forma negativa na expressão dos genes, através da complementariedade das suas sequências de fita-simples à região 3’ não traduzida (3’-UTR) complementar ao RNA mensageiro (RNAm) alvo (38). Essa ligação pode ocasionar a degradação do RNAm ou a inibição da tradução. Essas moléculas são conhecidas por sua ação tecido-específica e por agirem de forma temporal-espacial durante o desenvolvimento (38-41). Predições computacionais sugerem que cada microRNA pode atuar em até 200 transcritos diferentes e um RNAm pode ser regulado por milhares de microRNAs (38, 42).
Os microRNAs são formados a partir da transcrição do gene de microRNA (Figura 3), que leva à formação de um precursor, o pri-microRNA (transcrito primário), este recebe a adição de uma estrutura cap e de uma cauda poliA (43). Em seguida o pri-microRNA é processado pela RNAse III Drosha, formando uma estrutura em formato de hairpin com um tamanho aproximado de 60-70 nucleotídeos chamado de pré-microRNA (38). O pré-microRNA é transportado do núcleo para o citoplasma com o auxílio da enzima exportina 5 (43) e, uma vez no citoplasma, o pré-microRNA é submetido a um segundo processamento realizado pela enzima Dicer (outra RNAse III) que remove a alça da estrutura hairpin e forma um microRNA dupla fita. O duplex é então separado e uma das fitas será selecionada como microRNA maduro e fará parte do complexo RISC (RNA-induced silencing complex), enquanto a fita complementar será removida e degradada (38).
Figura 3. Biogênese dos microRNAs. A) transcrição do gene Mir gerando o pri-microRNA
com estrutura secundária em hairpin; b) formação do pré-microRNA pela clivagem do pri-microRNA pela DROSHA; c) transporte do pré-pri-microRNA pela exportina-5 para o citoplasma; d) clivagem pela DICER dos pré-miRNAs formando o complexo microRNA: mRNA*. A perfeita complementariedade entre o microRNA e o RNAm alvo resulta em degradação do RNAm, enquanto que o pareamento imperfeito resulta na repressão da tradução. Adaptado de Jin et al, 2013(51).
A perfeita complementaridade entre o microRNA e o RNAm alvo resulta no silenciamento gênico pela degradação do RNAm, enquanto que o imperfeito pareamento resulta na repressão da tradução (42). A inibição da tradução do RNAm ocorre após a ligação complementar com pelo menos seis dos oito nucleotídeos da região 5´ do microRNA. Essa região composta pelos oito primeiros nucleotídeos é conhecida como seed region (ou região semente) e tem sido descrita como crucial para inibição do RNAm alvo (44-47).Em mamíferos, a maioria dos RNAm é processada pela
ligação com o microRNA por complementaridade imperfeita em regiões 3’ UTR, causando a repressão da tradução do RNAm, sem a degradação de sua fita.Lytle et al. (2007) (48) and Zhou et al. (2014) (49) relataram que os microRNAs de mamíferos não se limitavam a interações na região 3'UTR, mas poderiam regular também as regiões 5'UTR e codificante do gene (50).
Muitos estudos têm mostrado que os microRNAs são reguladores finos de vários processos biológicos com um perfil de expressão tecido e tempo-específicos, regulando funções importantes como as do controle do desenvolvimento, diferenciação celular, apoptose, proliferação celular e organogênese (39; 52), além de contribuírem para a complexidade de diferentes organismos (42). O banco de dados de sequências de microRNAs, miRBase (http://www.mirbase.org/versão 21), tem depositados mais de 30.000 sequências maduras distintas de microRNAs entre vertebrados, invertebrados, plantas e vírus, totalizando mais de 200 espécies.
1.3.1MICRORNAS NO DESENVOLVIMENTO DO CÓRTEX CEREBRAL HUMANO
O papel regulatório dos microRNAs durante o desenvolvimento do córtex cerebral é bastante estudando e destacam-se: o miR-124, um dos mais conhecidos microRNAs expressos no cérebro, e que foi relacionado com a diferenciação e o desenvolvimento neuronal (40,53);o miR-9, conhecido por promover a diferenciação dos progenitores neurais e da correta migração das células diferenciadas (54); da mesma forma, sabe-se que miR-34a também regula a diferenciação neuronal, além de modular a formação dos dendritos (55,56). A Figura 4 resume o conhecimento atual sobre microRNAs envolvidos na corticogênese.
Figura 4. MicroRNAs envolvidos na regulação do desenvolvimento do córtex cerebral. A figura
demonstra microRNAs que foram associados com as três principais fases do desenvolvimento cortical. Na primeira fase, as células-tronco geram progenitores que ainda não estão comprometidos com a diferenciação e podem produzir neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. O passo concomitante de proliferação e diferenciação (5ª à 20ª semana de gestação) é regulado por um conjunto de microRNAs: miR-9, miR-124, miR-137, miR-184, let-7b e miR-34a, miR-153, miR-324 e miR-181a. Durante a fase de migração (6ª à 24ª semana de gestação), ondas sucessivas de neurônios migram das regiões ventriculares, ao longo das células radiais, para as áreas mais externas do córtex reguladas por miR-9, miR-134 e miR-137. E finalmente, a organização das camadas corticais (16ª à 40ºª semana) é orquestrada através da ação de miR-137 e miR-125b. Fonte: Dogini et al, 2013 (59).
Existe um grande número de estudos que associam a desregulação dos microRNAs ao envolvimento com as doenças.A literatura tem apresentado evidências do papel dos microRNAs em várias doenças humanas e processos fisiológicos normais e anormais (57) bem como nos distúrbios neurológicos (58).
Jiménez-Mateos e colaboradores (2012) (60), foram os primeiros a mostrar que os microRNAs também foram associados com a epilepsia. Eles observaram que o miR-134 estava com a expressão aumentada no lobo temporal e nos neurônios piramidais do hipocampo de pacientes com epilepsia do lobo temporal, refratários aos tratamentos com drogas antiepilépticas. Além do mais, eles sugerem que a desregulação deste microRNA poderia ser uma resposta à atividade neuronal anormal, potencialmente associada a alterações na densidade da espinha dendrítica.
1.3.2MICRORNAS CIRCULANTES
Recentemente, os microRNAs foram encontrados também em fluídos extracelulares, incluindo plasma sanguíneo, soro, urina, saliva, sêmen e liquido cefalorraquidiano (61-63). Esses microRNAs recebem o nome de microRNAs circulantes e tem sido estudados como potenciais biomarcadores não-invasivos que possibilitam o acompanhamento da progressão ou o diagnóstico de doenças.
São considerados altamente estáveis nos fluidos corporais, uma vez que são encontrados em várias formas que garantem sua proteção contra a ação da RNAses, tais como exosomas e corpos apoptóticos; podem ser encontrados encapsulados em microvesículas, ou formam um complexo com proteínas da família AGO ou ainda associados a frações de lipoproteínas de alta densidade (HDL) (64) (Figura 5).
Um dos primeiros relatos documentando a relevância clínica de microRNAs circulantes com papel diagnóstico e prognóstico foram descritos em câncer e, um deles chama atenção pelo pioneirismo e pela qualidade - Mitchell et al., (2008) (66) observarem que a expressão do miR-141
mostrou-se mais elevada no soro de pacientes com estádio avançado para câncer de próstata quando comparado com indivíduos controle.
Figura 5. Mecanismos de liberação celular e sistemas extracelulares de transporte de
microRNAs. Os microRNAs circulantes podem ser protegidos e liberados nos fluidos corporais de quatro maneiras: A) em complexos com proteínas da família AGO; B) associados a frações de lipoproteínas de alta densidade (HDL); C) em microvesículas e, D) dentro de exosomas. Adaptado de Guay & Regazzi (2013) (65)
Outro trabalho que merece destaque é o de Skog et al. (2008) (67). Eles demonstraram que microRNAs podem romper a barreira hematoencefálica, evidenciando que células de um paciente com glioblastoma liberavam na corrente sanguínea microvesículas contendo mRNA, microRNAs e proteínas angiogênicas, e que estas potencialmente aumentavam a proliferação deste tumor.
Recentemente, foi publicado o primeiro relato (68) de diferenças nos níveis de expressão de microRNAs circulantes no soro de um grupo de pacientes com epilepsias parcial e generalizada. Os mesmos autores, posteriormente, estudando um grupo clinicamente heterogêneo de pacientes
farmacoresistentes e farmacoresponsivos às drogas antiepilépticas encontraram níveis de expressão alterados do hsa-miR-301a, elegendo, com isso, esse microRNA como um bom candidato para discriminar estes dois grupos (69).
Evidências crescentes sugerem que as assinaturas de microRNAs circulantes oferecem maior sensibilidade e especificidade do que a expressão de um único microRNA (70), tendo em vista a busca por uma ferramenta confiável, que permita diagnóstico precoce, ou a predição da resposta ao tratamento. No entanto, há ainda um longo caminho da bancada até a prática clínica para tornar essa “biopsia liquida”um marcador preciso de diagnóstico ou prognóstico (71).
Esta tese constitui-se da continuação do projeto de mestrado, em que foram identificados e validados três microRNAs com a expressão alterada nos tecidos de pacientes com DCF tipo II. Além disso, havia um candidato a possível gene alvo de um dos três microRNAs. Na presente tese buscou-se avançar na identificação e validação deste gene, bem como de explorar buscou-seu papel nos mecanismos subjacentes a esta malformação do desenvolvimento cortical.
2.OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOGERAL
Contribuir para a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na DCF tipo II, bem como identificar biomarcadores não invasivos que auxiliem no diagnóstico de epilepsia.
2.2OBJETIVOSESPECÍFICOSDECADAARTIGO
Artigo I: Investigar e explorar a existência de regulação gênica anormal, mediada por microRNAs,
para obter uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na fisiopatologia da DCF tipo II.
Artigo II: Identificar e validar um biomarcador robusto e não invasivo para auxiliar no diagnóstico
3.METODOLOGIA
3.1.METODOLOGIAS UTILIZADAS NO ARTIGO I
3.1.1.ASPECTOS ÉTICOS E CASUÍSTICOS
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, protocolo 470/03 (Anexo I). Foram inseridos neste estudo os pacientes que preencheram os critérios de inclusão, ou seja, todos os pacientes com diagnóstico confirmado pelo exame anatomopatológico para DCF tipo II. Foi excluído desse trabalho, pacientes que não apresentam anatomopatológico para DCF tipo II.
Todos os pacientes que concordaram em participar da pesquisa assinaram um formulário de consentimento livre e esclarecido (Anexo II). Foram analisados tecidos cerebrais obtidos de 16 pacientes com Displasia Cortical Focal tipo II (sete pacientes com DCF tipo IIa e dez com DCF tipo IIb) submetidos à ressecção seletiva de estruturas corticais para o tratamento das crises epilépticas refratárias. Todos os pacientes foram recrutados no ambulatório de epilepsia geral e epilepsia de difícil controle, diagnosticados e operados pelo corpo clínico do Hospital das Clínicas da UNICAMP. Após a cirurgia, o diagnóstico de DCF tipo II foi confirmado por dois neuropatologistas de acordo com a classificação ILAE (18). Dados clínicos de todos os pacientes encontram-se na Tabela 1 do Artigo.
Da mesma forma, todas as amostras de tecidos cerebrais de indivíduos controle utilizados neste trabalho foram avaliadas por exame histopatológico e foram incluídas na pesquisa amostras oriundas tanto de autópsia quanto de biópsia. Os critérios de inclusão incluíram presença de citoarquitetura normal do córtex cerebral e ausência de alterações citológicas. Foram excluídos dessa coorte tecido cerebral com alterações citológicas ou com citoarquitetura cortical anormal, bem como
indivíduos com presença de antecedentes clínicos como doenças neuropsiquiátricas. As características clínicas dos indivíduos de controle estão resumidas na Tabela 2 do Artigo I.
3.1.2.COLETA DE TECIDOS E EXTRAÇÃO DE RNA
As amostras de tecido foram divididas em dois grupos: tecido congelado e tecido fixado em formalina e embebido em parafina. Para os tecidos frescos e congelados, foram selecionadas amostras contendo achados neuropatológicos representativos de DCF do tipo II e que foram avaliadas com hematoxilina e eosina (H&E); anti-NeuN (Millipore, MAB377, 1:1000, Darmstadt, Alemanha), anticorpo monoclonal que reconhece uma proteína nuclear específica encontrada no corpo celular e prolongamentos proximais de neurônios de vertebrados; anti-MAP-2 (Invitrogen, M13, 1:500, Waltham), anticorpo que reconhece a região somatodendrítica de neurônios e Anti-Nestina (Millipore, AB5922, 1:500), proteína expressa em vários tipos de células imaturas e embrionárias. Para o tecido fixado em parafina, foi realizada a extração de RNA total utilizando o kit Recover All (Ambion Inc. Austin, EUA). Para o tecido fresco congelado, foi extraído o RNA total utilizando Trizol (Invitrogen, Waltham, EUA) seguindo recomendações pelo fabricante. A quantidade e à qualidade do RNA extraído foi determinado por espectrofotometria (Epoch, BioTek Instruments, Inc., Winooski, EUA). A integridade do RNA foi avaliada utilizando-se eletroforese capilar (Agilent RNA 6000 Pico e RNA 6000 Nano Chip Kit, Agilent, Santa Clara, EUA) no analisador 2100 Bio-AnalyzerTM (Agilent).
3.1.3.ANÁLISE DE MICROARRANJOS DE MICRORNAS
A análise de microarranjos de microRNAs foi realizada com 300 ng de RNA total oriundo de tecido parafinado e o GeneChip ® 1,0 microRNA array (Affymetrix, Santa Clara, EUA), que
interrogou 847 microRNAs humanos. Neste experimento, foram utilizadas nove amostras de pacientes com DCF tipo II (tipo IIa, n = 4, tipo IIb, n = 5) e cinco controles. Os experimentos foram realizados de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Além disso, realizamos correção de fundo, sumarização e normalização utilizando-se a função RMA no pacote Bioconductor. Foi comparadao a expressão dos microRNAs de DCF tipo II com os controles utilizando o software RankProd (pacote Bioconductor) e a correção false discovery rate (FDR) para comparações múltiplas. Os microRNAs foram considerados diferencialmente expressos quando o Fold-change (FC) foi maior do que o valor absoluto de 1,5 com um p-valor ajustado (q-value) e inferior a 0,05. Os microRNAs candidatos para validação foram priorizados com base nos valores absolutos mais elevados de FC, menores q-valores e um papel biológico suposto que poderia demonstrar qualquer associação com potenciais mecanismos subjacentes a DCF.
3.1.4.ANÁLISES DE BIOINFORMÁTICA DE ALVOS DE RNAM
Foram identificados os potenciais RNAm alvos, regulados pelos microRNAs diferencialmente expressos utilizando o algoritmo miRGen (versão 2.0). Esses alvos foram selecionados pesquisando através das palavras-chaves: neurogênese, diferenciação celular, migração celular e proliferação celular. Com objetivo de refinar a lista de potenciais alvos desses microRNAs, foi utilizado o algoritmo RNA hybrid, para priorizar as interações mais favoráveis da ligação entre microRNAs e mRNA, tendo como base os valores mais baixos de energia livre mínima (MFE).
3.1.5.PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL
Para a síntese de cada cDNA de cada microRNA especifico foi usada a fração de pequenos RNAs e o kit de transcrição reversa de microRNA TaqMan™ (Life Technologies, Foster City, EUA)
com primers específicos para os microRNAs, seguindo as instruções do fabricante. Os primers utilizados foram: hsa-miR-486-5p (MIMAT0002177, ID1278); hsa-miR-106a (MIMAT0000103, ID2169); hsa-miR-886-5p (ID2193); hsa-miR-31 (MIMAT0000089, ID2279); hsa-let-7f (MIMAT0000067, ID382); miR-1274a (ID2883); miR-34a (MIMAT0000255, ID426); hsa-miR-23a (MIMAT0000078, ID399); hsa-miR-379 (ID568); e hsa-miR-1182 (MIMAT0005827, ID2830) como microRNAs candidatos na DCF tipo II e RNU24 (ID 1001) e RNU48 (ID1006) como controles endógenos (Life Technologies). Utilizou-se o ensaio TaqMan™ (Life Technologies) para a quantificação de transcritos de microRNAs maduros. Estes experimentos foram realizados em triplicatas com volume final de 12 μL, contendo 6,25 μL de Master Mix, 0,625 μL de sonda (20X), 1,125 μL de água livre de RNase e 4 μL de cDNA. As condições de reação foram 95 °C durante 10 minutos e 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos e 60 °C durante 1 minuto, efetuados em um termociclador 7500 (Life Technologies). Os dados foram analisados utilizando o software 7500 (Life Technologies, versão 2.05) determinando o ciclo de quantificação (Cq). Quantidades relativas de microRNAs foram calculadas usando o método 2-ΔCt após a normalização para o RNU24 e RNU48.
Foram utilizados 1200 ng de RNA total para a reação de partida da transcriptase reversa para os RNAm utilizando o kit de transcrição reversa Superscript SuperScript III e primers randômicos hexâmeros (Life Technologies). Para quantificar a expressão de RNAm, foram utilizadas as seguintes sondas TaqMan: MAP4K3 (Hs00269284_m1); SEMA4C (Hs00215035_m1); GAS7 (Hs00932959_m1); JAG1 (Hs01070032_m1); PAFAH1B1 (Hs00181182_m1); SYT1 (Hs00194572_m1); NOTCH1 (Hs01062014_m1); SATB2 (Hs00392652_m1); SLC1A2 (Hs01102423_m1); NEUROG2 (Hs00702774_s1); NEUROD1(Hs01922995_s1); RND2 (Hs00183269_m1). Como controle endógeno desses experimentos foram usadas as sondas GAPDH (Hs02758991_g1) e ACTB (Hs01060665_g1). As reações de PCR foram realizadas em triplicatas e
as condições de reação foram as mesmas que as utilizadas para quantificar microRNAs maduros como descrito acima.
3.1.6.EXPERIMENTO DE CO-TRANSFECÇÃO E ENSAIOS DE LUCIFERASE E MICRORNA
Os ensaios de luciferase foram utilizados para verificar se as regiões 5 'não traduzidas (UTR) e / ou 3'UTR do NEUROG2 se ligam in vitro com hsa-miR-31 e / ou hsa-miR-34a. Foram utilizados fragmentos de NEUROG2 5'UTR (cerca de 350 pb de comprimento, com dois sítios de ligação para hsa-miR-34a) e NEUROG2 3'-UTR (cerca de 400 pb de comprimento, com três sitios de ligação para hsa-miR-31). As sequências de oligonucleotidos foram da empresa Integrated DNA Technologies (IDT, gBlock Gene Fragments, Coralville, EUA) e estão descritas no material suplementar. Além disso, foram usadas sequências mutantes de ambos os fragmentos. Primeiro, foram clonadas as sequências NEUROG2 3'UTR e NEUROG2 5'UTR a jusante do gene repórter de luciferase de Renilla no vector psiCHECK2 (Promega, Madison, EUA), utilizando os sítios de XhoI / NotI do vector. As células U87 (1x105 células/mL) foram cultivadas em placas de 24 poços em meio Dulbecco modificado (Sigma Aldrich, Saint Louis, EUA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Invitrogen), a 37 °C em uma câmara umidificada com 5% de CO2. A co-transfecção foi realizada utilizando-se 50 nM de RNA sintetizado quimicamente (Life Technologies): mimic de hsa-miR-34a (MC11030) / mimic de hsa-miR-31-5p (MC11465), mimic negativo (4464058) e um controle positivo (4464080), bem como com 3900 ng de plasmídeos psiCheck2-5'UTR ou psiCheck2-3'UTR. Foi realizada a transfecção utilizando FuGENE (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Após 48 horas de transfecção, a atividade de luciferase foi avaliada de acordo com o protocolo de Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega). Os níveis relativos de luciferase foram expressos como luciferase de Renilla (r-luc) normalizada contra sinais de luciferase
de Firefly (f-luc). Cada experimento foi realizado em hexaplicata e repetido em três ensaios de transfecções distintas, realizadas com diferentes passagens de cultura de células.
3.1.7.HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
A hibridização in situ foi realizada utilizando-se locked nucleic acid (LNA)-modified DNA, que recebeu marcação com digoxigenina nas extremidades 5′ e 3′. A sonda 5'ATCATAAGAGACAGATGGCA3' foi utilizada para a detecção de mRNA de NEUROG2 (266172-1), o snoRNA de U6 (99002-01) foi utilizado como controle positivo, e uma sonda de LNA (99004-15) como o controle negativo. Todas as sondas foram obtidas do fabricante Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). As hibridizações foram realizadas em cortes de 4 μm em material emblocado em parafina dos pacientes com DCF tipo II e de tecido cerebral de individuos controle, seguindo o protocolo do fabricante, com as seguintes alterações: a digestão com proteinase k foi realizada em sete minutos; concentração da sonda de hibridização foi de 40 nM, temperatura de hibridização foi de 56 °C e a incubação com substrato de fosfatase alcalina ocorreu durante a noite. Os cortes foram contracorados com Fast Red por um minuto. A análise qualitativa foi realizada por meio de imagens digitalizadas obtidas pelo sistema PALM MicroBeam (Zeiss, Jena, Alemanha).
3.1.8.ANÁLISE DOS GENES DA VIA PI3K/AKT/MTOR
Com o objetivo de verificar a existência de mutações em mosaico em genes da via PI3K/AKT/MTOR no tecido cerebral dos pacientes com DCF tipo II foi realizado o sequenciamento completo do exoma. O DNA genômico foi extraído de tecido cerebral e de amostras de sangue de sete pacientes. Foi realizada a captura e enriquecimento utilizando o kit Nextera® Expanded (Illumina, San Diegeo, EUA). As amostras foram sequenciadas seguindo o protocolo de 200bp paired-end no Hiseq2500 (Illumina). As sequências foram alinhadas utilizando-se BWA-MEM e o
algoritmo de chamada de variante foi o Genome Analysis Toolkit (GATK). Foi avaliada a presença de mosaicismo através dos algoritmos Mutect2 e Strelka. As variantes foram classificadas como mutações em mosaico quando menos de 20% das reads não foram alinhadas ao genoma humano de referência e estiveram presentes apenas no tecido cerebral.A lista dos genes pertencentes a esta via de sinalização encontra-se no Anexo III.
3.1.9ANÁLISE ESTATÍSTICA
O programa R (https://www.r-project.org/) foi utilizado para análises estatísticas. O teste não paramétrico Wilcoxon-Mann-Whitney com correção de Bonferroni foi utilizado para comparar a transformada logarítmica da expressão relativa (RQ) dos microRNAs na DCF tipo IIa, IIb e dos controles. Utilizou-se também transformada logarítmica de RQ para os mRNAs em um teste de coeficiente para o modelo ajustado através de uma equação de estimação generalizada (GEE) (Geepack, versão 1.2.0, teste de Wald) entre os tipos de DCF IIa, IIb e controles, corrigidos para comparações múltiplas. Realizou-se o teste t Student para comparar a atividade relativa de luciferase. O nível de significância, alfa, foi ajustado para ≤ 0,05.
3.2.METODOLOGIAS UTILIZADAS NO ARTIGO II
3.2.1.PACIENTES E DESENHO DE ESTUDO
Foram recrutados pacientes entre os anos de 2013 e 2015 no ambulatório de epilepsia do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Todos os pacientes e indivíduos controle assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo IV), aprovado
pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Campinas (CAAE: 12112913.30000.5404) (Anexo V).
A avaliação clínica dos pacientes foi realizada por neurologistas com experiência no tratamento de pacientes com epilepsia. Todos os pacientes foram entrevistados por meio de um questionário estruturado coletando informações sobre idade, início de epilepsia, histórico de convulsões febris, histórico familiar de epilepsia e número de DAE´s utilizadas. Além disso, todos os pacientes foram submetidos a exame neurológico, EEG interictal e ressonância magnética de alta resolução. A atrofia do hipocampo e outros sinais de esclerose hipocampal foram avaliados por meio de análises visuais.
Foram utilizados os seguintes critérios de inclusão: para pacientes DCF tipo II, confirmação do diagnóstico pelo exame anatomopatológico por neuropatologista; para o grupo de epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM), presença de sinais clínicos, eletrográficos e de imagem correspondentes a este tipo de epilepsia; e do grupo controle, indivíduos sem epilepsia que não apresentaram doença neurológica ou psiquiátrica, e voluntariamente concordaram em doar amostras de plasma para o nosso estudo. Pacientes com patologia dupla ou tumores não foram incluídos.
3.2.2.COLETA DE SANGUE E EXTRAÇÃO DE RNA
Para a preparação de plasma, foi coletado sangue periférico (4 ml) em tubos de EDTA e mantidos em gelo durante o tempo máximo de três horas. Os tubos foram submetidos à centrifugação a 515 x g durante 10 min a 4 °C. Em seguida, alíquotas de 1 ml do plasma foram transferidas para tubos de 1,5 ml e centrifugadas a 12 000 x g durante 10 min, 4°C para sedimentar restos celulares. Posteriormente, o sobrenadante foi transferido para novos tubos e foram armazenados a -80 °C. A concentração de hemoglobina livre foi medida no plasma por
espectrofotometria (BioTek Instruments, Inc., Winooski, EUA) e foram excluídas amostras com A414
> 0,2. Foi utilizado o kit microRNA MirVana PARIS (Ambion Inc, Austin, EUA) para a extração da fração enriquecida de pequenos RNAs, de acordo com as instruções do fabricante. O volume final utilizado para eluição foi de 35 uL de água livre de RNase. A concentração e a pureza foram analisadas utilizando espectrofotômetro.
3.2.3.TRANSCRIÇÃO REVERSA E PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL
Foi utilizado um volume fixo de 5 ul da fração enriquecida de pequenos RNAs como substrato para a reação de transcrição reversa (RT) utilizando o kit de transcrição reversa TaqMan™ (Life Technologies, Foster City, EUA) que utiliza iniciadores específicos stem-loop, seguindo as instruções do fabricante. As sondas utilizadas para os microRNAs candidatos foram: hsa-miR-23a (ID399), hsa-miR-31 (MIMAT0000089, ID 2279) e hsa-miR-134 (MIMAT0000447, ID 1186). Para os controles endógenos, foram utilizadas as seguintes sondas: hsa-miR-16 (MIMAT0000069, ID391), hsa-miR-191(MIMAT0000440, ID 2299), hsa-miR-451 (MIMAT0001631, ID 1141), RNU24 (ID 1001), e RNU48 (ID1006) (Life Technologies). Desses cinco controles endógenos, foram selecionados hsa-miR-191 e hsa-miR-451, uma vez que ambos foram encontrados expressos no plasma em níveis elevados e apresentarem-se relativamente estáveis tanto nas amostras de pacientes quanto de indivíduos controle. Os dados foram analisados com o software DataAssist™ (Life Technologies). Os valores do ciclo quantificação (Cq) foram determinados usando configurações automáticas do software. Todas as reações foram realizadas em triplicatas. A quantificação relativa foi calculada com o método 2-ΔΔCt após a normalização com hsa-miR-191 e hsa-miR-451. MicroRNAs com um nível de quantificação inferior ao valor limiar (Cq ≥ 36) e, com uma taxa de detecção inferior a 75% em ambos os grupos foram desconsiderados.
3.2.4.ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise estatística foi usado o programa R (versão 3.1.2 (2014-10-31). Os níveis de expressão dos microRNAs não seguiram uma distribuição normal e foi realizada uma transformação logarítmica. Os níveis de significância, alpha, foram ajustados para ≤ 0,05 para as transformações de log2 da expressão relativa (RQ), que corresponderam aos valores de 2-ΔΔCt dos p-values ajustados por Bonferroni. Foi utilizado o teste t para comparações de log2 (RQ) entre os três microRNAs candidatos e os grupos estudados, a saber: 1° fase: ELTM x grupo controle; ELTM x DCF; DCF x controle; na 2° fase ELTM responsivo x controle, ELTM refratário x controle e ELTM responsivo x ELTM refratário.
Os parâmetros de sensibilidade, especificidade e a área sob a curva (AUC) para microRNAs foram estimadas receiver operator characteristic (ROC) usando o pacote R caret. Foi aplicada a estratégia de reamostragem bootstrap para otimizar a AUC através da implementação do pacote caret. Diferentes parâmetros clínicos entre os grupos de pacientes e controles foram comparados utilizando-se o teste qui-quadrado com correção de Yates.
4.RESULTADOS(ARTIGOS)
CAPITULO I.DYSREGULATION OF NEUROG2 PLAYS A KEY ROLE IN FOCAL CORTICAL DYSPLASIA
Dysregulation of NEUROG2 plays a key role in focal cortical dysplasia
Simoni H. Avansini1, MSc; Fábio R.Torres1, PhD; André S. Vieira1, PhD; Danyella B. Dogini1, PhD; Fabio Rogerio3, MD, PhD; Ana C. Coan2, MD, PhD; Marcia E. Morita2, MD, PhD, Marilisa
M. Guerreiro2, MD, PhD; Clarissa L. Yasuda2, MD, PhD, Rodrigo Secolin1, PhD; Benilton S. Carvalho1, PhD; Murilo G. Borges1, MSc;Vanessa S.Almeida1, MSc; Patrícia A.O. R. Araújo1, ,
PhD; Luciano Queiroz3, MD, PhD; Fernando Cendes2, MD, PhD and Iscia Lopes-Cendes1, MD, PhD
Departments of Medical Genetics1, Neurology2 and Anatomical Pathology3, University of Campinas - UNICAMP, and the Brazilian Institute of Neuroscience and Neurotechnology (BRAINN),
Campinas, SP, Brazil
Correspondence to: Iscia Lopes-Cendes, MD, PhD Department of Medical Genetics School of Medical Sciences
University of Campinas - UNICAMP Tessalia Vieira de Camargo, 126,
Campinas, SP, Brazil 13083-887 Phone and fax: +55 19 35218909 e-mail: icendes@unicamp.br
Running head: NEUROG2 dysregulation in FCD
Key words: cortical development, cortical malformation, epilepsy, gene regulation, microRNAs,
hsa-miR34a, neuroglial differentiation, radial migration Number of characters in the title: 58
Number of characters in running head: 25 Number of words in abstract: 247
Number of words in main text: 4274 (Introduction 308: Discussion: 1451) Number of figures: 5 (color figures:3)
ABSTRACT
Objective: Focal cortical dysplasias (FCDs) are an important cause of drug-resistant epilepsy. In this
work we aimed to investigate whether abnormal gene regulation, mediated by microRNA, could be involved in FCD type II.
Methods: We used total RNA from brain tissue of 16 patients with FCD type II and 28 controls.
MicroRNA expression was initially assessed by microarray. Quantitative PCR (qPCR), in situ hybridization,luciferase reporter assays, and deep whole exome sequencing for genes in mTOR pathway were performed to validate and further explore our initial study.
Results: hsa-let-7f (p=0.039), hsa-miR-31 (p=0.0078) and hsa-miR34a (p=0.021) were
downregulated in FCD type II, whereas a transcription factor involved in neuronal and glial fate specification, NEUROG2 (p<0.05), was upregulated. We also found RND2 gene, a NEUROG2-target, upregulated (p<0.001) which has a key role in radial migration of cortical neurons. In vitro experiments showed that hsa-miR-34a downregulates NEUROG2 by binding to its 5'-untranslated region. Moreover, we observed strongnuclear expression of NEUROG2 in balloon cells and dysmorphic neuron, besides, 28.5% of our patientsharbored brain somatic mutations in mTOR pathway.
Interpretation: Our findings suggest another way to understanding the molecular mechanisms,
wherein NEUROG2 has a pivotal and central role in the pathogenesis of FCD type II. We found downregulation of hsa-miR-34a leading to upregulation of NEUROG2, and consequently leading to overexpression of RND2 gene. Together, these findings indicate that a faulty coupling in neuronal differentiation and migration mechanisms may explain the presence of aberrant cells and complete dyslamination in FCD type II.
INTRODUCTION
The development of the cerebral cortex involves complex steps, requiring tightly regulated molecular mechanisms for the efficient and precise control of gene expression1. Some of the molecular pathways that control gene expression are mediated by microRNAs, a class of non-coding RNAs that regulate gene expression at the post-transcriptional level2. Gene regulation mediated by microRNAs is involved in a large number of key processes in the nervous system3, 4, especially in neurodevelopment.
Malformations of cortical development (MCDs) are an important cause of disorders in the central nervous system. MCDs are usually highly epileptogenic, which may result from major
changes in the pattern of gene expression involved in neuronal excitability5. Focal cortical dysplasias (FCDs) are a subtype of MCD affecting more than 25% of all patients undergoing surgery for the treatment of refractory epilepsy6. FCDs are associated with dysmorphic neurons and occasionally with balloon cells7, being an important cause of severe drug-resistant epilepsy. The current
classification of FCDs is based upon neuropathological examination of surgical specimens8. In the present study, we examined FCD type II, which presents as an isolated lesion characterized by cortical dyslamination and dysmorphic neurons without (Type IIa) or with balloon cells (Type IIb).
Although recent literature points to the involvement of the mTOR pathway in FCD type II9
-12
, the exact molecular mechanism leading to this type of cortical malformation, especially to the presence of aberrant cells, remains undetermined13, 14 As development of the cerebral cortex is a sophisticated fine-tuning process, we decided to analyze the expression of microRNAs as a shortcut to gain better understanding of mechanisms involved in the pathogenesis of FCD. Therefore, we aimed to investigate whether abnormal gene regulation, mediated by microRNA, could be involved
in FCD type II. In addition, we explored the role of putative candidate genes regulated by the abnormally expressed microRNAs in the mechanisms underlying FCD type II.
SUBJECTS/MATERIALS AND METHODS Patients
We analyzed brain tissue obtained from 16 patients with FCD type II (six patients with FCD type IIa and ten with FCD type IIb) who had undergone selective resection of cortical structures for the treatment of clinically refractory seizures. Adult patients signed a written informed consent approved by the Research Ethics Committee of UNICAMP; patients under the age of 18 years gave their assent, and parents signed the consent on their behalf. All patients were recruited at the epilepsy service of the University of Campinas-UNICAMP, Campinas, Brazil. All patients had been
diagnosed with drug-resistant epilepsy and presented magnetic resonance imaging (MRI)
abnormalities suggestive of FCD (Fig. 1A and 1B). Patients underwent epilepsy surgery with the aim of removal of the epileptogenic zone after extensive clinical assessment, routine
electroencephalograms (EEGs), ictal recordings under long-term video-EEG monitoring, and
structural and functional neuroimaging investigation. In all patients, the epileptogenic zone included the area suggestive of FCD, as observed in the MRI study and intraoperative EEG. After surgery, FCD type II was confirmed by two neuropathologists according to the ILAE classification7, 8 (Fig. 1C-E). Clinical and pathological characteristics are summarized in Table 1. According to Engel classification, 68.8% (n = 11/16) presented a good postoperative seizure outcomes, Engel class I and II. Control samples (n=28) were obtained from autopsies of individuals whose cause of death was non-neurological, as well as from normal temporal cortex obtained during anterior temporal
by histopathological examination, and normal cytoarchitecture of the cerebral cortex was confirmed. Clinical characteristics of control individuals are summarized in Table 2.
Tissue collection and RNA extraction
Tissue specimens were divided into two groups: fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue that had been preserved between 2003 and 2010. For both fresh-frozen and FFPE tissues, we selected samples containing representative neuropathological findings of FCD type II that were evaluated on haematoxylin and eosin (H&E), anti-NeuN (Millipore, MAB377, 1:1000, Darmstadt, Germany), anti-MAP-2 (Invitrogen, M13, 1:500, Waltham, USA) and anti-Nestin (Millipore, AB5922, 1:500) stained sections. For FPPE tissue, extraction of total RNA was performed using the Recover All kit (Ambion Inc. Austin, USA), following the manufacturer’s recommendations with amendments proposed by Goswani15. For FF tissue, total RNA was extracted using Trizol (Invitrogen, Waltham, USA) following the manufacturer’s recommended protocol. The total RNA yield was determined using an Epoch spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA). RNA integrity was assessed using on-chip capillary electrophoresis (Agilent RNA 6000 Pico and RNA 6000 Nano Chip Kit; Agilent, Santa Clara, USA) and a 2100 Bio-AnalyzerTM (Agilent).
MicroRNA microarray analysis
Microarray profiling of microRNA was performed on FFPE tissue using 300 ng of total RNA and the GeneChip® 1.0 miRNA array (Affymetrix, Santa Clara, USA) which interrogates a total of 847 human microRNAs. In the microarray experiments, we included nine samples from patients with FCD type II (type IIa, n = 4; type IIb, n = 5) and five controls. All experiments were performed
according to the manufacturer’s recommended protocol. In addition, we performed background correction, summarization and normalization using the RMA function in the Bioconductor package16. We compared microRNA expression in tissue with FCD type II and controls using RankProd (Bioconductor package) software and FDR correction for multiple comparisons.
MicroRNAs wereconsidered to be differentially expressed when the fold change (FC) was greater than the absolute value of 1.5 with an adjusted p-value less than 0.05. Candidate microRNAs for subsequent validation were prioritized based on the highest absolute values of FC, smallest q-values and a putative biological role that could demonstrate any association with candidate mechanisms underlying FCD.
Bioinformatics prediction of human mRNA targets
We identified candidate mRNAs whose expression was likely to be modulated by the differentially expressed microRNAs found in the microarray experiments using the miRGen algorithm (version 2.0)17. We selected candidate mRNAs by searching for the keywords neurogenesis, cell differentiation, cell migration and cell proliferation. We included mRNA previously reported to be potentially associated with FCD. Finally, in order to refine the list of potential mRNA targets, we searched for favourable binding interactions between microRNAs and mRNA transcripts using RNAhybrid18. We prioritized lower values of minimal free energy (MFE) in order to select the strongest microRNA–mRNA interactions.
Quantitative real-time PCR (qPCR) experiments
We obtained mature microRNAs using 10 ng of total RNA from FFPE tissue as the substrate in a reverse transcription (RT) reaction. For synthesis of each microRNA-specific cDNA, small
RNA enrichment was reverse transcribed using the TaqMan™ microRNA reverse transcription kit (Life Technologies, Foster City, USA) with microRNA-specific stem-loop primers, following the manufacturer’s instructions. Primers used were: miR-486-5p (MIMAT0002177, ID1278); hsa-miR-106a (MIMAT0000103, ID2169); hsa-miR-886-5p (ID2193); hsa-miR-31 (MIMAT0000089, ID2279); hsa-let-7f (MIMAT0000067, ID382); 1274a (ID2883);
hsa-miR-34a(MIMAT0000255, ID426); hsa-miR-23a (MIMAT0000078, ID399); hsa-miR-379 (ID568); and hsa-miR-1182 (MIMAT0005827, ID2830) as candidate microRNAs in type II FCD and RNU24 (ID 1001) and RNU48 (ID1006) as endogenous controls (Life Technologies). We used the TaqMan™ (Life Technologies) assay for the quantification of mature microRNA transcripts. These experiments were performed in triplicate with a final volume of 12 μL, containing 6.25 μL Master Mix, 0.625 μL probe (20X), 1.125 μL of RNase-free water and 4 μL cDNA. Reaction conditions were 95 °C for 10 minutes, and 40 cycles of 95 °C for 15 seconds and 60 °C for 1 minute, carried out in a 7500
thermocycler (Life Technologies). Data were analysed using the 7500 software (Life Technologies, version 2.05) by determining the threshold cycle (Ct). Relative quantities of microRNAs were calculated using the 2-Ct method19 after normalization to the RNU24 and RNU48.
We obtained human mRNA using 1200 ng of total RNA,extracted from FF tissue, using the Superscript SuperScript III reverse transcriptase kit and random hexamer primers (Life
Technologies). To quantify mRNA expression, we used TaqMan PCR probes: MAP4K3 (Hs00269284_m1); SEMA4C (Hs00215035_m1); GAS7 (Hs00932959_m1); JAG1 (Hs01070032_m1); PAFAH1B1 (Hs00181182_m1); SYT1 (Hs00194572_m1); NOTCH1 (Hs01062014_m1); SATB2 (Hs00392652_m1); SLC1A2 (Hs01102423_m1); NEUROG2 (Hs00702774_s1); NEUROD1(Hs01922995_s1); RND2 (Hs00183269_m1). As an endogenous control, we used GAPDH (Hs02758991_g1) and ACTB ( Hs01060665_g1).. PCR reactions were
