Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Universidade do Vale do Paraíba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Elisa Celeste Dreux

“Avaliação do efeito antiinflamatório do extrato hidroalcoólico de

Vernonia scorpioides (Lam) Persoons em inflamação aguda”.

Persoons in acute inflammation”.

São José dos Campos, SP 2005

Elisa Celeste Dreux

“Avaliação do efeito antiinflamatório do extrato hidroalcoólico de

Vernonia scorpioides (Lam) Persoons em inflamação aguda”.

Persoons in acute inflammation”.

Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.

Orientador: Prof. Dr. José Carlos Cogo. Co-orientador: Prof Dr Rodrigo A. Martins

São José dos Campos, SP

... Aos meus pais Denis e Arlete que através de exemplos de integridade, sabedoria, amor e compreensão me apoiaram e incentivaram em todos os momentos de minha vida.

... Ao Beto e minha filha Priscille por tudo que representam em minha vida e pela compreensão nos momentos difíceis e de ausência.

... ao Professor José Carlos Cogo

pela orientação, pelo seu profissionalismo e seriedade na pesquisa, pelo respeito e credibilidade na minha pessoa, me incentivando e ajudando-me nos momentos necessários.

... A amiga Ana Maria Barbosa por me ensinar algumas técnicas na realização desta pesquisa e pelo companhei- rismo indispensável em todos os momentos necessários.

Agradecimentos

- Ao Prof Dr Wellington Ribeiro pelos conselhos, trocas de idéias e incentivos na realização desta pesquisa, permitindo o livre acesso ao laboratório de fisiologia e farmacodinâmica;

- Ao Prof Dr Rodrigo A. Martins pela co-orientação durante a realização desta pesquisa;

- Ao Prof Mestre Luiz Eduardo Cardozo que orientou sobre a produção do extrato. - Ao Prof Dr Milton Beltrame por auxiliar na elaboração do extrato utilizado na

pesquisa, permitindo a utilização do Laboratório de química e os equipamentos necessários;

- As técnicas Carolina e Érica do laboratório de química orgânica que me apoiaram e auxiliaram para que o extrato ficasse pronto em tempo hábil, me ensinando a manipular os aparelhos e me auxiliando nos momentos difíceis;

- Á Rebeca da Biblioteca do IP&D que viabilizou grande parte dos pedidos de inúmeros “papers” e teses para a realização desta pesquisa;

- Ao Prof Dr Stephen Hyslop pela liofilização do extrato no laboratório do Departamento FCM - Unicamp;

- Á Carol do Laboratório de Histologia da Odontologia (Univap) pela oportunidade de confeccionar as lâminas histológicas e o ensinamento das técnicas pertinentes para a realização das mesmas;

- Á Fernanda por me auxiliar na confecção das lâminas histológicas;

- A amiga e Mestre Tatiana V. Mendes pelo incentivo nos momentos difíceis e o contato com o laboratório da odontologia para a confecção das lâminas histológicas; - À Tatiana, Carli, Andréia Delu; Roberta, Catarina pelo companherismo constante

no laboratório de Fisiologia e Farmacodinâmica durante a realização dos experimentos;

- Ao amigo e Mestre Luiz Prudêncio e Silvana pelo apoio, amizade e lucidez que me ofereceram nas várias etapas desta pesquisa;

- Ao Amigo e Mestre Antonio Carlos Prianti, pela presença, orientação, incentivo e amizade dispensada durante toda a pesquisa;

- Ao André Luiz de Toledo, pela ajuda e o empenho na finalização da dissertação me auxiliando nos recursos gráficos e técnicas apropriadas de computação;

- A Rosangela Regis Cavalcanti Taranger, pela revisão final da dissertação e a delicadeza em me orientar nos erros e na finalização da dissertação;

- Aos meus amigos e vizinhos Naiara e Davis pelo apoio e empenho na parte gráfica e recursos do computador;

- Á todos professores, amigos e funcionários do IP&D que me ajudaram nos momentos em que necessitei de apoio e orientação.

“Que se permita a

todas as coisas

fazerem o que elas

naturalmente fazem, de

modo que a sua natureza

fique satisfeita”

A espécie vegetal Vernonia scorpioides (Lam) Persoons (Asteraceae) (Piracá), é utilizada popularmente no Vale do Paraíba (SP) como agente antiiflamatório na forma de extratos fluidos preparados empiricamente com álcool e folhas do vegetal no tratamento de processo edematogênicos. Com o objetivo de investigar a atividade antiinflamatória de

Vernonia scorpioides em inflamação aguda, foi preparado o extrato hidroalcoólico de

folhas e flores da espécie vegetal, realizando-se os seguintes testes: - Edema de pata em ratos induzido por carragenina e histamina; - Peritonite em camundongos induzido por carragenina; - Análise histológica do músculo plantar dos ratos após 4 horas da indução do

edema de pata por carragenina.

No teste de edema de pata em ratos por carragenina (1mg/pata), determinou-se as curvas doses respostas do extrato de Vernonia scorpioides para as doses de 0,45, 0,67 e 1g/Kg, comparados ao diclofenaco sódico (10 mg/Kg) (i.p), adotando-se os tratamentos de 30 minutos antes, tratamento imediato e tratamento 30 minutos após a indução do edema. No teste de edema de pata em ratos induzido por histamina (50µg/pata), foi utilizada a dose única de 0,45g/Kg (i.p) comparado ao Fernegan (cloridrato de prometazina) (4mg/Kg) adotando-se os tratamentos de 15 minutos antes; tratamento imediato e tratamento 15 minutos após a indução do edema. No modelo de peritonite em camundongos induzida por carragenina (600µg/cavidade), utilizou-se as doses de 0,45, 0,67 e 1g/Kg do extrato comparados ao diclofenaco sódico (10 mg/Kg) (v.o); 30 minutos após a indução de peritonite. O extrato inibiu o edema por carragenina e histamina em todos os tratamentos realizados com resposta diferenciada das doses adotadas. No edema de pata induzido por carragenina o tratamento realizado 30 minutos antes, a melhor dose foi de 1 g/Kg que reduziu o edema em 32%, 51%,45% e 42% após 1, 2, 3 e 4 horas respectivamente; para o tratamento imediato, todas as doses inibiram o edema sem apresentar diferença significativa entre elas, mas de forma superior ao diclofenaco; no tratamento 30 minutos após a melhor dose foi a de 0,45g/kg que reduziu o edema em 30%, 60% 55% e 60 % respectivamente após 1, 2, 3 e 4 horas respectivamente. Em edema de pata induzido por histamina o melhor resultado foi o realizado 15 minutos após onde o extrato apresentou ação semelhante ao fernegam, reduzindo o edema em 30%, 60%, 55% e 40 % após 0,5, 1, 1,5 e 2 horas respectivamente; nos demais tratamentos, o extrato inibiu o edema mas não foi mais eficiente que o fernegan. Em peritonite induzida por carragenina a melhor dose foi a de 1g/kg em relação a contagem total e diferencial com resultados semelhantes ao diclofenaco. A análise histológica do músculo plantar dos ratos realizada 4 horas após a indução do edema por carragenina confirmou a diminuição do edema e do infiltrado leucocitário em todas a doses utilizadas.Baseados nos resultados obtidos podemos concluir que o extrato de

Vernonia scorpioides possui ação antiiflamatória nos modelos de inflamação aguda

testados.

Abstract

Ethanolic extracts and the leaves of Vernonia scorpioides (Lam) Persons (Compositae), a plant commonly known in Brazil as piracá, are widely used to treat inflammation and edema. In this work, we examined the antiinflammatory activity of a lyophilized ethanolic extract of the leaves and flowers of V. scorpioides on rat paw edema induced by carrageenan (1 mg/paw) and histamine (50 µg/paw), and on peritonitis induced by carrageenan. The histological alterations in paws injected with carrageenan were also assessed. Administration of three doses of this extract (0.45, 0.67 and 1 g/kg) 30 min before the agonists markedly reduced the subsequent edema, although this inhibition was not as effective as that seen with sodium diclofenac (10 mg/kg); an extract dose of 1 g/kg had an effect similar to that of diclofenac, and reduced the edema by 31%, 51%, 45% and 48% after 1, 2, 3 and 4 h, respectively. Inhibition of edema was also seen when the extract was give 30 min after the agonists, with the most effective dose being 0.45 g/kg, which reduced the edema by 48%, 44%, 50% and 60% after 1, 2, 3, and 4 h, respectively; the other doses produced effects similar to that of diclofenac. When given immediately after the agonists, all doses of the extract also inhibited the edema to an extent similar to that seen with diclofenac. A single dose of extract (0,45 mg/kg) also inhibited the edema induced by histamine when given 15 min before, 15 min after or immediately after the agonist. The greatest inhibition was seen when the extract was given 15 min after the agonist, with reductions of 30%, 60%, 55% and 40% after 0.5, 1.0, 1.5 and 2 h, respectively; these decreases were similar to that seen with promethazine (4 mg/kg). In carrageenan (600 µg/cavity)-induced peritonitis, the same doses of extract as used for paw edema reduced the leucocyte migration when given 30 min after the agonist. The most effective dose of extract was 1 g/kg, with reductions of 39%, 29%, 18% and 43% after 1 ,2, 3 and 4 h, respectively, which was similar to that seen with diclofenac (1 g/kg). The most effective doses against neutrophil migration were 0.45 g/kg and 1 g/kg (27% inhibition at all time intervals), whereas the most effective doses against mononuclear migration were 0.67 and 1 g/kg, both of which were similar to diclofenac. Histological analysis of the effects of the extract 4 h after the induction of edema with carrageenan showed a reduction in the amount of edema and a decrease in leucocyte infiltration compared to mice receiving carrageenan alone. Together, these results indicate that the ethanolic extract of V. scorpioides has an antiinflammatory action in experimental models of acute inflammation.

Key words: Ethanolic extract, inflammation, peritonitis, rat paw edema, Vernonia scorpioides.

vegetativo; (B) receptáculo floral; (C) Detalhes do botão floral; (D) semente. 04

Figura 2: Fotografia da espécie Vernonia scorpioides (Lam) Persons, detalhe das

folhas adultas e do botão floral.

06

Figura 3: Seqüência dos eventos leucocitários na inflamação. 11

Figura 4: Geração de metabólitos do ácido aracdônico e seus papéis na inflamação 14

Figura 5: Fotografia do pletismógrafo. 21

Figura 6: Fotografia ilustrando a realização da medição do volume da pata de ratos

através do uso do pletismógrafo

22

Figura 7: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos

inoculados com carragenina (1000 µg/pata). Os animais foram tratados 30 minutos antes (i.p) após a aplicação do estímulo.

29

Figura 8: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos

inoculados com carragenina (1000 µg/pata). Os animais foram tratados (i.p) 30 minutos após a aplicação do estímulo.

31

Figura 9: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos

inoculados com carragenina (1000 µg/pata). Os animais foram tratados imediatamente (i.p) após a aplicação do estímulo.

32

Figura 10: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos

inoculados com Histamina. Os animais foram tratados 15 minutos antes da

aplicação do estímulo. 34

Figura 11: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos ) em ratos

inoculados com histamina. Os animais foram tratados imediatamente após a

aplicação do estímulo. 35

Figura 12: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos ) em ratos

inoculados com histamina. Os animais foram tratados 15 minutos após da

aplicação do estímulo. 36

Figura 13: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45

g/Kg; 0,67g/Kg e 1 g/Kg sobre o processo inflamatório em modelo experimental de Peritonite em camundongos induzido por carragenina

comparados aos grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico ), observando o nº de Leucócitos Totais migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas após a

indução da inflamação. 39

Figura 14: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45

g/Kg; 0,67g/Kg e 1 g/Kg sobre o processo inflamatório em modelo experimental de Peritonite em camundongos induzido por carragenina comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico , observando o nº de Neutrófilos migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas após a

indução da inflamação. 40

Figura 15: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45

g/Kg; 0,67g/Kg e 1 g/Kg sobre o processo inflamatório em modelo experimental de Peritonite em camundongos induzido por carragenina comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico), observando o nº de células mononucleares migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas

após a indução da inflamação. 41

Figura 16: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle salina A:

Aumento de 100x. B: aumento de 400x. 44

Figura 17: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo carragenina. A:

Aumento de 100x. B: Aumento de 400x. 45

Figura 18: Fotomicrografia do grupo diclofenaco sódico.A: Aumento de 100x. B:

Aumento de 400x.

46

Figura 19: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose de

0,45g/kg do extrato de V. scorpioides. A: Aumento de 100x. B: Aumento de 400x.

47

Figura 20: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose de

0,67g/kg do extrato de V. scorpioides A: Aumento de 100x. .B:Aumento de 400x.

48

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Porcentagem de inibição nº de Leucócitos Totais migrantes para a

cavidade peritonial comparados com o grupo carragenina e os tratamentos

por diclofenaco sódico e o extrato. 42

Tabela 2: Porcentagem de inibição nº de neutrófilos migrantes para a cavidade

peritonial comparados com o grupo carragenina e os tratamentos por

diclofenaco sódico e o extrato. 42

Tabela 3: Porcentagem de inibição nº de neutrófilos migrantes para a cavidade

peritonial comparados com o grupo carragenina e os tratamentos por

1.1

–

1.2 - A Família Asteraceae 02

1.3 - Considerações Gerais sobre Vernonia scorpioides 03

1.4 - Aspectos vasculares e celulares da reação inflamatória aguda 09

1.4.1 - O processo inflamatório. 09

1.4.2 - Os mediadores da inflamação 12

1.4.3 – Inflamação experimental 16

2 – Objetivos 17

3 - Material e métodos 18

3.1 – Aprovação pelo comitê de ética 18

3.2 – Animais 18

3.3 – Protocolo de eutanásia 18

3.4 – Obtenção do extrato 19

3.4.1 – Coleta do material vegetal 19

3.4.2 – O processo extrativo 19

3.5 – Avaliação farmacológica – via intraperitonial 20

3.5.1 – Edema de pata induzido pela carragenina 20

3.5.2 – Edema de pata induzido pela histamina 24

3.6 – Análise histológica 25

3.7 – Avaliação farmacológica – via oral 25

4 - Resultados 28

4.1 – Avaliação farmacológica – via intraperitonial 28

4.1.1 – Edema de pata induzido pela carragenina 28

4.1.2 – Edema de pata induzido pela histamina 33

4.2 – Peritonite induzida pela carragenina 37

4.2.1 – Resultados da migração celular 37

4.3 – Estudo histológico 43

5 - Discussão 50

6 – Conclusão 56

Referências Bibliográficas 57

1. INTRODUÇÃO

1.1 Fitoterapia

A fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que cresceu notadamente nestes últimos anos, ao ponto que atualmente o mercado mundial de fitoterápicos gira em torno de aproximadamente 22 milhões de dólares. O Brasil não se destaca no mercado mundial de fitoterápicos apesar de possuir uma extensa e diversificada flora (detendo aproximadamente um terço da flora mundial) ficando inclusive atrás de países menos desenvolvidos tecnologicamente. No entanto, no Brasil desenvolve-se um grande número de pesquisas que têm contribuído significativamente para o desenvolvimento da química de produtos naturais de plantas (YUNES et al., 2001).

Existem muitos setores da sociedade que desenvolvem programas de assistência fitoterápica baseados nas práticas e saberes populares, tradicionalmente transmitidos, sobre o uso de plantas. Muitos desses programas, assentados em bases não científicas, contribuem para agravar o problema social do uso indiscriminado de medicamento. Apesar de se reconhecer a legitimidade do conhecimento tradicional, uma planta para ser usada em qualquer atividade ou programa de fitoterapia deve ser cientificamente validada (ABULQUERQUE et al., 2004).

Carline (1983) propõe que o estudo farmacológico de extratos de plantas brasileiras conste de três etapas. Primeiramente, os testes farmacológicos devem ser realizados ao acaso, preferencialmente com vegetais utilizados na medicina popular; comprovando sua atividade, parte-se para o fracionamento do extrato bruto e para testes farmacológicos das respectivas frações; a seguir, realiza-se estudo farmacológico detalhado de substâncias ativas, eventualmente obtidas em estado puro.

Segundo Bachi (1988), Davino (1989), o extrato bruto com ação farmacológica comprovada e baixa toxicidade podem ser utilizados na terapêutica com vantagens sobre substâncias puras dele isoladas. A atividade terapêutica do extrato bruto deve-se muitas vezes, a um conjunto de substâncias com ação sinérgica que contribui para a obtenção de melhores resultados do que com os compostos isolados.

2 Do ponto de vista de saúde pública é de extrema importância que haja uma avaliação farmacológica de plantas e preparações utilizadas pela população com propriedades medicinais.

Há no Brasil, inúmeras famílias botânicas bem representadas em número de táxon e estudadas entre as quais destacam-se a família dos Compositae (Asteracae) devido ao seu grande uso popular e grande variedades de espécies freqüentemente citadas em levantamentos etnobotânicos, podendo citar como exemplos a “Camomila” (Matricaria

chamomila L.), a “Carqueja” (Baccharis trimera Less.), “ erva doce” (Stevia rebaudiana Ber), “Guaco” (Mikania glomerata) entre outras (MENDES, 2001).

No Vale do Paraíba destaca-se a espécie vegetal “Piracá”, Vernonia sp; que apresenta ampla distribuição entre a vegetação nativa nos quintais das residências, sendo utilizada popularmente na forma de infusões para tratamento de edemas e traumatismos.

1.2 A Família Asteraceae

A espécie Vernonia scorpioides (Lam) Persons pertence a família das Compositae (Asteraceae), que reúne cerca de 1.100 gêneros (180 no Brasil) com aproximadamente 2.500 espécies, de ampla distribuição, sendo a família com maior número de espécies entre as dicotiledôneas, com inúmeras propriedades farmacológicas devido a grande variedades de metabólicos secundários por elas produzido (CUNHA, 1989).

Os constituintes químicos mais encontrados entre as espécies desta família são os terpenos, flavonóides e poliacetilenos, enquanto que as lactônas sesquiterpênicas constitui o componente químico que desencadeia grande parte da atividade farmacológica dessas plantas ( DAVINO, 1989; FREIRE, 1996; LOPES, 1991).

Entre as atividades biológicas atribuídas as espécies desta família cita-se a ação citotóxica tumoral, antibiótica, inibidora de penetração de cercarias de Schitossoma

mansoni, atividade desistimulante de apetite de insetos, alergênica, ação tóxica nos

vertebrados, alelopática ,fungicida, antielmíntica, atividade antiinflamatória (DAVINO,1989), moluscida (LOPES, 1991).

Entre as 13 tribos que compõem a família Asteraceae, destaca-se a tribo Vernoniae, uma das mais numerosas, com cerca de 70 gêneros e aproximadamente 1500 espécies. A

tribo Vernoniae tem uma distribuição pan tropical, ocorrendo na América, África, Ásia e Austrália. Reconhece-se dois centros de dispersão do gênero, um no sudeste do Brasil e outro na África. A tribo presente no Brasil contém 40 gêneros e entre eles o gênero Vernonia (CUNHA, 1989).

O gênero Vernonia contém cerca de 1000 espécies encontradas nos trópicos do velho e novo mundo. No Brasil é bastante disseminado, ocorrendo pelo menos 200 espécies, cujo porte pode ser herbáceo, arbustivo e aéreo (HARBONE, 1977).

A variação do aspecto morfológico e vegetativo de suas espécies é extensa; os caracteres florais são relativamente uniformes (KELEY, 1979).

1.3 Considerações gerais sobre Vernonia scorpioides

Vernonia scorpioides conhecida em algumas regiões do Brasil por Erva-de Preá,

Erva de São Simão, Capichingui-de-bicho, Enxuga, Piracá encontra-se distribuída geograficamente pelos continentes: Europeu, Asiático, Africano e Americano, e foi espalhada pela ação do homem. É cultivada em vários países tropicais e alguns subtropicais.

É uma espécie perene, subarbustiva, bastante ramificada, caule lanuginoso-pubescente, medindo entre 1 e 2 metros de altura, com reprodução por sementes e por estaquia. As folhas são alternadas, membranáceas, glabas na face superior e cerício-pilosa na inferior, pecioladas medindo 6-12 centímetros de comprimento e 3-6 cm de largura. As inflorecências são terminais, em cimeiras escorpiódes de capítulos sésseis. As flores são violáceas em números de 20 a 30 por capítulo (LORENZI, 1982) (Figura 1).

A espécie Vernonia scorpioides apresenta a seguinte classificação botânica: Divisão: Angiospermae

Classe: Dicotyledonea Sub classe: Asteridae Ordem: Asterales

Família: Composite Giseke (Asteraceae) Sub família: Asteróide

Gênero: Vernonia

4

Figura 1: Esquema Vernonia scorpioides (Lam) Persons. (A) Aspecto geral do hábito vegetativo;

No que se refere à anatomia, Carvalho et al., 1884 descreveram a presença de células de transferência do tipo a em V. scorpioides, ou seja, células companheiras, altamente especializadas, apresentando projeções parietais, citoplasma denso e numerosas mitocôndrias caracterizadas por suas cristas abundantes e conspícuas, agrupadas densamente.

Vernonia scorpioides (Lam) Persons, foi descrita pela primeira vez como Conyza

scorpioides Cass. Essa espécie possui diversas sinonímias, entre elas:

* Chrycossoma reponda Well * Lepidoploa scorpioides Cass * Cacalia scorpioides O Huntze

* Vernonia centrioflora Link

* Vernonia flavescens Less

É uma erva comum da vegetação secundária da encosta Atlântica e da Floresta Latifoliada do alto do Uruguai, no extremo oeste Catarinense, apresentando, portanto área de dispersão a América Central, desde a Nicarágua até o nordeste da Argentina (CABRERA, 1980).

No Brasil, apresenta extensa distribuição geográfica, sendo encontrada desde o Ceará até o Rio Grande do sul, como também no Centro-oeste (MS e MT) (CORREA, 1984).

É uma planta que exige plena luz suportando bem o sol intenso do verão, preferindo solos argilo-arenosos, não necessariamente férteis, mas drenados (espécie seletiva higrófita), nestas condições costuma florescer de junho a outubro (CABRERA, 1980). No entanto, quando encontrada em áreas sombrias e úmidas (planície litorânea) floresce nos meses de setembro a fevereiro (CORREA, 1984).

A espécie é de fácil cultivo sendo que as partes do vegetal empregadas em medicina popular são preferencialmente as folhas (Figura 2).

6

Figura 2: Fotografia da espécie Vernonia scorpioides (Lam) Persons, detalhes das folhas adultas e

do botão floral (Dreux, 2004, Bairro dos Freitas - SJC – SP)

Na terapêutica popular e em levantamentos etnobotânicos encontram-se algumas indicações do uso de V. scorpioides como por exemplo, infecções do estômago (úlceras) (chás), edemas provocados por traumatismos e agentes infecciosos (Infusão), efeito sedativo (chás), cura de hemorróidas e leucorrérias (banho das partes afetadas), cura de desinterias (chás).

Na literatura podemos encontrar estudos farmacológicos realizados com

V. scorpioides onde:

Lopes (1991) verificou a ação desestimulante de apetite em insetos (antifeedant) contra Locrusta migratória (defesa da planta contra atividade predadora de insetos herbívoros).

Freire et al., (1996) verificou a existência de propriedades antifúngicas dos extratos obtidos de folhas e caules de V. scorpioides para Penicilium citrinus. O desenvolvimento de hifas no meio da cultura, testado na presença dos extratos hexânico e clorofórmicos

mostraram-se insipientes, além de formar halos de inibição significativos. Os extratos de folhas frescas também apresentaram efeitos semelhantes, embora de menor intensidade, obtendo halos de inibição para Aspergillus alutaceos. Os autores relacionaram a atividade observada a provável produção de lactonas sesquiterpênicas indicadas pela observação de sinais característicos do estiramento de carbanilas lactânicas ativas com obsorção entre 1750 nm e 1770 nm no espectro de infravermelho.

Leite et al., (2002) investigaram a atividade de cicatrização a partir do extrato etanólico de folhas de V. scorpioides comprovando que o tratamento não acelera o tempo de fechamento do ferimento mais contribui para o processo de regeneração e organização do novo tecido.

Alguns autores também realizaram estudos referentes a composição fitoquímica de

V. scorpioides como:

Drew et al., (1980) isolaram e identificaram das partes aéreas desta planta um novo germacranolídeo que foi denominado escorpioidina.

Warning et al., (1987) isolaram e identificaram em partes aéreas de V. scorpioides um novo tipo de lactona sesquiterpênica denominada escorpiolídeo.

Gomes et al., (1987) descreveram a estrutura em raio-X de 6 - deoximikanokryptin, um novo guaianolide de V. scorpioides (Lam) Pers.

Andreucci (2002) verificou e descreveu a presença dos princípios ativos presentes no extrato hidroalcólico de V. scorpioides tais como: alcalóides, flavonóides, taninos,

saponinas e óleo essencial através da análise química qualitativa do extrato de

V. scorpioides.

Freire (2000) isolou e quantificou pela primeira vez um triterpeno, o acetato de lupeol através de métodos fitoquímicos clássicos. O método de detecção foi estabelecido a partir de anticorpos antiacetato de lupeol (anti-L Ac). Foram realizados ensaios de Elisa de captura, segundo a metodologia clássica para a quantificação de haptenos. A maior concentração de acetato de lupeol foi encontrada nas raízes na casa de vegetação, e na parte aérea (principalmente no caule) das plantas silvestres, sugerindo existir uma relação entre a idade das plantas analisadas e o sítio de produção desta susbstância.

Mendes (2001) isolou compostos terpenoidais a partir da fração clorofórmica, de V.

8 espectroscopia de RMN de 1H e de 13C. O lupeol e seus derivados lupenona e acetil lupeol revelaram ter atividade sobre a produção de anticorpos em especial os das classes IgM e IgG2a. O acetil lupeol apresentou atividade antitumoral, enquanto que o lupeol foi ineficiente. Já o acetil lupeol inibiu a rejeição aguda a transplantes alogênicos de pele em camundongos. Os ensaios microbiológicos realizados com o extrato bruto metanólico de V.

scorpioides não inibiu o crescimento dos microrganismos testados; o extrato metanólico

bruto como a fração clorofórmica de V. scorpioides induziu inibição do número de células secretoras de anticorpos IgM em animais imunizados com antígenos T dependente.

Embora V. scorpioides seja potencialmente importante por suas propriedades medicinais, permanece pouco estudada quanto a sua padronização no sentido de proporcionar o controle de qualidade na produção de fitoterápicos. Suas atividades biológicas e farmacológicas também necessitam ser estudadas com maior profundidade pois praticamente não existem.

1.4 Aspectos Vasculares e Celulares da reação inflamatória aguda: 1.4.1 O Processo inflamatório

A inflamação é uma resposta do organismo a um trauma, cuja característica fundamental é a de se manifestar de maneira esteriotipada, independente da natureza do agente lesivo; caracterizando-se por alterações morfofuncionais da microcirculação na área lesada envolvendo células, tecidos, vasos sanguíneo, e linfáticos. As alterações estereotipadas podem ser determinadas pela intensidade ou persistência da injúria, característica do órgão ou tecido atingido e pela capacidade de reação do organismo (PEGORARO, 1994).

Desde Celsus (contemporâneo de Cristo) que se caracteriza a inflamação por quatro sinais cardinais “rubor, calor, tumor e dor”. Virchow, no século XIX, acrescentou um quinto sinal a perda da função (MONTENEGRO et al., 1999).

Desta forma, a inflamação é um processo multimediado e seus sinais e sintomas podem ser definidos como a expressão dos efeitos da mobilização endógena de mediadores que atuam localmente (DI ROSA et al., 1971).

A resposta inflamatória ocorre no tecido conjuntivo vascularizado, inclusive no plasma, nas células circulantes, nos vasos sanguíneos e nos componentes extravasculares do tecido conjuntivo (COTRAN et al., 1996).

Uma resposta inflamatória, entretanto pode ser transitória ou aguda, com predomínio de alterações vasculares exudativas, e se o estímulo lesivo original ou modificado permanecer por períodos relativamente longos, pode modificar-se e adquirir caráter persistente ou crônico, com grande proliferação celular, que não raramente levará a lesão funcional do órgão afetado (GARCIA & LEME, 1979).

Na primeira fase da reação inflamatória, a fase aguda, ocorrem fenômenos vasculares e celulares; as principais mudanças observadas envolvem praticamente três processos sumariamente caracterizados pelas seguintes fases (ALBERTINE, 2001):

10 1) Mudança de calibre e fluxo na microcirculação levando a vasodilatação das

arteríolas;

2) Aumento da permeabilidade vascular das vênulas em conseqüência da abertura das junções entre as células levando a formação de exudato rico em proteínas e edema local;

3) Migração de leucócitos do sangue circulante para o local da lesão.

As alterações que ocorrem nas arteríolas a contração das células endoteliais das vênulas e as respostas celulares são causadas por substâncias liberadas no local da inflamação, conhecidos como mediadores inflamatórios. Estes mediadores podem atuar isoladamente, associadamente ou em seqüência podendo amplificar a resposta inflamatória influenciando na sua resolução (YOSHIKAI, 2001).

Os mediadores podem ter origem no plasma, células e tecidos agredidos. Entre os principais mediadores destacam-se: histamina, cininas plasmáticas, serotonina, prostaglandinas, elementos formados durante a ativação do sistema complemento, proteases neutras, proteínas catiônicas de origem lisossomal, produtos decorrentes da degradação de fibrina (PDF), fatores reativos de linfócitos, citocinas, entre outros (LANSEN et al., 1983).

A reação inflamatória é caracterizada pelo acúmulo local de leucócitos polimorfonucleares no tecido lesado que migram de vasos adjacentes. Os mecanismos de acúmulo no local da lesão são complexos e dependem de uma seqüência de eventos que compreendem a marginação, adesão, migração em direção ao estímulo quimiotático, fagocitose e degradação intracelular, ocorrendo também a liberação extracelular de produtos de leucócitos (COTRAN et al., 1989) (Figura 3).

Figura 3: Seqüência de eventos leucocitários na inflamação (COTRAN, et al., 2000).

Na inflamação existe um aumento da permeabilidade capilar devido a ação dos mediadores que se formam no local induzindo a contração dos endotélios e pericitos, separando as junções intracelulares e permitindo a passagem sucessiva de líquido, macromoléculas e eventualmente de células do sangue para o interstício. (MONTENEGRO

et al., 1999).

O líquido rico em macromoléculas e células que se acumula nos intertíscio da área constitui o exsudato, que é um fluido extravascular de origem inflamatória contendo altas concentrações de proteínas e muitos detritos celulares (SIQUEIRA & DANTAS, 2000).

O exudato inflamatório é importante na contenção e limitação da agressão, trazendo para o interstício anticorpos, complemento e outras macromoléculas envolvidas na inibição e destruição de agressores, assim como na modulação da própria resposta inflamatória ( MONTENEGRO et al., 1999).

O exudato deforma e comprime os vasos, sobrecarregando a circulação linfática, que perde a eficiência de drenagem agravando a retenção de água no interstício. Todo este processo, portanto, contribui para a formação do edema inflamatório (BRASILEIRO, 1998).

12 As células, principalmente neutrófilos são as primeiras a atingirem o sítio da lesão e migram pelo processo de quimiotactismo se acumulando no sítio da lesão seguido por leucócitos mononucleares, em períodos mais tardios. Muitos são dotados de propriedades fagocíticas, englobando material particulado ou microorganismos do seu citoplasma (GARCIA & LEME, 1979).

Estudos histológicos demonstraram casos de inflamação exudativa aguda com predomínio de infiltração neutrolítica, seguida de fase crônica caracterizada por proliferação fibroblastica, formação de vasos sanguíneos e infiltração de mononucleares (SILVA, 1986; GARCIA & LEME, 1979).

1.4.2 Mediadores da inflamação:

Em termos simples, um mediador pode ser considerado como um mensageiro químico que tem ação nos vasos sanguíneos e/ou células e contribuem para a resposta inflamatória. (LANSEN et al., 1983).

Tais substâncias modulam uma série de eventos locais, sendo os principais vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, opsonização, quimiotaxia para células inflamatórias, destruição tecidual e dor, como também febre e mal estar. Os mediadores químicos da inflamação podem ser de origem plasmática ou tecidual (SIQUEIRA & DANTAS , 2000).

Plasmática:

- Sistema das cininas (Substrato plamático).

- Sistema complemento ( C3a; C5a; C5b – C9) (Proteínas plasmáticas via fígado, macrófagos).

- Sistema de coagulação (leucócitos). - Sistema fibrinolítico.

Tecidual:

- Aminas vasoativas: histamina e serotonina (mastócitos e plaquetas). - Derivados do ácido aracdônico (A.A.) (fosfolipídeos da membrana). - Enzimas lisossomais (neutrófilos e mastócitos).

- Radicais livres derivados do oxigênio (leucócitos).

- Fator ativador de plaquetas (PAF) (leucócitos e mastócitos). - Citocinas (macrófagos e linfócitos ativados).

- Óxido nítrico (macrófagos e endotélio). - Fatores do crescimento.

As aminas vasoativas, histamina e serotonina, liberadas dos mastócitos e das plaquetas podem ser identificadas no início da inflamação aguda. A histamina é o primeiro mediador a atuar; gerando o aumento da permeabilidade vascular e uma contração do endotélio venular com alargamento de junções celulares interendoteliais. A serotonina apresenta ações semelhantes ás da histamina, correspondendo a um segundo mediador pré formado (COTRAN et al. 1996).

As prostaglandinas originadas da conversão do ácido aracdônico também agem como importantes substâncias vasodilatadoras. No homem, o ácido aracdônico é o mais abundante precursor de prostaglandinas, como também prostaciclina, tromboxanos ou leucotrienos. A liberação do ácido aracdônico ocorre como conseqüência da estimulação específica de receptores da superfície celular e da subseqüente ativação de fosfolipases do tipo A2. Vários tipos de células liberam ácido aracdônico em resposta a diferentes estímulos tais como a bradicinina, angiotensina II, vasopressina, trombina, colágeno, adrenalina, ADP, peptídios quimiotáticos, IgE – Ag, concanavalina A e histamina (CARVALHO, 1990).

Duas grandes rotas do metabolismo do Ácido aracdônico em células de mamíferos correspondem a via da ciclooxigenase e a via da lipoxigenase. Prostanóides incluindo prostaglandinas e tromboxano A2 são produzidos por fosfalipases A2 e ciclooxigenase e leucotrienos são produzidos por 5- lipoxigenase (YOSHIKAI, 2001) (Figura 4).

14

Figura 4: Geração de metabólitos do ácido aracdônico e seus papéis na inflamação. (COTRAN,

As prostaglandinas podem participar de reações alérgicas, como o mais abundante produto produzido por reação imunológica de mastócitos em pulmão, como a PGD2. Efeito biológico de prostaglandinas produzido durante a reação de mastócitos em tecidos incluem modulação da musculatura lisa e contração, permeabilidade vascular, sensação de prurido e dor e agregação plaquetária (WHITE, 1999).

A via da ciclooxigenase conduz a geração de prostaglandinas que incluem PGE2, PGD2, PGF2α, PGI2 (Prostaciclina e tromboxano (Tx A2), todos derivados da ação de enzimas específicas (COTRAN et al., 1996).

Na via da lipooxigenase a 5-lipooxigenase é a enzima predominante dos neutrófilos. O principal produto, a HETE, que é quimiotática para neutrófilos é convertida em uma série de compostos conhecidos como leucotrienos (COTRAN et al., 2000). Dentre os leucotrienos mais importantes está o LTB, que causa aderência de neutrófilos ao endotélio das vênulas pós-capilares, sendo também um potente quimiotático para neutrófilos (CORREA, 2001). O LTC4 LTD4, LTDC4, causam vasoconstrição, broncoespasmo e aumento da permeabilidade vascular (SIQUEIRA & DANTAS, 2000).

Recentemente descobriu-se que o óxido nítrico (NO) pode ser sintetizado por células do organismo com células endoteliais, macrófagos e por neurônios específicos podendo desempenhar funções distintas em muitos tecidos. O NO é uma molécula instável capaz de permear rapidamente membranas biológicas e interagir com a enzima guanilato ciclase solúvel presente em células vizinhas. Assim, o NO sintetizado nas células endoteliais difunde-se rapidamente para fora das células de origem para as células musculares lisas subjacentes, provocando relaxamento e, conseqüentemente vasodilatação e para as plaquetas do lúmen do vaso, inibindo a adesão e agregação destas (PALMER et al., 1987; IGNARO, 1989). Além de promover o relaxamento da musculatura lisa, o NO desempenha outros papéis importantes na inflamação. Reduz a agregação e adesão plaquetária, é citotóxico para determinados micróbios e células tumorais, e sua produção descontrolada por macrófagos ativados no choque séptico pode levar a uma vasodilatação periférica maciça e a choque (COTRAN et al. 2000). Células endoteliais produzem e liberam NO, após a estimulação por citocinas como MCP-1;IL-6; M-CSF, ICAM – 1 e VCAM – 1 (TEDGUI & MALLAT, 2001).

16 As citocinas podem ser definidas como uma família de peptídeos sintetizados por monócitos e linfócitos, destacando-se a interleucina 1(IL-1) e o fator de necrose tumoral (TNF) que participam da resposta inflamatória (MONTENEGRO, 1999). Citocinas são liberadas também por fagócitos ativados em inflamação aguda. TNF-α é um indutor de inflamação aguda local causada por bactérias infecciosas ou lipopolisacarídeos. Interleucina 1 e 6 e TNF- α possuem papel importante não somente na indução da inflamação local mas também na indução da febre que favorece um efeito defensivo contra o agressor por vários dias (YOSHIKAI, 2001).

1.4.3 – Inflamação experimental:

O estudo da reação inflamatória e o desenvolvimento de novas terapias e drogas sempre dependeram de modelos animais apropriados (ALBERTINE, 2001).

Do ponto de vista laboratorial existem diversos métodos experimentais empregados na investigação do processo inflamatório. Estes métodos são bastante variáveis e analisam alguns aspectos do processo inflamatório (GARCIA & LEME, 1979). Exemplos:

- os fenômenos vasculares precoces: dilatação, alterações do fluxo, dinâmica circulatória; - as alterações da permeabilidade vascular;

- o desenvolvimento de edemas;

- a pesquisa de fatores quimiotáticos e seu mecanismo; - os processo fagocitários;

- a análise química e farmacológica de exsudatos inflamatórios e perfusatos de áreas inflamadas, para detecção de substâncias ativas (mediadores e enzimas).

- as alterações no sistema linfático: composição e fluxo da linfa; - os fenômenos dolorosos, sua produção e mecanismos;

- as alterações morfológicas globais, a natureza das células presentes, a extensão do infiltrado celular, a lesão final;

2 OBJETIVO

Objetivo geral:

- Investigar o efeito antiiflamatório do extrato hidroalcóolico liofilizado de flores e folhas de Vernonia scorpioides (Piracá) no processo inflamatório agudo, utilizando-se para isto, os modelos de edema de pata em ratos e peritonite em camundongos.

Objetivos específicos:

- Verificar o efeito inibitório do extrato hidroalcoólico de V. scorpioides em edema de pata induzido por carragenina e histamina.

- Verificar a migração leucocitária após a administração do extrato de V. scorpioides.

- Realizar a análise histológica do músculo plantar dos ratos em relação ao tratamento realizado por diclofenaco sódico e doses do extrato de 0,45g/Kg; 0,67g/Kg e 1,0 g/Kg 4 horas após a indução do edema por carragenina.

- Verificar o melhor tratamento adotado em relação ao extrato hidroalcoólico de V.

18

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Aprovação pelo Comitê de Ética

Neste trabalho foram aplicados os princípios éticos da experimentação animal de acordo com a COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação animal) tendo sido aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Univap seguindo as normas para Prática Didático Científica da Vivissecação de animais. Protocolo L017/2004/CEP (Anexo A).

3.2 Animais

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, machos adultos, pesando entre 150 e 200g, e camundongos machos, pesando entre 15 e 25g, acondicionados em gaiolas de polietileno convencionais (n = 6) em condições de temperatura controlada (22ºC á 28ºC), ciclo de luz controlado (período de luz 6:00 ás 18:00 h) e recebendo água e ração ad

libitum.

3.3 Protocolo de Eutanásia

Os animais foram anestesiados com 0,05 mL de cloridrato de Xilazina mais 0,05 mL cloridrato de Ketamina (10mg/Kg) injetados intraperitonialmente.

Os animais ainda sob o efeito do anestésico foram sacrificados em câmara fechada com Halotano .

3.4 Obtenção do extrato

3.4.1 Coleta do Material Vegetal

A espécie vegetal Vernonia scorpioides foi cultivada durante um período de 2 anos em um sítio particular localizado no Bairro dos Freitas no município de São José dos Campos onde foi realizada a coleta do material vegetal (folhas e flores) no período de intensa floração, em junho de 2003. A identificação botânica já havia sido realizada em 1996, no Instituto de Botânica pela Prof Drª Silvia Chiléia especialista na família Asteraceae (Anexo B).

3.4.2 O Processo extrativo

As folhas e flores de V. scorpioides foram secas á temperatura ambiente durante 10 dias, posteriormente foram colocadas numa estufa de lâmpadas de 100 watts por mais um período de 10 dias, terminando-se a desidratação total do material numa estufa com temperatura controlada á 40º C por mais 3 dias. Após a dissecação total, o material foi moído em moinho elétrico de facas. O pó obtido foi pesado e acondicionado em frasco âmbar e mantido á temperatura ambiente por aproximadamente uma semana.

O extrato fluido foi preparado em percolador de aço inoxidável com capacidade para 5000 mL segundo o processo da Farmacopéia Brasileira 1959, utilizando-se 650g da droga pulverizada, 3000 mL de álcool etílico 70%. A mistura permaneceu no percolador durante o período de seis dias onde foi feita a primeira extração. Adicionou-se ao resíduo a mesma quantidade de álcool etílico 70% (3000 mL) e a mistura foi agitada por mais três dias. Este processo foi repetido por mais uma vez totalizando três extrações (ANDREUCCI, 2002; MENDES, 2001).

O extrato líquido obtido foi concentrado com o auxílio de um rotoevaporador, obtendo-se 138g de extrato concentrado (rendimento de 21%). O extrato foi liofilizado no Laboratório do DR Stephem Hyslop – FCM – Unicamp.

20

3.5 Avaliação Farmacológica – via intraperitonial 3.5.1 Edema de pata induzido pela carragenina

Avaliação do processo inflamatório

O processo inflamatório agudo foi induzido pela administração de carragenina (1000µg/0,1 mL/ pata) no tecido subcutâneo do coxim plantar direito dos animais, sendo o edema medido através de plestimógrafo (UGO BASILLE 7140) Plethysmometer, ornano IMBIBENTE BBC 97 com precisão de duas casas decimais.

O Método utilizado para avaliação do edema inflamatório foi o método da pletismografia de VAN ARMAN et al., (1965). (Figura 5 e 6). A primeira medida do volume da pata foi feita imediatamente antes da injeção do agente irritante e as demais foram feitas de uma em uma hora no período de 4 horas. Nesse método a diferença de volume da pata medido por imersão de líquido reflete o edema acumulado.

O aumento do volume das patas foi calculado pela diferença entre o volume inicial da pata (antes da injeção do agente inflamatório) e o volume a cada hora, durante um período de 4 horas como pode ser observado na figura 6. Os resultados foram expressos como aumento do volume de pata (mL).

Tratamento dos animais

Nos experimentos para se obter a curva dose resposta do extrato de V. scorpioides foram utilizadas três concentrações das doses do extrato (0,45g/Kg; 0,67g/Kg e 1,0 g/Kg) que foram diluídas em 0,3 mL de água deionizada .A determinação das doses foram baseadas no estudo da toxicidade aguda segundo MONTEIRO, (1996); GAD & CHENGELIS, 1998).

O diclofenaco sódico foi utilizado em todos os tratamentos com o objetivo de comparar o efeito antiinflamatório produzido com o extrato vegetal.

22

Figura 6: Fotografia ilustrando a realização da medição do volume da pata em ratos através do

Foram realizados os seguintes protocolos:

Protocolo 1:

Tratamento com o diclofenaco e o extrato 30 minutos antes da indução do edema por carragenina.

Protocolo 2:

Tratamento com o diclofenaco e o extrato imediatamente com a indução do edema por carragenina.

Protocolo 3:

Tratamento com o diclofenaco e o extrato 30 minutos após a indução do edema por carragenina.

Todos os protocolos foram compostos por 30 animais, divididos em 5 grupos (n = 6). Grupo 1: Carragenina (1000µg/pata) - controle

Grupo 2: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com diclofenaco sódico (10 mg/Kg)(i.p).

Grupo 3: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com o extrato de V. scorpioides na dose de 0,45g/Kg (i.p).

Grupo 4: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com o extrato de V. scorpioides na dose de 0,67g/Kg (i.p).

Grupo 5: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com o extrato de V. scorpioides na dose de 1g/Kg (i.p).

24

3.5.2 – Edema de pata induzido por histamina Avaliação do processo inflamatório

O processo inflamatório agudo foi induzido por administração de histamina na dose de 50µg/0,1 mL/ pata (CARVALHO et al, 1999) no tecido subcutâneo do coxim plantar direito dos ratos, sendo o edema medido através de plestimógrafo.

Tratamento dos animais

Após a indução do edema por histamina os ratos foram tratados por via intraperitonial (i.p) com a dose única de extrato de 0,45g/Kg diluído em 0,3 mL de água deionizada. Os animais em todos os experimentos foram tratados com Fernegam (Cloridrato de prometazina) na dose de 4 mg/Kg (COELHO et al., 2004).

Foram realizados os seguintes Protocolos:

Protocolo 4:

Tratamento com Fernegan e Extrato 15 minutos antes da indução do edema por histamina.

Protocolo 5:

Tratamento com Fernegam e o extrato imediatamente após a indução do edema por histamina.

Protocolo 6:

Tratamento com Fernegan e o Extrato 15 minutos depois da indução do edema por histamina.

Todos os protocolos foram compostos por 18 animais divididos em 3 grupos (n = 6). Grupo 1: Histamina (50µg/pata) – controle

Grupo 2: Histamina (50µg/pata) + Cloridrato de prometazina (4mg/Kg) (i.p) Grupo 3: Histamina (50µg/pata) + tratamento com extrato de V. scorpioides na dose de 0,45 g/Kg (i.p).

3.6 Análise histológica

A análise histológica foi realizada para se confirmar o efeito antiiflamatório do extrato de V. scorpioides.

Ao término da 4ª hora do experimento de edema de pata induzido por carragenina o músculo plantar foi retirado para análise histológica e fixado em formol 10 % por um período de 7 dias.

Após este período a peça foi desidratada em etanol com porcentagens crescentes (50%, 70%, 80%, 90%) por períodos de 1 hora e finalmente em álcool 100% durante 8 horas. A peça desidratada foi diafanizada em xilol por 4 horas, permanecendo em parafina ou paraplast por 4 horas na estufa á 58ºC para então ser emblocada para a realização dos cortes histológicos. As peças foram coradas com eosina e hematoxilina e analisadas em microscópico óptico Karl Zeiss e fotografadas com câmara Olimpus BB12 acoplada ao microscópio CX41.

3.7 – Avaliação Farmacológica – via oral 3.7.1- Peritonite

Indução da peritonite

Os camundongos receberam 600 µg/cavidade carragenina suspensa em 0,1 mL solução fisiológica estéril através de injeção intraperitonial para a indução da peritonite e foram tratados por via oral com o extrato de V. scorpioides através de gavagem com as três

26 doses utilizadas no experimento com edema de pata por carragenina (0,45g/Kg; 0,67g/Kg 1,0g/Kg) 30 minutos após a aplicação do agente flocógeno (CARVALHO et al., 1999) e comparados com tratamento com diclofenaco sódico (10 mg /Kg) e o grupo salina.

Foi realizado o seguinte protocolo:

Protocolo 7

Grupo 1: Salina estéril (0,1mL/cavidade) (i.p)

Grupo 2: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) - controle

Grupo 3: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com diclofenaco sódico (10 mg/Kg) (v.o).

Grupo 4: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com o extrato de V. scorpioides na dose de 0,45g/Kg (v.o).

Grupo 5: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com o extrato de V. scorpioides na dose de 0,67g/Kg (v.o).

Grupo 6: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com o extrato de V. scorpioides na dose de 1g/Kg (v.o).

Os animais foram sacrificados 1, 2, 3 e 4 h após a indução da peritonite em câmara fechada utilizando-se Halotano. Em seguida suas cavidades peritoniais foram lavadas com 1mL de solução contendo PBS (dissolvido em 9 partes de água destilada) e 10 µl de heparina. O volume do interior da cavidade foi coletado com pipeta automática e em seguida foram feitas as contagens de leucócitos totais e contagem diferencial.

Contagem total de leucócitos

Para a contagem do número total de células presentes no lavado peritonial utilizou-se 20µl do lavado que foram diluídos em líquido de Tukey (380 µl). Para a contagem foi utilizada a câmara de Neubauer com auxílio de microscópio óptico Karl Zeiss sob aumento de 40x. Os resultados foram expressos como número total de leucócitos por cavidade.

Contagem diferencial de leucócitos

Para a contagem diferencial de leucócitos, alíquotas de 100µl da suspensão celular foram utilizadas para o preparo do citoesfregaço em citocentrífuga (FANAEM – Citospim). A coloração foi realizada pelo método de Instant – Prov e a contagem diferencial das células foi realizada com auxílio de um microscópio óptico (Karl Zeis) com objetiva de imersão em óleo sob aumento de 100x. As populações celulares avaliadas foram de células mononucleares e neutrófilos.

Análise estatística

Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste de variância a 5% de probabilidade (ANOVA) e quando da necessidade de outro teste para determinação da diferença encontrada foi utilizado o teste de Tukey, também com 5% de probabilidade. Os resultados estão expressos na forma de gráficos, que foram escolhidos de acordo com a melhor representação para cada tipo de experimento.

28

4. RESULTADO

4.1 Avaliação farmacológica – via intraperitonial 4.1.1 Edema de pata induzido pela carragenina

A administração de carragenina (0,1mL a 1%) no interior das patas dos ratos causou aumento progressivo do volume das patas que foi mensurado uma hora após a aplicação do agente irritante, apresentando pico máximo na 3ª hora e a redução do volume a partir deste momento em todos os tratamentos realizados.

No experimento de edema de pata induzido por carragenina determinou-se as curvas dose resposta do extrato hidroalcoólico de V. scorpioides quando administrado intraperitonialmente avaliando-se uma possível relação entre a dose administrada e o aparecimento de um efeito antiiflamatório.

No tratamento realizado 30 minutos antes da indução do edema por carragenina todas as doses do extrato diminuíram o edema em relação ao grupo controle. O diclofenaco sódico diminuiu o edema na proporção de 31%, 51%,54%, 40% respectivamente na 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora e a melhor dose do extrato para este tratamento foi a de 1 g/Kg, com ação semelhante ao diclofenaco sódico, na proporção de 31%, 51%, 45% e 48% respectivamente na 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora. (Figura 7)

0

1

2

3

4

5

0

1

2

3

*

*

*

*

*

*

_*

**

*

V

o

lu

m

e

poda

l (

m

L)

Figura 7: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos inoculados com carragenina

(1000 µg/pata). Os animais foram tratados 30 minutos antes (i.p.) com o extrato e diclofenaco, após a aplicação do estímulo (n = 6). Os valores estão representados como média + DP para *P< 0,05, ** P< 0,01, em relação ao controle.

30

A figura 8 representa o tratamento realizado imediatamente a indução do edema por carragenina. Observamos a evolução do edema de pata induzido pela carragenina e diminuição do edema quando tratados com diclofenaco e três doses do extrato. Nota-se que na primeira hora para a dose 0,45g/Kg do extrato, um efeito similar ao diclofenaco e nas demais horas com a mesma dose do extrato houve uma redução significativa do edema em 44% (2ª hora); 50 % (3ª hora) e 60 % na 4ª hora, comparado ao grupo controle.

As outras duas doses utilizadas (0,67g/Kg e 1g/Kg) também provocaram redução do edema em relação ao grupo controle, com efeito similar ao diclofenaco.

No tratamento realizado 30 minutos após a indução do edema por carragenina todas as doses diminuíram o edema de pata em relação ao grupo controle e ao tratamento realizado com o diclofenaco sódico. Nota-se que na 1ª hora o extrato, na dose de 1g/Kg tem um efeito similar ao diclofenaco sódico, apresentando posteriormente nas demais horas uma significativa redução do edema em relação ao grupo controle na proporção de 64%, 72% e 40% respectivamente para a 2ª, 3ª e 4ª hora.

A dose 0,45 g/Kg reduziu o edema em 64%, 59%, 63%, 55% na 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora, respectivamente. As doses utilizadas neste tratamento reduziram o edema numa proporção semelhante, não havendo uma diferença estatística significativa entre elas (Figura 9).

Para analisar a porcentagem de inibição do extrato em todos os experimentos de edema de pata utilizou-se como método a área da curva (expresso em porcentagem).

0

1

2

3

4

5

0

1

2

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Tempo (Horas)

V

o

lum

e

pod

al

(

m

L)

Figura 8: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos inoculados com carragenina

(1000 µg/pata). Os animais foram tratados (ip) imediatamente a aplicação do estímulo com o extrato e o diclofenaco n=6). Os valores estão representados como média + DP *P< 0,05, em relação ao controle.

32

0

1

2

3

4

5

0

1

2

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Tempo (horas)

V

o

lu

m

e

p

o

d

al (

m

L)

Figura 9: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos inoculados com carragenina

(1000 µg/pata). Os animais foram tratados 30 minutos após (ip) a aplicação do estímulo pelo extrato e diclofenaco (n=6). Os valores estão representados como média + DP *P< 0,05, ** P< 0,01, ***P< 0,001 em relação ao controle.

4.1.2 Edema de pata induzido pela histamina

O edema de pata provocado por histamina obteve seu pico máximo aos 60 minutos, onde o edema foi mensurado de 30 em 30 minutos após a aplicação do agente irritante. O

volume da pata voltou ao nível normal após 120 minutos. Neste experimento o edema foi mensurado até o 180 minutos onde foram realizados

os seguintes tratamentos: 15 minutos antes, imediatamente e 15 minutos depois da indução do edema pelo extrato e fernegam, devido ao fato do pico máximo do edema provocado pela histamina ocorrer aos 60 minutos.

No tratamento realizado 15 minutos antes da indução do edema por histamina observamos que a dose de 0,45g/Kg do extrato diminuiu o edema aos 30 minutos em 9,6%; 60 minutos em 32%; 90 minutos em 32% e 120 minutos em 15% . O grupo tratado pelo fernegam diminuiu o edema aos 30 minutos em 41%, aos 60 minutos em 55%, 90 minutos em 62% e 120 minutos em 60 % apresentando melhor resultado comparado á dose do extrato utilizado. (Figura 10)

No tratamento realizado imediatamente após a indução do edema por histamina observamos que o extrato na dose de 0,45g/Kg teve ação similar ao fernegam (Cloridato de Prometazina), reduzindo em ambos tratamentos aos 30 minutos em 30%, aos 60 minutos 60% aos 90 minutos 35% e 120 minutos 40 %. Não houve diferença significante após os 90 minutos entre grupo controle, extrato e Fernegam. (Figura 11)

A figura 12 representa o tratamento com Fernegam e extrato realizado 15 minutos após da indução do edema por histamina.

Para este tratamento o fernegam e o extrato diminuíram o edema aos 30 minutos, numa proporção menor que aos 60 minutos onde o extrato e o fernegam diminuíram o edema na proporção de 21%, apresentando portanto uma curva semelhante nos demais intervalos como pode ser observado na figura 12.

34 0 30 60 90 120 150 180 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Histamina 50µg/pata (n=6) Fernegan 4mg/pata (n=6) Extrato 0,45 g/Kg (n=6)

*

*

*

*

*

*

Figura 10: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos inoculados com histamina.

Os animais foram tratados com Fernegam e extrato 15 minutos antes da aplicação do estímulo. Os valores estão representados como média + para animais * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle.

0

30

60

90

120

150

180

0.00

0.25

0.50

0.75

*

_*

*

Tempo (Minutos)

V

o

lu

m

e

p

o

d

al (

m

L)

Figura 11: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos inoculados com Histamina.

Os animais foram tratados com Fernegam e extrato imediatamente com a aplicação do estímulo. Os valores estão representados como média + DP para 6 animais *P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle

36

0

30

60

90

120

150

180

0.00

0.25

0.50

0.75

*

*

_*

_*

*

Figura 12: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos inoculados com histamina.

Os animais foram tratados com Fernegam e extrato 15 minutos após a aplicação do estímulo. Os valores estão representados como média + DP para animais * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle.

4.2 Peritonite induzida pela carragenina

Através do uso do estímulo carragenina é possível produzir uma resposta inflamatória aguda na cavidade peritonial com predominância de um grande número de células polimorfonucleares presentes no exsudato.

Os resultados mostram a migração de leucócitos Totais e Diferenciais durante a 1ª, 2ª,3ª e 4ª horas, revelando a quantidade de células que migraram para o local inflamado nas respectivas horas (Figura 13, 14 e 15).

Para calcular os valores adequados e realizar a confecção dos gráficos, na contagem total e diferencial, utilizamos as seguintes fórmulas (CORREA, 2001) (obtidas pela fundação Oswaldo Cruz):

Contagem Total

Valor da contagem x 2,5 x 40 x 1000 (Resultado desta multiplicação corresponde ao valor real). Onde:

2,5 é o valor de correção da câmara de Newbawer 40 e o valor da diluição (Líquido de Turkey) 1000 é o fator da lavagem da cavidade.

Contagem diferencial

Valor da contagem total ________ 100%

X (Valor real) ________ nº diferencial %

4.2.1 Resultados da migração celular

Contagem Total

Na Figura 13 estão expressos o resultados do experimento, podendo observar a ação antiinflamatória do diclofenaco sódico e do extrato de V. scorpioides sobre o processo de migração leucocitária em camundongos (contagem total).

A contagem do número total de leucócitos que migraram para a cavidade peritonial foi feita durante o intervalo de tempo de uma hora em todos os grupos onde foi aberta a

38 cavidade peritonial dos animais durante a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª horas após a indução de peritonite por carragenina e os resultados podem ser observados na figura 13.

Contagem diferencial

Na contagem diferencial de células determinou-se o número de neutrófilos e células mononucleares que migraram durante a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora após a indução de peritonite por carragenina. Foram contadas 100 células por lâmina diferenciadas entre neutrófilos e células mononucleares até atingir o número total. O resultado foi expresso em porcentagem.

Os valores da migração de neutrófilos analisados durante o intervalo de tempo de 1 á 4 horas após a indução de peritonite por carragenina estão expressos em porcentagem com o mostra a figura 12 . O melhor resultado obtido em relação as doses utilizadas foi com a dose de 1g/Kg que diminuiu o edema em todos intervalos de tempo observados (Tabela 2).

A Figura 13 expressa os valores em porcentagem da migração de células mononucleares analisados durante o intervalo de tempo de 1 á 4 horas após a indução da peritonite por carragenina. Observamos que a dose de 0,67g/Kg e 1,0 g/Kg inibiram a migração de células mononucleares. A dose 2 apresentou um efeito significativo em relação ao grupo carragenina e e a dose 1 (Tabela 3). A dose de 1g/Kg apresentou o melhor resultado observado na quarta hora com valores semelhantes ao diclofenaco sódico e á dose 2.

Para melhor compreensão dos resultados da migração leucocitária induzida por carragenina os resultados estão expressos em porcentagem de inibição do número de leucócitos totais, neutrófilos e células mononucleares migrantes para a cavidade peritonial, comparados com grupo controle carragenina em relação aos tratamentos realizados pelo diclofenaco sódico, e as doses do extrato de V. scorpioides durante o intervalo de tempo de 4 horas nas tabelas 1, 2 e 3.

A

salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3

0 100 200 1 hora 10 6Le uc óc it os tot a is por ca vi d a d e ( m m 3) ** B

salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3

0 50 100 150 * † 2 horas 10 6Le ucó ci to s t ota is p or ca vi dade (m m 3) D

Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3

0 50 100 150 * * † 4 horas 10 6Le uc óc it os t o ta is por ca vi da de ( m m 3)

Figura 13: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45 g/Kg; 0,67g/Kg e 1

g/Kg sobre o processo inflamatório de peritonite em camundongos induzido por carragenina comparados aos grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico ), observando o nº de leucócitos totais migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1, 2 ,3 e 4 horas após a indução da inflamação. Os valores estão representados como média + DP * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle.; P < 0,01diclofenaco x extrato.(A=1; B=2; C=3 e D=4 horas)

C

salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3

0 50 100 150 *† 3 horas 10 6 Le uc óc it os t o ta is por ca vi da de ( m m 3) Carragenina 600µg/pata(n=6) Diclofenaco 10 mg/Kg (n=6) Dose1; 045g/Kg (n=6) Dose2; 0,67g/Kg (n=6) Dose3; 1,0g/Kg (n=6)