Daniela Silvestre
Evolução do genoma mitocondrial e
relações filogenéticas entre
abelhas da subfamília Apinae
São Paulo
2006
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Evolução do genoma mitocondrial e
relações filogenéticas entre
abelhas da subfamília Apinae
Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Doutor em Ciências, na Área de Genética e Biologia Evolutiva.
Orientador(a): Dra. Maria Cristina Arias
São Paulo
2006
Silvestre, Daniela
Evolução do genoma mitocondrial e relações filogenéticas entre abelhas da subfamília Apinae
105p.+IXp+anexo
Tese (Doutorado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva.
1. DNA mitocondrial 2. ordem gênica 3. Subfamília Apinae I. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva.
Fotos da capa: fontes no Anexo I
Comissão Julgadora:
________________________ _____________________________ Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
_________________________ _____________________________ Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
_________________________ Prof(a). Dr(a). Maria Cristina Arias
À minha mãe, em memória, que redefiniu "dificuldades", "superação"
e, principalmente, "AMOR" no dicionário da minha vida. Dedico.
“Era um conceito extremamente simples, mas capaz de explicar com naturalidade toda a infinita e desconcertante complexidade da vida. A admiração reverencial que experimentei fez com que o êxtase que as pessoas descrevem em relação à experiência religiosa parecesse francamente simplório em comparação. Eu escolhi o êxtase do conhecimento em vez do deslumbramento da ignorância,
quaisquer que fossem as circunstâncias”.
Agradecimentos
À minha orientadora Cristina, por todos esses anos de orientação extremamente competente e segura, seja para os experimentos, relatórios, artigos, prévias... E por estar sempre presente. Aos mestres, especialmente à Dra. Lyria Mori, Dra. Eliana Dessen, Dra. Maria Elena Infante-Malachias e Dr. Luís Netto, pelo conhecimento e pela amizade ao longo destes anos.
À maravilhosa Susy, por ótimas conversas! E pela enorme competência técnica também... Aos alunos (atuais e “ex”) do Lab: Leila, Flávio, Dani Lambda, Rute, Geraldo, Christiana, Dani “Zoo”, Lia, André, Alisson e os “filhos adotivos” que passaram mais rapidamente. A cara do laboratório sempre foi mudando, ao longo dos vários anos em que eu estive por aqui! A Elisângela, Sílvia e Luciana pelo apoio técnico no seqüenciamento das minhas muitas amostras.
Aos funcionários do Departamento de Biologia, da Biblioteca e da Seção de Pós-Graduação, pela dedicação e trabalho indispensáveis.
A todos os coletores dos exemplares utilizados neste projeto: não poderia ter sido realizado sem vocês. Em especial a Peter Kwapong, Connal Eardley, Mark Dowton e Isabel Alves dos Santos, pelo fornecimento das amostras de outros países.
À FAPESP, pela bolsa concedida e pelo apoio financeiro. Ao assessor anônimo, que avaliou meu projeto e relatórios e sempre me incentivou.
A todos os meus amigos, que já me ouviram falar tanto das mitocôndrias, da ordem gênica e das minhas abelhinhas incomuns “que vivem solitárias no meio do mato”, e que finalmente pararam de me censurar duramente quando eu explico que tenho que congelar os “pobres bichinhos” pelo bem da ciência!
Eu continuo agradecendo ao meu ônibus fretado, que me trouxe até o Departamento nos últimos onze anos...
De coração, à minha família, por ser tão unida e ter tanto amor. Especialmente, aos meus irmãos-padrinhos, por serem tão fortes e me apoiarem tanto!
À minha segunda família, Alves: antes só no coração, hoje também no nome.
Ao meu Drigo, por ser um homem maravilhoso, um companheiro para todas as horas, por ser meu esposo sem ter deixado de ser meu amigo. Com amor!
Índice
1. INTRODUÇÃO 1
1.1.ODNA MITOCONDRIAL (DNAMT) ANIMAL 1
1.2.REARRANJOS E POTENCIAL PARA INFERÊNCIA FILOGENÉTICA EM ABELHAS 3 1.3.SISTEMÁTICA DE ABELHAS – ESTUDOS TRADICIONAIS E MOLECULARES 5 1.4.GRAUS DE COMPLEXIDADE E ROTAS DE EVOLUÇÃO DO COMPORTAMENTO
SOCIAL 11
1.5.DESCRIÇÃO DOS TÁXONS ESTUDADOS 14
2. OBJETIVO 20
3. MATERIAIS E MÉTODOS 21
3.1.MATERIAL BIOLÓGICO 21
3.2.METODOLOGIA 23
3.2.1.COLETA POR NINHOS-ARMADILHA 23
3.2.2.EXTRAÇÃO DE DNA 26
3.2.3.POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 26
3.2.4.CLONAGEM DOS PRODUTOS DE PCR 29
3.2.5.SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁTICO 30
3.2.6.ANÁLISES COMPARATIVAS/FILOGENÉTICAS 31
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO I: SEQÜENCIAMENTO PARCIAL DE
4.1.SUBUNIDADE MAIOR DO RNA RIBOSSÔMICO (16S) 32
4.2.CITOCROMO C OXIDASE SUBUNIDADE I 39
4.3.CITOCROMO B 46
4.4.“EVIDÊNCIA TOTAL” 52
4.5.ANÁLISES MOLECULARES – CONTEÚDO DE A+T 56
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO II: SEQÜENCIAMENTO DE REGIÕES
MITOCONDRIAIS COM GENES PARA RNAT E ORDEM GÊNICA 60
5.1.ORDENS GÊNICAS MITOCONDRIAIS 61
5.2.DESENHO E ANÁLISE DAS ESTRUTURAS SECUNDÁRIAS DOS RNAT 65
5.2.1.RNAT-ALA (A) 66
5.2.2.RNAT-LYS (K) 66
5.2.3.RNAT-MET (M) 68
5.2.4.RNAT-VAL (V) 69
5.3.A ORDEM GÊNICA NA ÁRVORE DE MICHENER (2000) 70
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO III: ANÁLISES DA TRIBO MELIPONINI 73
6.1.ORDEM GÊNICA DO CLUSTER 4 74
6.2.SEQÜÊNCIAS PARCIAIS DO GENE COI 76
7. CONCLUSÕES 85
RESUMO 89
ABSTRACT 92
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 94
ANEXO I – FONTES DAS FOTOS DA CAPA 107
1. Introdução
1.1. O DNA mitocondrial (DNAmt) animal
O DNAmt animal possui genes codificadores para 2 subunidades ribossômicas (12S e 16S), 22 RNA transportador (RNAt), 3 subunidades da enzima citocromo c oxidase (COI, COII e COIII), citocromo B (cytB), subunidades 6 e 8 da ATPase e sete subunidades da NADH desidrogenase (ND1, ND2, ND3, ND4, ND5, ND6 E ND6L), além de uma região rica em A+T (em vertebrados, é chamada D-loop) não codificadora e que parece conter o controle da replicação e transcrição do DNAmt. A região rica em A+T é muito variável entre os organismos, em relação à sua seqüência de bases e tamanho. Ao contrário dessa região, os genes apresentam-se similares em tamanho em uma ampla gama de espécies, entre invertebrados e vertebrados (Brown, 1983; Moritz et al., 1987). Quanto à seqüência de nucleotídeos, o grau de variabilidade depende muito do gene em questão (Simon et al., 1994).
As seqüências completas ou de regiões dos genomas mitocondriais dos metazoários têm sido muito utilizadas para a inferência de relações filogenéticas (Avise, 1994; Sunnucks, 2000). Apesar de sua ampla aplicação, essa metodologia apresenta problemas que precisam ser melhor equacionados, como: evolução convergente dos nucleotídeos, taxas diferenciais de substituição entre os sítios, saturação de mutações em sítios altamente variáveis, substituições não-independentes por seleção na estrutura secundária, e restrições funcionais em termos moleculares (Rokas e Holland, 2000). Além disso, alguns grupos de organismos apresentam evolução muito rápida em sua seqüência de nucleotídeos, o que pode levar a
ambigüidades quando as seqüências são alinhadas, levando a uma falsa associação entre grupos não-monofiléticos (Boore e Brown, 1998).
O advento da era genômica trouxe a oportunidade de evidenciar e comparar caracteres mais raros, como alterações na ordem gênica, em estudos evolutivos e filogenéticos. Tais marcadores parecem evitar os equívocos acima mencionados. Da mesma forma que o conteúdo gênico, a ordem dos genes nos genomas mitocondriais é notavelmente conservada entre os animais, principalmente quando consideramos táxons superiores (Moritz et al., 1987). Rearranjos têm sido descritos entre ordens taxonômicas diferentes, porém são eventos raros, e normalmente apenas os genes para RNAt estão envolvidos (Gray, 1989). Estes são considerados mais móveis por sua similaridade estrutural com os elementos de controle da replicação (Cantatore et
al., 1987; Jacobs et al., 1988).
O primeiro rearranjo descrito em insetos foi descrito entre as ordens Diptera e Orthoptera: a comparação da ordem gênica de Drosophila yakuba (Diptera) e Locusta
migratoria (Orthoptera) apresenta apenas uma troca na ordem de dois genes para
RNAt (Haucke e Gellissen, 1988). Entretanto, a partir de novos dados moleculares, quando outras espécies dentro da Ordem Diptera foram seqüenciadas, mais alterações foram detectadas (Pruess et al., 1992; Beard et al., 1993; Junqueira et al., 2004; Lessinger et al., 2004). Portanto, a ocorrência dos eventos de translocação parece variar muito conforme o grupo estudado. Esse fato aumenta a importância de se determinar com antecedência o grau de variação dentro do grupo a ser estudado, para se verificar em qual nível taxonômico esse tipo de característica poderia ser considerado informativo.
1.2. Rearranjos e potencial para inferência filogenética em abelhas
A constatação desses eventos raros de translocação abriu uma nova perspectiva em estudos filogenéticos, onde seqüências completas de DNAmt podem ser comparadas entre grupos distantes enfocando a ordem gênica mitocondrial. Boore
et al. (1995) utilizaram esse tipo de caracter para inferir as relações filogenéticas
entre grandes grupos de artrópodos e outros invertebrados, chegando a uma árvore única e de alta confiabilidade, sem nenhuma ocorrência de homoplasia. Os resultados desse trabalho parecem resolver uma questão polêmica: sustentam fortemente a monofilia do grupo Mandibulata (Insecta + Myriapoda + Crustacea) em detrimento a um agrupamento chamado de Uniramia (Insecta + Myriapoda + Onychophora). Os autores afirmam que o uso dos rearranjos apresentou muitas vantagens em relação aos métodos anteriormente utilizados para tentar resolver essa questão, como a morfologia ou a comparação de seqüências de DNA (Boore et al., 1995).
Algumas dessas vantagens são bastante citadas na literatura: o grande número de rearranjos potenciais faz com que a convergência seja raríssima; é um caráter seletivamente neutro e a homologia é quase sempre assegurada (Boore e Brown, 1998). Raros casos de homoplasia são descritos, sendo bastante elucidativo aquele encontrado dentro da Ordem Orthoptera, envolvendo sucessivas trocas de posição entre os genes para os RNAt dos aminoácidos lisina e ácido aspártico. Essas alterações parecem ter ocorrido muitas vezes de maneira independente dentro dessa Ordem (Flook et al., 1995).
Numerosos trabalhos têm obtido resultados relevantes empregando a análise da ordem gênica. O aumento do número de organismos cuja ordem gênica é
conhecida provavelmente ajudará a estabelecer caracteres robustos e diagnósticos para ordens, famílias e até mesmo gêneros (Rawlings et al., 2001).
A importância dessas evidências moleculares no entendimento da evolução do genoma mitocondrial, e também da evolução dos táxons animais, nos incitou a utilizá-las em uma tentativa de resolver questões controversas quanto à classificação e filogenia das abelhas (Família Apidae). Esses insetos, pertencentes à ordem Hymenoptera, têm importância fundamental na polinização da vegetação natural e das plantas cultivadas. Além disso, ainda fornecem produtos bastante valorizados pelo homem, como cera, própolis, geléia real e principalmente mel, um dos poucos alimentos impossíveis de serem sintetizados (Grimaldi e Engel, 2005). Em muitos países, as populações apícolas naturais têm sido destruídas pela atividade humana, muitas vezes antes de serem estudadas e conhecidas (Michener, 2000).
A classificação das abelhas e as relações filogenéticas entre elas sempre foram questões muito controversas, sofrendo alterações freqüentes conforme o autor e os métodos adotados. As análises comparativas do genoma mitocondrial (por seqüências e através da ordem gênica) podem constituir fontes de caracteres para a inferência de uma filogenia entre as tribos, subfamílias e famílias. Adotaremos nesse trabalho a classificação publicada recentemente por Charles D. Michener (2000), na qual a Família Apidae fui subdividida em três subfamílias: Xylocopinae, Nomadinae e Apinae. O enfoque deste projeto será a Subfamília Apinae, composta atualmente por 19 tribos. Dentre estas, encontram-se as quatro tribos (Apini, Bombini, Euglossini e Meliponini) hoje chamadas de “Apidae corbiculadas”, as quais definiam uma família à parte antes da classificação de Michener (2000), e que têm especial importância nesse trabalho por Apini e Meliponini serem as únicas tribos que apresentam o grau de comportamento social mais avançado, a eussocialidade. Fazem parte também
dessa subfamília quinze tribos que antigamente compunham a Família Anthophoridae, e uma questão a ser analisada é a polêmica inclusão dessas tribos no grupo tradicionalmente restrito às abelhas corbiculadas. Das 19 tribos de Apinae, 16 estão presentes na região Neotropical, sendo 15 tribos nativas e uma tribo introduzida, Apini (representada pela espécie Apis mellifera) (Tabela I).
Tabela I – Tribos pertencentes à subfamília Apinae segundo Michener (2000) e indicação se presentes (3) ou não (
-
) na região neotropical. As quatro tribos em destaque são as “Apidae corbiculadas”. Tribos Região Neotropical 01- Isepeolini 3 02- Osirini 3 03- Protepeolini 3 04- Exomalopsini 3 05- Ancylini - 06-Tapinotaspidini 3 07- Tetrapediini 3 08- Ctenoplectrini - 09- Emphorini 3 10- Eucerini 3 11- Anthophorini 3 12- Centridini 3 13- Rhathymini 3 14- Ericrocidini 3 15- Melectini - 16- Euglossini 3 17- Bombini 3 18- Meliponini 3 19- Apini3
(introduzida)1.3. Sistemática de abelhas – estudos tradicionais e moleculares
As “Apidae corbiculadas” são um grupo tropical de abelhas com quase 1000 espécies (Roubik, 1989) que formam um clado dentro de Apinae (Roig-Alsina e Michener, 1993). Este é sustentado por vários caracteres, mas o mais conspícuo é a modificação da escopa (conjunto de pelos na perna posterior, responsável pela coleta de pólen e óleos) em uma reentrância com estrutura diferenciada, a corbícula (Figura
1), o que dá o nome ao grupo. Conforme comentado acima, esse grupo recebe especial atenção dos pesquisadores, porque duas tribos (Apini e Meliponini) apresentam um dos mais intrigantes comportamentos animais, a eussocialidade. Uma filogenia robusta entre essas tribos é de suma importância para resolver a dúvida sobre a origem e a evolução desse comportamento.
Figura 1 - Escopa (A) e corbícula (B), onde a seta aponta a reentrância que é preenchida de pólen ou óleos. (retiradas de http://www.ib.usp.br/beetaxon/imagens/escopas.htm)
Assim, a reconstrução da filogenia dessas abelhas tem sido motivo de vários estudos. Apesar de ser característica exclusiva de poucos grupos, a eussocialidade pode ter oferecido enormes vantagens competitivas às abelhas que a apresentam (Michener, 2000). Porém, há controvérsias até nesse ponto: Engel (2001) e Grimaldi e Engel (2005) afirmam que a eussocialidade não seria responsável pela irradiação das abelhas, pois não seria uma característica suficiente para dominância ecológica.
Os estudos de sistemática clássica de abelhas baseiam-se primordialmente em caracteres morfológicos e também comportamentais. Quando procuram esclarecer a questão da evolução do comportamento social no grupo, geralmente os resultados desses trabalhos apontam para uma origem única do comportamento eussocial, pois consideram que as duas tribos eussociais (Apini e Meliponini) compartilham um
ancestral comum exclusivo. Darwin, na sua “Origem das Espécies”, afirma que Meliponini seria intermediário entre Bombini e Apini, ressaltando portanto a origem única do comportamento eussocial no grupo. Essa visão tradicional foi mantida por muito tempo, baseada principalmente nas seguintes características comuns às duas tribos: formação de colônias grandes e perenes; castas morfologicamente diferenciadas; e sistemas elaborados de comunicação entre os indivíduos (Koulianos
et al., 1999).
Em 1977 foi publicado o trabalho de Winston e Michener, baseado em morfologia externa e caracteres comportamentais, que foi inovador em concluir que a eussocialidade surgiu duas vezes independentemente nesses grupos. O argumento central era que Meliponini tinha caracteres que sugeriam uma diferenciação antiga, muito divergente das demais tribos. Bombini e Euglossini foram considerados grupos-irmãos, e Apini seria irmão desse clado. O trabalho de Kimsey (1984) corroborou essa árvore com base em outros caracteres de morfologia externa e também interna.
Na década de 90, outros trabalhos (Prentice, 1991; Roig-Alsina e Michener, 1993) com base em caracteres morfológicos diferentes voltaram a considerar a origem única da eussocialidade, sugerindo que seria um comportamento muito complexo para surgir paralelamente em dois grupos.
Ao mesmo tempo, na década de 90, diversos trabalhos foram feitos baseados em caracteres moleculares. Foram seqüenciados fragmentos dos genes 16S, 18S e 28S (Cameron, 1991 e 1993; Sheppard e McPheron, 1991) e todas essas análises chegaram à conclusão de que o advento da eussocialidade ocorreu duas vezes, pois Apini e Meliponini não são posicionados como grupos irmãos. Bombini aparece
consistentemente como grupo-irmão de Meliponini, mas a relação entre Apini e Euglossini não é bem definida.
Nos trabalhos citados, foram utilizados vários marcadores moleculares diferentes, como o gene mitocondrial para a subunidade maior do RNA ribossômico - 16S (Cameron, 1993). Porém, Cameron (1993) cita em relação ao gene 16S algumas desvantagens, como: (1) dificuldade no alinhamento por apresentar grandes indels; (2) saturação de substituições; (3) estrutura secundária do produto gênico, que prejudica a independência entre os caracteres; e (4) um alto grau de polimorfismo ancestral.
Para superar essas dificuldades, foram feitos estudos com outros genes. Koulianos et al. (1999) utilizaram seqüências do gene mitocondrial para o citocromo B. Genes nucleares também foram seqüenciados, como o 28S e o gene para a opsina (Mardulyn e Cameron, 1999). Há também tentativas de unir dados moleculares de todos esses genes em busca de árvores mais consistentes (Cameron e Mardulyn, 2001). Todos esses trabalhos associam Meliponini com Bombini, separadamente de Apini, indicando que o comportamento eussocial dos dois grupos evoluiu independentemente. Cameron e Mardulyn (2001) acreditam que essas análises seriam mais precisas do que as análises morfológicas, visto que as características de morfologia que são analisadas podem estar convergindo devido ao comportamento comum aos dois grupos, levando assim a acreditar que Apini e Meliponini são grupos irmãos. Além disso, os dados moleculares apresentam um volume maior de caracteres do que os morfológicos e comportamentais, a homologia é mais facilmente assegurada e a evolução dos caracteres segue modelos relativamente simples (Koulianos et al., 1999).
Alguns autores procuram compilar dados morfológicos com moleculares, dando a eles novos tratamentos e interpretações, em uma abordagem chamada de “evidência total”. No caso das abelhas, as árvores filogenéticas obtidas dessa maneira sempre corroboraram as árvores originais dos trabalhos de morfologia. Dois desses trabalhos (Chavarría e Carpenter, 1994; Schultz et al., 1999) afirmam que os dados moleculares somente acrescentam ruído às análises conjuntas, portanto os dados conclusivos seriam os morfológicos, já que a árvore de genes nem sempre equivale à filogenia das espécies.
As árvores que ilustram as relações filogenéticas dentro das “Apidae corbiculadas” sugeridas em cada um dos trabalhos citados acima estão representadas na Figura 2.
E
B
M
A
E
B
M
A
M
M
A
A
B
B
E
E
E
B
M
A
E
B
M
A
A
A
E
E
M
M
B
B
E
B
M
A
E
B
M
A
(A) (B) (C) (D) (E)Figura 2 – Relações entre as “Apidae corbiculadas” resultantes de cada um dos trabalhos citados no texto. Os táxons nos terminais estão representados por letras (A = Apini; B =
Bombini; E = Euglossini e M = Meliponini) Os ramos pontilhados são relações que os trabalhos correspondentes não conseguiram resolver. (A) Árvore baseada em morfologia, chamada de “visão tradicional” (Michener, 1944 e 1974); (B) Dados morfológicos e comportamentais (Winston e Michener, 1977 e Kimsey, 1984); (C) Novos dados morfológicos (Prentice, 1991 e Roig-Alsina e Michener, 1993); (D) Dados moleculares (Cameron, 1993 e Sheppard e McPheron, 1991); e (E) “Evidência total” (Chavarría e Carpenter, 1994).
Não há, portanto, um consenso sobre o assunto, e nenhum marcador se mostrou suficientemente conclusivo, principalmente devido à alta variabilidade e homoplasias. Dentro desse contexto problemático, todas as tentativas de resolver o clássico problema da sistemática das abelhas podem ser consideradas válidas.
Uma importante iniciativa nesse sentido é a obtenção de dados moleculares para genomas mitocondriais completos e de várias espécies de abelhas. Silvestre (2002) seqüenciou cerca de 77% do genoma mitocondrial de M. bicolor. Esse trecho continha todos os 13 genes mitocondriais codificadores para proteínas, 18 dos 22 genes para RNAt e os dois genes para RNAr (sendo um integral e o outro parcialmente seqüenciado). O viés para o uso de bases A+T, bastante evidente em A.
mellifera, mostrou-se ainda mais acentuado em M. bicolor. Foram encontradas
diferenças no tamanho e composição dos genes. As diferenças mais significativas foram aquelas encontradas nas comparações da ordem gênica: pelo menos nove rearranjos na ordem gênica mitocondrial foram observados entre as duas espécies de abelhas, um fenômeno raro entre organismos tão próximos.
A raridade de tais mudanças em outros grupos de organismos foi instigadora a iniciar estudos mais aprofundados do genoma mitocondrial das abelhas, incluindo também representantes das outras tribos de Apinae. Considerando que as duas tribos, Apini e Meliponini, são justamente aquelas que compartilham o comportamento eussocial, foi levantada a hipótese de que esses rearranjos poderiam servir como um excelente marcador para estudar a origem e a evolução desse comportamento, dentro
de um enfoque maior, sobre a história filogenética e também sobre o padrão de evolução de algumas características do DNAmt dentro do grupo.
A baixa ocorrência dos eventos de translocações dentro de grupos próximos aumenta sua importância evolutiva, podendo servir como um excelente marcador molecular. Além disso, seqüenciar parcialmente um gene mitocondrial pode ter alto valor filogenético, contanto que a região seja bem escolhida e apresente uma variação mais adequada do que aquelas que foram verificadas nos trabalhos citados acima.
A ordem gênica mitocondrial é citada por diversos autores como um marcador molecular promissor para estudos de filogenia entre grupos distantes (Boore et al., 1995). Ainda não foram realizados trabalhos nesse sentido com a subfamília Apinae, mas existem alguns estudos promissores com ordens de insetos. Dowton e Austin (1999) encontraram um hot spot de translocações de genes para RNAt no genoma mitocondrial de diversos Hymenoptera, porém essencialmente vespas. No entanto, utilizar somente essa região poderia ser um problema devido à alta variabilidade e, portanto, alto grau de homoplasia (Dowton et al., 2002). Outro grupo de insetos que parece ter uma alta taxa de translocações e inversões no DNAmt são os “hemipteróides” (Shao et al., 2001a), e os autores indicam que pretendem ampliar esse estudo a fim de estudar a filogenia das famílias. A experiência obtida com base nesses trabalhos será certamente de grande ajuda para tentar estudar a evolução dentro da subfamília Apinae.
1.4. Graus de complexidade e rotas de evolução do comportamento social
As abelhas compõem um grupo muito diverso quando observamos o nível de socialidade de suas espécies. O comportamento social dos animais apresenta diversos
graus de complexidade, que podem ser classificados em uma escala que vai do comportamento solitário até o eussocial avançado, conforme a presença de certas características etológicas e morfológicas. Será apresentada aqui uma classificação desse comportamento (Michener, 1969), para facilitar o entendimento posterior dos termos relacionados com esse assunto.
• Comportamento solitário
Os membros da espécie não interagem, exceto para corte e acasalamento. O comportamento solitário é o mais comum entre as abelhas: 85% das cerca de 20000 espécies são solitárias. Essas abelhas são muito importantes na polinização de plantas cultivadas e principalmente das plantas selvagens, e estão ameaçadas pelas monoculturas, já que nesse caso o alimento só está disponível (em grande quantidade) em uma pequena época do ano, durante a floração daquela planta específica (Batra, 1984).
• Comportamento subsocial
Os adultos cuidam da própria prole por algum tempo, de forma a aumentar sua sobrevivência. É amplamente encontrada nos artrópodes: crustáceos, aranhas, ácaros, escorpiões, centopéias, baratas, grilos, besouros e hemípteros, além de várias espécies de Hymenoptera.
• Comportamento comunal
Membros da mesma espécie coabitam (mesmo ninho ou próximos), mas não têm cuidado cooperativo das proles. Além de muitas abelhas, também ocorre em aranhas.
• Comportamento quasissocial
Membros da mesma espécie coabitam (mesmo ninho ou próximos), com cuidado cooperativo das proles. Ocorre em abelhas e aranhas.
• Comportamento semissocial
Membros da mesma espécie coabitam (mesmo ninho ou próximos), com cuidado cooperativo da prole, mas nesse caso há diferenciação de castas (operárias estéreis e rainha fértil). Não há, porém, sobreposição entre as gerações, pois a colônia não é perene, desfazendo-se após a reprodução. Muitas abelhas e vespas apresentam esse comportamento.
• Comportamento eussocial “primitivo” ou simples
Cuidado cooperativo com a prole, diferenciação de castas e sobreposição de gerações, com baixo grau de diferenciação (e, portanto, maior flexibilidade no papel de cada indivíduo). Também ocorre em muitas abelhas e vespas. Há um caso descrito em mamíferos: o rato-toupeira sem pelos (Heterocephalus glaber), o único eussocial não-pertencente ao Filo Arthropoda (Grimaldi e Engel, 2005).
• Comportamento eussocial “avançado” ou complexo
Há cuidado cooperativo da prole, diferenciação de castas e sobreposição de gerações, com um altíssimo grau de diferenciação. Isso faz com que o papel de cada indivíduo seja considerado irreversível. Ocorre em todas as espécies de cupins (Ordem Isoptera), que compartilham um ancestral comum eussocial que
surgiu há 140 milhões de anos (Grimaldi e Engel, 2005). Dentro de Hymenoptera, muitas formigas, abelhas (Apinae e Meliponinae) e vespas (Vespinae) apresentam esse grau de comportamento. Assim, em insetos a eussocialidade é restrita a essas duas ordens, além de um único caso em Coleoptera, o besouro eussocial
Austroplatypus incompertus (Kent e Simpson, 1992).
A partir da observação desses comportamentos na natureza, foram idealizadas duas hipóteses a respeito da rota que a socialidade teria tomado ao longo da evolução. A primeira é a rota “subsocial”, em que um adulto solitário teria começado a cuidar de sua prole (apresentando comportamento subsocial), fenômeno que seria seguido de sobreposição de gerações e posteriormente culminaria com o desenvolvimento de uma casta estéril, até o nível eussocial avançado.
A rota “parassocial” inclui mais passos evolutivos para a formação do comportamento eussocial avançado: haveria uma agregação de irmãs da mesma geração (comportamento comunal), em seguida haveria cuidado cooperativo da prole (quasissocial), com posterior diferenciação de castas (semissocial) e por último, a sobreposição de gerações e a total perda da capacidade reprodutiva das operárias, gerando o comportamento eussocial avançado.
Não há provas concretas de qual seria a rota “verdadeira”, mesmo porque ambas podem ter ocorrido em diferentes grupos animais.
Serão apresentadas pequenas descrições das tribos e gêneros dos exemplares estudados neste projeto. Todas as informações abaixo foram retiradas de Michener (2000) e de Silveira et al. (2002):
• Apini
Esta tribo apresenta apenas um gênero, Apis, originário do Velho Mundo e posteriormente introduzido em todos os continentes para a produção de mel. Todas as espécies são eussociais e fazem ninhos em cavidades pré-existentes ou pendurados em galhos de árvores ou rochas. O genoma mitocondrial da espécie A. mellifera foi completamente seqüenciado em 1993 (Crozier e Crozier, 1993), e foi utilizado neste trabalho.
• Bombini
São as mamangabas sociais (bumble bees), pertencentes a um único gênero muito diversificado e rico em espécies, Bombus; sua distribuição é quase cosmopolita, excetuando-se a Austrália, porém são mais bem adaptadas ao clima frio. Tem espécies “primitivamente” sociais, além de algumas parasitas (que não ocorrem no Brasil). A espécie coletada, Bombus morio, ocorre no Brasil desde o Rio Grande do Sul até a Bahia.
• Centridini
Sua distribuição restringe-se à região Neotropical, com alguns grupos nas regiões subtropicais e temperadas da América. São abelhas médias a grandes, coloridas, solitárias, que nidificam plesiomorficamente no solo, freqüentemente em grandes agregações. Inclui dois gêneros, Centris e Epicharis, ambos presentes no
Brasil. O gênero coletado, Centris, reúne muitas espécies, mais abundantes nas regiões tropicais úmidas.
• Emphorini
Espécies robustas e solitárias, sendo muitas especialistas em pólen de algumas espécies de plantas. Esta é uma tribo exclusiva das Américas (do Chile e Argentina até o Canadá, mas sendo mais diversificada nas regiões temperadas da América do Sul). O exemplar, da espécie Melitoma segmentaria, foi coletado em Santa Catarina, local que não havia sido descrito ainda como parte da área de distribuição natural dessa espécie, segundo a lista de Silveira et al. (2002).
• Ericrocidini
Tribo que ocorre somente nas Américas, sendo que no Brasil estão representadas por nove gêneros. São abelhas médias ou grandes, todas cleptoparasitas de espécies da tribo Centridini. O gênero coletado, Mesocheira, distribui-se por toda a região neotropical.
• Eucerini
São abelhas médias a grandes, pilosas, sendo que os machos de muitas espécies são facilmente reconhecidos pelas longas antenas. Quase todas as espécies são solitárias e constroem ninhos no solo. Distribui-se por todo o mundo, exceto Austrália, sendo mais abundantes na América do Sul; no Brasil ocorrem 19 gêneros. O gênero do exemplar que foi coletado, Thygater, é exclusivo da região neotropical.
São chamadas abelhas das orquídeas (orchid bees), com cinco gêneros amplamente distribuídos na região neotropical, principalmente nas florestas úmidas. Os machos são polinizadores de muitas espécies de orquídeas, que visitam em busca de substâncias aromáticas. São solitárias, geralmente grandes e de colorido metálico e vistoso. Geralmente, fazem ninhos em cavidades pré-existentes em barrancos ou árvores. O gênero coletado foi Eufriesea, que tem diversas espécies que ocorrem no Brasil, relativamente raras e freqüentemente sazonais.
• Meliponini
São as abelhas “indígenas sem ferrão”, representadas por muitas espécies em toda a região tropical do mundo e também na região subtropical do hemisfério sul. Além de Apini, é o único grupo que exibe comportamento eussocial, que pode ser observado em todas as espécies (apesar de algumas delas sobreviverem à custa de alimento roubado de outras colônias). Os ninhos são geralmente instalados em cavidades pré-existentes. A espécie Melipona bicolor tem seu genoma mitocondrial quase totalmente seqüenciado (Silvestre, 2002), e esses dados foram utilizados neste trabalho. Outras espécies da tribo também foram analisada, mas somente para a comparação de uma região específica do genoma mitocondrial.
• Tapinotaspidini
Tribo exclusivamente neotropical, composta por espécies solitárias, coletoras de óleo, que antes eram consideradas parte de Exomalopsini. A maioria das espécies nidifica no solo, como o gênero estudado, Lanthanomelissa. A exceção é o outro gênero que foi coletado, Paratetrapedia, que utiliza orifícios pré-existentes na madeira.
• Tetrapediini
São abelhas pequenas e esguias, ocorrendo nas regiões tropicais das Américas. A tribo inclui apenas dois gêneros, sendo Coelioxoides cleptoparasita dos ninhos do outro gênero, Tetrapedia.
• Xylocopinae: Xylocopini
Abundantes nas regiões mais quentes, são chamadas de abelhas carpinteiras porque, à exceção de um subgênero paleártico, costumam nidificar em madeira. Apesar de incluir espécies de comportamento comunal, o gênero estudado (Xylocopa) é solitário e compõe-se de abelhas grandes e robustas.
• Megachilidae: Megachilinae: Anthidiini
A subfamília possui duas características distintivas: as fêmeas carregam pólen em uma escopa ventral, e utilizam material coletado (folhas e resinas vegetais) para a construção de ninhos. São abelhas solitárias, e estão representadas aqui pelo gênero Dianthidium.
• Halictidae: Halictinae: Augochlorini
Abelhas pequenas a médias, de coloração metálica, geralmente fazem ninhos no solo ou em madeira podre. Há diversos graus de comportamento social (solitário a eussocial simples), que evoluíram independentemente dentro do grupo por diversas vezes, inclusive com a ocorrência de reversão da socialidade para comportamento solitário (Wcislo e Danforth, 1997; Danforth, 2002). A tribo é
predominantemente neotropical e certamente monofilética. Foram estudadas duas espécies: Augochlora sp. e Neocorynura sp.
2. Objetivo
O objetivo deste trabalho foi procurar estabelecer relações filogenéticas entre as espécies pertencentes a tribos da Subfamília Apinae que habitam a região neotropical. Considerando que a Subfamília Apinae inclui quatro tribos com diferentes graus de comportamento social, essa filogenia poderia ajudar a compreender melhor a origem e evolução desse comportamento no grupo.
Na busca desse objetivo, foram escolhidas duas categorias de dados moleculares para a obtenção de caracteres filogenéticos:
1. seqüências parciais de genes mitocondriais;
2. seqüências das regiões mitocondriais onde há genes para RNAt, buscando comparar as variações na ordem gênica mitocondrial;
3. Materiais e Métodos
3.1. Material biológico
Os dados de duas tribos, Apini e Meliponini, já haviam sido obtidos previamente: o genoma mitocondrial de Apis mellifera está seqüenciado totalmente (Crozier e Crozier, 1993) e o de Melipona bicolor foi seqüenciado quase integralmente no mestrado (Silvestre, 2002; Silvestre e Arias, in press). Para a realização deste projeto, foram coletados e analisados os dados de dez tribos diferentes dentro da subfamília Apinae. Diversos táxons de outras subfamílias e famílias diferentes de abelhas também foram analisados, para possibilitar o uso de grupos-externos (Tabela II). Foram utilizados indivíduos criados em cativeiro e também espécimes coletados diretamente do ambiente natural, por meio de rede entomológica ou ninhos-armadilha. Em qualquer um dos casos, as amostras obtidas foram imediatamente armazenadas a -80°C até a extração do DNA. Todas as abelhas foram identificadas por uma especialista (Dra. Isabel Alves dos Santos ou Dra. Favízia Freitas de Oliveira) antes de serem analisadas com as técnicas moleculares, diante da impossibilidade de conservação dos indivíduos posteriormente à extração de DNA.
Tabela II - Dados dos exemplares de abelhas estudados. Os asteriscos (*) indicam as espécies cujos dados foram retirados da literatura.
Família Subfamília Tribo Espécie(s) Coletor Cidade de coleta Data de coleta
Apidae Apinae Apini Apis mellifera * * *
Bombini Bombus morio Isabel Alves dos Santos São Paulo, SP 01/10/2001
Centridini Centris sp. Rute Magalhães Brito Sinop, MT 22/06/2001
Centris tarsata Christiana Klingenberg Boracéia, SP 25/01/2003
Emphorini Melitoma segmentaria Thiago de Souza Criciúma, SC 01/03/2005
Ericrocidini Mesocheira sp. Rute Magalhães Brito Cuiabá, MT 25/08/2002
Eucerini Thygater sp. Maria Cristina Arias São Roque, SP 29/05/2001
Euglossini Eufriesea sp. Marilda Cortopassi-Laurino e Márcia F. Ribeiro Mogi das Cruzes, SP 27/11/2001
Meliponini Melipona bicolor * * *
Tapinotaspidini Lanthanomelissa sp. Isabel Alves dos Santos Içara, SC 20/10/2004
Tetrapediini Coelioxoides sp. Isabel Alves dos Santos São Paulo, SP 17/03/2001
Tetrapedia sp. Christiana Klingenberg Boracéia, SP 09/02/2003
Xylocopinae Xylocopini Xylocopa sp. Flávio de Oliveira Francisco São Paulo, SP 10/10/2001
Halictidae Halictinae Augochlorini Augochlora sp. Favízia Freitas de Oliveira São Paulo, SP 27/05/2004
Neocorynura sp. Daniela Silvestre São Paulo, SP 27/05/2004
No decorrer do projeto, também foram amostradas e analisadas outras espécies da tribo Meliponini para verificar a possibilidade de generalização dos resultados obtidos com Melipona bicolor. Assim, foram coletadas mais espécies de meliponíneos brasileiros, principalmente de gêneros considerados distantes de
Melipona, antes considerados outra tribo (Trigonini) e também foram obtidos
exemplares de uma espécie de meliponíneo proveniente da Índia, de duas espécies da Tailândia e de duas espécies da África. Ainda, quatro espécies australianas foram analisadas pelo Dr. Mark Dowton, da Wollongong University, colaborador dessa parte do projeto. A Tabela III apresenta as espécies analisadas e suas regiões de origem dentro da região neotropical.
Tabela III - Espécies de Meliponini coletadas.
Espécie Origem do ninho Coletor Data
Austroplebeia australis Austrália Patrícia Drummond 1997
Austroplebeia symei Austrália Patrícia Drummond 1997
Trigona carbonaria Austrália Patrícia Drummond 1997
Trigona hockingsi Austrália Richard Rowe e Ross Crozier 2005
Schwarziana quadripunctata Cunha, SP, Brasil Maria Cristina Arias 12/07/99
Dactylurina sp. Gana (África) R. Comby 11/04/06
Liotrigona sp. Gana (África) K. Aidoo 03/03/06
Heterotrigona iridipennis Índia Meiyappan Muthuraman 01/09/04
Plebeia remota Prudentópolis, PR, Brasil Flávio de Oliveira Francisco 31/03/98
Lestrimellita limao São Sebastião, SP, Brasil Rute Magalhães Brito 14/03/01
Tetragonisca angustula Sinop, MT, Brasil Rute Magalhães Brito 23/06/01
Trigona doipaensis Tailândia Isabel Alves dos Santos 2000
Trigona flavibasis Tailândia Isabel Alves dos Santos 2000
Scaptotrigona xantotricha Viçosa, MG, Brasil Patrícia Drummond 28/09/99
3.2. Metodologia
3.2.1. Coleta por ninhos-armadilha
Foram instalados ninhos-armadilha para a coleta das tribos solitárias em diferentes cidades do estado de São Paulo: São Paulo (Jardim do Departamento de
Botânica do IBUSP), São Roque, Jaguariúna, Suzano e São Pedro. Cada um desses pontos de coleta recebeu um conjunto de ninhos-armadilha, de dois tipos:
Ninhos de madeira: pequenas caixas de madeira com orifícios de diferentes
tamanhos, que são fechadas com fita crepe e podem ser abertas longitudinalmente (Figura 3). Os ninhos foram emprestados pelo Prof. Dr. Carlos Brandão, do Museu de Zoologia da USP. Foram pendurados em maços, cada um com diversos tamanhos de orifícios (profundidade x diâmetro, em cm): 16 x 1,2; 16 x 1,0; 16 x 0,8; 16 x 0,4; e 8 x 0,2. Essa variedade é importante para tentar atrair o maior número de espécies possível.
Ninhos de cartolina em tronco: tubos confeccionados com cartolina preta,
medindo 8 x 0,5 cm (profundidade x diâmetro). Foram coletados troncos de árvores velhos na Composteira da USP, cada tronco foi perfurado com furadeira elétrica em cerca de 12 pontos de sua lateral, e os canudos de cartolina foram inseridos nesses furos (Figura 4).
As armadilhas foram deixadas nos locais por períodos longos, maiores do que um ano, para abranger todas as possíveis épocas de nidificação. Contudo, eram verificadas mensalmente em busca de amostras. Quando um dos orifícios se encontrava fechado por algum material (cera, argila, terra etc.), o tubo (de madeira ou cartolina) era trazido para o laboratório e aguardava-se os adultos emergirem para identificação e posterior congelamento do espécime. Para tanto, foram montadas incubadoras, com segmentos de 20 cm de mangueira de plástico (5 cm de diâmetro), cujas extremidades foram fechadas com tela de arame (malha de 2 mm) amarrada com barbante (Figura 5). As armadilhas foram mantidas dentro dessas incubadoras, em local iluminado e à temperatura ambiente, e vistoriadas diariamente.
(A) 2 cm2 cm (B)
Figura 3 - Ninhos-armadilha de madeira. Em (A) a armadilha está aberta, com a seta mostrando um resto de cera de uma nidificação. Em (B), pode-se observar um maço de armadilhas de diversos tamanhos, tais como foram colocadas nos locais de coleta.
(A) 2 cm 2 cm 2 cm 2 cm (B)
Figura 4 - Tronco-armadilha, com tubos de cartolina. Em (A), um tronco com diversos tubos encaixados e um tubo (indicado pela seta) em detalhe. Em (B), um tronco e um maço de ninhos de madeira.
(A)
2 cm 2 cm
(B)
Figura 5 - Incubadoras para ninhos-armadilha. Em (A), uma incubadora aberta, durante a colocação de um ninho-armadilha. Em (B), a incubadora já fechada com tela de arame e barbante.
3.2.2. Extração de DNA
Foram adotados dois métodos de extração de DNA, conforme a disponibilidade de indivíduos de cada espécie. Para espécies com mais de um indivíduo coletado, o método escolhido foi o descrito por Sheppard e McPheron (1991). Esse método, em estudos prévios com diversas espécies de abelhas, se mostrou o mais eficiente em termos de rendimento de ácidos nucléicos por tórax macerado e qualidade do DNA obtido, e nos forneceu resultados positivos em reações de PCR e RFLP (Francisco et al., 2001). Não foi possível preservar os espécimes após a extração, visto que esta foi feita a partir do tórax do indivíduo, mas os abdomens e cabeças foram guardados a -80°C para o caso de necessitarmos de mais DNA do mesmo indivíduo na finalização das análises.
No caso das espécies com apenas um indivíduo coletado, foi realizada a extração de DNA pelo método Chelex (Walsh et al., 1991), a partir de uma perna. Apesar do DNA resultante ser menos purificado, o método foi escolhido porque rende um volume final maior a partir de pouco tecido, possibilitando a preservação de mais partes de cada indivíduo para o caso de serem necessárias mais extrações, pois essas abelhas foram coletadas na natureza e não haveria mais indivíduos disponíveis.
3.2.3. Polymerase chain reaction (PCR)
Para amplificar diversas regiões do DNAmt, foram testados primers derivados de Apis mellifera, Melipona bicolor e outros considerados universais para o genoma mitocondrial dos insetos (Hall e Smith, 1991; Simon et al., 1994; Arias et al., 1998, Castro et al., 2002). Para cada espécie estudada, procurou-se amplificar três
fragmentos de genes mitocondriais: subunidade maior do RNA ribossômico (16S), citocromo B (cytB) e citocromo c oxidase subunidade I (COI). Todos esses genes já foram utilizados com sucesso em diversos trabalhos com insetos, sendo que os dois primeiros genes apresentam seqüência mais conservada e o último é mais variável (Simon et al., 1994).
Foram feitas amplificações de regiões entre os genes maiores (codificadores de proteínas e RNAr), procurando determinar a ordem dos genes de RNAt nos genomas. Esse tipo de amplificação é um pouco mais difícil, já que é necessário, em muitos casos, combinar primers derivados de organismos diferentes para se chegar a uma combinação eficaz para amplificar essas regiões variáveis. Roehrdanz et al. (2002) afirma que, em insetos, é impossível prever se um par de primers funciona de uma espécie para outra, o que leva a um enorme número de testes. Todos os primers que geraram amplificação em pelo menos uma das espécies testadas estão na Tabela IV.
Tabela IV - Primers utilizados para a amplificação de regiões do genoma mitocondrial das abelhas estudadas. A tabela indica o gene mitocondrial no qual o primer está localizado e o sentido de amplificação.
Primer Seqüência 5´→3´ Gene Sentido Referência 16SF CACCTGTTTATCAAAAACATGTCC 16S ⇐ Hall e Smith, 1991 16SR CGTCGATTTGAACTCAAATCATG 16S ⇒ Hall e Smith, 1991 5612R GAAATTAATATAACATGACCACC COIII ⇒ Arias et al., 1998 8321R TTATATATCTAATTCTAT ND5 ⇒ desenhado no laboratório AMB 01 TGATAAAAGAAATATTTTGA I ⇒ Arias et al., 1998 AMB 03 TTTAAAAACTATTAATCTTC ND2 ⇒ Arias et al., 1998 AMB 04 GAAAGTTAGATTTACTCC COI ⇐ Arias et al., 1998 ATP8 CTTATAGGTACTATTTGWGG ATP8 ⇐ Castro et al., 2002 COX2 ATTGGACATCAATGATATTGA COII ⇒ Castro et al., 2002 Mel 2 TGGAAAAATAATAATTG ATP6 ⇐ desenhado no laboratório mtD 07 GGATCACCTGATATAGCATTCCC COI ⇒ Simon et al., 1994 mtD 08 CAACATTTATTTTGATTTTTTGG COI ⇒ Simon et al., 1994 mtD 09 CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC COI ⇐ Simon et al., 1994 mtD 10 TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT COI ⇒ Simon et al., 1994 mtD 12 TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA L2 ⇐ Simon et al., 1994 mtD 19 GAAATTTGTGGAGCAAATCATAG COII ⇒ Simon et al., 1994 mtD 22 TCAACAAAGTGTCAGTATCA COIII ⇐ Simon et al., 1994 mtD 26 TATGTACTACCATGAGGACAAATATC CytB ⇒ Simon et al., 1994 mtD 29 GGTCCCTTAGGAATTTGAATATATCCT ND1 ⇒ Simon et al., 1994 NAD3 ATNTTTTTAATTTTTGAYGT ND3 ⇒ Castro et al., 2002 NAD5a GYTGGNTWTTATTCWAARGA ND5 ⇐ Castro et al., 2002 ND4F ATAAATTATGAACTTGGTCATCA ND4 ⇐ desenhado no laboratório Seq 07 GGAATAAGTCGTAACATAG 12S ⇐ desenhado no laboratório Seq 13 CCCTGATACAAAAGGTAC 16S ⇒ desenhado no laboratório Seq 18 GAACTATCAATTTGATATTG COIII ⇒ desenhado no laboratório Seq 19 TGGGATTGAATCCATATTC ND3 ⇐ desenhado no laboratório Seq 21 CTATTAAAACAATTGGTCATC COII ⇒ desenhado no laboratório Seq 30 TCGAGTTCCATTTGATTT ND1 ⇐ desenhado no laboratório Seq 32 AATGCAGTTGCTATTGATA ND6 ⇐ desenhado no laboratório Seq 33 TTTTGATGGACCCAAATTC ND4L ⇒ desenhado no laboratório Seq 34 TCTACATTAAGACAATTAGG ND5 ⇐ desenhado no laboratório Seq 48 ATTACATTTAATTTCCAA ND3 ⇒ desenhado no laboratório Seq 50 TAGAATATTAATAATTTGAAA ND2 ⇒ desenhado no laboratório Seq 51 AATCCTCCAATTAAAAATGG COI ⇐ desenhado no laboratório Seq 52 ATTGGACATCAATGATATTG COII ⇒ desenhado no laboratório Seq 53 CTTATAGGTACTATTTGWG ATP8 ⇐ desenhado no laboratório Seq 56 TATGTACTACCATGAGGACAAATAT CytB ⇒ desenhado no laboratório Seq 57 GTAGCATTTTTAACTTTATTAGAAC ND1 ⇐ desenhado no laboratório Seq 58 TTGAGGAGCAACAGTTATTAC CytB ⇒ desenhado no laboratório Seq 59 AAATATCATTCAGGTTTAATRTG ND1 ⇐ desenhado no laboratório Seq 60 GAAATATTTTGATAAAATATT I ⇒ desenhado no laboratório Seq 61 GGTTCATACCCTGTCGATAAAT M ⇒ desenhado no laboratório Seq 63 TGCATGACTAGTAACAATTG COI ⇐ desenhado no laboratório Seq 65 ATAGGTACTATTTGWGGAAT ATP8 ⇐ desenhado no laboratório Seq 66 TAATTTTTGAYGTTGAAATT ND3 ⇒ desenhado no laboratório TpheF GCGTAATATTGAAAATATTAATGA F ⇐ desenhado no laboratório
Para as reações de PCR foram utilizados 1 µl do DNA extraído por um dos métodos acima; 5 µl de tampão de PCR; 1,5 µl de MgCl2 100mM; 1,5 µl de cada primer 20 µM; 5 µl de dNTPs 2 mM cada e 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), em um volume final de 50 µl. As condições de amplificação inicialmente utilizadas foram: desnaturação inicial por 5 min. a 94°C, seguida por 35
ciclos (desnaturação a 94°C/1 min.; anelamento a 42°C/1min. e 20 seg. e elongação a 64°C/2 min) e de um passo extra de extensão a 64°C por 10 min.
Os produtos amplificados foram analisados eletroforeticamente em gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídeo e os fragmentos visualizados através de luz ultravioleta (UV). Nos casos em que a amplificação não ocorreu, foram realizadas tentativas posteriores, aumentando a concentração de MgCl2 em até 10% ou
diminuindo a temperatura de anelamento em até 4°C, a fim de diminuir a estringência das condições e aumentar a chance de amplificação. Nos casos de amplificação com baixo rendimento, uma estratégia utilizada foi a adição de Betaína (USB), à concentração final de 1M (Hengen, 1997). Por outro lado, se a amplificação dava origem a bandas extras, a banda correta era excisada do gel e purificada com o Purelink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) conforme instruções do fabricante, e então submetida à clonagem.
3.2.4. Clonagem dos produtos de PCR
Os fragmentos resultantes da reação de PCR foram ligados em plasmídeos específicos para essa finalidade, utilizando o kit pGEM-T Easy (Promega) ou o TA Cloning Kit (Invitrogen), conforme as instruções dos fabricantes.
Células competentes de Escherichia coli foram preparadas de acordo com o método descrito por Sambrook et al. (1989) e transformadas com os plasmídeos recombinantes de acordo com o seguinte protocolo: 100 µl de células foram incubados com 2 µl de plasmídeo recombinante por 15 minutos no gelo, em seguida a 37°C por 5 minutos e por mais 15 minutos no gelo. À temperatura ambiente, 250 µl de meio LB foram acrescentados, seguindo-se uma incubação a 37°C sob agitação
por uma hora. As células transformadas foram plaqueadas em meio LB-ágar com ampicilina (150mg/L) e X-Gal (100mg/L) e incubadas pela noite a 37°C. Colônias brancas (contendo plasmídeos recombinantes) foram inoculadas em meio LB e incubadas pela noite a 37°C.
Os plasmídeos recombinantes foram extraídos pelo método para miniprep descrito no manual “Automated DNA Sequencing Chemistry Guide” da Perkin Elmer Corporation, o qual pode ser encontrado no site da empresa (http://www.appliedbiosystems.com). Para verificar se realmente continha o inserto de tamanho esperado, uma alíquota de 10% de cada miniprep foi digerida com 5U de
Eco RI. Esta enzima possui dois sítios de restrição que flanqueiam o inserto, de modo
que, quando ocorre a digestão, este é isolado do plasmídeo. Ao final de uma hora, as digestões foram interrompidas e submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8%. Os géis foram corados com brometo de etídeo e os fragmentos visualizados através de luz UV. Os clones foram considerados positivos quando o inserto excisado do plasmídeo apresentou um tamanho compatível com o produto de PCR correspondente.
3.2.5. Seqüenciamento automático
Os clones positivos foram seqüenciados utilizando-se o kit para seqüenciamento automático “Big Dye Terminator” (Applied Biosystems), seguindo o protocolo do fabricante. As amostras foram analisadas em seqüenciadores automáticos modelo ABI-PRISM 310 (Applied Biosystems), do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do IB-USP; ou modelo ABI-PRISM 3100 (Applied Biosystems), do Departamento de Botânica do IB-USP ou da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia – USP. Primers complementares a regiões do plasmídeo
(M13forward: GTTTTCCCAGTCACGAC e M13reverse: CAGGAAACAGCTATGAC), foram utilizados nas reações de cycle sequencing.
Para cada região, foram seqüenciadas e alinhadas as duas fitas de DNA de no mínimo dois clones, para garantir a exatidão da seqüência final.
3.2.6. Análises comparativas/filogenéticas
As seqüências nucleotídicas parciais de genes mitocondriais foram alinhadas entre as espécies utilizando o algoritmo CLUSTALW dentro do programa DAMBE (Xia, 2000), com os parâmetros sugeridos por Schneider (2003). Para uma apresentação mais clara dos resultados, os alinhamentos foram importados para o
software BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999).
As relações filogenéticas foram inferidas através do programa MEGA (Kumar
et al., 2001). Foram empregados quatro métodos para construção das árvores
disponíveis no programa, sendo três baseados em distância (Neighbor-Joining, UPGMA e Evolução Mínima) e um baseado em homologia (Máxima Parcimônia). Para todos os métodos, foi realizado o teste de bootstrap com 1000 replicações para que cada nó interno recebesse um número, que representa sua confiabilidade.
Para a busca e análise dos genes para RNA transportadores, foi utilizado tRNA-Scan, um sistema que pode ser utilizado diretamente na Internet (http://www.genetics.wustl.edu/eddy/tRNAscan-SE; Lowe e Eddy, 1997), além da busca manual por alinhamento entre seqüências.
4. Resultados e Discussão I:
Seqüenciamento parcial de genes mitocondriais
Os resultados serão apresentados por gene analisado, para as espécies representantes das tribos de Apinae. As árvores foram comparadas quanto à topologia, sendo apresentadas nesta tese a árvore de consenso baseada em parcimônia e apenas uma das três árvores baseadas em distância, já que todas elas apresentaram topologias iguais. Assim, escolhemos Neighbor-Joining para a apresentação dos resultados, por ser a mais utilizada e a menos criticada na literatura consultada. Esse é um método baseado diretamente nos caracteres. Já pelo método de Máxima Parcimônia, é considerada a árvore mais provável aquela que requer o menor número de mudanças para explicar toda a variação da matriz de caracteres. É, portanto, baseado na homologia: se dois táxons compartilham o mesmo estado de caráter, assume-se que herdaram do ancestral comum (Schneider, 2003).
4.1. Subunidade maior do RNA ribossômico (16S)
Foram obtidas seqüências para 12 espécies, além das seqüências já publicadas de A. mellifera e M. bicolor. A Figura 6 representa o alinhamento entre as 14 seqüências parciais do gene 16S, totalizando 547 sítios alinhados a partir da posição 13415 do genoma de A. mellifera. A Tabela V apresenta o número de diferenças e as distâncias genéticas simples calculadas com base no alinhamento.
Figura 6 -Alinhamento das seqüências parciais do gene 16S obtidas para 14 espécies, utilizando-se o programa CLUSTALW. Os nomes das espécies estão na coluna da esquerda. Os pontos representam posições em que as bases são idênticas às da primeira espécie, A. mellifera.
Tabela V - Número absoluto de diferenças de bases entre as seqüências do gene 16S das 14 espécies analisadas (abaixo da diagonal) e distâncias genéticas simples calculadas com base nessas diferenças (acima da diagonal). As células em cinza contêm a maior e a menor distância encontradas. [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [1] Apis mellifera 0,20 8 0,167 0,232 0,149 0,188 0,143 1 0,17 0,171 0,165 0,180 0,232 0,199 0,186 [2] Augochlora sp. 96 0,20 6 0,247 0,216 0,221 0,232 0,210 0,219 0,210 0,214 0,160 0,210 0,234 [3] Bombus morio 77 95 0,20 3 0,14 3 0,16 5 0,12 8 0,14 5 0,12 3 0,11 7 0,16 9 0,22 1 0,17 5 0,16 7 [4] Centris sp. 10 7 114 94 0,203 0,184 0,216 0,197 3 0,20 0,197 0,219 0,260 0,186 0,201 [5] Coelioxoides sp. 69 100 66 94 0,19 9 0,136 0,156 0,169 2 0,16 0,165 0,208 0,182 0,177 [6] Centris tarsata 87 102 76 85 92 0,16 2 0,15 4 0,16 5 0,15 6 0,19 5 0,21 0 0,20 1 0,18 8 [7] Eufriesea sp. 66 107 59 100 63 75 0,14 5 0,160 0,154 0,158 0,201 0,160 0,156 [8] Lanthanomelissa sp. 79 97 67 91 72 71 67 0,15 8 0,152 0,173 0,199 0,141 0,154 [9] Melipona bicolor 79 101 57 94 78 76 74 73 0,01 3 0,16 5 0,23 2 0,17 3 0,16 7 [10] Melitoma segmentaria 76 97 54 91 75 72 71 70 6 0,158 0,223 0,171 0,162 [11] Mesocheira sp. 83 99 78 101 76 90 73 80 76 73 0,23 6 0,184 0,169 [12] Neocorynura sp. 10 7 74 102 120 96 97 93 92 107 103 109 0,20 6 0,21 9 [13] Tetrapedia sp. 92 97 81 86 84 93 74 65 80 79 85 95 0,15 2 [14] Thygater sp. 86 108 77 93 82 87 72 71 77 75 78 101 70 Figura 6 (cont.)
A Figura 7 apresenta a árvore de consenso (acima de 50%) entre duas árvores mais parcimoniosas, utilizando a Máxima Parcimônia e a
Figura 8 representa a árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining (NJ).
Figura 7 - Árvore de consenso (acima de 50%) entre duas árvores mais parcimoniosas, obtidas pelo método de Máxima Parcimônia, a partir de 547pb do gene 16S das 14 espécies, com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies de mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.
Halictidae
Apidae Apidae
Figura 8 -Árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining, a partir de 547pb do gene 16S das 14 espécies, com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de
bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais
símbolos foram utilizados para representar espécies de mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.
Há diferenças na topologia das duas árvores, nas posições de Tetrapedia sp.,
Thygater sp. e Lanthanomelissa sp. As duas espécies de Centris estão agrupadas em
ambas, conforme o esperado. No entanto, nenhuma delas reúne as espécies de Tetrapediini (Coelioxoides sp. e Tetrapedia sp.).
Os dados de 16S não agrupam as “Apidae corbiculadas”, o que é incompatível com todas as fortes evidências de que o grupo é monofilético (Michener, 2000). As árvores não resolvem as relações entre as tribos, por conterem a incompatibilidade citada no parágrafo acima.
O gene 16S foi utilizado por outros autores para tentar resolver as relações entre as “Apidae corbiculadas” (Cameron, 1993; revisão dos dados em Cameron e Mardulyn, 2001). A árvore resultante dos trabalhos citados acima tem sua topologia apresentada na Figura 9.
Figura 9 – Única árvore mais parcimoniosa obtida a partir do gene 16S, retirada de Cameron e Mardulyn (2001). Os valores acima dos nós são os de bootstrap.
Para comparação direta com o trabalho de Cameron e Mardulyn (2001), inferiu-se então uma árvore filogenética utilizando apenas os dados referentes às
“Apidae corbiculadas” e algumas espécies como outgroup (Figura 10). Para essa finalidade, foram escolhidas duas espécies de Halictidae (Augochlora sp. e
Neocorynura sp.).
Figura 10 – Árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining, a partir de 547pb do gene 16S das espécies de “Apidae corbiculadas” e dois outgroups.
Essa árvore reúne Bombini e Meliponini como grupos-irmãos, assim como Apini e Euglossini, repetindo a topologia do trabalho de Cameron e Mardulyn (2001). Fica claro que o acréscimo de mais espécies de Apinae trazido por este trabalho não ajudou a inferir a filogenia do grupo, além de demonstrar que o marcador não oferece resolução dentro da subfamília. Isso pode ser causado por problemas no posicionamento dos indels no alinhamento das seqüências, pois os genes não-codificadores para proteínas sempre apresentam esse tipo de dificuldade.
As diferenças entre as árvores obtidas a partir do mesmo gene parece ser indicativa da baixa resolução desse gene para separar o grupo em questão. Além disso, a árvore que inclui apenas as corbiculadas perde sua confiabilidade ao observarmos que o grupo torna-se parafilético quando a análise inclui as outras espécies de Apinae. Provavelmente, dados mais consistentes gerariam resultados mais semelhantes, não dependendo tanto da análise escolhida ou dos grupos acrescentados.
4.2. Citocromo c oxidase subunidade I
Foram seqüenciados e alinhados 439pb a partir da posição 2072 do genoma mitocondrial de A. mellifera, para 14 espécies, além das seqüências de A. mellifera e
M. bicolor. A Figura 11 representa o alinhamento entre as dezesseis seqüências
parciais da citocromo c oxidase subunidade I. A Tabela VI apresenta o número de diferenças e as distâncias genéticas simples calculadas com base no alinhamento.
Figura 11 - Alinhamento das seqüências parciais do gene COI obtidas para 16 espécies, utilizando-se o programa CLUSTALW. Os nomes das espécies estão na coluna da esquerda. Os pontos representam posições em que as bases são idênticas às da primeira espécie, A. mellifera.
Tabela VI - Número absoluto de diferenças de bases entre as seqüências do gene COI das 16 espécies analisadas (abaixo da diagonal) e distâncias genéticas simples calculadas com base nessas diferenças (acima da diagonal). As células em cinza contêm a maior e a menor distância encontradas. [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [1] Apis mellifera 0,305 0,151 0,179 0,194 0,191 0,179 0,202 0,171 0,134 0,177 0,154 0,248 0,191 0,182 0,174 [2] Augochlora sp. 107 0,328 0,293 0,319 0,305 0,288 0,328 0,293 0,291 0,293 0,288 0,182 0,293 0,316 0,288 [3] Bombus morio 53 115 0,188 0,194 0,191 0,208 0,194 0,148 0,120 0,202 0,137 0,271 0,197 0,197 0,160 [4] Centris sp. 63 103 66 0,134 0,179 0,211 0,199 0,145 0,182 0,185 0,165 0,259 0,199 0,151 0,177 [5] Centris tarsata 68 112 68 47 0,174 0,234 0,197 0,171 0,194 0,214 0,168 0,282 0,225 0,188 0,191 [6] Coelioxoides sp. 67 107 67 63 61 0,225 0,165 0,157 0,168 0,191 0,134 0,265 0,205 0,137 0,168 [7] Dianthidium sp. 63 101 73 74 82 79 0,222 0,222 0,208 0,197 0,208 0,239 0,222 0,211 0,211 [8] Eufriesea sp. 71 115 68 70 69 58 78 0,174 0,188 0,199 0,165 0,276 0,219 0,185 0,185 [9] Lanthanomelissa sp. 60 103 52 51 60 55 78 61 0,168 0,171 0,137 0,245 0,188 0,148 0,154 [10] Melipona bicolor 47 102 42 64 68 59 73 66 59 0,182 0,154 0,254 0,211 0,165 0,162 [11] Melitoma segmentaria 62 103 71 65 75 67 69 70 60 64 0,154 0,256 0,211 0,194 0,191 [12] Mesocheira sp. 54 101 48 58 59 47 73 58 48 54 54 0,245 0,171 0,145 0,123 [13] Neocorynura sp. 87 64 95 91 99 93 84 97 86 89 90 86 0,242 0,279 0,242 [14] Tetrapedia sp. 67 103 69 70 79 72 78 77 66 74 74 60 85 0,197 0,199 [15] Thygater sp. 64 111 69 53 66 48 74 65 52 58 68 51 98 69 0,174 [16] Xylocopa sp. 61 101 56 62 67 59 74 65 54 57 67 43 85 70 61
A Figura 12 apresenta a árvore de consenso (acima de 50%) de dez árvores mais parcimoniosas, utilizando a Máxima Parcimônia. A árvore obtida por Neighbor-Joining apresentou a mesma topologia e valores de bootstrap.
Figura 12 - Árvore de consenso (acima de 50%) entre quatro árvores mais parcimoniosas, obtidas pelo método de Máxima Parcimônia, a partir de 439pb do gene COI das 16 espécies (dos quais 173 eram informativos para o método), com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies de mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.
Há ramos bastante incompatíveis com a visão tradicional da filogenia das abelhas. Por exemplo, a árvore separa a tribo Euglossini das demais “Apidae corbiculadas” (Apini, Bombini e Meliponini), sendo que o grupo é bastante coeso morfologicamente por compartilhar um caráter importante, a corbícula (escopa modificada). As duas espécies de Tetrapediini (Coelioxoides sp. e Tetrapedia sp.) estão muito distantes, ao contrário do esperado, e formam um grupo parafilético.
Os dados de COI, por outro lado, agruparam com altos valores de bootstrap as espécies de Centridini (Centris sp. e Centris tarsata) e as espécies da família Halictidae, tribo Augochlorini (Augochlora sp. e Neocorynura sp.), separando estas últimas de Megachilidae (Dianthidium sp.) e de Apidae (as demais). As árvores sugerem uma relação forte entre Bombini (Bombus morio) e Meliponini (Melipona
Apidae
Halictidae Megachilidae
bicolor), em detrimento à união dos ramos Apini e Meliponini que aparece nos
trabalhos de morfologia. O fato de Apini não compartilhar um ancestral comum exclusivo com Meliponini, tanto nesta árvore quanto em muitos trabalhos com dados moleculares (Cameron, 1993; Koulianos et al., 1999; Schultz et al., 1999), parece indicar uma origem dupla para a eussocialidade em Apinae.
Outra hipótese seria o surgimento da eussocialidade no ancestral comum a Apini, Bombini e Meliponini com reversão para socialidade menos avançada em Bombini. Se por um lado a maioria dos trabalhos sobre Apinae rejeitam essa possibilidade como um evento complexo demais para sofrer reversão, por outro o fenômeno da reversão da socialidade para comportamentos solitários já foi descrito em diversas tribos de Halictidae (Wcislo e Danforth, 1997; Danforth, 2002). Nessa família, existem espécies com variação intraespecífica do comportamento social. Tendo em vista esse panorama, não há como concluir qual das duas hipóteses (dupla origem ou origem única com reversão) teria ocorrido apenas com base em árvores filogenéticas.
É possível observar que os valores de bootstrap são bastante baixos em diversos nós da árvore. Se condensarmos todos os ramos abaixo de 50% de bootstrap, obteremos a árvore da Figura 13.
Figura 13 - Árvore de consenso da Figura 12, condensada acima de 50% de bootstrap. Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies de mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.
Essa árvore demonstra claramente que os dados reproduziram apenas as relações entre alguns pares de espécies muito próximos (Augochlora sp.+Neocorynura sp.; Bombus morio+Melipona bicolor; e Centris sp.+Centris
tarsata) e dividiu as famílias como o esperado. Não há resolução para esclarecer
nenhuma outra relação na árvore, o que explica os “erros” nos demais agrupamentos. Foi realizada uma tentativa de utilização das seqüências de aminoácidos de COI, inferidas a partir da tradução das seqüências de DNA pelo código genético mitocondrial dos insetos. O resultado do método de Máxima Parcimônia está na Figura 14.
Halictidae Megachilidae
