Considerações finais

As abelhas são um grupo de insetos que surgiu no começo do Cretáceo, e sofreu uma enorme radiação adaptativa há cerca de 90 milhões de anos, concomitantemente com a radiação das angiospermas. Segundo Grimaldi e Engel (2005), muitas famílias, subfamílias e até mesmo tribos das abelhas já estavam diferenciadas no final do Cretáceo, o que significa muito tempo até os dias de hoje, mesmo em escala geológica. Isso implica em uma grande divergência molecular entre esses grupos.

Além disso, as abelhas apresentam uma alta taxa de substituição de bases em seu DNAmt (Crozier e Crozier, 1993; Black e Roehrdanz, 1998). As causas dessa aceleração no genomas mitocondriais dos animais podem estar relacionadas a diversos fatores: eficiência no reparo, taxa de divisão celular, tempo de geração ou taxa metabólica (Martin e Palumbi, 1993).

Assim, o seqüenciamento de fragmentos gênicos não ofereceu resultados consistentes neste trabalho, pois apenas alguns grupos foram mantidos com alta fidelidade. Como nos trabalhos anteriores de seqüenciamento de DNA das abelhas, as árvores não têm resolução. Apesar de alguns trabalhos sugerirem que o aumento dos dados sobre esses organismos seria útil para obter relações mais consistentes (Lockhart e Cameron, 2001), há evidências de que ocorreria exatamente o contrário: segundo Huelsenbeck et al. (1996), quando há atração entre os ramos longos de uma determinada árvore, o aumento de dados leva ao aumento da inconsistência da árvore. Já em 1993, Kumazawa e Nishida afirmaram que as seqüências de DNAmt podem não ter sucesso para obter filogenias em grupos com tempo de divergência

igual ou maior do que 100 milhões de anos. A morfologia, por outro lado, pode ser influenciada por uma forte evolução paralela devido aos hábitos comuns a todos os grupos, principalmente a alimentação à base de pólen. Alguns trabalhos afirmam que os problemas se resumem a utilizar bons métodos de recuperação de filogenia. Não acredito que o método escolhido faria diferença se os dados fossem realmente consistentes, pois nesse caso qualquer método simples deveria reconstruir com fidelidade uma árvore de mesma topologia e relações entre os táxons. É possível que a utilização de critérios escolhidos de forma mais específica consiga corrigir pequenos defeitos ou aumentar os valores de bootstrap de uma árvore, mas dificilmente seria capaz de sobrepujar os problemas encontrados com os dados deste e de outros trabalhos moleculares. O problema é, certamente, intrínseco à alta divergência entre as abelhas. Como a questão não é metodológica, e sim diretamente derivada da extrema diferenciação dos grupos, o problema parece não ter solução: acredito que a filogenia das abelhas dificilmente será resolvida.

Os rearranjos dos genes parecem ser os novos alvos das análises moleculares do genoma mitocondrial, pelos motivos discutidos aqui. Os resultados podem variar desde uma extrema conservação, como em mamíferos ou insetos de diversas ordens (Diptera, Coleoptera, Orthoptera e Lepidoptera) (Dowton, 2004), até grupos com uma taxa tão elevada de rearranjos que eles podem não oferecer informações filogenéticas relevantes, devido à ocorrência de homoplasia. Alguns grupos desse tipo são os crocodilos (Kumazawa e Nishida, 1995), aves (Mindell et al., 1998), insetos hemipteróides (Shao et al., 2001a; Shao et al., 2003) e Hymenoptera (Dowton e Austin, 1999; Dowton et al., 2002).

Estudos desse tipo são muito raros, principalmente devido ao seu alto custo operacional. Quando se quer seqüenciar um trecho de um gene para comparação,

geralmente são analisados cerca de 500pb de cada espécie. Para analisar ordens gênicas, são necessárias muito mais bases seqüenciadas, às vezes até o genoma mitocondrial completo (cerca de 16000pb). No Brasil, foram reportados pouquíssimos trabalhos com esse tipo de marcador em Arthropoda, oriundos do grupo de mitogenômica de moscas (Calliphoridae) do CBMEG-UNICAMP (Lessinger et

al., 2004) e de nosso laboratório com as abelhas (Silvestre et al., 2002; Silvestre e

Arias, in press).

Em Hymenoptera, a taxa de rearranjos é tão elevada que a homoplasia torna- se muito comum (Dowton e Austin, 1999; Dowton et al., 2002). É necessário muito cuidado para evitar os problemas trazidos por esse fator: por exemplo, o cluster 4 apresenta a ordem dos genes KD em abelhas e em um gafanhoto, e DK na maioria dos outros insetos. Porém, considerar “abelhas + gafanhotos” como monofilético separaria os Holometabola, um grupo sólido dentro dos insetos.

Portanto, em concordância com Dowton et al. (2002), acreditamos que os estudos da ordem gênica mitocondrial estão em sua infância. Em sua revisão sobre a mitogenômica, Rand (2001) afirmou que se faz necessária uma amostragem criativa de espécies e populações com diferentes histórias naturais para permitir o aumento do conhecimento da área. Assim, há muito a ser aprendido sobre esse tipo de informação, que sem dúvida mostrará seu valor conforme os dados aumentarem e representarem o maior número possível de espécies; esta tese é uma contribuição em direção a esse objetivo.

As seqüências do DNA mitocondrial (DNAmt) e, mais recentemente, a ordem dos genes desse genoma têm sido amplamente utilizadas como fontes de caracteres para estabelecer relações filogenéticas entre organismos. A inferência da filogenia dentro do grupo das abelhas, e em especial da subfamília Apinae, sempre apresentou muitas dificuldades, tanto com as metodologias tradicionais quanto com análises moleculares. Essa subfamília destaca-se das demais pelo fato de compreender espécies que apresentam diferentes graus de comportamento social; a origem e evolução desse comportamento são assuntos extremamente controversos e merecedores de estudo. O objetivo deste projeto foi o estudo do genoma mitocondrial e das relações filogenéticas entre as abelhas da subfamília Apinae empregando dois métodos: seqüenciamento parcial de três genes mitocondriais e análise da ordem gênica do DNAmt. Os dados do seqüenciamento parcial dos genes mitocondriais não geraram árvores com resolução suficiente para explicar a história dessas abelhas, possivelmente devido ao alto tempo de divergência do grupo. Porém, a associação consistente entre duas tribos, Bombini e Meliponini, reforça a idéia de uma origem dupla para a eussocialidade em Apinae. A ordem gênica também não forneceu dados suficientes para a elaboração de árvores filogenéticas, mas a análise de alguns

clusters de genes aponta na mesma direção do seqüenciamento de genes: alta taxa de

evolução molecular e algumas associações que parecem consistentes, como Bombini + Meliponini. Um estudo paralelo dentro da tribo Meliponini indicou uma alta fixação de um arranjo gênico particular no cluster 4, ao longo da distribuição geográfica da tribo por toda a região tropical. Analisando um gene mitocondrial dentro da tribo, foi possível confirmar algumas idéias de Michener sobre a ocupação da Austrália por essas abelhas. Este trabalho demonstrou potenciais e também limitações das análises do DNAmt para os estudos das abelhas, confirmando a

necessidade de estudos específicos para determinar a utilidade dos marcadores moleculares em cada grupo de organismos.

Abstract

Mitochondrial DNA (mtDNA) sequences, and more recently, its genomic order, have been extensively used as character resources to establish phylogenetic relationships among organisms. Phylogenetic inference among bees, particularly within the subfamily Apinae, always presented many pitfalls, as by using traditional methods or molecular analyses. The subfamily Apinae is distinct from the rest of the bees by including species with several degrees of social behavior; origin and evolution of that behavior are extremely conflicting in the literature and deserve more studies. This project aimed to study the mitochondrial genome and the phylogenetic relationships among bees within the subfamily Apinae, using two methods: partial sequencing of mitochondrial genes and analysis of the mitochondrial gene order. The partial sequencing data were not useful to generate phylogenetical trees with the required resolution to explain the bees relationships, possibly because of the long divergence time of the group. But the consistent association of two tribes, Bombini and Meliponini, reinforces the hypothesis of a double origin of eusociality in Apinae. Gene order also was not informative to elaborate cladograms, but the analysis of some gene clusters is concordant with the sequencing data: high rate of molecular evolution and some consistent associations, as Bombini + Meliponini. A parallel study on species of Meliponini pointed to the fixation of a particular gene arrangement on the cluster 4, along all the geographical distribution of the tribe at the tropics. Analysing mitochondrial gene sequences of species belonging to the tribe, it was possible to confirm the hypothesis postulated by Michener about the Australia occupation by those bees. This work demonstrated potentials and also limitations of

the mtDNA analyses for the study of bees, confirming the need of specific studies to determinate the usefulness of molecular markers to each group of organisms.