FÁBIO DE OLIVEIRA MARTIN
POLIMORFISMOS DO GENE RHD EM INDIVÍDUOS COM
FENÓTIPO RhD (RH1) NEGATIVO E PORTADORES DE
ALOANTICORPO ANTI-D
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
FÁBIO DE OLIVEIRA MARTIN
POLIMORFISMOS DO GENE RHD EM INDIVÍDUOS COM
FENÓTIPO RhD (RH1) NEGATIVO E PORTADORES DE
ALOANTICORPO ANTI-D
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Martin, Fábio de Oliveira
Polimorfismo do gene RHD em indivíduos com fenótipo RhD (RH1) negativo e portadores de aloanticorpo anti-D. / Fabio de Oliveira Martin
-- São Paulo, 2010. xiv, 86f.
Tese (DOUTORADO): Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Hematologia e Hemoterapia.
Título em inglês: RHD GENE POLYMORPHISMS IN ALLOIMMUNIZED RhD NEGATIVE INDIVIDUALS
1.Polimorfismos gene RHD 2.Aloimunização 3. Fenótipo RhD (RH1) negativo
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE ONCOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL
Chefe do Departamento: Prof. Dr. José Orlando Bordin
Coordenadora do Programa de Pós-graduação: Profa. Dra. Gisele W. B. Colleoni
FÁBIO DE OLIVEIRA MARTIN
Presidente da Banca:
Prof. Dr. José Orlando Bordin
Banca Examinadora
Prof. Dr. Dante Mario Langhi Jr. Prof. Dr. Hélio Moraes de Souza Dra. Melca Maria Oliveira Barros Prof. Dr. Edmir Boturão Neto
Suplentes
Profa. Dra. Maria Stella Figueredo Prof. Dr. Dimas Tadeu Covas
Dedicatória
Aos meus Pais, Jose Martin Subirats e Maria Cleuza, pelo amor incondicional.
À minha esposa, Mônica, pelo amor eterno, incentivo, dedicação e companheirismo.
Ao meu irmão Fernando e minha cunhada Mara, que sempre torcem por mim.
Ao meu filho Guilherme, pelo amor incondicional.
Ao meu amigo Laid, pela força em todos os momentos e amizade fiel.
Este projeto foi desenvolvido com o suporte financeiro da FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, São Paulo, Brasil, Processo 05/55237-9).
Agradecimentos
A Deus, pela presença constante e força em todos os momentos da minha vida.
Ao Dr. José Orlando Bordin, Professor Titular da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da UNIFESP – EPM pela oportunidade oferecida de ingressar na pós-graduação, orientar e esclarecer sobre o tema exposto.
A todos os demais docentes da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da UNIFESP – EPM pela valiosa contribuição na minha formação profissional.
À Akemi K. Chiba, Farmacêutica Bioquímica, supervisora técnica do Hemocentro do Hospital São Paulo, UNIFESP, pela enorme ajuda prestada no laboratório, pelo carinho e pela amizade conquistados no decorrer desse trabalho.
À amiga de todas as horas e companheira, Sidnéia Sanches de Menezes, pelo trabalho compartilhado, pela assistência prestada em todos os momentos deste trabalho, pelo incentivo nos momentos de desânimo e pelas alegrias compartilhadas em todos esses anos de convivência.
A todos os colegas e amigos, médicos e não médicos e funcionários do Hospital São Paulo e da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, que contribuíram direta ou indiretamente para a concretização desse trabalho.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro através da bolsa de estudo concedida.
Aos residentes, pós-graduandos e funcionários da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina.
Sumário
Dedicatória………... v Agradecimentos………... vii Listas………... xi Resumo………... xv 1. INTRODUÇÃO………... 1 1.1. Objetivos………... 3 2. REVISÃO DA LITERATURA…………..………... 4 2.1. Sistema Rh... 52.2. Base molecular do Locus RH... 11
2.2.1. Base molecular do RHD negativo... 2.2.2. Base molecular do RHD fraco... 2.2.3. Base molecular do RHD parcial... 2.2.4. Base molecular do RHD Del... 16 18 20 20 2.3. Evolução dos alelos RHD...……...………... 2.4. Frequências populacionais de RHD variantes... 2.5. Distribuição dos alelos RHD... 2.6. Reagentes anti-D... 2.7. Justificativa do estudo... 22 23 24 25 26 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS………..………. 27 3.1. Casuística... 28 3.2. Métodos... 3.2.1 Coleta das amostras...
29 29
3.2.5. Pesquisa do anticorpo anti-G... 3.2.6. Extração e quantificação do DNA... 3.2.7 Reação em cadeia de polimerase (PCR)... 3.2.7.1. PCR alelo especifico ... 3.2.7.2. PCR multiplex... 3.2.8 Sequenciamento gênico... 3.3. Análise estatística... 3.4. Aspectos éticos... 31 31 31 31 34 37 41 41 4. RESULTADOS………... 42
4.1. Característica dos indivíduos estudados... 43
4.2. Fenotipagem do sistema Rh... 45
4.3.Genotipagem do gene RHD... 46
4.4. Características gerais dos indivíduos com RHD variantes... 47
4.5. Sequenciamento gênico... 49 5. DISCUSSÃO………..………... 53 6. CONCLUSÕES………... 62 7. REFERÊNCIAS………..…...………. 64 8. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA...……….…….. 73 Abstract Anexos
Lista de Figuras
Figura 1. Modelo das proteínas RhD, RhCE e RhAG... 12
Figura 2. Estrutura dos genes RHD e RHCE em indivíduos RhD positivo... 13
Figura 3. Modelo Mutação “missense”... 14
Figura 4. Modelo Mutação “nonsense”... 14
Figura 5. Modelo da Mutação “frame shift”... 15
Figura 6. Modelo da Mutação “Gene conversion”... 15
Figura 7. Modelo Proposto do mecanismo de deleção do gene RHD... 16
Figura 8. Exemplos de negatividade D... 17
Figura 9. Modelo proposto das regiões de troca de aminoácidos nos fenótipos D Fraco e D Parcial... 18
Figura 10. Evolução do RHD em Humanos... 22
Figura 11. Número de publicações dos alelos RHD estão agrupados de acordo com antígeno D variante... 24
Figura 12. Eletroforese em gel de agarose do produto do PCR do cDNA das regiões do intron 4 do gene RHD e RHCE de indivíduos RhD negativo e RhD positivo... 32
Figura 13. Eletroforese em gel de agarose do produto do PCR do cDNA das regiões do exon 10 do gene RHD e RHCE de indivíduos RhD negativo e RhD positivo... 33
Figura 14. Eletroforese em gel de agarose do produto do PCR II e III do cDNA das regiões dos exons 2, 3, 5 e 7 do gene RHD de indivíduos RhD negativo e RHD positivo e da estratégia do estudo... 36
Lista de Quadros e Tabelas
Quadro 1. Nomenclatura dos antígenos do sistema do grupo sanguíneo
Rh... 10
Quadro 2. Características dos fenótipos dos antígenos D em relação a expressão, bases moleculares e alelos... 21
Quadro 3.
Quadro 4.
Relação dos clones dos reagentes monoclonais com os epítopos
detectados e a reatividade com o D categoria VI... Sequência dos primers utilizados para amplificação das regiões do intron 4 e exon 10 do gene RHD e RHCE...
26
31
Quadro 5. Sequência dos primers utilizados no PCRII e PCRIII, sua posição e
o gene detectado... 35
Quadro 6. Primers, especificidade, localização, Sequência, produto e condições
de PCR do sequenciamento do gene RHD... 39
Tabela 1. Características dos indivíduos RhD negativo e portadores de
aloanticorpo anti-D... 44
Tabela 2. Distribuição dos fenótipos Rh e reatividade com os reagentes anti-D... 45
Tabela 3. Frequência dos polimorfismos através do intron 4 e exon 10 do gene RHD... 46
Tabela 4. Caracterização de outras regiões do gene RHD... 47
Tabela 5. Características Gerais dos indivíduos polimórficos... 48
Tabela 6. Resultados moleculares dos 12 indivíduos com fenótipo RhD-negativo e portadores de anticorpo anti-D... 51
Tabela 7. Estudos populacionais anteriores para caracterizar o fenótipo RhD e o
genótipo RHD... 56
Lista de Abreviaturas
A Adenina aa Aminoácido AcMo AgRh AloAc Anticorpo Monoclonal Antígenos do sistema Rh Aloanticorpo C CitosinaCcdes Gene Híbrido r´s
cDNA Clone de DNA
D Antígeno D
DHPN Doença Hemolítica Perinatal
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTP DVI EBV
Dinucleotídeos trifosfato D categoria VI
Vírus Epstein Baar
EDTA epD1-epD9 Ethylenediamine-Tetracetic Acid Epítopos 1 a 9 G IgRh Guanina Imunoglobulina Rh MgCl2 Cloreto de magnésio
PAI Pesquisa de Anticorpos irregulares
pb Pares de Base
PCR Reação em cadeia da polimerase
PCR ASP PCR alelo específico
PoliAc Anticorpo policlonal
Rh Sistema de grupo sanguíneo Rh
RhD Fenótipo RhD
RhAG Glicoproteína associada ao Rh
RHAG Gene da glicoproteína associada ao Rh
RHD Gene RHD
RHCE Gene RHCE
RHDΨ Pseudogene RHD
Resumo
O fenótipo RhD negativo é decorrente da deleção total do gene RHD na quase totalidade dos caucasianos, por volta de 20% dos africanos e em 70% dos asiáticos. Em africanos, o RHDΨ caracterizado por uma inserção de 37 pb no exon 4 é um dos principais responsáveis pelo fenótipo RhD negativo. Em asiáticos, o DEL é uma importante causa de RhD negativo. Nós investigamos os polimorfismos do gene RHD numa amostra populacional miscigenada brasileira.
Objetivo: Determinar a frequência de polimorfismos do gene RHD em uma amostra populacional miscigenada caracterizada pelo fenótipo D negativo portadora de aloanticorpo anti-D.
Casuística: Foram estudados 130 indivíduos pré-selecionados através de registros imunohematológicos no Hemocentro do Hospital São Paulo- UNIFESP e no Hemocentro da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. Métodos: Os polimorfismos foram estudados através da técnica sorológica e da técnica molecular de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguido de sequenciamento gênico. Os dados clínicos foram obtidos através de um questionário feito previamente à coleta das amostras.
Resultados: Nosso estudo determinou que 118/130 indivíduos (90,76%) apresentavam a deleção total do gene RHD, enquanto 12/130 (9,24%) mostraram polimorfismos do gene RHD. O RHDΨ foi encontrado em 10 (7,70%) indivíduos que apresentavam a inserção de 37 pb entre o final do exon 3 e exon 4 e as mutações 609 G>A, 654 G>C, 667 T>G, 674C>T, 807 T>G. Um indíviduo (0,77%) RHD-CE-Ds /RHDΨ híbrido, e um indíviduo (0,77%) D Fraco tipo 4.2 foram caracterizadas por apresentarem as mutações 186 G>T, 410 C>T, 455 A>C, 1025 T>C / 609 G>A, 654 G >C, 667 T>G, 674C>T, 807 T>G mais a inserção de 37pb e 602 C>G, 667 T>G, 957 G>A, 1025 T>C, respectivamente.
Conclusão: Os resultados mostraram que o gene RHD estava presente em 9,24% indivíduos brasileiros miscigenados que produziram aloanticorpo anti-D que geralmente é clinicamente significante. Portanto, este estudo sugere que o uso da genotipagem em populações com alta taxa de miscigenação pode aumentar a segurança na medicina transfusional.
_______________________________________________________________________________ O sistema de grupo sanguíneo Rh é o mais polimórfico entre todos os
sistemas sanguíneos humanos, consistindo de 57 antígenos independentes e, próximo ao sistema de grupo sanguíneo ABO, é o clinicamente mais significante na medicina transfusional. O antígeno D (D) possui grande importância clínica por estar envolvido em casos de reações transfusionais hemolíticas, Doença Hemolítica Perinatal (DHPN), anemia hemolítica auto-imune, além do fenótipo Rh null ou Rh modificado, cujos portadores também desenvolvem o anticorpo anti-Rh total (Avent et al., 2000; ISBT., 2010).
A determinação sorológica do antígeno D pode ser algumas vezes problemática porque o antígeno D é definido pela conformidade de múltiplos epítopos. Embora a maioria dos indivíduos herde a codificação do gene RHD (RHD), a sequência do fenótipo RhD (RhD) convencional, 1 a 2% dos caucasianos (e com maior frequência em afro-americanos e hispânicos), têm alterações no RHD que alteram a sequência de aminoácidos da proteína. Estes aminoácidos podem mudar o nível de expressão ou a estrutura dos epítopos do D. Além disso, numerosos métodos são atualmente aplicados para o teste do D, tais como testes em tubo, gel e analisadores automáticos. Hemácias com expressão fraca do D, ou alteração na sua conformidade, podem reagir diferentemente, dependendo do método utilizado (Westhoff, 2007).
Na prática clínica, a aloimunizacão ocorre num contexto de exposição de hemácias, quando um indivíduo que é negativo para um determinado antígeno é exposto a um antígeno antitético, como por exemplo, indivíduo RhD-negativo que recebe transfusão de hemácias de um doador RhD-positivo. O risco de aloimunização depende da frequência de indivíduos RhD-negativo, que varia entre as populações. Anticorpos clinicamente significantes são detectados nos exames pré-transfusionais em cerca de 1% dos pacientes, e o anti-D é o anticorpo mais frequentemente encontrado em relação a todos os outros anticorpos relacionados dos grupos sanguíneos (Urbaniac, 2006).
_______________________________________________________________________________ Indivíduos que perdem ou alteram o antígeno D têm uma chance maior de
imunização quando transfundidos com hemácias RhD-positivas, e os reagentes anti-D não podem discriminar estas hemácias com o RhD convencional (Westhoff, 2007).
Na maioria dos europeus RhD negativo , que consistem em 15 a 17% da população total, a ausência do D resulta da deleção total do RHD (Mourant et al.,1976; Collin et al.,1991). Duas variantes genéticas têm sido identificadas em indivíduos RhD-negativo nos descendentes africanos. Primeiro, o pseudogene RHDΨ que caracteriza-se pela inserção de 37 pb resultando num prematuro stop codon no exon 4 e uma parada na tradução no exon 6. Segundo, o gene híbrido RHD-CE-Ds caracterizado pelo haplotipo (C) ces. Apesar de estes dois alelos RHD serem inativos, a frequência do RhD-negativo na população africana oscila de 3 a 7% (Singleton et al., 2000).
1.1 Objetivos do Estudo
Consoante ao exposto, o presente estudo pretende definir a frequência de polimorfismos do gene RHD em individuos RhD negativo e portadores de aloanticorpo anti-D, com os seguintes objetivos específicos:
1. Determinar a frequência fenotípica dos antígenos D/C/c/E/e dos indivíduos estudados.
2. Avaliar a integridade do gene RHD através da genotipagem pela técnica de PCR alelo específico para o intron 4 e exon 10 do gene RHD.
3. Caracterizar os genes polimórficos do gene RHD pelo sequenciamento gênico.
2.1 Sistema Rh
O sistema de grupo sanguíneo Rh (Rh) foi primeiramente descrito há 71 anos. Uma mulher apresentou reação transfusional quando foi transfundida com hemácias de seu marido após o parto de um recém-nascido com Eritroblastose Fetal. Seu soro aglutinava hemácias de seu marido e de 80% de doadores ABO compatíveis (Levine e Stetson, 1939). No seguinte ano, Landsteiner e Wiener (1940) descobriram que o soro de camundongos (e mais tarde porcos guinea) imunizados com hemácias da Macaca mullata (Macacus Rhesus no artigo original) aglutinava 85% das hemácias humanas. Inicialmente pensaram que se tratava de um mesmo anticorpo, nomeado de anti-Rh, na superfície das hemácias do rhesus e de humanos. Logo perceberam que não se tratava do mesmo anticorpo (Fisk e Foord, 1942). O heteroanticorpo foi renomeado de anti-LW (em homenagem a Landsteiner e Wiener), e o aloanticorpo humano chamado de anti-D (Levine et al., 1963). Após a descoberta do D, outros antígenos do sistema Rh (C, c, E, e) foram identificados (Racer et al.,1944; Fisher,1944).
O Rh é o maior de todos 30 sistemas de grupo sanguíneo e o mais polimórfico consistindo de 57 antígenos independentes, e esta enorme quantidade de antígenos Rh (AgRh) é atribuída à complexidade de sua base genética. Os antígenos são localizados em duas proteínas, RhD e RhCE, e são produzidas por diferentes sequências de proteínas (Flegel et al., 2003).
O Rh é o sistema de grupo sanguíneo clinicamente mais significante após o sistema ABO. Desde a introdução da profilaxia anti-D pós-parto, por volta de 1960, e a profilaxia combinada pré e pós-parto, no inicio de 1990, a incidência de Doença Hemolítica do Recém Nascido (DHPN) devido a aloimunização anti-D tem sido reduzida em mais de 90% (Haward et al.,1987).
Alemanha, receptores do gênero feminino em idade fértil devem receber hemocomponentes compatíveis com outros antígenos do sistema Rh (C,c,E,e) e também para o antígeno K do sistema Kell (Bundesärztekammer et al., 2005). Este procedimento também é adotado para pacientes que necessitam regularmente de transfusões sanguíneas ou aqueles que tiveram alguma intercorrência imunohematológica, como autoanticorpo e aloanticorpo.
O antígeno D, descoberto em 1939, foi o primeiro AgRh a ser descrito. Pacientes D positivo foram chamados de Rh Positivo. Em 1946, um variante quantitativo com a expressão enfraquecida do antígeno D foi descoberto e chamado de Du. Atualmente, este antigeno é chamado de D Fraco e tem certa importância diagnóstica e clínica. Desde 1953, outros variantes do tipo qualitativo do antígeno D foram descobertos. Embora pacientes com este tipo de variante D parcial serem considerados D positivo, eles podem desenvolver anti-D (Flegel, 2007).
As proteínas Rh são expressas exclusivamente em hemácias maturas e em progenitores eritróides (Sieff et al.,1982; Dunstan,1986). Os antígenos RhD e RhCE consistem de 417 aminoácidos (aa) distribuídos ao longo da membrana do eritrócito em um número de sítios que varia de 10.000 a 40.000 para cada antígeno, sendo 6 segmentos (alças) extracelulares, 12 segmentos transmembrana (dispostos em α-hélice) e 7 segmentos intracelulares. O carbono e o nitrogênio terminal das proteínas RhD e RhCE estão localizados na porção intracelular (citoplasma da célula). A disposição dos polipeptídeos Rh apresenta a mesma organização na membrana do eritrócito, de acordo com a sua propriedade hidrofóbica (Flegel et al., 2004).
O antígeno D é considerado um mosaico composto de 37 epítopos, onde pelo menos nove epítopos (epD1-epD9) já foram definidos por diferentes anticorpos monoclonais (Lomas-Francis et al., 1989) Alguns indivíduos RhD-positivo podem desenvolver aloanticorpos anti-D dirigidos contra um ou mais dos epítopos ausentes, definindo-se, assim, as categorias do antígeno RhD parcial
(DII, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT, RoHar) que são diferenciadas de acordo com a presença ou ausência de um ou mais epítopos (Tippett et al.,1996).
A função das proteínas Rh na membrana eritrocitária é de formar um complexo com a glicoproteína Rh-associada (RhAG). Este “Complexo Rh” faz parte do citoesqueleto da hemácia. Algumas proteínas adicionais, como CD47, LW e a glicoproteína de Duffy estão associadas também com o “Complexo Rh” , mas não necessariamente com a expressão de proteínas Rh. A expressão de Rh na membrana, depende do RhAG funcional; mutações no gene RHAG podem gerar a forma “reguladora” do fenótipo Rhnull, caracterizado pela falta de todos os antígenos do sistema Rh (Huang et al.,2000). As proteínas Rh têm função no transporte de íons, em especial os íons amônia, juntamente com a proteína RhAG. A função de transporte de outros íons como O2 e o CO2, ainda não foi comprovada (Turgeon, 1995).
Apesar da importância clínica, a natureza hidrofóbica das proteínas Rh trazia uma enorme dificuldade nos estudos bioquímicos, e as proteínas não eram isoladas com sucesso até o final da década de 1980 (Agre et al., 1987). Desde a disponibilidade do clone do DNA (cDNA) e a sequência genética das proteínas do Rh, em 1990, houve um conhecimento das bases moleculares de alguns dos AgRh. A partir da detecção sorológica de antígenos com polimorfismo, os seus fenótipos acabaram fornecendo valiosas informações das amostras apropriadas para um estudo molecular (Avent e Reid, 2000). Para que haja um conhecimento da base genética das doenças, a genética é um importante instrumento para entender as diferenças individuais, variabilidade genética, a frequência e distribuição nas populações.
Várias nomenclaturas têm sido usadas para descrever antígenos, proteínas e os genes do Rh. Duas terminologias se baseiam nos mecanismos genéticos postulados para o Rh, e a terceira terminologia descreve apenas a presença ou ausência de um determinado antígeno. A quarta terminologia é o resultado do grupo de trabalho sobre a terminologia dos antigenos de superfície das hemácias da Internacional Society of Blood Transfusion (ISBT). Letras maiúsculas e itálicas são usadas quando se referem aos genes do Rh, que incluem RHD, RHCE e RHAG. As proteínas são indicadas como RhD, RhCE (ou de acordo com os antígenos que eles carregam Rhce,RhCe ,RhcE e RhCE) e RhAG. Haplótipos Rh são chamamos de Dce, DcE e DCE, etc., ou ce, Ce,cE quando se referem especificamente ao RhCE (Avent e Reid, 2000).
No início da década de 1940, Fisher e Race postularam que os antígenos do sistema Rh eram produzidos por três grupos de alelos com relação estreita entre eles. Então, denominaram os antígenos do sistema D, d, C, c, E e e. Até o momento não foi descoberto nenhum antígeno d, que é considerado um amorfo (alelo silencioso) ou a ausência do antígeno D. Esta nomenclatura (linguagem CDE) tem sido amplamente utilizada para interpretar a maioria das reações sorológicas e para a comunicação dos resultados (Race et al., 1944).
A teoria de Wiener acreditava que o gene responsável pela definição do Rh realmente produzia uma aglutinina que continha uma série de fatores do sangue. Segundo a terminologia Rh-Hr, este gene RH produz pelo menos três fatores dentro de um aglutinógeno. O aglutinógeno pode ser considerado como a expressão fenotípica do haplótipo. Na descrição de um aglutinógeno, o R maiúsculo denota a presença de um fator original, o antígeno D. O r minúsculo indica a ausência do antígeno D. A presença de C maiúsculo é indicada por um (1) ou aspas simples(´). Um c minúsculo esta implícito quando não existe (1) nem (´). Ou seja R1 é o mesmo que DCe. A presença de E é indicado pelo numeral arábico dois (2) ou por aspas (”). O e minúsculo está implícito quando não existe nenhum 2 ou (”) indicados. Ou seja, R2 é o mesmo que DcE. Esta terminologia é bastante utilizada na designação de fenótipos, particularmente em conversação. Quando nos referimos aos AgRh (ou fatores) na nomenclatura de Wiener, a aspa simples (´) se
refere tanto ao C como ao c e as aspas (´´) tanto ao E como ao e. Se o r precede o h (rh' ou rh"), nós nos referimos aos antígenos C ou E, respectivamente. Quando o h precede o r, nós referimos tanto ao antígeno c (hr') como ao e (hr") (Wiener, 1943).
Outro tipo de nomenclatura foi desenvolvido por Rosenfield que enumerou os AgRh D, C, E, c, e em números, respectivamente, como: 1, 2, 3, 4 ,5.
A terminologia da ISBT foi estabelecida a fim de estabelecer uma nomenclatura uniforme que tanto as pessoas como os aparelhos pudessem compreender prontamente e que seguisse a base genética dos grupos sanguíneos. A ISBT adotou um numero de seis dígitos para cada espeficidade de grupo sanguíneo autenticada. O número 004 foi atribuído ao sistema de grupo sanguíneo Rh e, então, cada antígeno atribuído ao sistema Rh recebeu um único numero para complementar o número de seis dígitos para o computador. O quadro 1 resume os dados apresentados.
Para fenótipos raros com deleção usam-se travessões para indicar a perda do antígeno antitético, por exemplo, Dc- quando hemácias que perdem os antígenos e e E e D- - quando perdem os antígenos C, c, E e e. Hemácias com o fenótipo Rhnull não expressam nenhum dos antígenos Rh (Avent et al., 2000).
Quadro 1- Nomenclatura dos antígenos do sistema do grupo sanguíneo Rh. Numérica Fisher e Race Weiner ISBT Número ISBT Antígeno Numérica Fisher e Race Weiner ISBT Número ISBT Antígeno Rh1 D Rh0 004001 D Rh30 DCOR 004030 Goa Rh2 C rh' 004002 C Rh31 hrB 004031 hrB Rh3 E rh" 004003 E Rh32 RN 004032 Rh32 Rh4 c hr' 004004 c Rh33 R0HAR 004033 Rh33 Rh5 e hr" 004005 e Rh34 HrB 004034 HrB Rh6 ce hr 004006 f Rh35 004035 Rh35 Rh7 Ce rhi 004007 Ce Rh36 004036 Be a Rh8 Cw rhw1 004008 Cw Rh37 004037 Evans Rh9 Cx rhx 004009 Cx Rh38 004038 - Rh10 ces hrv 004010 V Rh39 C-símile 004039 Rh39 Rh11 Ew rhw2 004011 Ew Rh40 Tar 004040 Tar Rh12 G rhG 004012 G Rh41 Ce-símile 004041 Rh41 Rh13 RhA 004013 - Rh42 CeS rhi S 004042 Rh42 Rh14 RhB 004014 - Rh43 004043 Crawford Rh15 RhC 004015 - Rh44 004044 Nou Rh16 RhD 004016 - Rh45 004045 Riv Rh17 Hr0 004017 Hro Rh46 "Alélico" para RN 004046 Sec Rh18 Hr 004018 Hr Rh47 004047 Dav Rh19 hrS 004019 hrS Rh48 004048 JAL Rh20 eS 004020 VS Rh49 004049 STEM Rh21 CG 004021 CG Rh50 004050 FPTT Rh22 CE rh 004022 CE Rh51 004051 MAR Rh23 Dw 004023 Dw Rh52 004052 BARC Rh24 ET 004024 - Rh53 004053 JAHK Rh25 004025 - Rh54 004054 DAK
Rh26 c-símile 004026 c-símile Rh55 004055 LOCR
Rh27 cE rhii 004027 cE Rh56 004056 CENR
Rh28 hrH 004028 hrH Rh57 004057 CEST
Rh29 004029 Rh29
2.2 Base Molecular do Locus RH
O primeiro gene Rhesus descoberto foi o RHCE, em 1990. O gene RHD foi descoberto dois anos mais tarde juntamente com a deleção total deste gene como causa do fenótipo D negativo em europeus. Atualmente há descrição de mais de 200 alelos relacionados ao gene RHD (Wagner, 2010).
O sistema Rh é formado a partir de 3 genes: RHD, RHCE e RHAG. Os genes RHD e RHCE, codificam as proteínas RhD e RhCcEe respectivamente. O RHAG é um co-fator para a expressão das proteínas Rh na superfície das hemácias e recentemente foi relacionado na expressão de três antígenos na superfície da hemácia: Duclos, Ol (a) e DSLK (Tilley et al, 2009).
Os genes RHD e RHCE são altamente homólogos em cerca de mais de 90% enquanto RHAG em torno de 40% de homologia com eles, todos consistindo de 10 exons com um total de 417 aminoácidos. As proteínas RhD e RhCE são muito similares, e diferem apenas em 36 dos 417 aminoácidos. Cada proteína tem 20 segmentos dentro da membrana eritrocitária e 6 alças extracelulares. Ambas possuem uma amina (NH3) e uma carboxila terminal localizada dentro da célula (Figura 1) (Flegel et al., 2007).
Fonte: Modificado de Avent e Reid, 2000
Figura 1- Modelo das proteínas RhD,RhCE e RhAG . A proteína RhAG (50000 dáltons)
consiste de 409 aminoácidos e é codificado pelo RHAG no cromossomo 6p11-p21.1. As proteínas RhD e RhCE (30000 dáltons) têm uma topologia similar e são codificados pelos
RHD e RHCE ,que são adjacentes no cromossomo 1p34-p36. O domínio da proteína RhD
codificada por cada exon é representado por caixas numeradas, que representam o inicio e o final de cada exon. Dos aminoácidos específicos da proteína RhD, 8 são na superfície externa da membrana (Círculos amarelos), e 24 são representados na região de transmembrana e interna da membrana eritrocitária (círculos pretos). Círculos vermelhos representam aminoácidos específicos dos antígenos C/c (Ser103Prol) e E/E (Pro226Ala); círculos roxos representam Ser103 e Ala226 sobre RhD. As linhas em zig zag representam o desenho Cys-Leu-Pro que são provavelmente envolvidos nos sítios de palmitoilação.
Os genes RHD e RHCE têm direções opostas, sendo que o RHD se orienta no sentido 5‟ para 3‟ do lócus RH no cromossomo 1p36.13-p34.3. O gene RHD está ligado por 2 segmentos de DNA chamados de “Rhesus Box” sendo o primeiro chamado de “upstream” na porção 5‟ e o outro de “downstream” na porção 3‟. Situado entre “downstream Rh Box” e o gene RHCE está o SMP1 (“small membrane protein 1”), cuja função ainda é desconhecida (Figura 2) (Avent e Reid, 2000).
Figura 2- Estrutura dos genes RHD e RHCE . Dois segmentos de DNA estão ligados no
gene RHD chamados de Rhesus Box sendo constituídos pelas regiões Upstream e
Downstrean.
Fonte:Modificado de Flegel, 2007
Os alelos RH podem ser agrupados de acordo com a estrutura molecular. A principal parte é formada por grupos que mostram mutações de ponto (polimorfismos de um nucleotídeo) que causam mutações “missense”, “nonsense”, “frame shift” e “gene conversion”, conforme as figuras 3, 4, 5, 6, respectivamente. Os exemplos de alterações moleculares e seus efeitos sobre o D revelam que o fenótipo RhD se correlaciona com a sua estrutura molecular.
Figura 3- Modelo mutação “missense”: A troca de nucleotídeo produz um aminoácido
diferente (V- Valina > G- Glicina) que se reflete na diminuição da expressão antigênica.
Figura 4- Modelo mutação “nonsense”: A troca de nucleotídeo produz uma parada na
Figura 5- Modelo da mutação “frame shift”: A deleção ou inserção de um nucleotídeo
produz mudança na leitura do códon, e consequentemente altera a composição da proteína.
Fonte: Modificado de Flegel WA et al.,2000
Figura 6- Modelo mutação “Gene conversion”: Evento de recombinação entre RHD e RHCE que produz os genes híbridos responsáveis pelo D Categoria.
2.2.1 Base Molecular do RHD Negativo
Hemácias D negativo usualmente perdem toda a proteína RhD na superfície do eritrócito devido à deleção total do gene RHD. Esta deleção ocorre através de um mecanismo de “crossing over” desigual no lócus do RH, desencadeado pela homologia dos “Rh Boxes” (figura 7) (Wagner et al.,2000).
Fonte: Modificado de Wagner, 2002
Figura 7 – Modelo proposto do mecanismo de deleção do gene RHD . (A) A estrutura física
do lócus do gene RHD e RHCE. (B) Um “crossing over” desigual entre os segmentos “Upstream” e “Downstream” do “Rhesus Boxes” pode ser desencadeado pela alta homologia deles. (C) Após a deleção do gene RHD, a estrutura do gene RH do haplótipo
RHD negativo.
Como resultado deste “crossing over” desigual, o lócus RH sem o gene RHD carrega um segmento de DNA chamado de Rhesus Box híbrido, pois sua extremidade 5‟ é idêntica à extremidade 5‟ do segmento “upstream” e a outra extremidade 3‟ é idêntica à extremidade 3‟ do segmento “downstream” (Wagner et al., 2000).
Cerca de 15% da população européia é D negativo, enquanto apenas 5% da população negra, e menos que 1% dos asiáticos (Tills et al.,1983). Em brancos, a deleção total do gene RHD é a forma mais comum de RhD negativo. Em negros, a deleção do gene RHD é frequentemente causada por ambos os alelos pseudogene RHD (RHDΨ) e r’s (ou CcdeS
). O alelo RHDΨ é caracterizado por uma duplicação de 37 pares de bases nos limites do intron 3/exon 4 causando um “frame shift” e uma parada de leitura no códon terminal do exon 4, mutações missenses 609G>A, 654G>C e 667T>C no exon 5, e mutações missense 674C>T e nonsense 807T>C no exon 6 com uma frequência de 0,0714 em negros (Singleton et al., 2000). O r‟s é um alelo RHD híbrido caracterizado pela presença de exons do gene RHCE começando no nucleotídeo 455 (exon3) até exon 7. O alelo r‟s ocasiona uma expressão fraca do antígeno RhC e tem uma frequência de 0,036 em negros (Faas et al.,1997;Daniels et al., 1998). A figura 8 apresenta alguns exemplos de RhD negativos com a presença do RHD (Wagner et al., 2001).
Fonte: Modificado de Wagner, 2001
Figura 8- Exemplos das bases moleculares do fenótipo D negativo. As caixas em cinza
2.2.2 Base Molecular do RHD Fraco
As hemácias RhD positivo carregam um antígeno com densidade que oscila de 15.000 até 33.000 sítios por célula (R1r à R2R2). Entretanto, têm sido identificados fenótipos RhD com densidade antigênica que varia entre 70 a 5200 antígenos RhD por hemácia. Estes fenótipos são chamados de D Fraco e sua base molecular é o resultado de mutações de ponto que causam trocas de aminoácidos nas regiões intracelulares e transmembranares e não na região extracelular (Figura 9). Estas mutações afetam a eficiência de inserção, e além disso a quantidade de proteína RhD na membrana da hemácia. Isto reflete na redução de sítios antigênicos nas hemácias e explica porque o teste de antiglobulina indireto deve ser realizado para a sua detecção (Wagner et al., 1999).
Fonte: Modificado de Flegel WA.,1999
Figura 9 – Localização dos aminoácidos dos tipos de D fraco. Os aminoácidos
substituídos nos círculos em preto representam eventos simples e círculos em cinza representam eventos múltiplos. A substituição de todos os aminoácidos são localizados nas regiões transmembranar e intracelular.
Em um estudo europeu de 2005 revelou que hemácias com o fenótipo D Fraco são constituídas por um gene RHD intacto e ocorre em 0,2 a 1% dos indivíduos caucasianos. Até agora, 40 tipos de alelos D Fraco foram identificados em nível molecular sendo que os tipos D Fraco 1 e 2 são os mais freqüentes (70% e 18% de todos D fracos, respectivamente), e os tipos 1 a 3 representam a grande maioria de todos os D Fracos (Flegel et al., 2005; Muller et al., 2001). Estas mudanças não alteram os epítopos do antígeno D, pois a maioria dos indivíduos D fracos podem receber hemácias D+ e não produzir anti-D. Entretanto, dois tipos de D fracos, tipo 4.2 (também chamado de DAR) e tipo 15, podem produzir anti-D (Wagner et al., 2000). Adicionalmente, um anti-D foi observado depois de uma transfusão RhD positivo em um individuo D Fraco tipo 1 caracterizado fenotipicamente e genotipicamente (Roxby et al., 2003).
Portanto, a distinção entre D Fraco e D Parcial não pode ser feita através da produção de anti-D. Para predizer o risco de imunização anti-D nos D fracos, foi desenvolvido o índice rhesus. Este índice é baseado na densidade do antígeno através de diferentes anticorpos monoclonais com um intervalo de 1.0 (baixo risco de imunização, por exemplo, RhD normal) a 0.0 (alto risco de imunização, por exemplo RhD parcial, que perde muitos epítopos). D Fraco tipo 4.2 e 15 mostraram índice Rhesus de 0,21, sendo um dos mais baixos e sendo superado apenas pelo D Fraco tipo 7 , que mostrou 0,03 (Wagner et al., 2000). Entretanto, tem sido mostrado que o índice Rhesus não é somente dependente da quantidade do antígeno, mas também da afinidade do anticorpo (Hemker et al., 2004).
2.2.3 Base Molecular do RHD Parcial
A diversidade do sistema Rh é provavelmente causada pela disposição dos genes RHD e RHCE. Esta configuração genética, às vezes, pode gerar alelos RH aberrantes, chamados de D Parcial subgrupo D Categoria, causados por uma substituição unidirecional entre fragmentos dos genes RHD e RHCE , resultando em alelos híbridos como RHD-CE-RHD ou RHCE-D-RHCE. Provavelmente, estas mutações são causadas por genes conversores muito curtos, em que regiões isoladas do RHD e/ou RHCE são substituídas por uma parte específica do RHD e RHCE. Outro mecanismo são mutações de ponto nos genes RHD/CE em que não há troca entre estes genes. Estes dois mecanismos são responsáveis por um amplo número de alelos variantes (Westhoff et al., 2004; Daniels et al.,2002). A proteína D atravessa a membrana eritrocitária diversas vezes, levando a exposição somente de parte da proteína na superfície da membrana. Os D parciais, ocorrem por substituição de um ou mais aminoácidos da proteína D localizados na face externa da membrana, com isso epítopos podem ser perdidos ou novos antígenos serem formados (Flegel et al., 2007). Indivíduos portadores de uma proteína RhD parcial produzem anticorpos anti-D contra os epítopos ausentes da proteína RhD, quando eles são expostos a uma proteína RhD completa.
2.2.4 Base Molecular do RHD Del
Uma expressão muito enfraquecida do antígeno RhD é chamado de Del, que somente é detectado com testes de adsorção e eluição. As mudanças moleculares são mais profundas do que as do D fraco. Variantes Del derivam de mutações “missense”, “splice-site” (Wagner et al., 2001; Shao et al., 2002; Gassner et al., 2005) do RHD, ou deleção do exon 9 do gene RHD (Chang et al., 1998). Um total de dezoito diferentes alelos DEL foram descritos até o momento. No quadro 2 estão descritos os tipos de antígenos D com as alterações na expressão antigênica, bases moleculares e exemplos de alelos, respectivamente.
Quadro 2 Características dos fenótipos dos antígenos D em relação a expressão, bases moleculares e alelos.
* Não Nomeado
Antígeno Fenótipo Antígeno D Base Molecular Alelo/Nome
Alteração da proteína Mecanismo Descrição do Alelo Nome
D Parcial Alteração Qualitativa
Aminoácido trocado na superfície externa da
proteína D Mutação "missense" RHD(G355S) DNB
Gene conversão
Segmento de proteína trocado na superfície na
membrana da hemácia Gene Conversão RHD-CE(3-6)-D DIV tipo 3
D Fraco Alteração Quantitativa fraca
Aminoácido substituído na superfície interna e na
região transmembranar da proteína D Mutação "missense" RHD(V270G) D Fraco tipo 1
Del Alteração Quantitativa forte Expressão diminuída da proteína D
Mutação "missense" no local
do "splicing" RHD(M2951) em Cde *
RHD(K409K) *
D Negativo D Negativo Expressão ausente da proteína D Deleção do gene Deleção RHD D negativo
Mutação "nonsense" RHD(Y330X) *
Proteína Híbrida: Mudança da proteína no
2.3 Evolução dos alelos RHD
O extenso conhecimento da base molecular dos fenótipos D fraco e parcial permitiu o desenvolvimento do perfil evolutivo dos alelos RHD em humanos. Atualmente são descritos 4 grandes grupos de alelos RHD relacionados ao DIVa cluster, D Fraco tipo 4 cluster, DAU cluster e o Eurasian D cluster (Figura 10).
Figura 10 - Evolução do RHD em Humanos. Os alelos do D categoria IVa, D fraco tipo 4 e DAU cluster são restritos em grande parte em indivíduos com ancestralidade
africana e geralmente ocorrem em haplótipos Dce. Os alelos do Eurasian D cluster são predominantes na população européia e asiática e frequentemente ocorrem nos haplótipos DCe e DcE.
2.4 Frequências populacionais de RhD variantes
Há variações consideráveis de alelos RHD em diferentes grupos étnicos. A variabilidade de alelos RHD na população africana excede em muito a população européia. Por volta de 1% dos europeus têm alelos RHD aberrantes que representam variações do antígeno D. Em brancos, entre 0,2% a 1,0% têm hemácias com a expressão enfraquecida do D (D fraco) (Wagner et al.,1995; Mourant et al., 1976). Na população alemã a frequência de D fraco em doadores de sangue brancos é de 0,42% (Wagner et al., 1995).
Os tipos de D fracos mais prevalentes na população européia são D fraco tipo 1, tipo 2 e tipo 3, totalizando 93,49% entre todos os tipos de D Fraco. D fraco tipo 4 e tipo 5 são 1,3% e 0,84%, respectivamente. D fraco tipo 1 é o mais frequente antígeno D fraco associado com o fenótipo CcDee. O D fraco tipo 2 é a mais frequente causa entre ccDEe (Wagner et al., 1999). A frequência acumulativa em negros da África do Sul do D fraco tipo 4 é 17,2% (Hemker et al., 1999) e a frequência acumulativa de D fraco em doadores de sangue classificados como brancos é 0,0055% (Wagner et al., 1999).
Alguns alelos D parciais também são mais frequentes na população africana. Como ocorre nos tipos DIIIa, DIIIb e DIVa em descendentes de africanos (Avent et al., 1999; Tippett et al.,1996). A frequência de DAR é 1,5% em negros africanos (Hemker et al., 1999) e no Brasil encontrou-se 9,2% em pacientes portadores de doença falciforme associado com os tipos DAR e DIIIa (Castilho et al., 2005). Alelos DAU também ocorrem frequentemente na população africana, e o DAU-0 é o mais frequente alelo RHD aberrante, sendo encontrado em 19,9%. O próximo mais frequentemente encontrado na população africana é o RHDΨ (7%) e o Ccdes (4%) (Wagner et al., 2003). No Brasil, um estudo revelou a frequência de RHDΨ (11%) e o Ccdes (2%) em indivíduos com características de descendência africana (Castilho et al., 2007).
2.5 Distribuição de alelos RHD
Com o avanço das técnicas moleculares, houve um grande aumento na descrição de alelos RHD. Até 2008 foram descritos 209 alelos discriminados como Del, D categoria, D parcial, D fraco e D negativo (Figura 11) .
Figura 11: Alelos RHD conhecidos. Depois de 1992, com a padronização do cDNA do RHD o número de alelos conhecidos têm sido discriminados.
2.6 Reagentes anti-D
Desde 1980, muitos anticorpos monoclonais têm sido desenvolvidos a fim de substituir os reagentes policlonais de origem humana. Mais de 22 laboratórios diferentes desenvolvem por diferentes técnicas a fabricação de anticorpos monoclonais (AcMo): fusão celular por heterohibridoma, transformação de linfócitos B por EBV e anticorpo recombinante. Cinquenta e cinco e sessenta e quatro reagentes Anti-D monoclonais foram submetidos a avaliação funcional no terceiro e quarto Workshop Internacional e Simpósio de MoAc de Hemácias em 1996 e 2001, respectivamente. Obviamente, nem todos MoAc anti-D parecem ser sustentáveis em testes in vivo, porém se tem uma idéia dos reagentes promissores, e é uma forma de pré seleção. Atualmente, produtos anti-D policlonais preparados de plasma humano de doadores RhD-negativo aloimunizados, têm sido cada vez menos utilizados em países da Europa por questões éticas e disponibilidade da matéria prima (Sellinger et al.,1991).
Os reagentes anti-D têm uma grande variabilidade de detecção do antígeno RhD, sendo que o limite inferior de detecção é em torno de 500 sítios antigênicos por hemácia. Indivíduos que possuem polimorfismos no gene RHD, na maioria das vezes, apresentam alteração na expressão antigênica e/ou perda de epítopos da proteína RhD. Consequentemente, alguns indivíduos com alelos RHD quando em contato com uma proteína RhD íntegra podem desenvolver aloanticorpo contra os epítopos ausentes ou modificados por mutações. A alteração da expressão gênica do gene RHD torna-se um grande problema na detecção do antígeno D pelos métodos sorológicos tradicionais.
No quadro 3 observamos um sumário dos reagentes anti-D monoclonais disponíveis e a imunoglobulina dos vários anticorpos. Muito deles são específicos contra os epítopos 6/7, isto porque este é provavelmente o epítopo mais imunogênico do antígeno D (Bromilow I., 2007).
Quadro 3 Relação dos clones dos reagentes monoclonais com os epítopos do antígeno D e a detecção do D categoria VI.
Clone Tipo Epítopo DVI
ESD-1M IgM 9 + (direta)
175-2 IgM 6/7 -
MS-201 IgM 6/7 -
MS-26 IgG 3/9 + (TAI) LDM3 IgM 6/7 - (DFR-)
ESD-1 IgG 9 + (TAI)
TH28 IgM 6/7 - RUM IgM 6/7 - LDM1 IgM 6/7 - (e DFR-,pode ser + DAR
TAI- Teste de aglutinina indireta DFR- Pesquisa do D fraco
Fonte: modificado de Bromilow I.,2007
2.8 Justificativa do estudo
Diante do exposto, a análise da distribuição de alelos RHD em humanos é um dos tópicos de maior relevância da hemoterapia moderna. Nosso estudo é pioneiro na investigação de polimorfismos do gene RHD em indivíduos RhD negativo portadores de aloanticorpo anti-D em uma amostra populacional brasileira com alta taxa de miscigenação.
3.1 Casuística
Foram analisados amostras de 130 indivíduos fenotipados como D negativo e portadores de aloanticorpo anti-D , que haviam sido previamente fenotipados em testes rotineiros no Hemocentro do Hospital São Paulo da UNIFESP (n= 88) e no Hemocentro da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (n= 42).
A tabela 1 mostra a distribuição dos indivíduos estudados em relação ao gênero, e 117 (90%) dos indivíduos foram do gênero feminino enquanto que 13 (10%) eram do gênero masculino. Todos os indivíduos tinham alguma exposição para a aloimunização anti-D. A maioria destes, 80 (61,5%), tinham história de mais de uma gestação. Um segundo grupo com frequência 35 (27,0%) tinham história de dupla exposição, gestação e transfusão sanguínea, para aloimunização anti-D. Um terceiro grupo, com 15 (11,5%) indivíduos apresentavam apenas como fator de risco transfusão sanguínea.
Os candidatos foram definidos através da revisão do banco de dados do setor de imunohematologia dos hemocentros, e a seguir realizado o primeiro contato por telefone ou pessoalmente, quando eram fornecidas as orientações iniciais sobre a pesquisa e, se o candidato concordasse, era convidado a comparecer no setor de coleta dos Hemocentros. O candidato, então, recebia as explicações sobre a pesquisa em questão (pesquisador/orientador), a justificativa e os objetivos do trabalho, bem como os benefícios que seriam obtidos após a conclusão do estudo. Se o candidato concordasse em ceder uma amostra de sangue, era orientado de que caso houvesse necessidade, seria convocado para nova coleta. O candidato também era informado de que os resultados estariam a sua disposição e que seu anonimato seria preservado. Em seguida, o candidato lia e assinava o termo de consentimento esclarecido (anexo 1) e era encaminhado para coleta de amostra.
3.2 Métodos
3.2.1 Coleta das amostras
Os indivíduos foram submetidos à coleta de duas amostras de 5 mL de sangue periférico colhidos em tubos vacutainer estéreis com anticoagulante EDTA e uma amostra de sangue total em tubos vacutainer estéreis sem anticoagulante. A seguir, as primeiras amostras foram aliquotadas em tubos estéreis de 2 mL e armazenadas em freezer -20°C para posterior realização do PCR, as segundas amostras com EDTA para realização da fenotipagem do Rh através do método de cartão e as amostras em tubo sem anticoagulante foram centrifugadas para obtenção do soro para realização da pesquisa de anticorpos irregulares.
3.2.2 Fenotipagem do Sistema Rh
A fenotipagem eritrocitária do sistema Rh foi realizada no laboratório de imunohematologia do Hemocentro do Hospital São Paulo utilizando -se as técnicas em tubo e em gel teste, sendo utilizados os seguintes reagentes:
Reagente anti-D Blend (Diamed Latino America S.A) - Linhagem Celular: TH-28, MS-26
ID-Cartão (Diamed Latino America S.A) Rh Subgrupos+Cw+Kell
ID-Cartão (Diamed Latino America S.A) ABO/D (VI-) + prova reversa: anti-A [linhagem celular A5], anti-B [linhagem celular G ½] e anti-D [linhagens celulares LHM 59/20 (LDM3) + 175-2]
3.2.3 Pesquisas do Antígeno D Fraco
Em todas as amostras fenotipadas como RhD-negativo realizou-se a pesquisa do antígeno D fraco, conforme protocolo do Laboratório de Imunohematologia do Hemocentro do Hospital São Paulo. Adiciona-se 50µl da suspensão a 5% das hemácias + 50µl do reagente anti-D e centrifuga-se. Após a leitura se o teste estiver negativo, incubar a 37ºC por 5 minutos, e após centrifugue para leitura. Lavagem das hemácias por 3 vezes com solução fisiológica e adiciona-se 2 gotas de soro de coombs e centrifuga-se. Realizar leitura através de aglutinação macroscópica. Somente foram selecionadas as amostras D fraco-negativo para este estudo.
3.2.4 Pesquisa de Anticorpos Irregulares
A pesquisa de anticorpos irregulares (PAI) foi realizada adicionando 50µl das hemácias reagentes (ID-DiaCell I e II-DiaMed, DiaMed Latino America S.A) + 25 µl de soro do paciente em microtubo contendo o soro antiglobulina humana, suspenso no gel (cartão ID-Liss/Coombs, DiaMed Latino America S.A) e posterior fase de incubação a 37ºC por 15 minutos. Após a fase de incubação, eram realizadas centrifugação padronizada, leitura e interpretação dos resultados, segundo orientações do fabricante.
A identificação dos anticorpos irregulares foi realizada através de um painel de 11 hemácias (ID-Diapainel-Diamed, DiaMed Latino America S.A) adicionando 50µl de cada hemácia teste nos microtubos correspondentes. Adiciona-se 25µl de soro da amostra e incube por 15 minutos a 37ºC. Após a fase de incubação, eram realizadas centrifugação padronizada, leitura e interpretação dos resultados. Posteriormente, os resultados foram comparados com o padrão fenotípico constante do antigrama que acompanha os eritrócitos reagentes, para que se encontre uma combinação de resultados que determine a possível especificidade do(s) anticorpo(s), Foram incluídos neste estudo os indivíduos que tinham a presença de pelo menos um
3.2.5 Pesquisa do Anticorpo Anti-G
Todos os indivíduos que foram identificados contendo anticorpo anti-D e anti-C, no painel de hemácias, foram testados para identificação do anticorpo anti-G através da metodologia de eluição com antígenos específicos. Foram utilizados hemácias heterólogas conhecidas D+C- e D-C+ para adsorção, seguido de eluição com clorofórmio e identificação do anticorpo com painel de 11 hemácias (ID-Diapainel-Diamed, DiaMed Latino America S.A) segundo orientações do fabricante.
3.2.6 Extração e Quantificação do DNA
O DNA foi extraído do buffy-coat, utilizando o kit comercial para extração (QIAGEN, Valência, CA), de acordo a especificação do fabricante.O DNA extraído foi homogeneizado e após dissolução completa, quantificado por espectrofotometria ultravioleta nos comprimentos de onda de 260 a 280 nm. As amostras de DNA de cada indivíduo foram identificadas e armazenadas em freezer a -20 graus.
3.2.7 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
3.2.7.1 PCR Alelo-Específico
A genotipagem para a presença do RHD foi realizada através da amplificação de duas regiões genômicas, intron 4 e exon 10 pela técnica de PCR alelo-específico. Os primers estão ralacionados no Quadro 4 conforme descrito por Castilho et al, 2007.
Quadro 4: Sequência dos primers utilizados para amplificação das regiões do intron 4 e exon 10 do RHD e RHCE.
Primers Sequência de Nucleotídeos Intron/Exon
RHI41 5'-GTG TCT GAA GCC CTT CCA TC-3' Intron 4
RHI42 5'-GAA ATC TGC ATA CCC CAG GC-3'
RHI43 5'-ATT AGC TGG GCA TGG TGG TG-3'
EX10F 5'-TTT CCT CAT TTG GCT GTT GGA TTT TAA-3' Exon 10
RHD3'-UTR 5'-GTA TTC TAC AGT GCA TAA TAA ATG GTG-3'
RHCE3'-UTR 5'-CTG TCT CTG ACC TTG TTT CAT TAT AC-3'
Para o intron 4 , o produto de PCR foi feito a partir de 2,0µl de DNA genômico com 0,6µl de Mgcl2, 2,0µl tampão, 0,32µl de dNTP, 2,0µl do primer RHI41 e 43 e 4,0µl do primer RHI42 e 0,08 unidades de enzima Taq. O produto final foi de 20µl para cada amostra.. O termociclador PTC 200 (MJ Research, Waltham, MA) foi ajustado da seguinte forma.
Temperatura desnaturação inicial: 1 ciclo de 95ºC/15´
Temperatura de desnaturação, anelamento e extensão: 35 ciclos 94ºC/40´´+62ºC/40´´+72ºC/40´´
Temperatura de extensão final: 1 ciclo de 72ºC/10´
Temperatura de parada (“Stop”): 1x4ºC/1 hora
Após a amplificação, obteve-se um fragmento de 115 pb (referente ao RHD) e 236 pb (referente ao RHCE). Os produtos do PCR foram visualizados
Figura 12: Foto da eletroforese em gel de agarose da presença do intron 4 do RHD e RHCE. M: marcador de 100pb; 1 e 4 são produtos do PCR para o intron 4 do RHD (115pb) e RHCE (236pb); 2, 3, 5 e 6 são produtos do PCR
do intron 4 do RHCE.
Para o exon 10, o produto de PCR foi feito a partir de 2,0µl de DNA genômico com 0,8µl de Mg, 2,0µl de tampão, 0,32 de dNTP, 2,0 de primer e 0,08 unidades de enzima Taq. Foram utilizados dois termocicladores, PTC 200 e GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) sendo ajustados da seguinte forma.
Temperatura desnaturação inicial: 1 ciclo 95ºC/15´
Temperatura de desnaturação, anelamento e extensão: 35 ciclos 94ºC/40´´+61ºC/40´´+72ºC/40´´
Temperatura de extensão final: 115 pb
Após a amplificação, obteve-se um fragmento de 160 pb (referente ao RHCE) e 245 pb (referente ao RHD). Os produtos do PCR foram visualizados através de eletroforese em gel de agarose, conforme a figura 13.
Figura 13: Foto da eletroforese em gel de agarose da presença do exon 10 do RHD e RHCE. M: marcador de 100pb; 37 e 40 são produtos do PCR do exon 10 do RHCE (160pb) e do RHD (245pb); 38, 39, 41 e 42 são produtos do
PCR do exon 10 do RHCE.
3.2.7.2 PCR Multiplex
Após o PCR para o intron 4 e exon 10 do RHD, as amostras positivas para estas regiões do RHD foram submetidas ao PCR Multiplex para a caracterização da integridade de outras regiões específicas do RHD. Estas regiões foram estudadas através de duas reações em cadeia de polimerase chamadas de PCRII, exon 2 e 7 do RHD, e PCRIII, exon 2, 3 e 5. O exon 2 teve como função o controle interno da reação, pois é inespecífico para os gene RHD e RHCE e os primers estão ralacionados no Quadro 5 conforme
160 pb 245 pb
descrito por Okuda et al, 1997, com modificações.. A reação PCRII foi realizada a partir de 2,0µl de DNA genômico, 0,8µl de Mgcl2, 2,0µl tampão 10x, 0,6µl de dNTP, 0,3µl dos primers F1, R1, F5 e R5 e 0,5 unidades de enzima Taq DNA polimerase e água suficiente pra o volume final de reação de 20µL. O termociclador PTC200 foi ajustado da seguinte forma:
Temperatura desnaturação inicial: 1ciclo de 95ºC/5´
Temperatura de desnaturação, anelamento e extensão final: 35 ciclos de 95ºC/1´+60ºc/1´+72ºc/40´´
Temperatura de extensão final: 1 ciclo de 72ºC/10´
Temperatura de parada (“Stop”): 1 ciclo de 4ºC/1h
Os produtos do PCR foram visualizados através de eletroforese em gel de agarose, banhado no brometo de etídio e exposta à luz ultravioleta,
Quadro 5: Sequência dos primers utilizados no PCRII e PCRIII, sua posição e o gene detectado.
Primer Seqüência de Nucleotídeos Posição Detecção de F1 5'-GGCCAAGATCTGACCGTGATG-3' 151 - 171 (exon 2) RHD e RHCE R1 5'-TGAACAGTGTGATGACCACCTT-3' 334 - 313 (exon 2) RHD e RHCE F2 5'-GCTGGCCACCATGAGTGCTT-3' 342 - 361 (exon 3) RHD R2 5'-TTACTGATGACCATCCTCAGGT-3' 476 - 455 (exon 3) RHD F4 5'-TTGTGGATGTTCTGGCCAAGTT-3' 646 - 667 (exon 5) RHD R4 5'-CTGAGATGGCTGTCACCACG-3' 763 - 744 (exon 5) RHD F5 5'-CAGCTCCATCATGGGCTACAA-3' 972 - 992 (exon 7) RHD R5 5'-TGCCGGCTCCGACGGTATC-3' 1066 - 1048 (exon 7) RHD
A reação PCRIII foi realizada a partir de 2,0µl de DNA genômico, 0,8µl de Mgcl2, 2,0µl tampão 10x, 0.9µl de dNTP, 1,5µl dos primers F1,R1,F2,R2,F4 e R4 e 1,0 unidades de enzima Taq DNA polimerase e água suficiente pra o volume final de reação de 20 µL. Os termocicladores foram ajustados da seguinte forma:
Temperatura desnaturação inicial: 1 ciclo de 95ºC/5´
Temperatura de desnaturação, anelamento e extensão: 35 ciclos de 95ºC/30´´+65ºc/30´´+72ºC/30´´
Temperatura de extensão final: 1 ciclo de 72ºC/10´
Temperatura de parada (“Stop”): 1 ciclo de 4ºC/1h
Os produtos do PCR foram visualizados através de eletroforese em gel de agarose, banhado no brometo de etídio e exposta à luz ultravioleta,
Figura 14: Foto da eletroforese em gel de agarose do PCR II e III Multiplex para o
RHD. MK100pb: marcador de 100pb; exons 2, 3, 5 e 7 do RHD através das reações
de PCR II e PCR III com produtos de 180pb, 125pb, 117pb e 95pb, respectivamente.
3.2.8 Sequenciamento Gênico
As reações dos produtos do pré-sequenciamento foram realizadas com 100 a 200 ng de DNA, 1,5 µM de cada primer, 10 µg/mL de Taq 2X Master Mix (BioLabs, Inglaterra), em volume final de 50 ul de solução tampão. A sequência de primers utilizados para cada éxon do RHD e as condições de amplificação do PCR encontram-se no quadro 6. Os produtos amplificados pelo pares de primers foram submetidos a purificação utilizando o GFX PCR DNA and Gel
molecular (High DNA Mass ladder, Invitrogen, EUA). A eletroforese se fez usando 4µl de DNA de cada amostra junto com Mass Ladder 4µl + 1µl de azul de bromofenol. Após quantificação de DNA, os produtos foram submetidos a sequenciamento direto usando “Kit ABI Prism® Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha). Em microplacas, foram adicionados 1,5µl de Big DyeTM, 2 µl do produto de PCR purificado e 1,0 µl do primer F ou R de cada exon, 4,0µl de Buffer 5x, 2,0µl do produto de PCR. Foram realizados os mesmos passos para os pares de primers re01 e RHIN1R, Ds2-s e Ds2-a, RHIN2F e RHDIN3R, RHIN3F e rb12, rb11 e RHIN5R, Ds6-s e Ds-6-a, re621 e re75, RHin7DF e RHin8R, RHDIN8F e RHDIN9R, re91 e rr4.
Foram utilizadas as seguintes condições para amplificação no termociclador GeneAmp®
PCR System 9600 (Applied Biosystem, Norwalk, CT, EUA).
Temperatura desnaturação inicial: 1 ciclo de 94ºC/2´
Temperatura de desnaturação, anelamento e extensão: 25 ciclos de 96ºC/10´´+50º/15´´+60ºC/4´
Temperatura de parada (“Stop”): 1 ciclo de 4ºC/1h
Em seguida as amostras amplificadas, e foram submetidas a precipitação com álcool conforme a técnica a seguir:
1. Adicionam-se 80µl de etanol 80% no tubo amplificado. 2. Agitar em vortex.
3. Aguardar 20 minutos a temperatura ambiente protegido da luz.
6. Adicionar 100µl álcool 70%, agitar em vortex. 7. Centrifugar 10 minutos a 14000 rpm.
8. Remover o sobrenadante da mesma forma que o item 5.
9. Adicionar 100µl álcool 70%, agitar em vortex.
10. Centrifugar por 10 minutos a 14000 rpm. 11. Remover o sobrenadante.
12. Secar em banho 56ºC por 20 minutos.
13. Congelar o produto seco (-20ºC) por 15 a 20 dias.
Após adquirir a temperatura ambiente, a cada reação foi acrescido formamida 10-15µl por reação. Foi realizada a transferência do produto para a placa de sequenciamento para o processo de desnaturação a 95ºC por 5 minutos. Neste momento, foi inserida a placa no sequenciador automatizado de fluorescência (ABI 3100, Applied Biosystems, EUA).
As reações de sequenciamento foram estudadas e analisadas por programas computacionais. O software BioEdit® versão 7. 0. 9. 0 forneceu as ferramentas para realizar o alinhamento das sequências nucleotídicas com dedução dos aminoácidos correspondentes. Foram feitas buscas por similaridade, utilizando-se BLAST ou Basic Local Alinhament Sequence Tool, com sequências armazenadas no GenBank™. A análise de polimorfismo nas sequências nucleotídicas e de aminoácidos deduzidos foram realizadas manualmente.
Quadro 6 : Primers, especificidade, localização, sequência, produto e condições de PCR do sequenciamento do RHD.
Primers Especificidade Localização Sequence 5´- 3´ Produto PCR/pb Condições PCR re01 RHD 1 (F) atagagaggccagcacaa 381 1 x 94º.C / 2‟, 30x 94ºC/20”+ 59ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC / 7‟, 1 x 4ºC / 1 h RHIN1R RHD/CE 1 (R) tctgtgcccctggagaaccac
Ds2-s RHD 2 (F) tgacgagtgaaactctatctcgat
1 x 95º.C / 2‟, 30x 95ºC/20”+ 59,8ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC /
7‟, 1 x 4ºC / 1 h Ds2-a RHD/CE 2 (R) ggcatgtctatttctctctgtctaat 1602
RHIN2F RHD/CE 3 (F) aatgagtgagaggcatc 236
1 x 94º.C / 2‟, 30x 94ºC/20”+ 54ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC / 7‟,
1 x 4ºC / 1 h RHIN3R RHD 3 (R) tttcaaaaccctggaaac
RHIN3F RHD/CE 4 (F) tccagtgagccgagatcg 553
1 x 94º.C / 2‟, 30x 94ºC/20”+ 59ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC / 7‟, 1 x 4ºC / 1 h rb12 RHD 4 (R) tcctgaacctgctctgtgaagtgc rb11 RHD 5 (F) tacctttgaattaagcacttcacag 507 1 x 94º.C / 2‟, 30x 94ºC/20”+ 54ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC / 7‟, 1 x 4ºC / 1 h RHIN5R RHD/CE 5 (R) gtggggaggggcataaat
Ds6-s RHD/CE 6 (F) cagggttgccttgttccca 274 1 x 95º.C / 2‟, 30x 95ºC/20”+ 59,8ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC / 7‟, 1 x 4ºC / 1 h Ds6-a RHD 6 (R) cttcagccaaagcagaggagg re621 RHD 7 (F) catccccctttggtggcc 405 1 x 94º.C / 2‟, 30x 94ºC/20”+ 59ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC / 7‟, 1 x 4ºC / 1 h re75 RHD 7 (R) aaggtaggggctggacag RHin7F RHD 8 (F) ctggaggctctgagaggttgag 547 1 x 94º.C / 2‟, 30x 94ºC/20”+ 54ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC / 7‟, 1 x 4ºC / 1 h RHDIN8R RHD/CE 8 (R) tatgtgatcctcagggaaggag
RHDIN8F RHD 9 (F) gttttgacacacaatatttc 235
1 x 94º.C / 2‟, 30x 94ºC/20”+ 54ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC / 7‟,
1 x 4ºC / 1 h RHDIN9R RHD 9 (R) cagcaagtcaacatatatact
re91 RHD/CE 10 (F) caagagatcaagccaaaatcagt 382
1 x 95º.C / 2‟, 30x 95ºC/20”+ 59,8ºC/30” + 72ºC/30”, 1 x 72ºC / 7‟, 1 x 4ºC / 1 h rr4 RHD 10 ( R) agcttactggatgaccacca
3.3 Análise estatística
Análise Estatística Descritiva: foi utilizada no tratamento dos dados, em que foi feita a análise univariada, através da verificação das frequências absolutas de variáveis como fatores de risco, gênero, fenótipo Rh, aloanticorpo , número de gestações e polimorfismos do RHD.
3.4 Aspectos éticos
O presente estudo foi aprovado em 24/09/2004 pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de São Paulo/ Hospital São Paulo como projeto de tese de doutorado (CEP 0676/04). Todos os indivíduos que concordaram em participar do estudo assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) aprovado pelo CEP (Anexos 1 e 2).
_______________________________________________________________________________ O presente estudo realizou de forma sistemática análise sorológica e molecular de 130 indivíduos fenotipados como RhD negativo aloimunizados com anti-D e determinou a frequência de alelos variantes do gene RHD em uma amostra populacional brasileira.
4.1 Característica dos indivíduos estudados
Após a realização de identificação de aloanticorpos através de painel de hemácias , foram identificados 103 (79,20%) indivíduos com anti-D, 24 (18,40%) indivíduos com anti-D, -C, 1 (0,80%) individuo com anti-D, -C, -E e 2 (1,60%) indivíduos com anti-D, -E. Realizada a fenotipagem de todos os indivíduos para os principais antígenos do sistema Rh. A grande maioria, 120 (92,30%) indivíduos fenotipados como ccee, 5 (3,80%) Ccee, 2 (1,50%) CCEe, 1 (0,80%) CwcEe, 1 (0,80%) Cwcee e 1 (0,80%) CcEc (Tabela 1).
_______________________________________________________________________________ Tabela 1: Características dos indivíduos RhD negativo e portadores de
aloanticorpo anti-D. Número de Indivíduos (%) Gênero Masculino 13 (10,00) Feminino 117 (90,00)
Fatores de risco para aloimunização anti-D Transfusão 15 (11,50) Gestação 80 (61,50) Transfusão + Gestação 35 (27,00) Fenótipo Rh ccee 120 (92,30) Ccee 5 (3,80) CCEe 2 (1,50) CWcEe 1 (0,80) Cwcee 1 (0,80) CcEe 1 (0,80) Aloanticorpo anti-D 103 (79,20) anti-D, -C 24 (18,40) anti-D, -C, -E 1 (0,80) anti-D, -E 2 (1,60)
