EFEITO “IN VITRO” DE INSETICIDAS SOBRE Bacillus thuringiensis VAR. kurstaki EM DIFERENTES TÉCNICAS
Everton Ricardi Lozano da Silva1*, Luis Francisco Angeli Alves2,3, Michele Potrich4, Pedro Manuel Oliveira Janeiro Neves1,3,Leonardo Martinelo2
1
UEL - Universidade Estadual de Londrina –Programa de Pós Graduação em Agronomia evertonloz@gmail.com* lfaalves@unioeste.br, michelepotrich@utfpr.edu.br, pedroneves@uel.br,
2 Unioeste – Universidade Estadual do Oeste do Paraná –Cascavel, 3Bolsistas em Produtividade Científica CNPq 4 UTFPR - Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Campus Dois Vizinhos. Professora Assistente.
Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro o efeito de inseticidas sobre células de Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Btk), por meio de diferentes técnicas. Foram testados os seguintes ingredientes ativos espinosade, clorpirifós e cipermetrina + profenofós na concentração recomendada pelo fabricante (CR) e na metade desta (½ CR), sobre células em meio ágar nutriente (AN) - sólido (MS) e caldo nutriente (CN) – líquido (ML). Em MS os inseticidas foram incorporados ao AN e em discos de papel-filtro. Avaliaram-se, respectivamente, as UFC/mL (unidades formadoras de colônia) e a formação de halo de inibição. Em ML, a mistura Btk+inseticidas foi incubada em frascos erlenmeyers (30±2°C, 150rpm, 24 h), diluída e inoculada em AN, quantificando-se UFC/mL. O efeito dos produtos variou conforme a concentração e técnica. Em ambas as concentrações e técnicas, espinosade foi o único produto que permitiu formação de UFC/mL. Em MS as médias foram significativamente menores em relação à testemunha e no ML, na concentração recomendada, foi significativamente maior. Nos testes com discos de papel, espinosade, em ambas as concentrações foi compatível com Btk, sendo os demais inseticidas, incompatíveis.
Palavras-chave: Dipel, compatibilidade, técnicas de avaliação
Introdução
Dentre os entomopatógenos, Bacillus thuringiensis (Bt) tem sido utilizado há mais de 50 anos para o controle de pragas agrícolas e insetos vetores de doenças. Atualmente, é o ingrediente ativo mais utilizado comercialmente nos bioinseticidas, sendo que no Brasil, B. thuringiensis var. kurstaki (Btk) é aplicado em cerca de 150.000 ha para o controle de aproximadamente de 30 pragas, nas diversas culturas (Polanczyk,2004).
A combinação de produtos fitossanitários (PF) e Bt é estudada desde a década de 1950 e são várias as técnicas utilizadas para a avaliação do efeito destes produtos sobre a bactéria. Sutter et al. (1971) estudaram os efeitos de inseticidas sobre células de Bacillus thutingiensis var. thuringiensis (Btt) em meio de cultura líquido. Jimenezet al. (1989) avaliaram os efeitos de PF sobre esporos de Btt, por meio da técnica com discos de papel impregnados em caldas. Ainda, Salerno et al. (1999) testaram herbicidas, fungicidas e inseticidas sobre 16 cepas de Bt, misturando-os em meio de cultura fundido.
Contudo, os estudos referentes aos efeitos de PF sobre Btk são escassos, desatualizados, e sem uma padronização na metodologia. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro o efeito de inseticidas sobre células de Btk, por meio de diferentes técnicas.
Material e Métodos
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Zoologia de Invertebrados (CCBS) e no Laboratório de Enzimologia (CCMF) da Unioeste, Campus de Cascavel.
Foram testados inseticidas (Tabela 1), na concentração recomendada pelo fabricante (CR) e na metade desta (½ CR), sobre células de Btk, isoladas do produto comercial Dipel PM®. Os testes foram realizados em meio de cultura sólido (MS) e líquido (ML).
Mistura ao meio: Os inseticidas, na CR e na ½ CR foram adicionados em meio AN fundido, ainda não solidificado em placas-de-petri. Após solidificação, para cada tratamento, foram inoculadas suspensões de células do pré-cultivo, nas concentrações 4 × 103 e 4 × 102 UFC mL-1. Foram feitas quatro repetições por suspensão, sendo inoculadas duas placas com pontos de 5µ L cada. Após incubação (30± 2ºC; 20 h) foram quantificadas as UFC mL-1. Foi classificado como compatível com a célula de Btk o produto que permitiu crescimento, significativamente igual ao da testemunha, e incompatível o que não permitiu o crescimento bacteriano e ou foi significativamente diferente da testemunha.
Contato com papel de filtro: Discos de papel-filtro de 1cm de diâmetro foram mergulhados nas caldas dos inseticidas, nas duas concentrações, e colocados em contato com a superfície do meio de cultura já inoculado com 0,1 mL do pré-cultivo (1,4 × 105 UFC mL-1) distribuído na superfície do meio– técnica B. Foram utilizadas quatro repetições, sendo uma placa com cinco discos para cada repetição. Após incubação (24 h, 30±2ºC), avaliou-se a presença do halo de inibição no crescimento das colônias ao redor dos discos. O produto que apresentou halo de inibição ao redor do disco de papel foi classificado como incompatível, ao passo que o produto que não apresentou halo foi classificado como compatível com células de Btk.
Meio líquido
Os inseticidas foram adicionados ao meio CN, em frascos erlenmeyer com 1 mL de Btk na concentração de 4 × 107 UFC mL-1, utilizando-se quatro repetições – técnica C. Os frascos foram incubados em agitador horizontal (shaker) (30±2º C, 150 rpm, 24 h). De cada mistura procedeu-se diluições decimais, sendo as suspensões inoculadas nas concentrações de 10-4 e 10-5 em duas placas-de-petri. Foram utilizadas duas placas por repetição com cinco pontos de 5 µL placa-1 e após incubação (30±2ºC, 20 h) foi avaliado o crescimento vegetativo, quantificando-se o número das UFC mL-1 ponto.
Exceto para técnica dos discos impregnados, os experimentos foram realizados segundo delineamento experimental inteiramente casualizado, considerando cada ponto inoculado nas placas como repetição. Os dados foram submetidos à análise de variância pelo teste F e às médias comparadas entre si pelo teste de Tukey, ambos com 5% de significância. Quando necessário, os dados foram previamente transformados em x+1. Para todas as análises utilizou-se o programa estatístico SISVAR (Ferreira, 2005).
Resultados e Discussão Meio sólido
Mistura ao meio: Espinosade foi o único produto que permitiu a formação de UFC mL-1, porém com significativa redução em relação a testemunha. (Tabela 2). Em trabalho semelhante, inseticidas foram testados em duas concentrações e verificou-se que na concentração mínima não houve diferença significativa entre os tratamentos e a testemunha, e para a concentração máxima o efeito foi negativo para piretróide, organoclorado e um organofosforado (Batista Filho et al., 2001). Gassen et al. (2007) em testes com Btk também verificaram variação no efeito entre organofosforados, além de diferença entre neonicotinóides, sendo que neste último, tiametoxan foi considerado compatível e o acetamiprido, incompatível.
Contato com papel-filtro: Para espinosade, em ambas as concentrações, não houve formação de halo de inibição, semelhante à testemunha, sendo que para os demais tratamentos houve formação de halo (Tabela 3).
Jimenez et al. (1989) observaram que a presença do halo variou conforme o produto (fungicidas e inseticidas), sendo que as menores concentrações foram compatíveis. Ainda, de acordo com os autores, houve variação na formação do halo entre diferentes inseticidas organofosforados em diferentes concentrações.
Em meio líquido:
Assim como verificado no teste com discos impregnados, somente espinosade, em ambas as concentrações, permitiu o desenvolvimento de Btk (formação de UFC mL-1), sendo significativamente superior apenas para CR. Para os demais tratamentos não houve formação de UFC mL-1 (Tabela 4).
Em testes com Bt e inseticidas organofosforados e organoclorados ao longo dos tempos de 2, 4, 6 e 8 horas de incubação, verificou-se que os efeitos variaram conforme o inseticida utilizado, e entre inseticidas de um mesmo grupo químico, uma vez que alguns organosforados causaram efeito negativo sobre o crescimento vegetativo de Bt e outros não (Sutteret al., 1971). Ainda, segundo os autores, com o aumento do tempo de incubação os efeitos negativos diminuíram independentemente da concentração testada.
Comparação entre as técnicas de avaliação:
Em todas as técnicas testadas, espinosade, em ambas as concentrações, permitiu o desenvolvimento de Btk, porém com variação na classificação de compatibilidade. Na técnica com meio AN fundido, ainda não solidificado, em ambas as concentrações, o efeito do espinosade foi significativamente negativo, e positivo na técnica de contato como papel filtro. Porém, na técnica em meio líquido, espinosade, na CR foi significativamente superior a testemunha.
A técnica de contato com papel filtro apresenta fatores que a coloca em desvantagem em relação às demais, como grande quantidade de patógeno inoculado, impossibilidade de quantificação, além da variação na difusão do produto no meio de cultura. Assim, os resultados podem variar de acordo com as características físico-químicas dos componentes do produto, conforme discutido por Silva et al. (2006). Além disso, comparando-se as técnicas em meio AN fundido, ainda não solidificado e meio líquido, o fator oxigenação pode estar relacionado aos resultados, uma vez que a difusão do oxigênio em meio com agitação é maior. O efeito da oxigenação no desenvolvimento de Bt foi verificado por Ignatenkoet al. (1983).
Nesse sentido, os resultados da técnica em meio líquido são mais confiáveis, uma vez que há uma distribuição mais homogênea do produto no meio, melhor oxigenação e dispersão dos metabólitos secundários. Isto associado ao constante contato do patógeno com o substrato ao longo do tempo aumenta a possibilidade de metabolização dos componentes do meio e conseqüente crescimento populacional, justificando os resultados obtidos para espinosade nesta técnica. Efeitos positivos relacionados ao aumento do tempo de incubação do Bt com produtos fitossanitários também foram verificados para inseticidas Sutter et al.,1971, fungicidas, Silva et al. (2006) e herbicidas Silvaet al. (2007).
Além da técnica utilizada e o tempo de incubação, o efeito dos produtos fitossanitários pode estar relacionado à concentração do produto Jimenez et al., (1989), Batista Filho et al. (2001), Silva et al. (2006, 2007), bem como aos seus formulantes, como os solventes Morris (1975).
A maioria dos trabalhos referentes ao efeito de produtos fitossanitários e entomopatógenos é desenvolvida in vitro, com a exposição máxima dos entomopatógenos aos produtos. Assim, detectada a inocuidade em condições de laboratório, a aplicação em campo é praticamente garantida com relação ao efeito testado. Contudo,
A técnica em meio AN fundido, ainda não solidificado é comumente a mais utilizada para avaliação, in vitro, do efeito de produtos fitossanitários sobre Bt. Entretanto, há a necessidade de se rever a utilização desta para se atestar tal efeito, pois tanto para inseticida, como em trabalhos com fungicidas (Silvaet al., 2006) e herbicidas (Silva et al., 2007) observou-se variação no efeito com relação à técnica em meio líquido.
Conclusão
A técnica em meio líquido permite resultados mais confiáveis, uma vez que há uma distribuição mais homogênea do produto no meio de cultura.
Referências
ALVES, S.B.; MOINO JÚNIOR, A.; ALMEIDA, J.E.M. Produtos fitossanitários e entomopatógenos. In: ALVES, S.B. (Ed). Controle Microbiano de Insetos. 2ª Ed. Piracicaba: FEALQ, 1998. cap. 8, p.217-238.
FERREIRA, D.F. Sistema Sisvar para análises estatísticas. <http://www.dex.ufla.br/danielff/dff02.htm> Acessado em 23 de dez., 2005.
GASSEN, M.H. BATISTA FILHO, A., ZAPPELINI, L.O. Avaliação da compatibilidade de fungicidas e inseticidas com a bactéria entomopatogênica, Bacillus thuringiensis, em laboratório. In: 19ª RAIB – Reunião Anual do Instituto Biológico. O biológico, v.68, suplemento 2, 2007. Disponível em:
http://www.biologico.sp.gov.br/biologico/v68_supl_raib/252.PDF Acesso em : 15 mai. 2007.
IGNATENKO, YU.N.; SAKHAROVA, Z.V.; KHOVRYCHEV, M.P.; SHEVTSOV, V.V. Efect of temperature and aeration on growth and spore formation in Bacillus thuringiensis. Microbiology, v.52.n.5, p.553-556, 1983.
JIMENEZ, J.; ACOSTA, N.; FERNANDEZ, R. Efecto de insecticidas y fungicidas sobre la actividade biologica de preparaciones de Bacillus thuringiensis. Protección de Plantas, v.12, n.1, p.45 –59, 1989.
MORRIS, O.N. Effect of Some Chemical Insecticides on the Germination and Repelication of Commercial Bacillus thuringiensis. Journal of Invertebrate Pathology, v.26, n.2. p. 199-204, 1975.
POLANCZYK, R.A. Estudos de Bacillus thuringiensis Berliner visando ao controle de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith). 2004. 144p. Tese (Doutorado Entomologia) - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” - Universidade de São Paulo, Piracicaba.
SALERNO, C.; DIAS, S.; SAGARDOY, M. Efecto de pesticidas sobre cepas de Bacillus thuringiensis bajo condiciones controladas. Rev. Argentina de Microbiologia, v.31, p. 58-64, 1999.
SILVA, E.R.L.; ALVES, L.F.A.; SENE, L; SANTOS, J. BONINI, A.K., POTRICH, M. & NEVES, P.M.O.J. Técnicas para avaliação do efeito “in vitro” de fungicidas sobre Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Arq. Inst. Biol., v.73, n.4, 2006.
SILVA, E.R.L.; ALVES, L.F.A.; SANTOS, J.; POTRICH, M. & SENE, L. Técnicas para Avaliação in vitro do efeito de herbicidas sobre Bacillus thuringiensis Berliner var. kurstaki, Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.1, p.59-67, jan./mar., 2008.
SUTTER, G.R.; ABRAHANSON, M.D. ; HAMILTON, E.W. & VICK, I.D. Compatibility of Bacillus thuringiensis var. Kurstaki and Chemical inseticides. 1. Effect of Insecticide Doses on Bacterial Replication Rate. Journal of Economic Entomology, v.64, n.6, p.1348-1350, 1971.
Tabela 1. Inseticidas utilizados nos experimentos. Nome
Comercial Técnico Formulação Grupo Químico
Concentração Recomendada L/ha1 Politrin Cipermetrina + profenofós CE piretróide + organofosforado 1,2
Tracer Espinosade SC Espinosinas 0,1
Lorsban 480 BR Clorpirifos CE Organofosforado 0,5 1
Diluição padronizada em 100L H2O/ha
Tabela 2. Média de UFC mL-1 (±EP) de Bacillus thuringiensis var. kurstaki incubado em caldo nutriente (30±2º C e 150 rpm, por 24h) e inoculado (10-4) em ágar nutriente misturado com diferentes concentrações de inseticidas. Tratamentos Conc. Média UFC/mL (×107) % Relação à Testemunha1
Testemunha __ 20,07 ± 1,06 a __ Espinosade ½ CR 4,56 ± 0,08 b - 77,3 Espinosade CR 3,95 ± 0,6 b - 80,3 Clorpirifós ½ CR 0,0 c 2 Clorpirifós CR 0,0 c 2 Cipermetrina + profenofós ½ CR 0,0 c 2 Cipermetrina + profenofós ½ CR 0,0 c 2 CV (%) 7,23
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (α =5%) 1
Fórmula: [(Média de UFC/mL do tratamento/ Média de UFC/mL da testemunha × 100 ) – 100], sendo os valores positivos para aumento de UFC e negativos para a redução em relação à testemunha
2 Cálculo não realizado por não haver formação de UFC.
Tabela 3. Efeito de inseticidas em diferentes concentrações sobre Bacillus thuringiensis var. kurstaki após 24 horas de incubação (30±2º C). Repetição I II III IV Tratamentos Conc.1 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Testemunha __ - - - - Espinosade CR - - - - Espinosade ½ CR - - - - Clorpirifos CR + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Clorpirifos ½ CR + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - Cipermetrina + profenofós CR + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + Cipermetrina + profenofós ½ CR + + + + - + + + + + + + - - - + + + + + - = ausência de halo + = halo em torno de 1mm ++ = halo maior que 1 mm
Tabela 4. Média de UFC/mL (±EP) de Bacillus thuringiensis var. kurstaki após incubação em caldo nutriente (30±2ºC, 150 rpm, 24h) com inseticidas em diferentes concentrações.
Tratamentos Conc. Média UFC/mL (×107) % Relação à Testemunha1 Dif.Inóc.Inic.3 (×106) UFC/ mL Espinosade CR 24,65 ± 4,0 a +63,9 +1,66 Espinosade ½ CR 24,01 ± 3,5 ab + 59,6 +1,6 Testemunha __ 15,04 ± 6,6 b __2 +1,42 Clorpirifós ½ CR 0,0 c __2 Clorpirifós CR 0,0 c __2 Cipermetrina + profenofós ½ CR 0,0 c __2 Cipermetrina + profenofós ½ CR 0,0 c __2 CV (%) 18,25
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (α =5%) 1
Fórmula: [(Média de UFC/mL do tratamento/ Média de UFC/mL da testemunha × 100 ) – 100], sendo os valores positivos para aumento de UFC e negativos para a redução em relação à testemunha
2
Cálculo não realizado por não haver formação de UFC 3
Diferença do inóculo inicial = [(Média de UFC/mL do patógeno inoculada antes da incubação nos frascos Erlenmeyer) – (Média de UFC/mL do patógeno obtida após 24h de incubação )], sendo os valores positivos para crescimento da bactéria (aumento de UFC) e negativos para morte da bactéria (diminuição das UFC) em relação ao inóculo inicial.
