Desenvolvimento de Métodos por HPLC Fundamentos, Estratégias e Validação

(1)

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Desenvolvimento de Métodos por HPLC

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Edição revista em dezembro de 2001

Universidade Federal de São

Universidade Federal de São Carlos

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Oswaldo Baptista Duarte Filho

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São Carlos

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2001 2001

(5)

Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária da UFSCar

Cass, Quezia B.

C343d Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação / Quezia B. Cass, Ana Luiza Gusmão Degani - São Carlos: EdU FSCar, 2001.

77p. - (Série Apontamentos)

ISBN = 85-85173-61-0

1. Cromatografia líquida. 2. Análise quantitativa. 3. Parâmetros cromatográficos. 4. Cromatografia quiral. 5. Cromatografia preparativa. I. Título.

CDD - 543.0894 (20*) CDU - 543.544.44

Revisão e Produção Gráfica

Art es e Textos

Impressão e acabamento

Departamento de Produção Gráfica - Universidade Federal de São Carlos

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(6)

SUMÁRIO

1. In t r o d u ç ã o ... ... ... ... 2. Te o r i a... 3. Pa r â m e t r o s Cr o m a t o g r á f ic o s 4. In s t r u m e n t a ç ã o _____ _______ 5. Síl ic a Ge l ... 6. Fa s e s Qu im ic a m e n t e Li g a d a s .. 7. Mo d o s d e Se p a r a ç ã o . ... 8. Ot im iz a ç ã o... 9. El u i ç â o Gr a d i e n t e... 10. Cr o m a t o g r a f i a Qu ir a l ...

11.

Cr o m a t o g r a f i a Pr e pa r a t iv a ... 12. Tr a t a m e n t o d e Am o s t r a s ...

.. 5

.. 7

.11

.17

.23

.25

.27

.35

.41

.49

.57

63

13. Va l i d a ç ã o d e Mé t o d o s An a l ít ic o s

71

(7)

1. INTRODUÇÃO

A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias torna-a uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação.

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é atribuída a um botânico russo, ao descrever suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas. Neste estudo, a passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna de vidro preeenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicion ou o extrato, levou à separação dos componentes em faixas coloridas. Este é provavelmente o motivo pelo qual esta técnica é conhecida como cromatografia (“chrom” - cor e “graphie” - escrever), podendo levar à errônea idéia de que este processo seja dependente da cor.

Apesar deste estudo e de outros anteriores, os quais também poderiam ser considerados precursores do uso desta técnica, a cromatografia foi praticamente ignorada até a década de 30, quando foi redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na área possibilitaram seu aperfeiçoamento e, em conjunto com os avanços tecnológicos, a levaram a um elevado grau de sofisticação, o qual resultou no seu grande potencial de aplicação em muitas áreas.

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE/HPLC) surgiu como a aplicação de cromatografia líquida às teorias e instrumentações desenvolvidas originalmente para a cromatografia gasosa.

Baseando-se na teoria da cromatografia gasosa, de que a eficiência de uma separação aumenta com a diminuição do tamanho da partícula da fase estacionária, surgiu, na década de 60, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

Em 1952, Martin e Synge ganharam o prêmio Nobel pelo desenvolvimento do primeiro tratamento matemático da teoria cromatográfica e, com o avanço da tecnologia, foi possível aplicar esta teoria ao desenvolvimento da cromatografia líquida.

A principal diferença entre a cromatografia líquida clássica e a cromatografia líquida de alta eficiência é a utilização de fases estacionárias com micropartículas (10, 5 ou 3 m) esféricas, de preferência. Estas fases,' por serem muito menos permeáveis, tornaram necessária a utilização de bombas para a eluição da fase móvel.

A utilização destas novas fases estacionárias, associada ao desenvolvimento da instrumentação, levou esta técnica a uma melhor performance em termos de resolução, quantificação e detecção em um menor tempo de análise.

Referências

DEGANI, A.L.G.; CASS, Q.B.; VIEIRA, P.C. (1997). Cromatografia: Um breve ensaio. Química Nova na Escola, v.7, p.21-25.

LOUGH, W.J.; WAINER, I.W. (1995). High Perform ance L iq uid Chromatography, Fund amental Prin cipies an d P ractice. Glasgow, Blackie Academic & Professional. p. 1-276.

(8)

Desenvolvimento de Métodos por HPLC: Fundamentos, Estratégias e Validação 7

2. TEORIA

A separação cromatográfica baseia-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido às diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária, e no alargamento de bandas, que é dependente de processos físicos e não da diferença de equilíbrio.

A migração diferencial resulta da diferença de equilíbrio dos analitos entre as duas fases imiscíveis e é determinada pelos fatores que afetam este equilíbrio: composição da fase móvel, composição da fase estacionária e temperatura da separação. Mudanças em um ou mais destes parâmetros levam a alterações na migração diferencial.

Os processos físicos responsáveis pelo alargamento de bandas são: difusão de Eddy (ou de múltiplos caminhos), transferência de massa da fase móvel, transferência de massa da fase móvel estagnada, transferência de massa da fase estacionária e difusão longitudinal.

Difusão de Eddy - A permeabilidade microscopicamente diferente da fase estacionária causa o alargamento das bandas como conseqüência dos diferentes “caminhos” seguidos pela fase móvel

(Figura 2.1a).

Transfe rência de massa da fase móvel - Refere-se às diferenças de fluxo em um mesmo “caminho” seguido pela fase móvel, ou seja, entre as partículas, o fluxo central é maior do que os adjacentes a elas, levando a diferenças de transferência de massa e, conseqüentemente, ao alar gamento de bandas (Figura 2.1b).

Transferência de massa da fase móvel estagnada - Com partículas porosas tem-se fase móvel estagnada. As moléculas do soluto que se difundem para essa fase móvel transferem-se mais lentamente do que aquelas que não se difundem, resultando no alargamento da band a (Figura 2.1c).

Transferência de massa da fase estacionária - Resulta das diferenças de difusão das moléculas nos poros da fase estacionária (Figura 2.1 d).

Difusão longitudinal - £ decorrente do fato de que as moléculas do soluto tendem a se difundir randomicamente em todas as direções. Este fenômeno geralmente não tem importância, sendo significativo apenas em baixos fluxos (Figura 2.1e).

< 9 < 9 ( 9 V ? b 0 c d . e = ^ P

(9)

2.1 A Banda Cromatográfica

Em cromatografia líquida, as bandas devem seguir uma distribuição gaussiana, sendo a concentração do soluto calculada pela seguinte fórmula:

em que:

Fy= a velocidade de fluxo

O = o desvio-padrão da distribuição M= a massa injetada

tr = o tempo de retenção

A Figura 2.2 mostra que, seguindo a distribuição gaussiana, as larguras de picos são calculadas po r intermédio de tangentes que vão do po nto de inflexão até a lin ha de base e, sendo assim, a

largura de um pico na linha de base (wj corresponde a 4o, enquanto na meia altura (w05), a 2,354o. (2.1) 1,2 1.1 1.0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 2 o 2,354a - 4 - 2 0 ? 4 ' 4- — wb—*

Figura 2 .2 Esquema da distribuição gaussiana de uma banda cromatográfica.

2.2 Retenção (R)

É uma medida quantitativa da migração, sendo definida pela razão entre a velocidade da amostra (uj e a velocidade da fase móvel (uj, isto é,

Se a fração de moléculas da amostra na fase móvel for igual a zero (R = 0), não haverá migração e ux= 0. Por outro lado, se a fração de moléculas da amostra na fase móvel for igual a 1, as moléculas da amostra movem-se na mesma velocidade do solvente, R = 1.

Assim, o R em cromatografia líquida pode ser definido de acordo com a Equação 2.3 mostrada abaixo.

(10)

Pode também ser relacionado com a fração do número de moléculas na fase móvel em qualquer

tempo.

R = /m= Nm+Ne (2-4)

Tempo de retenção (tr)

- E a medida entre o ponto de injeção e o máximo do pico.

Tempo morto (tj - É o tempo de eluição de um soluto não retido. (Mede o tempo necessário para

que este soluto seja detectado, desde o ponto de injeção.)

Na Figura 2.3 estão esquematizadas as medidas relacionadas ao cálculo dos parâmetros de

separação.

t,

Figura 2.3 Esquematização das medidas relacionadas ao cálculo dos parâmetros de separação.

Referências

GILBERT, M.T. (1987).

High Performance Liquid Chromatography.

Bristol, Whight. p.5-11.

RILEY, C.M. (1995). Efficiency, retention, selectivity and resolution in chromatography. Ini

WAINER, I.W.; LOUGH, W.J., eds.

High Performance Liquid Chromatography, Fundamental

Principles and Practice.

Glasgow, Blackie Academic & Professional, p. 15-35.

SNYDER, L.R.; KIRKLAND, JJ. (1979).

Introduction to Modern Liquid Chromatography.

2.ed. New

York, John Wiley and Sons. p. 15-82.

SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1997).

Practical HPLC Method Development.

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3. PARAMETROS CROMATOGRAFICOS

3.1 Fator de Retenção (k)

Medida adimensional e fundamental da retenção em cromatografia líquida. E definido como a razão entre o número de moléculas do soluto na fase estacionária e o número de moléculas do soluto na fase móvel, sendo:

N, N„

k = ^ * (3.1)

A combinação das Equações 2.3, 2.4 e 3.1 leva ao desenvolvimento da Equação 3.2, que correlaciona o fator de retenção (k) de um soluto com o seu tempo de retenção (tr) e o tempo de retenção de um soluto não retido (tj:

R = — t. R = N" N„ + N„ t„ Nn tr Nm+N. t0(Nm+N.) = Nmxtr toXNn,+t0xNa=Nmxtr t0xN,=Nmxtr-Nmxt0 t„ xN, = Nm(tr - 10) Ne t r-to i Ne ,, — = . ecomo k = —— (3.1), Nm tn Nm k = - —-(2.3) (2.4) (3.2)

3.2 Número de Pratos (N)

Cada prato corresponde a uma etapa de equilíbrio do soluto entre as duas fases. Mede a eficiência das condições cromatográficas, através dos tempos de retenção obtidos e do alargamento de bandas. Este parâmetro é normalmente utilizado para avaliar a performance da coluna, admitindo-se uma escolha adequada das condições.

N = ( i ) ‘ (3.3)

g _ w0Æ _ w b 2,354 4

(12)

12 EdUFSCar - Apontamentos

Então,

N = 16

't *

vwby (3.4)

N = 5,54 _(3.5)

Como o valor de N é aproximadamente constante para diferentes bandas em um cromatograma, o alargamento das bandas aumenta proporcionalmente com o aumento do tempo de retenção.

A utilização da largura do pico na meia altura é mais simples, por não exigir a extrapolação das linhas tangentes ao ponto de inflexão, sendo também mais exata.

Altura Equivalente a um Prato (H)

E a correlação entre o número de pratos teóricos e o tamanho da coluna. Utilizada para comparação de eficiência entre colunas de diferentes comprimentos.

H =—

N (3.6)

Altura do Prato Reduzido (h)

Correlaciona a altura equivalente a um prato teórico com o diâmetro das partículas, sendo utilizado para a comparação de eficiência entre colunas de diferentes comprimentos, empacotadas com partículas de diferentes diâmetros.

As Equações 3.6 e 3.7 mostram que o número de pratos (N) é diretamente proporcional ao comprimento da coluna (L) e inversamente proporcional ao diâmetro das partículas (dj.

A obtenção do valor de N necessário à separação deve considerar também o tempo de análise e a pressão exercida pela coluna no sistema. A pressão é diretamente proporcional ao comprimento da coluna e inversamente proporcional ao diâmetro das partículas. Desta forma, aumenta-se N preferencialmente por intermédio da utilização de partículas de menor diâmetro em colunas de

menor comprimento.

As colunas analíticas comerciais têm usualmente 15 ou 25 cm, sendo empacotadas com partículas de 5 ou 10 p.. Colunas com partículas de 3 JXe comprimentos menores do que 15 cm

têm sido usadas para análises rápidas.

Os números de pratos das colunas comerciais variam entre 25.000 e 50.000 pratos/m.

Dispersão Extracoluna (o^

E o alargamento causado por difusão no injetor, no detector e/ou na tubulação.

(13)

Como o alargamento de bandas aumenta com o aumento da retenção, as contribuições ante riores são significativas apenas para valores baixos de k. Volumes extra coluna inferiores a 10% do volume do pico são ideais.

Os equipamentos atuais são configurados de forma a evitar volume morto. São utilizadas tubulações com 0,8 mm d.i. antes do injetor e 0,3 mm d.i. depois dele.

Assimetria de Picos (As)

Embora não prevista teoricamente, é extremamente comum. Suas principais causas são: a mistura dos mecanismos de retenção, a incompatibilidade da amostra com a fase móvel e/ou estacionária e a existência de volume morto no topo da coluna. E calculada da seguinte forma:

a b f

A. = - (3.9)

Figura 3.1 Esquema e equação para o cálculo da assimetria de um pico.

Há divergências quanto à posição em que a assimetria deve ser calculada. Há recomendações para que a mesma seja calculada tanto a 5% como a 10% da altura do pico, como mostra a Figura

3.1.

3.3 Fator de Separação (a)

Mede a seletividade da separação para duas bandas adjacentes. E a relação entre seus fatores de retenção, sendo calculado da seguinte forma:

k2

■ «- ]£ (3.10)

Pode ser alterado por variações na fase móvel e/ou estacionária, temperatura, pH e força iônica.

Resolução (Rs)

Mede a qualidade da separação. Leva em conta as larguras das bandas, além de seus respectivos tempos de retenção. Pode ser estimada ou medida de três formas:

(14)

14 EdUFSCar - Apontamentos

Rs =1,18- _(3.12)

• Por comparação com curvas de resolução padrão (0,4 < Rs < 1,3) (Figura 3.2)

1/1 1/4 1/16

Rs= 0,6

R,- 0,8

R, = 1.0

R, = 1,25

Figura 3.2 Curvas de resolução padrão.

• Por intermédio de cálculos baseados no vale entre duas bandas, os quais fornecem valores mais precisos para 0,8 < R < 1,5 (Figura 3.3 e Tabela 3.1)

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Tabela 3.1 Estimativas do valor de Rs baseadas na altura do vale entre duas bandas (hv é expresso como a porcentagem dele em relação ao menor pico).

Rs de acordo com a razão entre as bandas (hi/fe)

hv(%) 1/1 2/1 4/1 8/1 16/1 3 1,46 1,50 .- ®*. -5 1,35 1,42 1,48 1,52 -8 1,26 1,33 1,40 1,45 -10 1,22 1,29 1,35 1,41 1,47 15 1,14 1,21 1,27 1,33 1,39 20 1,07 1,15 1,21 1,27 1,33 30 0,97 1,06 1,12 1,19 1,24 40 0,90 0,98 1,06 1,12 1,18 50 0,83 0,92 1,00 1,07 1,12 60 0,78 0,87 0,95 1,02 1,08 70 0,73 0,82 0,90 0,97 1,03 80 0,68 0,78 0,86 0,93 0,99

Resolução de linha de base é alcançada com valores Rs ^ 1,5. Importante é a obtenção da

resolução necessária com o menor tempo de análise. O Rs desejado deve corresponder, ao tipo de

aplicação da separação, ou seja, análise qualitativa, quantitativa ou separações preparativas.

Referências

GILBERT, M.T. (1987).

High Performance Liquid Chromatography.

Bristol, Whight. p.5-11.

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York, John Wiley and Sons. p. 15-82.

SNYDER, L.R., KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1997).

Practical HPLC Method Development,

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4. INSTRUMENTAÇÃO

A instrumentação necessária para HPLC é extremamente sofisticada, muito diferente dos aparelhos utilizados pela Cromatografia Líquida Clássica. A Figura 4.1 mostra os componentes fundamentais de um equipamento para HPLC.

Atualmente, existem equipamentos totalmente computadorizados. São divididos em módulos, que podem ser controlados individualmente ou por computador. Os softwares disponíveis são capazes de detectar problemas de funcionamento e também a necessidade de troca de alguma peça.

O desenvolvimento de colunas com fases estacionárias preparadas com partículas de menor diâmetro, as quais ofereciam maior resistência à passagem de fase móvel, tornou necessária a utilização de sistemas de bombeamento mais eficientes. As primeiras bombas utilizadas, conhecidas como bombas de baixa pressão, produziam fluxos pulsantes, sendo inadequadas para tal fim.

Uma bomba de HPLC precisa ser capaz de produzir fluxo constante e reprodutível, sem pulsos, nas altas pressões necessárias, e ser resistente às fases móveis utilizadas.

As bombas analíticas atuais operam em pressões de no máximo 500 bar (7000 psi), em fluxos de 0,01-10 mL/min, e são feitas de aço inoxidável (tubulações e demais partes), safira, cerâmica, quartzo ou titânio (pistões), rubi (assentos das check valves) e teflon (selos) e outros polímeros.

4.1 Bombas

Existem dois tipos de bombas para HPLC: as bombas que produzem fluxo variável a uma pressão constante e as que produzem fluxo constante a uma pressão variável, sendo as últimas as

utilizadas em HPLC.

Bombas de pressão constante

Pneumáticas

Bombas em que o líquido é deslocado mediante a pressão exercida por um gás inerte à alta pressão.

Não são utilizadas em HPLC por fornecerem fluxos variáveis e com pulsação, devido ao seu mecanismo de ação, mas são muito utilizadas para o empacotamento de colunas, pelas altas pressões geradas.

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Bombas de fluxo constante

Seringa

Funciona de maneira análoga a uma seringa, sendo o êmbolo movido por um motor, que possibilita o deslocamento do líquid o a um fluxo constante.

Ás câmaras (seringas) possuem capacidade limitada de fase móvel, embora existam modelos para até 500 mL.

Não são mais utilizadas por um a série de fatores, tais como: a necessidade de recarregamento constante da câmara de solvente ou troca deste e o tempo requerido para que ela chegue ao fluxo nominal.

Atualmente, têm sido utilizadas em micro HPLC, pela ausência de pulsos.

Recíprocas

Representam 85% das bombas utilizadas em HPLC. Também são chamadas de bombas de pistão ou diafragma.

O funcionamento destas bombas baseia-se em um pistão, movido por um motor elétrico, que empurra a fase móvel através do sistema cromatográfico (Figura 4.2).

Safda de fase móvel

fase móvel

Figura 4.2 Esquematização de uma bomba recíproca.

O grande problema destas bombas é a produção de fluxos pulsantes, decorrentes do movimento de “ida e volta” do pistão.

Bombas com dois ou mais pistões e o uso de sistemas de amortecimento foram desenvolvidos para contornar a pulsação.

O uso de bombas com apenas um pistão, sendo este muito pequeno, já se tornou mais comum que o modelo anterior, de dois pistões, por ser mais simples e muito eficiente.

4.2 Injetores

Inicialmente, a introdução da amostra era feita com microsseringas, de maneira análoga à Cromatografia Gasosa.

Atualmente, são utilizados injetores de válvula e, embora existam diversos modelos no mercado, o princípio de operação de todos é o mesmo.

A alça de amostragem (loop) de tais válvulas pode ser externa ou interna. As alças externas nada mais são que tubulações de volume preciso, as quais podem ser trocadas para que se permita a injeção de diferentes volumes de amostra.

Estas válvulas possuem duas posições. Na posição LOAD, a amostra é injetada na alça de amostragem com uma seringa de ponta rombuda, sendo o excesso imediatamente descartado (Figura 4.3a, entradas 1-6-3-2).

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Desenvolvimento de Métodos por HPLC: Fundamentos, Estratégias e Validação 19 Descarte P o s i ç ã o LOAD Saída para a coluna

Seringa com amostra

Descarte

P o s iç ã o i n j e c t

Seringa com amostra

Saída para

a coluna 4

Entrada de Entrada de fase móvel fase móvel

Figura 4.3 Injetor de válvula, a) Posição LOAD e b) posição INJECT.

A posição INJECT abre a válvula para que a fase móvel empurre a amostra para a coluna (Figura 4.3b, entradas 4-3-6-5).

A lavagem da alça de amostragem, antes da injeção da amostra, com aproximadamente dez vezes o volume desta, é recomendável, de modo a assegurar a remoção de possíveis resíduos.

Estas válvulas, embora caras, possibilitam a injeção de amostras nas pressões necessárias a estes sistemas, com grande eficiência e precisão.

São facilmente automatizáveis, por intermédio de motores elétricos ou pneumáticos, controlados por computador. Estes injetores automatizados são denominados auto-injetores e são capazes de injetar um grande número de amostras sem a presença do analista, além de operações como diluição, derivatização ou adição de reagentes.

4.3 Detectores

A função destes equipamentos é a detecção dos compostos vindos do eluente da coluna. Algumas das características desejadas ao escolher um detector são: alta sensibilidade, alta seletividade, linearidade; baixo limite de detecção e estabilidade frente a mudanças na composição da fase móvel e na temperatura.

Os detectores para HPLC são classificados em duas categorias: os que detectam propriedades existentes tanto na fase móvel como nos solutos (não-seletivos) e os que apenas detectam prop riedades inerentes ao soluto (seletivos). A lim itação em relação à utilização de detectores universais reside no fato de que muitas vezes as propriedades do soluto e da fase móvel são similares.

UV-Visível

E o detector mais utilizado em HPLC.

Princípio: absorção de luz ultravioleta ou visível, por parte da amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.

E um detector seletivo para moléculas que possuem cromóforos.

Há três diferentes tipos de equipamentos, operando de acordo com o princípio descrito acima: os fotômetros de comprimento de onda fixo, os espectrofotômetros e os detectores por arranjo de fotodiodos.

Os fotômetros de comprimento de onda fixo têm sua aplicação restrita a moléculas que absorvam no comprimento de onda em que eles trabalham.

Os espectrofotômetros são mais versáteis, perm itindo a escolha do comprimento de onda mais adequado a cada análise. Estes equipamentos podem emitir apenas luz ultravioleta, de 190-600 nm, através de lâmpadas de deutério, como também na região do visível, de 350-900 nm, utilizando-se lâmpadas de tungsténio.

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Os detectores por arranjo de fotodiodos fornecem espectros no UV-Vis do eluente da coluna em determinados intervalos de tempo. São especialmente úteis para o desenvolvimento de métodos, por possibilitarem um a “varredura” da região UV-Vis em uma única corrida cromatográfica, para

medidas de pureza de pico e para a análise de amostras desconhecidas.

Recomenda-se a utilização do comprimento de onda máximo do analito, desde que este seja superior a 220 nm, pois abaixo deste valor geralmente observa-se interferência da fase móvel. Embora alguns eluentes possibilitem a análise em comprimentos de onda mais baixos (por exemplo, acetonitrila/água - 200 nm), sugere-se a utilização do comprim ento de onda de um cromóforo mais fraco, em um comprimento de onda mais alto. A Tabela 4.1 mostra os comprimentos de onda mínimos para que não se observe interferência da fase móvel.

Tabela 4.1 Comprimento de onda mínimo dos solventes mais utilizados.

Solvente UV (nm) mínimo Acetona 330 Acetonitrila 200 Benzeno 280 Tetracloreto de carbono 265 Clorofórmio 245 Ciclohexano 210 Éter etílico 220 Dimetilsulfóxido 270 Etanol 210 Acetato de etila 255 Hexano 200 Metanol 210 Pentano 200 1-Propanol 210 Tetraidro furano 215 Tolueno 285 Agua 190

Fluorescência

Princípio: emissão de energia fluorescente por um soluto que foi excitado por radiação UV. Baseia-se no fato de que, quando uma molécula absorve luz e um elétron é promovido a um estado de maior energia, existe uma série de caminhos pelos quais esta energia pode ser dissipada. Normalmente, esta energia é perdida po r sua tra nsferência às moléculas vizinhas. Ent reta nto ,

algumas moléculas podem perder apenas parte da energia indo ao mais baixo nível vibracional do estado excitado. A energia restante pode ser perdida pela emissão de um fóton, sendo este processo denominado de fluorescência.

É um detector seletivo, para moléculas que fluorescem, ou seja, sistemas aromáticos policíclicos ou que contenham duplas ligações conjugadas múltiplas.

Devido ao seu princípio de operação (emissão de luz), é muito mais sensível e seletivo que o UV (absorção).

Os comprimentos de onda de absorção e emissão devem ser escolhidos pelo espectro de fluorescência do(s) soluto (s).

Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna, para que o analito se torne fluorescente. A fluorescamina e o cloreto de dansila são reagentes muito utilizados para tal fim.

(20)

índice de refração

Princípio: mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna. E um detector não-seletivo, sensível a variações na temperatura, pressão, fluxo e composição da fase móvel. Apresenta baixa sensibilidade e é difícil de estabilizar, sendo inadequado para eluição gradiente.

E muito utilizado em análises de amostras que não absorvem no UV e não fluorescem e em cromatografia preparativa.

Infravermelho

Princípio: absorção de luz infravermelha (4000 cm_1-670 c m '1), por parte da amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. Esta radiação causa apenas movimentos vibracionais na molécula e estes são característicos dos grupos presentes na mesma.

E um detector não-seletivo, mas apresenta uma série de limitações, como necessidade de eliminação do solvente, material de fabricação da cela e limite de detecção alto.

Embora muitas das limitações venham sendo contornadas pela evaporação do solvente e pelo uso de transformadas de Fourier (FT-IR), este detector é muito pouco utilizado.

Polarímetro e dicroísmo circular

Princípio: medem o efeito da luz plana ou circularmente polarizada sobre compostos oticamente ativos.

São equipamentos seletivos, específicos para a detecção de compostos quirais.

São úteis para a determinação da ordem de eluição de pares enantioméricos, sendo possível a determinação da configuração absoluta destes, por dicroísmo circular, por intermédio de regras empíricas ou não empíricas.

Enquanto o polarímetro opera em qualquer comprimento de onda, por dicroísmo circular a amostra só é vista nos comprimentos de onda em que ela absorva energia.

Eletroquímicos

Princípio: baseiam-se em interações eletroquímicas úteis à detecção do analito por HPLC. Medem a condutância do eluente (Detectores de Condutividade) ou a corrente associada à oxidação ou redução dos solutos (Amperométrico, Coulométrico).

Embora todos sejam detectores eletroquímicos, esta designação é usualmente empregada para aqueles que medem a corrente no fluxo da célula (Amperométrico, Coulométrico).

São detectores seletivos, para solutos iônicos, oxidáveis ou redutíveis, e apresentam alta sensibilidade e baixos limites de detecção.

Não se popularizaram com o esperado, devido à necessidade de manutenção perió dica dos eletrodos e células e à complexidade de operação, sendo, entretanto, muito utilizados em cromatografia de troca iônica (Detector de Condutividade) e em pesquisas biomédicas.

As condições adequadas são determinadas experimentalmente observando-se a resposta dada pelo detector para uma série de potenciais aplicados.

Espalhamento de luz (

light-scattering)

Princípio: envolve a nebulização do eluente vindo da coluna em um aerossol, seguido de vaporização do solvente para produzir pequenas partículas que serão detectadas em uma cela de espalhamento de luz. A intensidade da luz espalhada depende do tamanho das partículas formadas no tubo de aquecimento, que, por sua vez, depende do tamanho das gotícuias formadas durante o

(21)

processo de nebulização. A interação da luz com a partícula dependerá de seu tamanho, forma e propriedades superficiais.

É um detector não-seletivo, destrutivo.

É muito utilizado para a detecção de ácidos graxos e para análises de pureza.

Espectrometria de massas

A utilização deste detector vem se tornando comum, apesar do seu alto preço, da necessidade de um operador especializado e dos gastos com manutenção.

É um detector universal, embora destrutivo, que apresenta alta sensibilidade, fornece a massa molecular dos solutos e permite a elucidação estrutural destes.

Pode ser utilizado como um detector extremamente seletivo, fixando-se um íon molecular. A utilização de MS-MS permite a fragmentação dos íons já formados, fornecendo informações estruturais e aumentando a seletividade.

Devido à incompatibilidade entre o fluxo líquido vindo da coluna e o alto vácuo existente em tais equipamentos, é necessária a utilização de uma interface. Várias são as interfaces disponíveis, bem como os métodos de ionização e os analisadores de massa.

É o detector ideal para estudos de bioequivalência.

Ressonância magnética nuclear

Combina o poder de separação da HPLC às informações estruturais obtidas pela RMN. Não é um detector de uso rotineiro, devido à dificuldade encontrada em sua hifenação à HPLC. O desenvolvimento de interfaces adequadas tem sido investigado, de modo a contornar os problemas em relação ao tempo necessário para a aquisição de dados e a supressão dos sinais do solvente.

Referências

FIELDEN, PR. (1992). Recent Developments in LC Detector Technology. /. Chromatogr Sei, v.30,

p.45-51.

LINDSAY, S. (1989). High Performance Liquid Chromatography. New York, John Wiley and Sons.

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LLOYD, D.K. (1995). Instrumentation: Detectors and Integrators. In: WAINER, I.W.; LOUGH, W. J. eds. High Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and Practice.

Glasgow, Blackie Academic & Professional, p. 14-142.

NOCTOR, T. (1995). Instrumentation: Pumps, Injectors and Column Design. In: WAINER, I.W.; LOUGH, W.J. eds. High Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional, p.97-113.

SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L., Practical HPLC Method Development, 2.ed. New

(22)

5. SILICA GEL

Sílica gel é a matéria-prima mais importante das fases estacionárias da cromatografia líquida. E um material extremamente versátil, podendo ter sua superfície alterada por derivação química, pos sibilitand o, desta form a, a criação de diversos tipos de fases estacio nária s com diferentes

mecanismos de separação.

E um polímero composto por átomos tetraédricos de silício conectados entre si por átomos de oxigênio (ligações siloxano, Si-O-Si), tendo grupos silanóis (Si-OH) de diferentes tipos (Figura 5.1a, b, c) em sua superfície.

a b c OH OH... OH HO. PH ' ! ' SI \ / Si Si / i \ Si / I

Figura 5 .1 Tipos de silanóis. a) Livre; b) geminai; e c) com ligações de hidrogênio.

E uma forma amorfa, altamente porosa e parcialmente hidratada de sílica, preparada usualmente pela hidrólise ácida do silicato de sódio, seguida por emulsificação em uma mistura álcool/água e subseqüente condensação, quando então é lavada e seca para uso.

As condições de preparação da sílica gel (pH, catalisadores, temperatura) determinarão suas propriedades. As características mais importantes, reguladoras de sua performance cromatográfica,

são: tamanho médio de partícula, formato da partícula, área superficial específica, tamanho do poro, pH , número de grupos silanóis e a presença de íons metálicos.

A superfície da sílica é função de suas condições de preparação. Sílicas com grande número de silanóis livres (Figura 5.1a) são mais ácidas que as sílicas com grupos hidroxilados (Figura 5.1b e 5.1c). A Tabela 5.1 mostra uma escala da acidez relativa de diferentes sílicas comerciais. Deve-se ter em mente que sílicas ácidas são boas para compostos ácidos e ruins para básicos, e vice-versa.

Tabela 5.1 Escala da acidez relativa de algumas sílicas comerciais.

Zorbax RX Menos ácida

Vydac Rsil Nucleosil Polygosil Novapak m-Bondapak Supelcosil DB Spherisorb 2 LiChrosorb Chrompack Hypersil Perkin-Elmer Supelcosil Zorbax

(23)

Suas partículas podem ser esféricas (Figura 5/2a) ou irregulares (Figura 5.2b). O uso de partículas esféricas, embora mais caras, tem sido preferido, por estas apresentarem maior

durabilidade e eficiência.

Figura 5.2 Partículas a) esféricas e b) irregulares.

A sílica gel é utilizada como fase estacionária em cromatografia no modo normal, não sendo recomendado seu uso com fases móveis aquosas.

Devido à alta polaridade da água e sua forte afinidade com os grupos silanóis da superfície da sílica, mesmo a presença de pequenas quantidades de água altera o comportamento cromatográfico de tais colunas, causando a desativação da sílica.

Colunas de sílica não podem ser usadas em pH > 8, pois ela começa a se tornar solúvel. As principais desvantagens do uso de colunas de sílica estão associadas à água. Além da impossibilidade de seu uso na fase móvel, sua presença em traços afeta profundamente a reprodutibilidade das análises. Outro problema é sua inadequação ao uso em eluição gradiente.

Referências

SCOTT, R.P. W. (1993). Silica Gel and Bonded Phases: Their Production, Properties and Use in LC.

New York, John Wiley and Sons. p. 1-261.

SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1988). Practical HPLC Method Development.

(24)

Desenvolvimen

Desenvolvimento de to de MétodMétodos por os por HPLCHPLC: Fundamentos, Estratégias e : Fundamentos, Estratégias e Validação Validação 2525

6. FASES QUIMICAMENTE LIGADAS

São as fases estacionárias mais utilizadas atualmente. São as fases estacionárias mais utilizadas atualmente.

A alta polaridade da sílica tornava difícil a separação de compostos polares. Para contornar este A alta polaridade da sílica tornava difícil a separação de compostos polares. Para contornar este pro

probleblema, ma, forforam am iniiniciacialmlmenente te desenvdesenvolvidas olvidas fases cofases com m líqlíquiduidos, os, gergeralmalmentente e óleos, óleos, memecanicanicamcamenteente aderidos em um suporte inerte. Estas fases apresentavam baixa eficiência e reprodutilidade.

aderidos em um suporte inerte. Estas fases apresentavam baixa eficiência e reprodutilidade.

As fases quimicamente ligadas foram desenvolvidas visando ã eliminação destas falhas, As fases quimicamente ligadas foram desenvolvidas visando ã eliminação destas falhas, busc

buscandando-se o-se fases estfases estacionacionárias árias que que pudesspudessem em retreter er os solos solutoutos s popor r meio meio de de outoutros ros tiptipos os de de inteinteraçãraçãoo que não a polaridade. A proposta inicial era a produção de fases que mimetizassem as fases líquidas que não a polaridade. A proposta inicial era a produção de fases que mimetizassem as fases líquidas aderidas, sendo estáveis, eficientes e reprodutíveis.

aderidas, sendo estáveis, eficientes e reprodutíveis.

A superfície da sílica pode ser modificada de várias maneiras: A superfície da sílica pode ser modificada de várias maneiras:

1. Por reação dos grupos silanóis com um álcool, produzindo um alcoxisilano. 1. Por reação dos grupos silanóis com um álcool, produzindo um alcoxisilano.

si

si — — OOH H + + R R — — OOHH _---_---► ► — S— Si i — — O O — — RR

2. Por halogenação dos grupos silanóis e posterior reação com um nucleófilo, produzindo, por 2. Por halogenação dos grupos silanóis e posterior reação com um nucleófilo, produzindo, por

exemplo, um alquilaminosilano. exemplo, um alquilaminosilano. — — SS i i — — OO H H + + SS00 22CICI22 _---_---^ ^ — — SSi i — — CllC R R — — NNHH22

—

— Si

Si — N

— NH

H — R

— R

3. Por reação com organosilanos, levando à formação de ligações siloxano.

\

0 0E

Et

t

\

—

SSii

— — OOHH II 1) Refluxo em1) Refluxo em ---

SSii

— — O O OOHH ____ ttoolluueenno o / / \ \ ✓✓ O O + + R R — — SSi i — — OEOEtt _{--- O}_---O gjgj \\ 22_{) CH3OH/H}_{) CH3OH/H}2200 _{\\ /}_/ _v_v — — SSi i — — OO H H | | _ _ SSi i — — O O RR / / OEOEt t / /

Das formas descritas acima, a última é a mais utilizada. Enquanto a primeira leva a um produto Das formas descritas acima, a última é a mais utilizada. Enquanto a primeira leva a um produto po

poucuco o estáveestável, l, facfacilmilm enente te hidhidrolrolisávisável, el, a a forformaçmação ão da da ligaligação ção siloxsiloxano ano é é mmuiuito to conconvevenieniente nte poporr pr

prododuzuzir ir umuma a fase fase conconsidesideravravelmelmentente e estável.estável. A

A variaçvariação da ão da cadeia latcadeia lateral do eral do organosilano possibilita a preparação de umorganosilano possibilita a preparação de um a grande a grande variedadevariedade de fases estacionárias a serem utilizadas nos diferentes modos de separação. Grupos octadecil, octil de fases estacionárias a serem utilizadas nos diferentes modos de separação. Grupos octadecil, octil e propil, na cadeia lateral, são usados na preparação de fases estacionárias a serem utilizadas no modo e propil, na cadeia lateral, são usados na preparação de fases estacionárias a serem utilizadas no modo reverso, enquanto grupos aminoalquil, fenil e cianopropil são utilizados na derivação de sílica, com reverso, enquanto grupos aminoalquil, fenil e cianopropil são utilizados na derivação de sílica, com aplicabilidade em modo reverso ou normal. Grupos dióis na cadeia lateral são úteis à preparação aplicabilidade em modo reverso ou normal. Grupos dióis na cadeia lateral são úteis à preparação de fases para cromatografia em fase normal e exclusão.

de fases para cromatografia em fase normal e exclusão.

A utilização de grupos octadecil leva à formação da fase octadecilsilano, conhecida por ODS A utilização de grupos octadecil leva à formação da fase octadecilsilano, conhecida por ODS ou C18, sendo esta a fase mais utilizada em HPLC analítico. A presença deste grupo torna a fase ou C18, sendo esta a fase mais utilizada em HPLC analítico. A presença deste grupo torna a fase apoiar, em relação à sílica não derivada.

(25)

A retenção nestas fases é dependente da quantidade de carbono presente, geralmente expressa

em porcentagem. Desta porcentagem e da quantidade de silanóis residuais dependerá a qualidade

da separação a que se aplica.

Esta derivação, por razões estéricas, não atinge todos os grupos silanóis. Os grupos silanóis

restantes, em alguns casos, ao interagir com o soluto, causam rabeamento dos picos. Este problema

pode ser minimizado reagindo-se a sílica, após a derivação, com trimetilclorosilano, que, por ser

menor, tem acesso a alguns destes grupos, formando trimetilsilanos, embora não seja possível a

derivação de todos os grupos silanóis. Este processo é chamado capeamento

(end capping(end capping

. Em

cromatografia por pareamento de íons, é recomendável a utilização deste tipo de fase.

Referências

LINDSAY, S. (1989).

Hi High Pgh Pererfoformrmanance ce Liquid ChLiquid Chroromamatotogrgraaphphy.y.

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2.ed. New

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(26)

Desenvolvimento

Desenvolvimento de de Métodos Métodos por por HPLC: HPLC: Fundamentos, Estratégias Fundamentos, Estratégias e e Validação Validação 2727

7. MODOS DE SEPARAÇÃO

A classificação da cromatografia líquida de acordo com a fase estacionária levou a uma grande A classificação da cromatografia líquida de acordo com a fase estacionária levou a uma grande variedade de tipos. A primeira grande divisão feita foi: cromatografia de adsorção e cromatografia variedade de tipos. A primeira grande divisão feita foi: cromatografia de adsorção e cromatografia de partição, referindo-se às fases estacionárias sólida e líquida, respectivamente.

de partição, referindo-se às fases estacionárias sólida e líquida, respectivamente. No

No caso das caso das fases estafases esta cionárcionárias ias serem serem líquidlíquidas, as, estas estas podpodem em estar estar simplsimplesmeesmente nte adsorvidaadsorvidas sos sobrebre um suporte sólido ou imobilizadas sobre ele. No primeiro caso, a cromatografia é referida como um suporte sólido ou imobilizadas sobre ele. No primeiro caso, a cromatografia é referida como cromatografia de partição.

cromatografia de partição. A cromatografia de paA cromatografia de pa rtição pertição perdeu espaço para a cromatografia de fasrdeu espaço para a cromatografia de faseses quimicamente ligadas, devido à maior estabilidade conferida por estas quando comparadas com as quimicamente ligadas, devido à maior estabilidade conferida por estas quando comparadas com as fases líquidas adsorvidas. Estas fases com suportes modificados são consideradas à parte por dife fases líquidas adsorvidas. Estas fases com suportes modificados são consideradas à parte por dife rirem dos outros dois modos em seu mecanismo de separação.

rirem dos outros dois modos em seu mecanismo de separação.

O grande desenvolvimento conseguido a partir das fases líquidas quimicamente ligadas fez com O grande desenvolvimento conseguido a partir das fases líquidas quimicamente ligadas fez com que estas sejam as fases majoritariamente usadas em HPLC analítico.

que estas sejam as fases majoritariamente usadas em HPLC analítico.

A separação de uma mistura por HPLC se dá por uma ou mais interações entre o soluto, a A separação de uma mistura por HPLC se dá por uma ou mais interações entre o soluto, a fase estacionária e a fase móvel, as quais podem ser pontes de hidrogênio, interações eletrostáticas fase estacionária e a fase móvel, as quais podem ser pontes de hidrogênio, interações eletrostáticas e hidrofóbicas ou forças de Van der Waals, entre outras. Os modos de separação podem ser e hidrofóbicas ou forças de Van der Waals, entre outras. Os modos de separação podem ser classificados de acordo com a natureza destas interações. São eles: cromatografia em fase reversa, classificados de acordo com a natureza destas interações. São eles: cromatografia em fase reversa, em fase normal, por pareamento de íons ou por troca iônica e por exclusão.

em fase normal, por pareamento de íons ou por troca iônica e por exclusão.

A escolha do modo mais adequado à separação de um soluto é baseada em sua natureza, peso A escolha do modo mais adequado à separação de um soluto é baseada em sua natureza, peso molecular, polaridade e caráter iônico.

molecular, polaridade e caráter iônico.

7.1 7.1 Modos

Modos de

de Retenç

Retenção

ão

A retenção em cromatografia líquida é dependente das interações entre soluto-fase móvel, A retenção em cromatografia líquida é dependente das interações entre soluto-fase móvel, soluto-fase estacionária e fase móvel-fase estacionária. Assim, a escolha do modo de separação soluto-fase estacionária e fase móvel-fase estacionária. Assim, a escolha do modo de separação depende da escolha da fase estacionária e da fase móvel para cada classe de soluto.

depende da escolha da fase estacionária e da fase móvel para cada classe de soluto.

Dois modelos de retenção em cromatografia líquida foram propostos. O primeiro por Scott Dois modelos de retenção em cromatografia líquida foram propostos. O primeiro por Scott e Kucera, interação-solvente, e o segundo por Snyder, competição-solvente. Os dois modelos são e Kucera, interação-solvente, e o segundo por Snyder, competição-solvente. Os dois modelos são equivalentes, uma vez que ambos consideram que, em uma dada separação, a interação do soluto equivalentes, uma vez que ambos consideram que, em uma dada separação, a interação do soluto com a fase estacionária permanece constante e, portanto, a retenção é determinada pela composição com a fase estacionária permanece constante e, portanto, a retenção é determinada pela composição da fase móvel.

da fase móvel.

7.2 7.2 Crom

Cromatogr

atografia no

afia no Modo

Modo Norm

Normal

al

A fase estacionária é mais polar que a fase móvel; o oposto ocorre em cromatografia no modo A fase estacionária é mais polar que a fase móvel; o oposto ocorre em cromatografia no modo reverso. Os solventes usados são normalmente uma mistura de solventes orgânicos sem a adição de reverso. Os solventes usados são normalmente uma mistura de solventes orgânicos sem a adição de água. A

água. As fass fases estacionárias são adsorventes es estacionárias são adsorventes orgânicos orgânicos (síli(sílica, alumina) ca, alumina) ou fases ou fases polares quimicapolares quimica mentemente ligadas (ciano, diol, fenil, amino).

ligadas (ciano, diol, fenil, amino).

Os dois modelos de retenção, interação-solvente (Figura 7.1a) e competição-solvente (Figura Os dois modelos de retenção, interação-solvente (Figura 7.1a) e competição-solvente (Figura 7.1b), têm sido usados com sucesso para descrever o efeito da fase móvel em cromatografia líquida 7.1b), têm sido usados com sucesso para descrever o efeito da fase móvel em cromatografia líquida no modo normal. Independentemente do modelo usado, a retenção em fase normal aumenta com no modo normal. Independentemente do modelo usado, a retenção em fase normal aumenta com o decréscimo da polaridade da fase móvel.

o decréscimo da polaridade da fase móvel.

Embora moléculas iônicas ou ionizáveis possam ser separadas por cromatografia no modo Embora moléculas iônicas ou ionizáveis possam ser separadas por cromatografia no modo normal, a aplicação majoritária tem sido para moléculas neutras.

normal, a aplicação majoritária tem sido para moléculas neutras.

As moléculas hidrofóbicas (menos polares) são eluídas primeiro, enquanto as moléculas As moléculas hidrofóbicas (menos polares) são eluídas primeiro, enquanto as moléculas hidrofílicas (mais polares) são mais retidas. O oposto acontece em cromatografia no modo reverso. hidrofílicas (mais polares) são mais retidas. O oposto acontece em cromatografia no modo reverso. Grandes mudanças em seletividade são conseguidas por alteração na fase móvel ou estacionária. É Grandes mudanças em seletividade são conseguidas por alteração na fase móvel ou estacionária. É o modo de separação preferido, por isso, para separações de isômeros de posição ou estereoisômeros. o modo de separação preferido, por isso, para separações de isômeros de posição ou estereoisômeros.

(27)

Quando a dissolução da amostra apresenta problemas em solventes polares e dificulta a injeção no modo reverso de eluição, a separação no modo normal é recomendada. Devido à maior facilidade no manuseio da amostra em solventes orgânicos, para o isolamento, em separações preparativas é o modo mais aplicado.

A força de diferentes misturas de solventes para eluição no modo normal pode ser medida experimentalmente e é representada por £°. A Tabela 7.1 lista alguns dos solventes mais usados em cromatografia, tendo sílica gel como fase estacionária. A força relativa para os solventes em outras fases estacionárias segue o mesmo caminho.

Tabela 7.1 Força ( e°)e seletividade de alguns solventes.

Solvente e° Localização Basicidade

Hexano, heptano 0,00 Não a

Clorofórmio 0,26 Não a

Diclorometano 0,30 Não a

Éter etílico 0,38 Sim Sim

Medi í-butil éter 0,48 Sim Sim

Acetato de etila 0,48 Sim Não

Dioxano 0,51 Sim Sim

Acetonitrila 0,52 Sim Não

THF 0,53 Sim Sim

1 ou 2-propanol 0,60 Sim b

Metanol 0,70 Sim b

a) a basicidade é irrelevante para solventes não-localizados

(28)

O solvente para eluição no modo normal é selecionado escolhendo-se um solvente fraco e misturando com um solvente forte para conseguir a força desejada.

A presença de traços de água na fase móvel é provavelmente a causa mais comum da pobre reprodutibilidade na retenção quando se trabalha no modo normal, especialmente quando se usa sílica não modificada como fase estacionária. Este problema tem sido resolvido trabalhando-se com solventes anidros com um volume conhecido de água, metanol ou ácido acético para desativar os grupos silanóis mais reativos da fase estacionária. Além de melhorar a reprodutibilidade, melhora o formato do pico. O mesmo efeito pode ser conseguido adicionando-se trietilamina, essencial na separação de aminas em sílica gel.

O uso de sílicas quimicamente modificadas em eluição no modo normal tem sido preferida, uma vez que elas oferecem sítios específicos de interação com o soluto, além de oferecer uma superfície mais homogênea quando comparada com a sílica gel, que tem uma variedade de grupos silanóis de diferentes polaridades. As fases quimicamente ligadas são úteis para cromatografia de compostos moderadamente polares, entretanto, estes solutos podem também ser eficientemente resolvidos no modo reverso de eluição, e a escolha entre eluição no modo normal ou reverso é, usualmente, mais dependente da matriz que do soluto.

7.3 Cromatografia no Modo Reverso

Enquanto na cromatografia em fase normal a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, no modo reverso a fase móvel é mais polar que a fase estacionária. A cromatografia em fase reversa é a mais utilizada em HPLC, uma vez que permite a separação de uma grande variedade de solutos e o uso de fases móveis aquosas. A fase móvel mais comumente utilizada é uma mistura de acetonitrila/água, sendo a acetonitrila, quando necessário, substituída por metanol ou tetraidrofurano (THF). O uso de apenas esses três solventes deve-se à pequena quantidade de solventes orgânicos miscíveis com água. Já no modo normal, há uma maior variedade de solventes disponíveis.

O princípio da retenção em fase reversa é a hidrofobia. A separação em fase reversa se deve principalm ente a interações entre a parte não-polar do soluto e a fase estacionária, isto é, à repulsão

desta parte do soluto pela fase móvel aquosa.

A aplicação da teoria solvofóbicâ de Sinanoglu, por Horváth e colaboradores, à cromatografia de fase reversa é provavelmente o tratamento mais completo do assunto. A teoria engloba elementos dos modelos de solvente-interação e solvente-competição, levando em consideração todas as interações entre soluto-solvente-fase estacionária que levam à retenção.

A retenção em fase reversa aumenta com o aumento de água na fase móvel. O logaritmo do fator de retenção, k, para um determinado soluto varia linearmente com o volume de solvente orgânico na fase móvel de acordo com a equação:

logk = logkw- S O (7.1)

kwé o fator de retenção quando o solvente é 100% aquoso. O coeficiente de inclinação, S, pode ser usado para indexar a força do solvente em fase reversa. A relação mostrada na equação abaixo pode ser feita, sendo k o fator de retenção de um soluto de referência quando O é igual a 1.

S = logkw-lo g k s (7.2)

Estas relações são mantidas somente quando variações da ordem de 0,3 são feitas. Para maiores variações deve-se usar uma relação quadrática:

(29)

A força do solvente em fase reversa depende não só do percentual de B, mas também do tipo de solvente orgânico usado. Devido à limitação de miscibilidade, o nomógrafo a seguir (Figura 7.2) tem sido amplamente usado para ajustar a força entre os três solventes mais comumente utilizados em fase reversa. E importante ressaltar que a força do solvente em fase reversa aumenta com o decréscimo da polaridade do solvente. Assim, água (solvente mais fraco) < metanol < acetonitrila < tetraidrofurano < diclorometano. Diclorometano, por não ser sóluvel com água, não é usado em fase reversa, mas por ser um solvente muito forte é, às vezes, usado para limpar as colunas de fase reversa que foram contaminadas por solutos fortemente retidos.

Acetonitrila, além de poder ser usada em uma baixa faixa de absorção no ultravioleta, apresenta soluções aquosas com baixa viscosidade, o que é desejável; Assim, juntamente com metanol e THF, estes são os solventes mais usados para controlar a seletividade e separação no modo reverso de eluição. ApM/u n 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 AON/ttjU ,----,----1----1----,----1----1----1----1----1----1 MaHM/M n 0 20 40 60 80 100 Me0_H/H20 _| _{, ! |} _| _,---1_---1_---1---1---1 T H p/h n 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 l---1---1_---1_---1_---1---1---1_---1---1---1

Figura 7.2 Nomógrafo para alteração de solventes no modo reverso.

Quando, por algum motivo, não se usa água na fase móvel, usando fases estacionárias apoiares, a cromatografia é dita cromatografia não-aquosa de fase reversa. Ela só é usada quando se trabalha com solutos muito hidrofóbicos, como lipídios e polímeros, e o solvente normalmente consiste em uma mistura de solventes polares, como acetonitrila ou metanol (solvente A), com um solvente mais fraco (B), como THF, clorofórmio, diclorometano, acetona, metil-í-butil éter. A retenção, neste caso, também é alterada pelo percentual de/ou o tipo B.

7.4 Cromatografia de Compostos lônicos

Separações cromatográficas de compostos iônicos tendem a ser mais complicadas que a de moléculas neutras, mas, por outro lado, o espaçamento de bandas é usualmente conseguido com maior facilidade. A separação de compostos ionizáveis pode ser conseguida por supressão da ionização ou, então, por completa ionização e separação por pareamento de íons ou por troca iônica. Estas duas últimas opções também se aplicam a íons.

Em cromatografia de fase reversa, a retenção diminui para compostos mais hidrofílicos, assim, quando um ácido ou uma base são ionizados, eles se tornam menos hidrofóbicos e, conseqüente mente, a retenção é reduzida. Assim, com o aumento de pH, a retenção para ácidos diminui e para bases aumenta.

Quando o pH é igual ao pKa de um composto, este se encontra parcialmente ionizado. Todas as mudanças de retenção ocorrem d entro de uma faixa de ± 1,5 unidade de pKa Fora desta faixa, o composto ou está ionizado ou está não ionizado, e a retenção não muda muito. A situação é mais complicada para compostos que contêm múltiplos grupos ácidos ou básicos. Para compostos anfóteros, a retenção pode ser ainda mais complexa. A molécula é mais hidrofílica quando a carga total de íons é zero, ou seja, maximamente ionizada (Figura 7.3).

(30)

pH

Figura 7.3 Relação teórica entre o fator de retenção (k) e o pH da fase móvel.

Devido à maior facilidade, a primeira alternativa de separação para moléculas ionizáveis é a supressão da ionização e eluição no modo reverso. A adição de um par iônico deve ser considerada quando a primeira alternativa falhar. E importante ressaltar que, dependendo da concentração do contra-íon, há uma contínua transição entre modo reverso e par iônico. A cromatografia de par iônico e de fase reversa tem várias propriedades em comum. As fases estacionárias e móveis são as mesmas, diferindo simplesmente na adição do contra-íon. A cromatografia de troca iônica é usualmente a última alternativa a ser examinada para compostos ionizáveis.

A retenção em cromatografia de par iônico é dependente da concentração e hidrofobicidade do contra-íon. Dois mecanismos de separação têm sido propostos para a retenção em par iônico. O primeiro modelo assume que o par iônico é formado na fase móvel e a separação ocorre pela distribuição do par entre as fases estacionária e móvel. O segundo modelo assume que o contra-íon primeiro adsorve na fase estacionária e o par iônico é feito por uma interação dinâmica do soluto com a monocamada do contra-íon adsorvido. Ambos os mecanismos de retenção propostos são possíveis e a expressão matem ática para a relação fator de retenção k e concentração do co ntra-ío n

é a mesma nos dois modelos propostos.

Grupos residuais de silanóis na fase estacionária representam sítios adicionais de retenção. O grupo silanol é fracamente ácido, com pK na faixa de 4 a 6, e, portanto , interage com os solutos. Estas interações são particularmente importantes em par iônico, pois podem levar à retenção irreversível do soluto ou do contra-íon, e devem ser evitadas pelo uso de fases estacionárias capeadas.

7.5 Cromatografia de Troca Iônica

E o método de escolha para análise de íons inorgânicos e, às vezes, é também o preferido para a análise de pequenos íons orgânicos.

A retenção em troca iônica se dá por atração eletrostática entre os íons na fase móvel e os íons de carga oposta na fase estacionária. As fases estacionárias são referidas como resinas trocadoras de íons e são classificadas em aniônicas e catiônicas (fortes e fracas). As aniônicas fortes têm usualmente um íon amónio quaternário imobilizado, enquanto a catiônica forte tem um ácido sulfônico, sendo

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ionizados na faixa completa de pH. As resinas aniônicas fracas apresentam aminas imobilizadas, enquanto as catiônicas fracas têm ácidos carboxílicos.

As resinas catiônicas são usadas para separação de catíons como bases protonadas, enquanto as aniônicas são usadas para a separação de ânions ou solutos acídos.

As primeiras resinas foram feitas de materiais peliculares e atualmente são de sílica ou de polímeros porosos. En quanto as de sílica têm maior resistência mecânica, as poliméricas têm

resistência à degradação em pH alto.

A retenção em troca iônica é determinada pelo pH da fase móvel. Força iônica, temperatura e a natureza dos íons do tampão são também um fator importante.

Se a fase estacionária for denominada R" (catiônica) ou R (aniônica), podemos representar a retenção como mostrado abaixo: a) para troca catiônica e b) para aniônica, considerando potássio e cloro como contra-íons da fase móvel e o soluto um íon univalente.

a) X++ R_K+<=>X+R" + K+ b) X" + r +c

r

<=>

x_R++ cr

Assim, a retenção pode ser diminuída pelo aumento da concentração do tampão, e este efeito é tanto maior quanto maior for a carga iônica do soluto. A força iônica da fase móvel é alterada para conseguir diferenças em retenção e em seletividade. Como a retenção se dá por atração eletrostática, só moléculas ionizadas são retidas. Assim, para ácidos, um aumento de pH leva a maior ionização e, conseqüentemente, a maior retenção em troca aniônica, enquanto o decréscimo do pH favorece a retenção de bases em troca catiônica.

A adição de solventes orgânicos pode ser explorada e, como em fase reversa, a retenção e a seletividade são alteradas.

7.6 Cromatografia de Exclusão

E usada especialmente para: separação preliminar de amostras complexas visando isolar ou purificar polímeros, na análise de polímeros para observar a presença de dímeros, trímeros etc. ou para estimar o peso molecular de polímeros sintéticos ou naturais.

A separação por exclusão requer que o tamanho do poro da fase estacionária seja adequadamente selecionado de acordo com o tamanho das moléculas que se pretende separar. As moléculas pequenas devem penetrar nos poros, enquanto as moléculas grandes devem ser excluídas de todos os poros da fase estacionária. As de tamanho intermediário serão só parcialmente excluídas. A resolução em cromatografia de exclusão é determinada pela retenção em decorrência do tamanho molecular e pela eficiência da coluna ou, em outras palavras, largura de banda. Assim, o critério importante em cromatografia de exclusão é a distribuição do tamanho dos poros. Qualquer interação com a fase estacionária levará à retenção e a um aumento de volume de retenção, assim a redução de interações com a fase estacionária deve ser conseguida quando se usa a cromatografia de exclusão para determinação de peso molecular.

A escolha do solvente em cromatografia de exclusão requer somente que o soluto seja solúvel no mesmo e que este tenha baixa viscosidade, além de compatibilidade com o soluto e a fase estacionária. Em HPLC, as fases estacionárias que podem ser usadas em cromatografia de exclusão são sílica gel, sílica derivada ou polímeros rígidos.

A determinação da massa molecular relativa é feita por intermédio de calibração com polímeros de massa molecular relativa conhecida.

A escolha da fase estacionária apropriada é importante porque a faixa de massa molecular relativa que pode ser separada em uma única coluna é de somente 1,5 unidade de log e, assim, várias colunas de exclusão são usualmente necessárias.