Enantiomeric Compounds. The Current State of the Art.
Clinical Pharmacology,n.18, p.347-
362.
WELCH, C.J. (1994). Evolution of Chiral Stationary Phase Design in the Pirkle Laboratories.
J.11. CROMATOGRAFIA PREPARATIVA
Embora a cromatografia tenha sido originada como uma técnica preparativa, desenvolvida por Tswett, para o isolamento de compostos puros de amostras complexas, os avanços da cromatografia, nos últimos anos, têm sido maiores em sua aplicação como uma técnica analítica para a identificação e quantificação de compostos do que como uma técnica de isolamento.
A cromatografia preparativa apresenta problemas inerentes a ela e depende da aplicação da separação ou, em outras palavras, de quanto se deseja, isolar.
A cromatografia preparativa pode servir para o isolamento de poucos miligramas, para elucidação estrutural ou para o isolamento de gramas ou quilogramas, requerendo, neste último caso, diferentes perspectivas no desenvolvimento da separação. Enquanto, no primeiro caso, o que importa é a eficiência da separação, no segundo, o importante é a quantidade de material isolado por tempo de trabalho.
11.1 Estratégias de Separação
Quando se deseja isolar pequenas quantidades de amostra com uma grau de pureza alto, trabalha-se em condições analíticas fazendo-se o escalonamento necessário para a separação preparativa. Nestes casos, usa-se uma coluna semi (0,7 ou 0,8 X 25 cm d.i.) ou preparativa (2,2 X
25 cm d.i.) com o mesmo material da coluna analítica, ou seja, sílica de 5 ou 10 p.m de tamanho de partícula, e trabalha-se sem sobrecarga da coluna para a obtenção de máxima eficiência.
Quando se deseja separar grandes quantidades de amostra, utilizam-se colunas de menor eficiência, sílicas de 20-40 |lm de tamanho de partícula, mas com maior capacidade de carga, e trabalha-se com a coluna em sobrecarga para uma maior produtividade.
Quando se obtém uma resolução de 1,25 em separação analítica, sabe-se que isso corresponde a uma resolução de quase linha de base, entretanto, em separações preparativas, este valor indica uma separação difícil. Pouca sobrecarga pode ser conseguida com esta resolução, já que esta se deteriora rapidamente com o aumento de carga.
Considerando que o fator de separação, a, é o parâmetro com maior impacto na resolução, este deve ser otimizado para se poder trabalhar em sobrecarga.
E importante ressaltar que, quando se trabalha em sobrecarga, tanto o fator de retenção, k, quanto o fator de separação, (X, diminuem drasticamente, mas o efeito da velocidade da fase móvel na resolução é pouco sentido. Assim, máxima produtividade é conseguida trabalhando-se em condições de sobrecarga em altos fluxos.
Colunas com sílicas de menor tamanho de partícula perdem eficiência mais rapidamente que sílicas de partículas maiores, mas, por outro lado, são mais eficientes para a separação de pequenas quantidades de amostra. O gráfico da Figura 11.1 exemplifica o efeito da carga no número de pratos para duas colunas, uma com sílica de 10 |im e outra de 40 |Im.
Analisando-se o gráfico da Figura 11.1 nota-se que a coluna com partículas de 10 |im é mais eficiente para todas as cargas de benzofenona adicionadas, mas esta diferença quase desaparece quando se trabalha com grandes cargas de massa.
A assimetria da banda aumenta com o aumento da carga. Esta perda de simetria é mais drástica para colunas mais eficientes e isto se deve aos efeitos termodinâmicos, que são responsáveis pelas
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Benzofenona (mg)
Figura 11.1 Efeito da carga no número de pratos da coluna.
25 mg
100 mg
200 mg
300 mg
500 mg
Figura 11.2 Perfis das bandas obtidas com o aumento da carga. Amostra: benzofenona; fase móvel: hexano/acetato de etila (99,05:0,5); fluxo: 45 mL/min; a) coluna com partículas de 10 p. e b) coluna com partículas de 40 fl.
Newburger e colaboradores chamam a atenção para o fato de que, independente da simetria dos picos, quando dois compostos são quimicamente muito similares e de difícil resolução, terão isotermas do mesmo tipo e de valores similares. Para esse tipo de mistura, quando a coluna é sobrecarregada com um composto, é como se o outro também estivesse sobrecarregado na parte da coluna onde as bandas se sobrepõem. O comportamento, neste caso, não será mais linear e a eluição
de cada um dos componentes será influenciada pela do outro e dependente da concentração relativa dos dois componentes. Como conseqüência, a banda do primeiro composto elui mais cedo e é mais estreita do que seria se a mesma quantidade do composto tivesse sido injetada pura. O uso de colunas altamente eficientes deve, nestes casos, ser considerado para que se possa ter maior produtivid ade com boa pureza.
Para separações com fator de separação entre 1,5 e 1,7, uma carga de 20 mg/g é considerada um valor adequado, mas não para separações com u m baixo valor de (X, se a eficiência não p uder ser comprometida.
O escalonamento de uma separação analítica para uma separação preparativa pode ser feito usando por base os volumes das colunas analíticas e preparativas. Desta forma, o fator de escalonamento, S, pode ser calculado pela seguinte equação:
s= Rplp
R aLa
em que R e RAsão os diâmetros e Lp e LA, o com prime nto das colunas preparativas e analíticas, respectivamente. E recomendado que se trabalhe com colunas com o mesmo material de empacotamento. Na separação analítica, o par de picos com a menor resolução deve servir para definir a carga que se trabalhará na separação preparativa. Melhor carga pode ser conseguida quando se trabalha com reciclo. Com reciclo, o escalonamento pode ser inteiramente diferente, uma vez que se coletam frações da amostra e/ou se descartam impurezas durante os ciclos.
A Figura 11.3 exemplifica uma separação de 100 mg de amostra conseguida por uso de reciclo.
Figura 11.3 Exemplo da separação de 100 mg de um composto por intermédio de reciclo.
Quanto ao volume e concentração de amostra injetados, não há dúvida de que é preferível trabalhar com sobrecarga de concentração do que com sobrecarga de volume, ou seja, é
melhor trabalhar com pequenos volumes de soluções concentradas.
A Equação 11.2 mostra como calcular o máximo volume permitido.
w ^ V o d + k , )
i V
N (1 1 .2)
em que V. é o volume morto da coluna e V( pode ser aumentado para trabalhar com sobrecarga de massa.
Há várias definições, todas muito teóricas, de quanto deve ser a carga que uma coluna pode receber. Em cromatografia preparativa, este limite é normalmente aquele no qual não mais se consegue resolução suficiente para isolar o soluto na pureza adequada.
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E importante, no entanto, não confundir a perda de resolução com a perda do poder de detecção, por se estar trabalhando com o detector em alta sensibilidade. Isto é particularmente comum quando se trabalha em alta absorbância no U.V.
Os cromatogramas mostrados na Figura 11.4 exemplificam o que se pode conseguir em carga ao trabalhar em um comprimento de onda de menor absorbância.
Minutos Minutos
Figura 11.4 Cromatogramas da separação dos enantiômeros de uma amida axial quiral em uma coluna tris[(S)-l-etilfenilcarbamato] de amilose adsorvida em sílica APS-hypersil
(15% g/g; 0,7 X 25 cm d.i.) usando hexano:2-propanol (98:02) como fase móvel, a) 5 ,7 mg de amostra; fluxo de 0,5 mL/min A „ 254 nm. b) 10,4 mg de amostra; fluxo de 1 mL/min A „ 300 nm.’ már ' ° máx
Enquanto em cromatografia analítica a presença de impurezas que não são detectáveis não compromete a análise, em cromatografia preparativa elas poderão comprometer a análise, uma vez que os compostos isolados são normalmente caracterizados por espectroscopia e espectrometria.
Enquanto em cromatografia analítica o modo reverso de eluição é o preferido, em cromatografia preparativa o modo normal de eluição é o mais usado. Deve-se ter em mente que, para o isolamento, os solventes usuais de eluição no modo normal são preferíveis. Além disto, a
solubilidade da amostra, nas concentrações desejadas em preparativa, é quase sempre um problema em soluções aquosas.
11.2 Solubilidade da Amostra
Enquanto a solubilidade da amostra quase nunca é um sério problema em cromatografia analítica, em preparativa é muitas vezes o que determina o limite a ser injetado, prejudicando, portan to , a prod utiv idad e. A utilização da fase móvel para solubilizar a am ostra é a melh or alternativa, embora nem sempre possível. Quando a solubilidade da amostra na fase móvel é muito baixa, deve-se ter cuidado para que não ocorra precipitação. O uso de soluções supersaturadas deve