Extração em Fase Sólida

E feita pela retenção seletiva dos componentes de interesse de uma matriz complexa. Os mesmos princípios da cromatografia líquida se aplicam, assim, para conseguir a seletividade desejada. Desta forma, é necessária uma adequada seleção da fase sólida e da fase líquida. A mesma variedade de fases que está disponível em HPLC está disponível para extração em fase sólida. Assim,  pode-se fazer extrações no modo normal, reverso e troca iônica.

A extração em fase sólida é usualmente mais eficiente que a extração líquido-líquido e altos  percentuais de recuperação são conseguidos. Uma melhor separação dos interferentes tam bém é

obtida. A extração no modo reverso é a mais aplicada, usando fases como Clg, C„, ciano, fenil ou amino. Como somente um pequeno volume de solvente se faz necessário para a eluição, consegue- se uma alta concentração do analito, e como não se manipula muito a amostra, pois não é feita separação de fases, como na extração líquido-líquido, eliminam-se erros associados a medidas inexatas de volumes.

Em princípio, este tipo de extração pode ser feito como em cromatografia clássica de coluna com sílica ou resinas trocadoras para processar grandes concentrações de amostra e/ou grandes volumes de solvente, mas o usual é que seja feito em microescala com sílica gel ou sílicas derivadas na forma de cartuchos ou discos.

Os cartuchos são usualmente empacotados com material de 40 (lm, de alta capacidade de carga e sílica irregular. São descartáveis e possuem um espaço para a adição da amostra e dos solventes de condicionamento, lavagem e extração. Estes são aspirados por seringas ou vácuo. Uma das grandes desvantagens da extração em fase sólida é a pobre reprodutibilidade entre os lotes dos cartuchos.

Os discos têm o aspecto de um filtro de membrana, com 1 mm de espessura e diâmetro de 4 a 96 mm. Estes podem ser comprados individualmente e instalados em um porta-filtro não descartável ou ser comprados em unidades descartáveis próprias para serem conectados a seringas. São feitos de poli trifluor etileno (PTFE), de fibra de vidro ou ainda de membrana de cloreto de  polivinila recheada com sílica derivada ou resina. Membranas derivadas também têm sido usadas. Estas últimas são funcionalizadas por intermédio de reações orgânicas e são feitas de celulose, muito úteis em troca iônica.

Os discos têm encontrado grande aplicação em análise ambiental, especialmente em análises de contaminantes orgânicos em água, as quais utilizam grandes volumes de água para conseguir a necessária sensibilidade. Neste caso, os compostos orgânicos são retidos no disco e posteriormente eluídos com um pequeno volume de solvente orgânico.

Cartuchos ou similares têm sido amplamente utilizados. Estes podem ser trabalhados manualmente ou de forma automatizada. Independente do modo que se trabalhe, faz-se necessário otimizar a retenção e a eluição do analito de interesse e minimizar a presença de interferentes.

Desenvolvimento de Métodos por HPLC: Fundamentos, Estratégias e Validação 67

As etapas usuais em extração em fase sólida são:

1. Condicionamento- ativação da fase estacionária por solvatação.

2. Aplicação da amostra -  normalmente espera-se que haja retenção dos solutos de interesse, enquanto os interferentes da matriz são descartados. Alternativamente, pode-se ter a retenção dos interferentes e a eluição dos analitos.

3. Lavagem - é feita para a remoção de interferentes menos retidos que o soluto de interesse. Quando se trabalha no modo reverso de eluição, esta etapa é feita com água, tampão e, às vezes, com uma solução aquosa com um pequeno percentual de solvente orgânico. No modo normal, esta etapa é feita com um solvente ou misturas de solventes apoiares.

4. Eluição  - a eluição do soluto pode ser feita com um solvente forte, no qual k = 0, o que  possibilita pequenos volumes de solvente, aumentan do a sensibilidade do método. Isto, entretanto, pode resultar ná eluição de compostos mais retidos que os solutos de interesse, assim, às vezes prefere-se um solvente de força intermediária para que estes compostos mais retidos não eluam. Quando se trabalha com maiores volumes, pode-se posteriormente concentrar as amostras para obter a necessária sensibilidade.

A Figura 12.1 exemplifica estas etapas.

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 Figura 12.1 Etapas envolvidas na extração em fase sólida.

A extração em fase sólida requer que as seguintes etapas sejam avaliadas para desenvolvimento do método.

1. Seleção do eluente - vários solventes são testados para a extração do soluto e o melhor solvente é aquele que oferece um maior percentual de recuperação. O volume necessário para a extração também deve ser examinado.

2. Seleção do solvente de lavagem - é feita com matrizes fortificadas, testando-se diferentes solventes. O melhor solvente será aquele que remover o máximo de interferentes sem eluir os compostos de interesse. O volume necessário para lavagem também deve ser considerado. 3. Avaliação de interferentes da m atriz  - é feita com uma matriz em branco eluída após a

lavagem com o solvente previamente selecionado. Se interferentes estiverem presentes, a etapa de lavagem deve ser modificada ou, então, troca-se o solvente de eluição.

4. Avaliação do percentual de extração - é feita por comparação entre uma solução padrão e a matriz fortificada. Uma baixa recuperação pode significar que os analitos interagem com a matriz e/ou outros parâmetros devem ser otimizados.

Os cromatogramas a seguir (Figura 12.2) mostram um exemplo de uma extração de drogas do  plasma no modo reverso de eluição. Neste caso, os plasmas fortificados e os brancos (1 mL) foram

transferidos para cartuchos de extração Bakerbond SPE light octadecil (100 mg) previamente condicionados com metanol (2 mL) e água (2 mL). Após a adição do plasma, os cartuchos foram secos por aspiração sob vácuo e então lavados com solução saturada de cloreto de sódio (1 mL), água (1 mL), solução aquosa 20% de acetonitrila (1 mL), água (1 mL), antes de serem extraídos com metanol (1 mL). Os extratos de metanol foram então evaporados sob nitrogênio e os resíduos foram reconstituídos com 150 |Xl de hexano:etanol (90:10 v/v). Então, 120 |Il destas soluções foram transferidos para os inserts  (200 p.1) do injetor automático e 50 p.1 foram injetados para a análise  por HPLC.

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 Figura 1 2.2 Cromatogramas da a) amostra em solução e da b) amostra extraída do plasma.

Independentemente do método que se esteja usando para fazer a extração em fase sólida, o fluxo de solvente não deve ser muito rápido para permitir que o soluto interaja com a fase estacionária. Este fluxo deve ser controlado quando se deseja obter boa precisão entre as extrações. Para grandes números de amostras, a melhor opção é a automatização do processo. Vários equi  pamentos permitem tal automação.