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Brazilian
Journal
of
OTORHINOLARYNGOLOGY
ARTIGO
ORIGINAL
The
effect
of
melatonin
and
vitamin
C
treatment
on
the
experimentally
induced
tympanosclerosis:
study
in
rats
夽
Sema
Koc
a,∗,
Halil
Kıyıcı
b,
Aysun
Toker
c,
Harun
Soyalıc
¸
d,
Huseyin
Aslan
e,
Hakan
Kesici
ee
Zafer
I.
Karaca
eaAntalyaEducationandResearchHospital,DepartmentofENTHeadandNeckSurgery,Antalya,Turquia bMevlanaUniversity,SchoolofMedicine,DepartmentofPathology,Konya,Turquia
cNecmettinErbakanUniversity,SchoolofMedicine,DepartmentofBiochemistryandClinicalBiochemistry,Konya,Turquia dGaziosmanpasaUniversity,SchoolofMedicine,DepartmentofOtorhinolaryngology,Tokat,Turquia
eGaziosmanpasaUniversity,SchoolofMedicine,DepartmentofHistologyandEmbryology,Tokat,Turquia
Recebidoem1dejunhode2016;aceitoem24dejunhode2016 DisponívelnaInternetem1dejulhode2017
KEYWORDS
Tympanosclerosis; Melatonin; VitaminC; Totalantioxidant status
Abstract
Introduction:Theethiopathogenesisoftympanosclerosishasnotbeencompletelyunder-stood yet.Recentstudieshaveshownthatfree oxygenradicalsareimportantintheformationof tympanosclerosis.MelatoninandVitaminCareknowntobeapowerfulantioxidant,interacts directlywithReactiveOxygenSpeciesandcontrolsfreeradical-mediatedtissuedamage. Objective: Todemonstrate thepossiblepreventativeeffectsofmelatoninandVitaminCon tympanosclerosisinratsbyusinghistopathologyanddeterminationoftotalantioxidantstatus totalantioxidantstatus.
Methods:Standard myringotomy andstandard injury were performed in themiddle ear of 24 rats. The animalswere dividedinto threegroups:Group 1received melatonin,Group 2 receivedvitaminC,andGroup3receivedsalinesolution.
Results:Themeanvaluesoftotalantioxidantstatusweresimilarintheallstudygroupsbefore thetreatmentperiod.Themeanvaluesoftotalantioxidantstatusweresignificantlyhigherin themelatoninandvitaminCgroupscomparedtocontrolgroupbutvitaminCwithmelatonin groupsweresimilarafterthetreatmentperiod(p<0.001).Minimumandmaximumwall thick-nesseswerelowerinthemelatoninandvitaminCgroupscomparedtothecontrolgroupbut thedifferenceswereinsignificant.
DOIserefereaoartigo:http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2016.06.008 夽
Comocitaresteartigo:KocS,KıyıcıH,TokerA,Soyalıc¸H,AslanH,KesiciH,etal.TheeffectofmelatoninandvitaminCtreatmenton theexperimentallyinducedtympanosclerosis:studyinrats.BrazJOtorhinolaryngol.2017;83:541---5.
∗Autorparacorrespondência.
E-mail:drsemakoc@gmail.com(S.Koc).
ArevisãoporparesédaresponsabilidadedaAssociac¸ãoBrasileiradeOtorrinolaringologiaeCirurgiaCérvico-Facial.
Conclusion:Melatoninincreasestotalantioxidantstatuslevelandmighthavesomeeffecton tympanosclerosisthatdevelopsaftermyringotomy.
© 2016 Associac¸˜ao Brasileira de Otorrinolaringologia e Cirurgia C´ervico-Facial. Published by Elsevier Editora Ltda. This is an open access article under the CC BY license (http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
PALAVRAS-CHAVE
Timpanoesclerose; Melatonina; VitaminaC; Capacidade antioxidantetotal
EfeitodotratamentocommelatoninaevitaminaCnatimpanoescleroseinduzida experimentalmente:estudoemratos
Resumo
Introduc¸ão:A etiopatogênese da timpanoesclerose (TE) não foi ainda totalmente esclare-cida. Estudosrecentes têmdemonstrado queos radicaislivresdeoxigênio sãoimportantes naformac¸ãodeTE.MelatoninaevitaminaCsãoconhecidasporserempoderosos antioxidan-tes,interagirdiretamentecomespéciesreativasdeoxigênio(ROS)econtrolardanosemtecidos mediadosporradicaislivres.
Objetivo:DemonstrarospossíveisefeitospreventivosdamelatoninaedavitaminaCnaTEem ratoscomhistopatologiaedeterminac¸ãodacapacidadeantioxidantetotal(CAT).
Método: Miringotomias padronizadasforam feitasna orelha médiade 24 ratos. Os animais foramdivididosemtrêsgrupos:oGrupo1recebeumelatonina,oGrupo2vitaminaCeogrupo 3soluc¸ãosalina.
Resultados: OsvaloresmédiosdeCATforamsemelhantesemtodososgruposdeestudoantes doperíodo de tratamento. Osvalores médios deCAT foramsignificativamente maioresnos grupos que receberam melatonina evitamina Cem comparac¸ão como grupo de controle, mas os grupos vitamina C e melatonina foram semelhantes após o período de tratamento (p<0,001).Asespessurasmínimasemáximasdeparedeforammenoresnosgruposmelatonina evitaminaC,emcomparac¸ãocomogrupocontrole,masasdiferenc¸asnãoforamsignificativas. Conclusão:AmelatoninaaumentaosníveisdeCATepodeteralgumefeitosobreaTEquese desenvolveapósamiringotomia.
© 2016 Associac¸˜ao Brasileira de Otorrinolaringologia e Cirurgia C´ervico-Facial. Publicado por Elsevier Editora Ltda. Este ´e um artigo Open Access sob uma licenc¸a CC BY (http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Introduc
¸ão
Atimpanoesclerose (TE) é umacondic¸ão que podeafetar tanto a membrana timpânica quanto a mucosa da orelha média.É caracterizadahistologicamente porumaumento nas fibras de colágeno, diminuic¸ão da vascularizac¸ão e formac¸ão de células, hialinizac¸ão, calcificac¸ão e degenerac¸ãodacamadadecolágeno.1,2ATEénormalmente
identificadacomomanchasbrancas,quernamucosada ore-lha média ou na membrana timpânica (MT). Inicialmente A TE se manifesta como massas de material timpanoes-clerótico semelhantes aqueijo e com o tempotornam-se semelhantesa osso e endurecem.3 Aetiopatogenia daTE
aindanãofoitotalmente compreendida.Estudos recentes têm demonstrado que os radicais livres de oxigênio são importantena formac¸ãodaTEna MTsubmetida atrauma eagentesantioxidantesdiminuemouprevinema miringos-cleroseeaTEapósmiringotomiaexperimental.4---7
A melatonina (N-acetil-metoxitriptamina), uma indola-mina derivada de triptofano, é produzida principalmente naglândulapinealdemamíferos,mastambéméproduzida em outros órgãos.8 Tem sido demonstrado que age como
um potente anti-inflamatório, antioxidante e eliminador deradicaislivres, protegecontra várias espéciesde radi-cais.Váriosestudostêmdemonstrado que,devidoa essas
características,amelatoninadiminuiaesclerose.9---11A
vita-mina C é conhecida por ser um poderoso antioxidante, interagir diretamente com espécies reativas de oxigénio (ERO)eporcontrolardanosteciduaismediadosporradicais livres.12
O objetivo deste estudo foi investigar e comparar os possíveis efeitos preventivos de melatonina e vitamina C na TE em ratos submetidos a miringotomia daMT e uma lesão padrão na orelha média, por histopatologia e pela determinac¸ãodacapacidadeantioxidantetotal(CAT).
Método
Normasinternacionaisparaocuidadodeanimaisde labora-tórioforamseguidase oprotocolodoestudofoiaprovado pelocomitêdeéticalocalresponsável.
Manutenc¸ãodosanimais
cuidadoscomosanimais.Qualqueranimalqueapresentasse sinaisdeinfecc¸ãonaorelhaexternaoumédiaepossibilidade dedoenc¸assubjacentesfoiexcluídodoestudo.Osanimais foramalojados emumasalamantidaa23±3◦C,com12h
deluze12hdeescuridão,com13-18mudanc¸asdearpor hora.
Procedimentosoperacionaisedesenhodoestudo
Todasasintervenc¸õesforamfeitasem condic¸õesestéreis. Após anestesia com cloridrato de cetaminapor via intra-muscularaumadosede30mg/kg,amiringotomiafoifeita de forma semelhanteem ambas as orelhas dos ratos sob umotomicroscópio, por meiode umespéculo aural, com orientac¸ãoradialnoquadranteposterossuperiordasMT,com umaincisãode3a4 milímetros.Subsequentemente,uma lesãopadrão foifeitana orelha média.Elesforam dividi-dosemtrêsgrupos (Grupos1,2e3).Oitoratos(Grupo 1) receberam5mg/kgdemelatoninapormeiodegavagem oro-gástrica;oito(Grupo2)receberam75mg/kgdevitaminaC por meiode gavagem orogástrica; e oito (Grupo 3) rece-beram soluc¸ão salina(NaCl a0,9%) por meiode gavagem orogástrica,comdurac¸ãode10dias.Aquantidadede suple-mentodemelatoninaevitaminaCfoideterminadacombase naliteratura.9,13
Análisebioquímica
Amostrasdesangueforamcoletadasdaveiadacaudados ratosnoprimeirodia, nomomentodaanestesia, antesda miringotomiaeno28◦diaporviaintracardíacanovamente,
quandoforamanestesiadosantesdosacrifício.
Capacidadeantioxidantetotal(CAT)
Osníveisdacapacidadeantioxidante totalforammedidos com kits comercialmente disponíveis (Rel Assay). O novo métodoautomatizadoébaseadonobranqueamentodacor característicadeumcátionradicalABTSmaisestável(ácido 2,2’---azino-bis[3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato])por antio-xidantes.Ométodocolorimétricodokitcomercialbaseia-se em 660nmdeabsorbância.Osresultadosforamexpressos comoequivalenteTroloxemmmol/L.
Coletadetecidoeanálisehistopatológica
No 28◦ dia, todos os animais foram sacrificados sem dor,
apósa administrac¸ão dedose elevada (80mg/kg) de pen-tobarbitalpor via intraperitoneal. Osossostemporais dos animaisforamremovidose contadose acavidadeda ore-lhamédia,damembranatimpânicaedoscanais auditivos externosfoiisolada.Osespécimesforamfixadosemformol a4%eentãodescalcificadoscom0,1mol/Ldeácido etile-nodiaminotetra-acético(EDTA).Apósoprocessamentodos tecidosea conservac¸ão emblocosdeparafina,os espéci-mesforamcortadosparaobterem-seamostrasde3mde espessura.Colorac¸ãodehematoxilina-eosina(H&E)e tricrô-micadeMassonforamusadasnaavaliac¸ãohistopatológica.A espessuradalâminaprópriadaorelhamédiafoimedidapor umocular graduado,com ummicroscópioópticoOlympus BX53.Exsudadosnãoforamincluídosnaespessuradelâmina própria.Quandodisponível,aespessuradamembrana tim-pânicafoimedidapormeiodamesmatécnica.
Análiseestatística
ForamfeitascomoprogramaSPSSparaWindowsversão15 (SPSS,Chicago,IL,EUA).OtestedeKolmogorov-Smirnovfoi usadopara avaliarsea distribuic¸ão dasvariáveisera nor-mal.OtestetdeStudentouotesteUdeMannWhitneyfoi usadoparacompararvariáveiscontínuasentreosdois gru-pos.Asvariáveiscontínuasforamapresentadascomomédia (desviopadrão[DP])oucomomediana(intervalo interquar-til[IIQ]).Umvalordepmenordoque0,05foiconsiderado estatisticamentesignificante.
Resultados
OsvaloresmédiosdaCATeramsemelhantesemtodosos gru-posdeestudo antesdoperíododetratamento. Osvalores médios de CAT foram significativamente maiores nos gru-pos de melatonina e vitamina C, em comparac¸ão com o grupodecontrole,masosgruposdemelatoninaevitamina C com foram semelhantes após o período de tratamento (p<0,001) (tabela 1). As espessuras mínima e máxima da paredeforammenoresnosgruposdemelatoninaevitamina C,emcomparac¸ãocomogrupocontrole,masasdiferenc¸as não foram significantes. As espessuras mínima e máxima daparede foramsemelhantes nosgrupos demelatoninae vitaminaC(tabela1)(figs.1e2).
Tabela1 Capacidadeantioxidantetotaleespessuradaparedenosgruposdeestudo
Controle (n =8)
VitaminaC(n = 8) Melatonina(n =8) p
CATantesdotratamento(mmoLTroloxEq/L)a 2,97±0,86 2,51±0,39 3,20±0,91 0,199
CATdepoisdotratamento(mmoLTroloxEq/L)a 2,51±0,64 5,68±0,28 5,46±0,23 <0,001c
Espessuramínimadaparedeb 2,35
(1,25---4,5)
2,0(1,0---6,9) 2,0(1,25---3,6) 0,946
Espessuramáximadaparedea 38±27 33±26 32±17 0,847
CAT,capacidadeantioxidantetotal.
a Valoressãoapresentadoscomomédia±desviopadrão.
b Valoressãoapresentadoscomomedianaeintervalointerquartil(Q1-Q3).
c Houvediferenc¸aestatisticamentesignificanteentreogrupocontroleeogrupodemelatonina(p<0,001)eentreogrupocontrole
Figura 1 Ausência de timpanoesclerose significativa (seta) nestaamostradogrupo controle;comotite médiamoderada (ladoesquerdodaseta).Colorac¸ão:H&E,aumento100x.
Figura 2 Timpanoesclerose leve (seta) e otite média leve (abaixodaseta)sãodemonstradasem umaamostradogrupo melatonina.Colorac¸ão:H&E,aumento100x.
Discussão
Nossoestudodemonstrouqueaadministrac¸ãosistêmicade melatoninareduziuouinibiuaformac¸ãodeTE,agiucomo um eliminador de radicais livres em ratos submetidos a miringotomiaelesãopadrãonaorelhamédia.Tantoquanto sabemos,esteéoprimeiroestudonaliteraturaparaavaliar aeficáciadamelatoninanaprevenc¸ãodeTE.
Espéciesreativasdeoxigênio (ERO)sãomoléculas con-tendooxigênio, produzidasduranteometabolismonormal em condic¸ões aeróbicas. ERO incluem um ânion radi-cal superóxido (O2 •-), peróxido de hidrogênio (H2O2),
radical hidroxila (•OH) e oxigênio singleto (1O2).14 Esses
radicaisdeoxigêniosãoconsideravelmentereativosetêma capacidadedecausardestruic¸ãocelularirreversível.Os sis-temasantioxidantescontêmmecanismosenzimáticosenão enzimáticoscontra os efeitos nocivos dos produtos endó-genos ERO.15 O sistema enzimático envolve a superóxido
dismutase(SOD),acatalase(CA)eaglutationaperoxidase (GSH-Px).Oácidoascórbico,aglutationa,o-caroteno,os tocoferóiseoácidoúricopodemserincluídoscomosistemas dedefesanãoenzimáticos.16 Aformac¸ãoeaeliminac¸ãode
radicaislivresdeoxigênioestãoemumequilíbrioconhecido comobalanc¸ooxidativo. Enquantooequilíbriooxidativoé mantido,radicaislivresdeoxigênionãoprejudicamo orga-nismo.Quandooequilíbriooxidativoécorrompido,osníveis deradicais livresde oxigênio aumentame ocorremdanos aos tecidos; essa última situac¸ão é chamada de estresse oxidativo.17 É possível medir, um por um, os parâmetros
deantioxidantesnosoro.Osparâmetrosantioxidantestêm efeitosaditivos,portantoosvaloresindividuaispodemnão refletir completamente a capacidade antioxidante total. Portanto, a medic¸ão daCAT é o procedimentomais ade-quadoparaavaliaroestadoantioxidante.18
A timpanoesclerose é causada por otite média aguda recorrente, tratamento de otite média com efusão com inserc¸ão de tubo de ventilac¸ão na MT, otite média crô-nica,reac¸ãoimunológica de hipersensibilidade,tendência genética ou trauma. Estudos recentes têm investigado a formac¸ão de miringosclerose após miringotomia e apon-tadoumarelac¸ãoentreodesenvolvimentodeTEeERO.1,4,5
Quandocomparadacom10%noarambiente,aconcentrac¸ão decercade5%deoxigênionacavidadedaorelhamédiaé muitomaisbaixadoqueadoarambiente.Amiringotomia levaaumaumentodaconcentrac¸ãodeoxigênionacavidade daorelha média, resultaem uma condic¸ão relativamente hiperóxica.19Ahiperoxigenac¸ãoprovocaaformac¸ãodeERO
e, dessaforma,poderiacausaro processoinflamatório. O aumentodeEROeadeficiênciadosmecanismosdedefesa antioxidantecausamdanosaotecido,queincluemfibrose, degenerac¸ão hialina,acumulac¸ão eagregac¸ão de cálcioe fósforo,formamdepósitosescleróticos.Jáfoidemonstrado queoseliminadores deEROdiminuema resposta inflama-tória,oquetambémdiminuiaformac¸ãodeaderências.4---7
Portanto,pode-selevantarahipótesedequeotratamento antioxidantereduzaformac¸ãoereformac¸ãodaTE.
Amelatoninaéumpotenteantioxidanteeeliminadorde radicais livres.9 Osefeitos antioxidantes diretos e
indire-tosdamelatoninajáforamrelatados.Amelatoninatemum efeitoantioxidanteindiretocomainduc¸ãodasatividadesda SODeGSH-Px.Aoeliminarosradicaislivresderivadosde oxi-gênio,taiscomohidroxileperoxil,amelatoninademonstra seuefeitoantioxidantedireto.14 Além disso,amelatonina
impedea escleroseao inibira agregac¸ãoe a secrec¸ão de plaquetas, a síntese das prostaglandinas e a proliferac¸ão defibroblastos.20 Rosaetal.21 relataramqueamelatonina
reduzadestruic¸ãoeafibrosecausadasporestresse oxida-tivopormeiodaelevac¸ãodasenzimasantioxidantes,como a SOD e GSH-Px, em ratos cirróticos. Koc et al.11
avalia-ramosefeitosdamelatoninasobreoestresseoxidativoea aderênciaemratosapóslaparotomialesãopadrãonocorno uterinodireito.Ogrupoquerecebeumelatoninaapresentou menosaderências,maioratividadedeSODedeCAeníveis baixosdemalondialdeído(MDA).Outroestudomostrouque amelatoninaimpedeaaderência peritonealpelareduc¸ão doestresseoxidativo.9
Umtratamentocurativoparaamiringoesclerose(ME)e TEaindanãofoiidentificado.Váriosantioxidantestêmsido usadosnotratamentoe foicomprovadoqueeles reduzem a ME.21 Emir et al.22 afirmaram que o extrato de ginkgo
biloba,quetemefeitosantioxidantes eanti-inflamatórios, reduziu ou inibiu a ME em ratos submetidos a miringoto-mia. Dundar et al.12 usaram ácido ascórbico em orelhas
ácido ascórbico reduziu a ocorrência de ME, tanto nos exames por otomicroscopia quanto nos histopatológicos. Karlidag etal.23 avaliaram estresse oxidativo e TE em 65
pacientes submetidos a timpanoplastia ou timpanoplastia com mastoidectomia. Nos pacientescom níveis deTE, os níveisencontradosforamelevadoseaatividadedeCAera baixa,emcomparac¸ãocomospacientessemTE,enquanto nenhuma diferenc¸a na atividade da SOD foi encontrada entreosgrupos.Kazikdasetal.5demonstraramqueo
alfa--tocoferol reduz o estresse oxidativo e ME, por meio de análisesbioquímicas,otomicroscópicas,timpanométricase histopatológicas.
No presenteestudo, o efeito damelatonina e da vita-mina C em TE foi avaliado na mucosada orelha deratos submetidos a miringotomia e com lesão na orelha média comhistopatologiaedeterminac¸ãodoestadooxidativocom amedic¸ãodosníveisdeCAT.Nesteestudo,demonstrou-se queosvaloresmédiosdeCATeramsemelhantesemtodosos gruposdeestudoantesdoperíododetratamento.Osvalores médios de CAT foramsignificativamente maiores nos gru-posdemelatoninaevitaminaC,quandocomparadoscomo grupocontrole,masosgruposdavitaminaCeda melato-ninaforamsemelhantesapós operíododetratamento.As espessurasmínimaemáximadaparedeforammenoresnos gruposdemelatoninaevitaminaC,emcomparac¸ãocomo grupocontrole,masasdiferenc¸asnãoforamsignificantes.As espessurasmínimaemáximadaparedeforamsemelhantes nosgruposmelatoninaevitaminaC.
Conclusão
Aadministrac¸ão demelatoninaaumentao nível deCAT e podeteralgumefeitonaTEquesedesenvolveapósa mirin-gotomia,mas essasobservac¸õesnão sãoestatisticamente significativas. No entanto, outros estudos experimentais comumnúmeromaiordeindivíduos,commelatoninae/ou vitamina C em doses elevadas e por vários períodos de tempo,devemserfeitosparaapoiarosefeitosda melato-ninae/ouvitaminaCemTEinduzidapormiringotomia.
Conflitos
de
interesse
Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.
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