Avaliação da resposta tecidual ao implante de osso bovino misto medular em subcutâneo de ratos

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INNOVATIONS IMPLANT JOURNAL - BIOMATERIALS AND ESTHETICS 21

Avaliação da resposta tecidual ao implante de osso

bovino misto medular em subcutâneo de ratos

Resumo

O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta tecidual ao implante do osso bovino misto (OBM) acelular em subcutâneo de ratos. Blocos de OBM (10x10x5mm) foram implantados no tecido subcutâneo de 25 ratos machos Wistar, os quais foram mortos após 3, 7, 14, 30 e 60 dias (n = 5/período) da cirurgia. O tecido reacional foi coletado, fi xado em formol 10% tamponado, lavado, desidratado, diafanizado em xilol e incluído em parafi na. Cortes com 6µm de espessura foram corados com Hematoxilina e Eosina. A análise microscópica subjetiva indicou que o OBM foi circundado por tecido de granulação (composto de células mononucleares semelhantes a fi broblastos e polimorfonucleares) aos 3 dias. Entre 7 e 30 dias observou-se a invasão gradual dos poros do material implantado pelo tecido de granulação apresentando um discreto infi ltrado infl amatório mononuclear com poucas células gigantes multinucleadas (CGM). Concomitantemente à angiogênese observa-se aparecimento de adipócitos no interior do material confi rmando porosidade interconectada dos poros. Após 60 dias os espaços medulares estavam completamente ocupados por tecido de granulação composto por células semelhantes a fi broblastos e raras células infl amatórias mononucleares e CGM. Não se observou indícios de degradação ou absorção do material até o período de 60 dias. Considerando a ausência de necrose ou outros sinais de destruição tecidual, a presença de proliferação celular e angiogênese para o interior do material e que não se observou absorção do material, concluiu-se que o OBM é biocompatível e não absorvível, tendo potencial aplicação na engenharia de tecidos.

Unitermos: biomaterial; xenoenxerto; análise histológica; biocompatibilidade.

Abstract

The aim of this study was to evaluate the tissue response to acellular mixed bovine bone graft (MBG) implanted in the subcutaneous tissue of rats. MBG in block (10x10x5mm) was implanted in 25 adult male Wistar rats, killed 3, 7, 14, 30 e 60 days after surgery (n=5/period).The granulation tissue was fi xed in 10% buffered formalin, washed, dehydrated in ethanol, diafanized in xylene, and included in paraffi n according to standard technique. Histological sections measuring 6µm in thickness were stained with haematoxylin and eosin. Histological analysis 3 days after surgery showed a granulation tissue around the MGB block presenting mononuclear cells like fi broblasts and neutrophils. From 7 to 30 days, chronic infl ammatory infi ltrate consisting mainly of macrophages and few infl ammatory multinucleated giant cells (MGC) were observed invading the porous of MGB. Parallel to angiogenesis, adipocytes were present in the interior of material, corroborating the presence of interconnected porous. After 60 days, medullar spaces were fulfi lled with granulation tissue presenting fi broblast-like cells and rare mononuclear infl ammatory cells and MGC. No signs of material degradation or absorption were noted throughout the experimental periods. Considering the absence of necrosis or other signs of tissue destruction, cell growth and angiogenesis inside the material and the absence of material absorption, it was concluded that MGB was biocompatible and non absorbable being potentially adequate for tissue engineering.

Keywords: biomaterial; histological analysis; biocompatibility; xenograft.

Evaluation of tissue repair, in case of bovine bone implantation mixed with bone marrow graft, in subcutaneous region of rats

Danilo Donizetti Januário Janune1_{, Tânia Mary Cestari}2_{, Rodrigo Cardoso De Oliveira}3_{, Eulázio Mikio Taga}4_,

Rumio Taga4_{e José Mauro Granjeiro}5

1 Mestrando do Programa de Medicina, Odontologia e Ciências Farmacêuticas do Primeiro Departamento de Cirurgia Reconstrutiva Oral e Maxilofacial Universidade de Okayama, Japão 2 Doutoranda do Curso de Biologia Oral - FOB/USP

3 Professor Doutor do Departamento de Ciências Biológicas - FOB/USP 4 Professor Titular do Departamento de Ciências Biológicas - FOB/USP

5 Professor Adjunto do Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia da UFF; Professor Visitante da FOB-USP.

Revista Inovation 2007_2.indd 21

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22 Volume 01 - Número 01 - Maio/2006

INTRODUÇÃO

E

m algumas áreas da saúde como Ortopedia,

Odontologia (Periodontia, Cirurgia Bucomaxilofacial e Implantodontia) e Medicina Veterinária, os protocolos terapêuticos visando à regeneração ou preservação do tecido ósseo são muito freqüentes. O osso lesado possui considerável capacidade de regeneração espontânea, entretanto, nos casos de perdas ósseas extensas esta capacidade não é suﬁ ciente para repará-lo adequadamente (Ludwig, Kowalski,

Boden, 2000)7_{. Nestes casos é necessária a utilização}

de métodos e materiais alternativos, como os enxertos, para auxiliar o reparo morfofuncional do tecido ósseo. Apesar dos enxertos ósseos autógenos (tecido do próprio receptor) serem amplamente aceitos como padrão para o tratamento desses defeitos, os enxertos alógenos (tecido de doador da mesma espécie), xenógenos (tecido de doador de espécie diferente) (National Institute of Health Consensus Development Conference Statement

on Dental Implants, 1989)11_{e sintéticos têm sido}

amplamente estudados e propostos como alternativas

interessantes ao osso autógeno (Cancian et al., 19991_;

Ludwig, Kowalski, Boden, 20007_{; Cordioli}_{et al., 2001}2_;

Von Arx et al., 200125_).

Dentre os materiais de origem xenógena, os de origem bovina merecem destaque, pois a matéria-prima para sua produção é abundante, seu custo ﬁ nal é acessível à população, além de serem seguros em relação à

transmissibilidade de doenças (Sogal & Tofe, 199920_;

Wenz et al., 200126_{), pois o processamento industrial}

para acelularização e desproteinização elimina os riscos de resposta imunogênica e transmissão de doenças

como a encefalopatia espongiforme bovina (Marx et al.,

198610_{, Wenz}_{et al., 2001}26_{). Estudos recentes avaliando}

a resposta tecidual a xenoenxertos desproteinizados (Oliveira et al., 199915_{, Sicca}_{et al., 2000}19_{, Oliveira}_et

al., 200315_{) e desmineralizados (Oliveira}_{et al., 2004}12₎

conﬁ rmaram sua biocompatibilidade (Sanada et al.,

200317_{). Entre os materiais desmineralizados alguns se}

mostraram absorvíveis em testes subcutâneos (Oliveira

et al., 200412_{e Oliveira}_{et al., 2006}14_).

Atualmente, uma das grandes metas na área médico-odontológica mundial é encontrar um carreador ideal para fatores de crescimento ou de indução, como as

proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) (Nakashima

& Reddi, 20039_{; Granjeiro}_{et al., 2005}15_{), que seja}

biocompatível, osteocondutor e melhore a regeneração do tecido ósseo no local do tratamento. O carreador deve mimetizar ou se aproximar da forma do tecido original

(Lutolf et al., 20038_{), facilitando assim a regeneração do}

tecido lesionado (Nakashima & Reddi, 20039_).

Embora muitos materiais concorram para esse ﬁ m, todos devem atender a exigências como: biocompatibilidade, previsibilidade, ausência de riscos transoperatórios, aplicabilidade clínica, seqüelas pós-operatórias mínimas, aceitação por parte do paciente e custo acessível. No entanto, nenhum material conhecido preenche de forma satisfatória todos os requisitos (Nakashima &

Reddi, 20039_).

Um aspecto que limita sobremaneira a aplicação clínica de novos materiais refere-se às suas características mecânicas como falta de resistência, material friável e rigidez. O osso bovino desproteinizado já foi descrito

por Yukna et al. (1998)28_{como um potencial carreador,}

bem como a hidroxiapatita sintética (Stephan, 1999)22_,

apesar de não apresentar um comportamento ﬁ siológico devido à sua microestrutura, tamanho do cristal e tipo de ossiﬁ cação diferente do osso natural. O tecido ósseo tem a capacidade de aliar resistência (componente mineral - hidroxiapatita) à capacidade de absorver tensões (componente orgânico - colágeno tipo I). Materiais que preservem tanto a estrutura mineral como a orgânica, livre de células e moléculas imunogênicas teriam, potencialmente, grande aplicabilidade clínica. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta tecidual ao osso medular bovino misto implantado em tecido subcutâneo de ratos.

Material e Método

Material

Blocos (10x10x5mm) obtidos da cabeça do fêmur bovino foram submetidos à limpeza mecânica e tratamento químico com álcalis, soluções tensioativas e caotrópicas, de forma a eliminar células, gordura e matriz extracelular, mas conservando o conteúdo de colágeno e apatita intrínseca do osso. Em seguida os blocos foram lioﬁ lizados e esterilizados por radiação gama (25 kGy).

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Animais

Foram utilizados 25 ratos machos adultos (Rattus

norvegicus), pesando cerca de 250g. A pesquisa foi

realizada com a aprovação e segundo as normas recomendadas pela Comissão de Ética no Ensino e Pesquisa em Animais da Faculdade de Odontologia de Bauru-USP, seguindo o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

Procedimentos Cirúrgicos

Os animais foram anestesiados com uma solução de cloridrato de xilazina + cloridrato de ketamina (1:1) via intramuscular utilizando a proporção de 0,14 mL/100g de peso do animal. Sob anestesia geral, fez-se a tricotomia, anti-sepsia vigorosa com álcool iodado, incisão de 1,5 cm de comprimento no tegumento do dorso do animal. Em seguida, uma loja cirúrgica, no tecido subcutâneo, foi criada com o auxílio de uma tesoura de ponta romba. O bloco de OBM foi colocado na loja cirúrgica utilizando pinça

reta. Seguiu-se a sutura (ﬁ o de seda nº 4.0, EthiconTM_,

Johnson & Johnson, São José dos Campos, Brasil) e assepsia com álcool iodado. Todos os animais foram mantidos durante todo o período do experimento com

ração peletada Purina® e água ad libitum.

Obtenção das biópsias e processamento histotécnico

Decorridos os períodos experimentais de 3, 7, 14, 30 e 60 dias, cinco animais por período, foram mortos com dose excessiva de solução anestésica e as peças cirúrgicas foram removidas. Estas foram imersas em formol a 10% em tampão fosfato por uma semana, lavadas por uma noite em água corrente, desmineralizadas por uma solução de EDTA 0,05M pH 7,2, desidratadas em etanol, clariﬁ cadas em xilol e incluídas em Histosec Merck (paraﬁ na + resina plástica). Cortes alternados de 6μm foram obtidos no micrótomo Jung-Leica e corados pela Hematoxilina e Eosina.

Análise dos Resultados

Análise Microscópica Descritiva

Ao microscópio de luz foram analisadas a morfologia do material empregado e a resposta tecidual em função das alterações infl amatórias, tais como edema, proliferação vascular e infi ltrado infl amatório; processos reparatórios, como grau de fi brose, proliferação angioblástica e fi broblástica.

Resultados

Período de 3 dias: No período inicial, o material se apresentava aparentemente íntegro e envolto por tecido de granulação jovem composto de vasos congestos na área periférica ao redor do OBM (FIGURA 1A) e apresentando infi ltrado infl amatório moderado composto de poucos linfócitos e polimorfonucleares (PMN). Hemácias extravasadas e rede de fi brina, provavelmente proveniente do trauma cirúrgico, ocupavam os espaços internos do material (FIGURA 1B).

Período de 7 dias: O bloco de OBM implantado ainda se apresentava íntegro, envolto por discreto adensamento de fi bras colágenas e contendo hemácias extravasadas e rede de fi brina no seu interior (FIGURA 2A). A congestão vascular do tecido ao redor diminuiu em relação ao período anterior. Nesta fase, o tecido de granulação jovem ao redor do material contém alguns linfócitos, células mononucleares semelhantes a fi broblastos e macrófagos e vasos adentrando o material, denotando angiogênese (FIGURA 2B).

Período de 14 dias: o material continua íntegro, apresentando vasos congestos em seu interior semelhante ao período anterior, porém o tecido de granulação ocupa todo o interior do bloco (FIGURA 3A). O centro do material apresenta discreto infi ltrado infl amatório, contendo linfócitos, poucas células polimorfonucleares, mononucleares semelhantes a macrófagos e Células Gigantes Multinucleadas Infl amatórias (CGMI).

Período de 30 dias: O tecido de granulação apresenta-se mais celularizado e invade os espaços medulares do material, com diminuição leve da atividade angiogênica e do número de células inﬂ amatórias e aumento da quantidade de ﬁ bras colágenas. Os vasos

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neoformados estão presentes nos poros do material (FIGURA 3A). Alguns adipócitos podem ser vistos adentrando os espaços medulares.

Período de 60 dias: No ultimo período, o tecido de granulação ocupava praticamente todos os poros do OBM (FIGURA 3B), a presença de adipócitos era mais intensa, substituindo o tecido de granulação nos espaços medulares do material em direção ao centro do material. O número de CGMI continua bem discreto semelhante ao período anterior.

Discussão

O desenvolvimento da engenharia de tecidos trouxe novas perspectivas e possibilidades para a regeneração de tecidos lesionados ou perdidos. A engenharia de tecidos está fundamentada em três pilares básicos: células, substrato carreador e moléculas sinalizadoras (UEDA

et al., 2000)23_{, porém não há, ainda, o carreador ideal}

(Nakashima & Reddi, 2003)9_{. Alguns componentes}

naturais de tecidos duros aparecem como candidatos em potencial, como a hidroxiapatita e colágeno (Nakashima

& Reddi, 2003)9_{. No presente estudo, o OBM reúne}

diversas características importantes que o coloca como um potencial carreador na terapia celular: é constituído de hidroxiapatita e colágeno tipo I, pode ser produzido nas mais diferentes formas contendo poros de diversos diâmetros, biologicamente desenhados para a condução dos tecidos para seu interior.

Uma propriedade muito importante do material carreador é justamente sua estrutura e formato (Jin et

al., 2000)5_{, além do tamanho da partícula que pode}

interferir no processo de resposta tecidual e mesmo na modulação de atividade de algumas enzimas (Zambuzzi

et al., 2006a)30_{. A presença de poros também é importante}

devido a possibilidade de migração celular e angiogênese

(Jin et al., 2000)5_{e, nesse sentido, mostrou-se no}

presente trabalho que os poros do OBM foram invadidos pelo tecido de granulação, contendo vasos oriundos do tecido adjacente, conﬁ rmando relatos na literatura

acerca de outros xenoenxertos (Oliveira et al. 199915_,

Zambuzzi et al. 200529_{e Zambuzzi}_{et al., 2006b}31_).

Essa característica de proporcionar proliferação celular e vascular em seu interior e em sua superfície parece ser um evento menos freqüente nos materiais sintéticos, como

A OBM B OBM A OBM B OBM

Figura 1 Fotomicrografi a do período de 3 dias.

A) Partícula do material (OBM) envolto por tecido de granulação com presença de vasos congestos na periferia do bloco (elipse). B) Infi ltrado infl amatório e hemácias nas lacunas do material (círculo). Aumento original 10x (A) e 4x (B), coloração hematoxilina-eosina.

A) Partícula da material (OBM) envolto por tecido de granulação adentrando os espaços do material (elipse). B) Em poros do material se observa angiogênese no tecido de granulação (círculo). Aumento original 4x (A) e 10x (B), coloração hematoxilina-eosina.

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a hidroxiapatita sintética, que não possui poros nem micro-estrutura naturalmente produzidos (Stephan,

1999)22_{. A utilização de carreadores naturais minimiza}

o risco de reações alérgicas a polímeros sintéticos, potencialmente reduzindo os riscos de insucesso como

observado com o ácido polilático em ratos Wistar

(Solheim et al., 2000)21_{. Já o poliéster, quando testado}

também em ratos Wistar, apesar de ter causado apenas

uma pequena inﬂ amação, dissipada em quatro semanas, não apresentou efeito qualitativo nem quantitativo na

formação óssea (Solheim, 2000)21_.

Destacamos que, no presente trabalho, em nenhum dos períodos analisados foi notada a ocorrência de ossiﬁ cação ectópica, como observada para a matriz óssea cortical humana em sítio heterotópico ou matriz óssea cortical bovina em sítio ortotópico de animais de laboratório nos períodos de 12 a 15 dias (Pettis, Kaban,

Glowacki, 199016_{; Damien}_{et al., 1995}3_{). Esse resultado}

aparentemente contraditório poderia ser explicado pela ausência de BMPs na matriz de osso bovino misto, decorrente do tratamento do material com agentes caotrópicos capazes de retirar BMPs e fatores de crescimento da matriz óssea, justiﬁ cando assim a não

ocorrência de osteogênese (Schwarz et al., 1991) 18 no

presente trabalho. Outra hipótese para explicar a ausência de formação óssea demonstrada por vários pesquisadores em experimentos similares seria a ocorrência de reação imunológica inativando as BMPs porventura existentes

e bloqueando a neoformação óssea (Urist et al., 1985)24_.

Killey et al. (1970)6_{, analisando a resposta celular ao osso}

bovino misto, isto é, contendo tanto a porção mineral como a orgânica, denominado Kiel bone (B. Braun®, Melsungem, Alemanha), implantado na calvária de coelhos, observaram que o aparecimento de células gigantes e a absorção do material estavam associados a uma inﬁ ltração linfoplasmocitária, que poderia ter

impedido a osteogênese (Killey, Kramer, Wright, 1970)6_.

No entanto, no presente estudo, não foram observados linfócitos ou plasmócitos em quantidade que indicasse reação imunológica ao material em nenhum dos períodos analisados.

Williams27_{deﬁ niu, em 1987, que biocompatibilidade}

em biomateriais é a capacidade do material de manter sua função em meio ao tecido receptor e desencadear

A OBM B OBM * * A OBM B OBM

A) O tecido de granulação continua invadindo o interior do material (OBM) através dos poros, possuindo vasos congestos (seta). B) Angiogênese (setas) e material sendo envolvido pelo tecido de granulação (seta dupla) e célula gigante (*). Aumento original 4x (A) e 10x,(B), coloração hematoxilina-eosina.

Figura 4 Fotomicrografi a dos períodos de 30 e 60

dias. A) Após 30 dias o OBM continha em seu interior tecido de granulação maduro localizado mais internamente exibindo muitas fi bras e poucas células (seta) e adipócitos invadindo o material (elipse). B) Após 60 dias se observou tecido de granulação maduro com muitas fi bras, poucas células e poucos vasos (círculo), bem como partículas desprendidas do material sugerindo sua degradação (seta). Aumento original 10x (A e B), coloração hematoxilina-eosina.

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resposta tecidual favorável. O OBM se manteve no sítio (conjuntivo subcutâneo) e provocou resposta tissular favorável (invasão tecidual e angiogênese).

Conclusão

Considerando que o material possibilitou a invasão de células e formação de um tecido de granulação rico em vasos no seu interior e não induziu destruição tecidual, conclui-se que o OBM é biocompatível e apresenta bom potencial para ser usado como carreador de células e fatores de crescimento.

Agradecimentos

Os autores agradecem os servidores da FOB-USP, Th elma

Lopes da Silva, Luiz Carlos da Silva, Erasmo Gonçalves da Silva e Danielle Santi Ceolin, pelo auxílio técnico prestado durante a execução deste trabalho. Este trabalho foi ﬁ nanciado pelo PIBIC/CNPq, FOB-USP, PRP-USP.

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