UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE COMPÓSITOS RESTAURADORES REMINERALIZANTES COM PARTÍCULAS NANOPOROSAS DE
SÍLICA-HIDROXIAPATITA (Si-HAp) CARREGADAS COM NaF.
Niterói 2017
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE COMPÓSITOS RESTAURADORES REMINERALIZANTES COM PARTÍCULAS NANOPOROSAS DE
SÍLICA-HIDROXIAPATITA (Si-HAp) CARREGADAS COM NaF.
DIRCIANE PERPÉTUO REIS
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Área de Concentração: Dentística
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Moreira da Silva.
Co-orientador: Prof. Dr. Jaime Dutra Noronha Filho
Niterói 2017
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Eduardo Moreira da Silva
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Profa. Dra. Aline de Almeida Neves
Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. Victor Pinheiro Feitosa Instituição: Faculdade Paulo Picanço
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Dedico este trabalho aos meus pais, irmãos, sobrinhos, que sempre me apoiaram, vibraram com cada conquista e foram meu porto seguro perante as dificuldades que surgiram durante todo esse percurso. Amo vocês demais!
Ao meu namorado Gustavo Macedo, pelo amor, companherismo, cuidados, por sempre estar comigo para o que der e vier, por acreditar na minha capacidade e incentivar cada passo dado. Te Amo!
.
Agradeço primeiramente a Deus por ter me dado saúde, força, energia e por ter colocado pessoas especiais na minha vida.
Ao meu orientador, Prof. Eduardo Moreira da Silva e ao meu co-orientador Jaime Dutra Noronha Filho por todo apoio, orientação, dedicação e por ter me auxiliado de perto durante toda a pesquisa. Agradeço também por todos os ensinamentos desde a especialização ( onde tive o prazer de conhecer vocês) que me possibilitou a ser uma profissional melhor.
Aos professores da disciplina de Dentística da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, José Guilherme Antunes, Laiza Poskus, Glauco Botelho e Cristiane Mariote, pela convivência diária e por ter contribuído com vários ensinamentos e com suas experiências profissionais.
Aos professores Maristela Portela, Aline Neves, Jackson Resende e Marcelo Marques pela contribuição a pesquisa e pela boa vontade de sempre em querer ajudar no que for possível.
À minha sogra, Maria de Fátima por me adotar com uma verdadeira filha, pelo carinho e por estar sempre torcendo por mim.
A todos os amigos e colegas da pós-graduação, por cada momento vivido e compartilhado, cada almoço, cada conversa ou conselho. Acreditem esses momentos tornam nossa jornada mais leve e prazerosa!
À minha amiga Marcelle Garcia, pelo companherismo, carinho, preocupação e o mais importante, me ensinou a ter um pouco mais de Fé. Me ensinou que as coisas são possíveis, basta a gente acreditar.
À Cleide e Leleia, que sempre estiveram presentes para qualquer ajuda solicitada. Pela amizade, por cada conversa e por cada café gostoso.
Ao Sr. José Maria pela paciência e dedicação durante todo o tempo de trabalho laboratorial.
Reis DP. Síntese e caracterização de compósitos restauradores remineralizantes com partículas nanoporosas de sílica-hidroxiapatita (Si- HA) carregadas com NaF.
[dissertação] Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia;
2017.
O objetivo deste estudo foi a síntetizar e caracterizar compósitos restauradores remineralizantes com partículas nanoporosas de sílica-hidroxiapatita (Si-HAp) carregadas com fluoreto de sódio (NaF). A produção das partículas nanoporosas de Si-HAp foi feita através da sinterização de nanopartículas primárias de sílica e hidroxiapatita sintética à temperatura de 900°C. Foram produzidos quatro compósitos experimentais (SiLF, SiL, F e NT) com 40 %p/p de matriz orgânica (Bis- GMA/TEGDMA, 70/30 %p/p), 0,5 %p/p de canforoquinona, 1 %p/p de etil N,N- dimetil-4aminobenzoato (EDMAB) para atuarem como sistema de fotoiniciação e 60
%p/p de partículas nanoporosas de Si-HAp. Nos compósitos SiLF e F, as partículas foram previamente imersas durante 24 h em solução aquosa de NaF na concentração de 10% e secas durante 7 dias em estufa a 40 °C. A seguir, os compósitos SiLF e SiL tiveram as partículas silanizadas com γ-metacriloxipropil-1- trimetoxisilano. O compósito NT não recebeu tratamento prévio de suas partículas. O nanocompósito comercial Z350 (3M ESPE) foi utilizado como controle comercial. A análise do potencial remineralizante foi feita através da obteção das imagens no micro-CT e os perfis de densidade foram avaliados utilizando o software Dataviewer e imageJ. Para a caracterização do compósito foram feitos os seguintes ensaios:
Grau de conversão (GC%), reistência à flexão (RF), módulo de elasticidade (ME), rugosidade, dureza, cor, translucidez, absorção e solubilidade. Os dados obtidos foram analisados com os modelos estatísticos adequados com nível de significância de (α = 0,05). O potencial remineralizador foi estatisticamente diferente para todos os grupos ( F > SiLF > NT > SiL). O NT apresentou o maior valor de GC% (63,84%).
Para RF e ME, os grupos SiLF e F apresentaram menores valores que os grupos SiL e NT. Para a rugosidade, o grupo SiLF apresentou o maior valor (1,68 µm). Não houve diferença entre os grupos para a dureza e cor. Para a translucidez somente o NT foi diferente (0,54 TP). Para a absorção, o SiLF apresentou o maior valor (25,66 µg /mm3). Em relação a solubilidade, todos os grupos foram diferentes entre si ( F >
a estrutura dentária e alterar as propriedades físico-químicas, ópticas, bem como os parâmetros de degradação hidrolítica dos compósitos.
Palavras-chave: compósitos restauradores remineralizantes, partículas nanoporosas, hidroxiapatita, materiais resposivos, fluoreto.
Reis DP. Synthesis and characterization of remineralizing restorative composites with silica-hydroxyapatite nanoporous fillers (Si-HAp) loaded with NaF [dissertation].
Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2017.
The purpose of this study was to synthesize and characterize remineralizing restorative composites with sintering silica-hydroxyapatite (Si-HAp) nanoporous fillers loaded with sodium fluoride (NaF). It were produced four experimental composites (SiLF, SiL, F and NT). In SiLF and F composites, the particles were previously immersed for 24 h in 10% NaF aqueous solution, and maintained for 7 days in a dryer at 40°C. Afterwards, SiLF and SiL composites had their particles silanized with y-methacryloxypropyl-1-trimethoxysilane. The particles of NT composite were not treated. Z350 (3M ESPE) nanocomposite was used as a commercial reference for the enamel remineralization analysis. The remineralizing potential was evaluated by using micro-CT. The following properties were characterized: degree of conversion (DC%), flexural strength (FS), Young’s modulus (YM), roughness (Ra), hardness (KHN), color (ΔE), translucency (TP), water sorption (Wsp), and water solubility (Wsl).
The remineralizing potential was statistically different for all groups (F > SiLF > NT >
SiL). The NT showed the highest DC% (63,84%). SiLF and F showed lower FS and YM than SiL and NT. The highest roughness was presented by SiLF (1,68µm). No significant difference in Ra and ΔE was found for all composites. NT presented the highest translucency (TP = 0,54). The highest Wsp was presented by SiLF (25,66 µg / mm³). Wsl was as follow: F > SiLF > SiL > NT). It was concluded that the treatment of Si- HAp particles with NaF improved the enamel remineralization.
Keywords: resin-based composites remineralizing, nano-porous fillers, hydroxyapatite, responsive materials, fluoride.
1 - INTRODUÇÃO
Desde o desenvolvimento dos compósitos restauradores o emprego deste tipo de material na prática clínica vem aumentando de forma exponencial.[1, 2]
Compósitos restauradores são constituídos basicamente de uma matriz orgânica constituída de monômeros metacrílicos, partículas inorgânicas de carga (vidros sintéticos e alótropos da sílica) e de um agente de união organo-silano que estabelece ligações químicas entre a matriz e as partículas de carga. No entanto, apesar de apresentar vantagens tais como a capacidade de mimetizar as características ópticas dos tecidos dentais perdidos bem como o controle de sua reação de polimerização através de um processo de fotoativação, estes materiais ainda apresentam limitações relativas ao desempenho clínico, principalmente em relação ao alto índice de formação de cáries secundárias na interface dente- compósito.[3, 4] Em consequência, estudos recentes têm sugerido inovações no sentido de melhorar o desempenho dessa classe de material restaurador.[5-7]
Diferentes estratégias, tais como a incorporação de monômeros antimicrobianos e a introdução de partículas de carga bioativas são sugeridas para maximizar o desempenho destes materiais [8]. Neste campo, destaca-se o desenvolvimento de materiais com nanopartículas bioativas capazes de liberar altas concentrações de íons Ca2+, PO43- e F- para promover a remineralização da dentina e do esmalte atacados por ácidos orgânicos produzidos pelo biofilme oral, [9-12]. Nos últimos anos, materiais com partículas mesoporosas têm sido desenvolvidos para aplicação em diversas áreas biomédicas.[13-17]. Estas partículas permitem a produção de estruturas hierarquizadas em termos de tamanho, com grande área de superfície, canais nanométricos e topografia porosa, aspectos que introduzem vantagens como a maior interação através de interfaces com matrizes orgânicas e potencial para carreamento, bem como liberação controlada de substâncias bioativas.[18] Samuel et al [19]. sintetizaram e avaliaram compósitos experimentais com partículas mesoporosas e não porosas de sílica e concluíram que a combinação destas partículas poderia produzir compósitos restauradores com valores elevados de propriedades mecânicas. Mais recentemente Atai et al. [20] também mostraram que os compósitos experimentais com partículas nanoporosas de sílica com 12nm, produzidas através de um processo de
sinterização, apresentaram um maior valor de resistência à flexão, módulo de elasticidade e resistência à fratura quando comparado com um compósito microparticulado.
Devido às freqüentes mudanças de pH existentes no ambiente oral, o mecanismo de ação dos biomateriais restauradores carregados com partículas de fosfato de cálcio ocorre pela liberação de Ca² + e PO4³- que supersaturam o meio, incorporando-se à matriz do esmalte, Aumentando assim sua resistência contra os ácidos produzidos pelo biofilme oral cariogênico.[21, 22]
Outro fator que contribui substancialmente para diminuir o risco de cárie é o aumento da disponibilidade de F- na cavidade oral. Assim, o desenvolvimento e o uso de compósitos capazes de liberar altos níveis de Ca² +, PO4³ e F- podem prevenir o desenvolvimento de cárie nas interfaces dente-restauração, bem como induzir a remineralização dos tecidos dentários duros expostos aos ácidos bacterianos. [23]
Os estudos anteriores envolvendo o desenvolvimento de compósitos remineralizantes contendo partículas de carga de fosfato de cálcio utilizaram partículas na escala micrométrica.[24-26] No entanto, com a introdução da nanotecnologia na odontologia [27-29] novos estudos com compósitos carregados com diferentes nanopartículas de fosfato de cálcio têm mostrado resultados promissores quanto à remineralização do esmalte.[30, 31] A principal vantagem dessas nanopartículas é a libertação eficaz de Ca² + e PO4³- devido à sua elevada área de superfície em relação ao volume.
Portanto, o objetivo do presente estudo foi sintetizar compósitos restauradores remineralizantes com sinterização de partículas nanoporosas de sílica-hidroxiapatita (Si-HAp) carregados com fluoreto de sódio (NaF) e caracterizar suas propriedades físico-químicas. As hipóteses avaliadas foram: 1) Os compósitos carregados com flúor irão remineralizar o esmalte previamente cariado por biofilme, adjacente as restaurações, 2) a silanização das partículas não influenciará na remineralização do esmalte e 3) a silanização das partículas não influenciará as propriedades físico-químicas dos compósitos.
2 – METODOLOGIA
2.1) Produção das partículas mesoporosas de Si-HAp
Nanopartículas de sílica de 40 nm (Aerosil OX 50, Evonik, USA) e hidroxiapatita cristalina de 20 nm [(sintetizadas no Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas – (CBPF, Rio de Janeiro, Brasil )] na proporção de 50/50 %p/p foram previamente tratadas com acetona p.a. (Sigma Aldrich Chemical, Inc Milwaukee, WI, EUA) e agitadas em agitador magnético Q261A11(Quimis, Rio de Janeiro, Brasil) por vinte minutos, a fim de diminuir a sua agregação. Em seguida, foram sinterizadas por 15 min a 900 °C, com taxa de aquecimento de 20 °C / min. Após, os blocos sinterizados foram triturados por 30 minutos em micronizador (Glen Creston – McCrone Micronising Mill. Londres, Reino Unido) para obtenção de partículas mesoporosas de Si-HAp nanométricas. A comprovação da estrutura mesoporosa das partículas foi observada por microscopia eletrônica de transmissão JEM-2100F (JEOL LTD., Japão) e pelo método multiponto Brunauer-Emmett-Teller (BET).
2.1.1) Microscopia eletrônico de transmissão (MET)
As partículas de Si-HAp foram preparadas com acetona em temperatura ambiente a fim de diminuir a sua aglomeração e foram gotejadas sobre grades de cobre com filme de carbono amorfo. Posteriormente, a amostra foi inserida em um porta-amostras. O Microscópio JEM-2100 LaB6 TEM, foi operado em a 200 kV, com 0,25 nm de resolução ponto a ponto. Este microscópio estava equipado com duas câmeras para o registro de imagens: ES 500W modelo 782 e Câmera MultiScan modelo 794 (Gata. , Inc.). A primeira câmera é dedica para o registro de vídeos e aquisição de imagens a baixa e intermédia magnificação. A segunda câmera é dedica para o registro de imagens de alta resolução. Para aquisição e processamento das imagens em alta resolução, foram utilizadas câmeras digitais acopladas ao JEM-2100. Os quadros (frames) foram extraídos usando-se programas
computacionais, analisados utilizando-se as ferramentas do DigitalMicrographTM (Gatan Inc.) e interpretados usando-se o Java Electron Microscopy Software (JEMS).
2.1.2 ) Análises de Brunauer, Emmett e Teller (BET)
O equipamento Accelerated Surface Area and Porosimetry (ASAP 2020, Micrometrics) na temperatura de N2 líquido foi utilizado para realizar as análises do BET. A amostra calcinada foi acondicionada em mufla a 200°C durante 4 h com uma taxa de aquecimento de 10 °C/min e resfriadas até 140ºC por 6 horas.
Posteriormente, foi acondicionada sob vácuo (aproximadamente 4 μHg) a temperatura ambiente e em seguida foi elevada a 240 °C até atingir novamente a pressão de aproximadamente 4 μHg, para a completa eliminação de H2O. A análise consistiu na determinação da área específica pelo método multi ponto Brunauer- Emmett-Teller (BET) e as isotermas foram geradas a partir de 40 pontos de adsorção e 40 pontos de dessorção. O volume dos poros foi determinado pelo método Barrett-Joyner-Halenda (BJH).
2.2 ) Síntese dos Compósitos Experimentais
Quatro compósitos experimentais foram manipulados (Tabela 1). A matriz polimérica para todos os materiais foi composta de Bis-GMA/TEGDMA (70/30 %p/p) (ESSTECH, Inc, EUA). Os compósitos tiveram 40 %p/p de matriz e 60 %p/p de partículas mesoporosas de Si-HAp. Em dois compósitos (SiLF e F), as partículas foram imersas durante 24 h em solução aquosa de NaF na concentração de 10% e secas durante 7 dias em estufa a 40 °C (Q317M, Quimis, Rio de Janeiro,Brasil). A seguir, as partículas de dois compósitos (SiLF e SiL) foram silanizadas com γ- metacriloxipropil-1-trimetoxisilano (α-MPS), (sigma aldrich, EUA). O fluoreto de sódio foi diluído em água deionizada, a mistura foi levanda a uma temperatura de 60 ºC por 30 minutos, para que todo o sal fosse dissolvido, obtendo uma solução homogênea e sem que houvesse a precipitação do NaF.
A silanização das partículas foi realizada de acordo com a metodologia de Chen & Brauer.[32 ] A quantidade de silano mínima para cobrir as partículas de carga (X) foi calculada através da seguinte equação:
Onde, A é a área de superfície de 1g da partícula de sílica e hidroxiapatita (BET das partículas Si/HA = 18 m2 g-1
), ω é a área de superfície de cobertura por grama do silano (MPTS = 2525 m2
g-1
), e f é a quantidade de partículas de sílica e hidroxiapatita (com diâmetro médio de 20nm em gramas).
As partículas de Si-HAp, o silano, o solvente (cyclohexano, 100 ml) e n- propylamina (0,1 ± 0,01 g) foram misturados em temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, a uma temperatura 60 ± 5 ºC por mais 30 minutos em agitador magnético (Modelo Q261A11- Quimis, Rio de Janeiro, Brasil). A mistura foi então colocada em um evaporador rotativo (Modelo G344B1 – Quimis, Rio de Janeiro, Brasil) para remoção do solvente e volatilização do s subprodutos com temperatura de 60 ± 5 ºC até restar apenas o produto seco. O pó resultante foi então aquecido a 90 ± 5 ºC por 1 hora no evaporador rotativo para condensação do silano na superfície das partículas e, finalmente, seco em estufa (Modelo Q317M- 22 – Quimis, Rio de Janeiro, Brasil) a 50 ºC por 48 horas. O compósito NT não recebeu o tratamento prévio de suas partículas, sendo o grupo controle.
Tabela 1 - Composição dos compósitos experimentais.
Compósito Tratamento superficial das partículas de silica-hidroxiapatita SiLF Silanização + Tratamento das partículas com NaF a 10%
SiL Silanização
F Tratamento das partículas com NaF a 10%
NT Sem tratamento superficial
Finalmente, o fotoiniciador (canforoquinona = 0,5 %p/p) e o agente redutor etil N,N-dimetil-4aminobenzoato (EDMAB = 1,0 %p/p) (Aldrich Chemical, Inc., Milwaukee, WI, EUA) foram adicionados e os compósitos foram centrifugados usando três ciclos de 1 min de 1500 rpm (DAC 140.1 FVZ SpeedMixer (FlackTek Inc., Herrliberg, Germany). O nanocompósito Z350 (3M, ESPE, St Paul, MN, EUA) foi utilizado como controle comercial para análises da remineralização.
Todos os espécimes no presente estudo foram fotopolimerizados com uma unidade de luz LED (Radii-Cal, SDI, Victoria, Austrália) usando uma irradiância de 650 mW / cm2 durante 40 s.
2.3) Avaliação do Potencial Remineralizante
2.3.1) Preparo das cavidades
Vinte e cinco molares humanos livres de cárie tiveram as raízes removidas na junção amelocementária e as coroas seccionadas no sentido mesiodistal (Isomet 1000, Büehler, EUA). Cavidades cilíndricas ( = 2 e profundidade = 1,5 mm) foram confeccionadas nas superfícies vestibular e palatina / lingual dos fragmentos produzidos, utilizando a ponta diamantada 2294 (KG Sorensen, Cotia - SP - Brasil).
Em uma peça de mão de alta velocidade fixada em um dispositivo especial de alinhamento de amostras. Posteriormente as cavidades foram divididas aleatoriamente em cinco grupos (n = 10), de acordo com os cinco compósitos testados. Em seguida, os fragmentos dos dentes foram imersos em água deionizada, secos com papel absorvente, hibridizados com ácido fosfórico 37%
(FGM, Joinville - SC - Brasil) por 15 s e com Adper Single Bond 2 (3M, St Paul, MN, EUA) conforme as instruções do fabricante e as cavidades foram restauradas em incremento único com os compósitos experimentais e fotopolimerizados.
2.3.2) Indução do biofilme nos espécimes
Os fragmentos dentais com as cavidades (antes da restauração), foram esterilizados com óxido de etileno e colocados em placas de 24 poços (TPP, 24 ZellkulturFestplatte F), com a superfície das cavidades voltada para cima. S. mutans ATCC 25175 (American Type Culture Collection, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) foi cultivado em 20 ml de infusão de cérebro coração (Brain Heart Infusion - Difco, Sparks, EUA), o caldo foi suplementado com sacarose a 2% a 37 ° C em condição anaeróbia por 24 h. Depois, ajustou-se a suspensão bacteriana a uma densidade óptica de 0,5 a 550 nm utilizando um Espectrofotómetro UV / Vis (Beckman Coulter DU® 530, LifeScience, San Diego, CA, EUA) de acordo com a escala McFarland (Biomérieux Brazil SA, RJ , Brasil). A suspensão foi diluída a 1: 100. Foram adicionados 10 μl desta suspensão a cada poço, contendo um fragmento de dente, com 2 ml de caldo BHI suplementado com 2% de sacarose [33]. As placas de 24 poços foram incubadas a 37 ° C numa condição anaeróbia durante 72 h. Durante os sete dias de formação do biofilme, o meio de crescimento foi trocado a cada 24 h.
2.3.4) Ciclagem de pH.
Metade de cada restauração e esmalte adjacente foram cobertos com verniz ácido resistente e os fragmentos submetidos a ciclagem de pH durante 15 dias:
imersão alternada em solução desmineralizante (1h): 3,0 mmol/L de CaCl2, 1,8 mmol/L de KH2PO4, 0,1 mmol/L de ácido lático e 1% de carboximetilcelulose, pH = 4,0. E remineralizante (23 h): 1,2 mmol/L de CaCl2, 0,72 mmol/L de K2HPO4, 2,6 μmol/L de NaF e 50 mmol/L de tampão TRIS, pH = 7 .Cada fragmento foi imerso em 20 mL de cada solução, mantidas a 37°C e trocadas diariamente.
Figura 1: Esquema que descreve a preparação dos espécimes. Procedimentos realizados antes e após a formação do biofilme e ciclagem Des-Re. Esses procedimentos antecederam a aquisição das imagens através do micro-CT e da avaliação dos perfis de densidade. A área não coberta dos espécimes (esmalte/restauração), ficou exposta e em contato direto com as soluções desmineralizante e remineralizante; 1 hora e 23 horas respectivante.
2.4) Avaliação do conteúdo mineral das lesões
2.4.1 ) Procedimentos de aquisição e reconstrução em micro-CT
Os espécimes foram escaneados em micro-CT de alta energia (Skyscan 1173, Bruker micro-CT, Kontich, Bélgica). Os espécimes foram envoltos em parafilm™ durante os procedimentos de escaneamento para evitar a desidratação excessiva. Os parâmetros de aquisição foram: 70 kV, 114 μA, tamanho de matriz do detector 2240x2240 pixels, tamanho de pixel de 8,19 μm, filtro de Al de 1 mm de espessura, tempo de exposição de 1 segundo, passo de rotação de 0,5° em 360°, média de quadro de 5, movimentos aleatórios de 40. O tempo de escaneamento foi de aproximadamente 85 minutos para cada espécime.
Após a aquisição, as secções transversais foram reconstruídas através de um software próprio (NRecon, Bruker) utilizando parâmetros pré-selecionado:
redução de artefato de anel de 10, correção de beam hardening de 75%, sem filtros de redução de ruído e entrada de mínimo (0) e máximo (0,15) de limite de contraste.
2.4.1.1) Avaliação dos perfis de densidade
O conteúdo mineral das lesões foi avaliado através de perfis de densidade, ou seja, medindas em tons de cinza. A imagem reconstruída foi importada para uma interface de software de visualização 3D (Dataviewer, Bruker) e um volume de interesse (VOI), passando pelo meio da restauração com uma espessura de 2,5 mm ( Figura 2 A). A imagem foi importada para o software ImageJ (implementação FIJI) e dez fatias foram selecionadas para avaliação de perfis de densidade. A Figura 2 B mostra uma das fatias avaliadas. Em cada fatia selecionada, foram obtidos dois perfis de valores de densidade ao longo de uma linha (um na região exposta e um na região coberta do esmalte). Os perfis foram tomados em cada pixel a partir da superfície do esmalte até 250 μm de profundidade na camada de esmalte.
Figura 2: (A) Representação 3D de um espécime mostrando a restauração de compósito (z350 Filtek) no centro e sua relação com o esmalte e a dentina. O retângulo amarelo pontilhado mostra o VOI selecionado e o retângulo vermelho pontilhado mostra o plano de corte para a imagem em B. (B) Fatia de Micro-CT passando pelo meio da restauração de compósito (corte coronal). A linha vermelha descreve a região do esmalte coberto enquanto a linha verde mostra o esmalte exposto ao ciclo do pH. Ambas as linhas mostram o trajeto onde os valores da densidade mineral foram analisados. As setas brancas mostram lesões cariosas. Seta preta aponta para o tecido dentinário cariado.
2.5) Caracterização Físico-Química
2.5.1) Grau de conversão Monomérica (GC%)
Os incrementos de cada compósito foram inseridos em um molde de teflon (0,785 mm3) posicionado sobre um cristal ATR do espectrómetro FT-IR (Alpha-P/
Platinum ATR Module, Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Alemanha) e os espectros entre 1600 e 1800 cm-1 foram registados com 120 scans a uma resolução de 4 cm-1. Posteriormente, os incrementos foram fotopolimerizados e os espectros foram novamente registados (n = 5). O GC% foi calculado a partir da razão entre a área integral das bandas de absorção da ligação C = C alifática (1638 cm-1) e da ligação aromática C = C (1608 cm-1), utilizada como padrão interno, que foram obtidos a partir dos incrementos fotopolimerizados e não fotopolimerizados, utilizando a seguinte equação:
aliphaticC C aromaticC C uncured cured C aromaticC C
aliphaticC x
GC ( )/( )
) /(
) 1 (
100
%
2.5.2) Resistência à Flexão (RF) e Módulo de Elasticidade (ME)
Foram preparados 10 espécimes em forma de barra para cada compósito experimental. O compósito foi inserido em incremento único em um molde de aço inoxidável com dimensões de 10 mm x 2 mm x 1 mm, que foi posicionado sobre uma lâmina de vidro. Depois do molde ter sido coberto com uma tira de poliéster e outra lâmina de vidro, os compósitos foram fotololimerizados dos lados superior e inferior utilizando um regime de sobreposição. Os espécimes foram polidos com papel de SiC de 1200 e 4000 grãos, armazenados em água destilada a 37 ° C por 24 h e submetidos a teste de flexão em três pontos em uma máquina de ensaio universal (DL 2000, EMIC, SP) com 6 mm a uma velocidade de 1 mm / min. A resistência à
flexão (RF) em MPa e o módulo de elasticidade (ME) em GPa foram calculados usando as seguintes equações:
2 2
3 wh RF lF
d wh ME Fl3
3
4
onde l é a distância (mm) entre os pontos inferiores, F a carga (N) aplicada no momento da ruptura do espécime, h a altura (mm) do espécime, w a largura do espécime e d a deflexão (mm) do espécime, sobre a carga F, durante o regime elástico.
2.5.3) Rugosidade
Foram confeccionados cinco espécimes cilíndricos (8,0 mm de diâmetro x 2,0 mm de espessura) para cada compósito experimental. O compósito foi inserido em incremento único em um molde de aço inoxidável, que foi posicionado sobre uma lâmina de vidro. Após o molde ter sido coberto com uma tira de poliéster e outra lâmina de vidro, os compósitos foram fotopolimerizados dos lados, superior e inferior. Após a fotopolimerização, as superfícies superiores dos espécimes foram polidas com papel de SiC de 1200, 2500 e 4000 grânulos a 250 rpm durante 60 s em cada papel (DPU-10, Struers, Copenhagen, Dinamarca). Todos os espécimes tiveram sua rugosidade superficial avaliada usando um rugosímetro digital com resolução de 0,01 µm (Surftest SJ 201, Mitutoyo, Tóquio, Japão).
Foram registados quatro traços de rugosidade espaçados a 45 °, com um ponto de corte de 0,8 mm e uma velocidade de 0,1 mm / s, para cada espécime e foi determinada a rugosidade média da superfície (Ra - μm). O parâmetro Ra foi obtido utilizando a seguinte fórmula:
L
a f x dx
R L
0 ( )
1
Onde a curva de rugosidade é expressa em y = f (x) e L é o cumprimento total da medição. A rugosidade de cada espécime foi considerada como a média aritmética das quatro medidas.
2.5.4 ) Dureza (KHN)
Para cada compósito experimental foram confeccionados cinco espécimes cilíndricos (2,0 mm de diâmetro x 3,0 mm de espessura). O compósito foi inserido em incremento único em um molde de aço inoxidável, que foi posicionado sobre uma lâmina de vidro. Após o molde ter sido coberto com uma tira de poliéster e outra lâmina de vidro, os compósitos foram fotopolimerizados dos lados, superior e inferior. Após a fotopolimerização, as superfícies superiores dos espécimes foram polidas com papel de SiC de 1200, 2500 e 4000 grãos a 250 rpm durante 60 s em cada papel (DPU-10, Struers, Copenhagen, Dinamarca). Foram feitas cinco indentações Knoop (25 g / 15 segundos), espaçadas a 200 μm, em cada amostra (Micromet 5104 - Full MHT software, Buëhler, Lake Bluff, IL EUA). As médias das cinco indentações foi tomadas como KHN para cada espécime.
2.5.5) Cor e Translucidez
Para cada compósito experimental foram confeccionados cinco espécimes cilíndricos (8,0 mm de diâmetro x 2,0 mm de espessura). O compósito foi inserido em incremento único em um molde de aço inoxidável, que foi posicionado sobre uma lâmina de vidro. Após o molde ter sido coberto com uma tira de poliéster e outra lâmina de vidro, os compósitos foram fotopolimerizados dos lados, superior e inferior. Após a fotopolimerização, as superfícies superiores dos espécimes foram polidas com papel de SiC de 1200, 2500 e 4000 grânulos a 250 rpm durante 60 s em cada papel (DPU-10, Struers, Copenhagen, Dinamarca). A cor e a translucidez
foram medidas de acordo com o sistema CIE L * a * b * utilizando um espectrofotômetro (modelo CM2600d, Konica Minolta Sensing Inc, Osaka, Japão).
Utilizou-se um iluminante D65 com um ângulo de entrada de 45 ° e uma geometria de ângulo de observação de 0 °. Antes da medição da cor, o espectrofotômetro foi calibrado de acordo com as instruções do fabricante, utilizando o padrão de calibração de branco fornecido. A fim de garantir a consistência das medições consecutivas e repetidas dos parâmetros CIE L * a * b *, foi desenvolvido um dispositivo que foi anexado com precisão na unidade de base do espectrofotômetro e onde os padrões cerâmicos de espectrofotometria branca e preta (Konica Minolta Sensing Inc, Osaka, Japão) foram posicionados. Este procedimento permitiu que a cor fosse consistentemente medida na área central e na mesma posição para todos os espécimes. Os valores L *, a * e b * de cada amostra foram medidos separadamente em triplicata contra o fundo branco e preto. A variação de cor (ΔE) para cada amostra foi calculada a partir dos valores médios ΔL *, Δa *, Δb *, obtidos contra o fundo branco, utilizando a seguinte fórmula:
2 / 1 2 2
2 ( *) ( *) ]
*)
[( L a b
E
,
Onde ΔL*, Δa*, Δb* são as diferenças entre os parâmetros L*, a* e b* obtidos em cada aferição.
A translucidez (TP) foi aferida através da seguinte equação:
Onde as letras B e W representam as medidas realizadas sobre os padrões espectrofotométricos preto e branco, respectivamente.
2.5.6 ) Sorção de água (W sor) e Solubilidade em água (Wsol)
Foi preparado cinco espécimes cilíndricos em um molde dividido em aço inoxidável (6,0 mm em diâmetro e 1,0 mm de espessura) para cada compósito experimental. O molde foi colocado sobre uma lâmina de vidro e preenchido com o compósito. Depois de colocar uma tira de poliéster e outra lâmina de vidro sobre a matriz, o compósito foi comprimido durante 20 s com um dispositivo (500 g) para evitar porosidades e fotopolimerizado. Após a fotopolimerização, os espécimes foram colocados em um dessecador contendo gel de sílica desidratado e transferidos para uma estufa a 37 ° C. Após 24 h, os espécimes foram pesados diariamente utilizando uma balança analítica com uma precisão de 0,01 mg (AUW 220D, Shimadzu, Tóquio, Japão) até atingir uma massa constante (m1) (três dias consecutivos com uma variação de massa inferior a ± 0,01 mg ). A espessura eo diâmetro de cada espécime foram medidos em quatro pontos espaçados igualmente na circunferência utilizando um paquímetro digital (MPI / E-101, Mytutoyo, Tóquio, Japão) e o volume (V) foi calculado em mm3. Os espécimes foram então imersos individualmente em 10 mL de água destilada a 37 ° C durante sete dias e pesados na mesma balança analítica para se obter m2. Posteriormente, os espécimes foram submetidos ao mesmo processo descrito para se obter m1 até se obter uma nova massa constante (m3). A sorção de água (Asp) e a solubilidade em água (Asl), em μg / mm3, foram calculadas usando as seguintes equações:
As l= m1 - m3 V
As p= m2 - m3 V
3 - ARTIGO PRODUZIDO
Synthesis and characterization of remineralizing restorative composites with silica-hydroxyapatite nanoporous fillers (Si-HAp) loaded with NaF.
Dirciane Perpétuo Reis, PhD student1
Jaime Dutra Noronha Filho, Adjunct professor1 Aline de Almeida Neves, Adjunct professor2 Maristela Barbosa Portela, Adjunct professor3 Eduardo Moreira da Silva,Associate professor1,*
1Analitical Laboratory of Restorative Biomaterials – LABiom-R, School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
2Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
3Odontopediatric Division, School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
*Corresponding author: Dr. Eduardo Moreira da Silva – Universidade Federal Fluminense / Faculdade de Odontologia - Rua Mário Santos Braga, nº 30 - Campus Valonguinho, Centro, Niterói, RJ, Brazil - CEP 24040-110 - Phone: 55 21 2629-9832 - Fax: 55 21 2622-5739 - e-mail: [email protected]
ABSTRACT
The purpose of this study was to synthesize and characterize remineralizing restorative composites with sintering silica-hydroxyapatite (Si-HAp) nanoporous fillers loaded with sodium fluoride (NaF). It was produced four experimental composites (SiLF, SiL, F and NT). In SiLF and F composites, the particles were previously immersed for 24 h in 10% NaF aqueous solution, and maintained for 7 days in a dryer at 40°C. Afterwards, SiLF and SiL composites had their particles silanized with y-methacryloxypropyl-1-trimethoxysilane. The particles of NT composite were not treated. Z350 (3M ESPE) nanocomposite was used as a commercial reference for the enamel remineralization analysis. The remineralizing potential was evaluated by using micro-CT. The following properties were characterized: degree of conversion (DC%), flexural strength (FS), Young’s modulus (YM), roughness (Ra), hardness (KHN), color (ΔE), translucency (TP), water sorption (Wsp), and water solubility (Wsl).
The remineralizing potential was statistically different for all groups (F > SiLF > NT >
SiL). The NT showed the highest DC% (63,84%). SiF and F showed lower FS and YM than SiL and NT. The highest roughness was presented by SiLF (1,68µm). No significant difference in Ra and ΔE was found for all composites. NT presented the highest translucency (TP = 0,54). The highest Wsp was presented by SiLF (25,66 µg / mm³). Wsl was as follow: F > SiLF > SiL > NT). It was concluded that the treatment of Si-HPa particles with NaF improved the enamel remineralization.
Keywords: resin composites, enamel remineralization, nanoporous fillers, hydroxyapatite, responsive materials, fluoride.
1. Introduction
Since the development of restorative composites, the use of this restorative biomaterial in the clinical practice has increased exponentially [1, 2]. Basically, dental composites consist of an organic matrix of dimethacrylate monomers, inorganic fillers and a silane-coupling agent that establishes chemical bonds between the matrix and the filler particles. However, irrespective of advantages such as the capacity to mimic the optical characteristics of the teeth, and the on demand polymerization reaction, which facilitates the reconstruction of the dental structures lost due to traumas or caries, these materials still present limitations related to their clinical performance, especially regarding the recurrent caries formation at the tooth-restoration interfaces [3, 4]. Consequently, recent studies have been suggested innovations in order to improve the performance of these restorative biomaterials [5-7].
Different strategies such as the incorporation of antibacterial monomers and the introduction of bioactive fillers are suggested to maximize the performance of these materials [8]. In this field, the development of composites with bioactive fillers capable of releasing high concentrations of Ca²+, PO4³- and F- able to promote the remineralization of the dentin and enamel attacked by organic acids produced by the oral biofilm is welcome [9-12]. In the last few years, materials with mesoporous fillers have been developed to be used in many biomedical areas [13-17]. These fillers allow the production of hierarchical structures in terms of length, with great surface area, nanometric channels and porous topography, aspects that shows advantages such as the highest interaction through interfaces with organic matrix and delivery potential, as well as controlled release of bioactive substances [18]. Samuel et al.
[19] synthesized and evaluated experimental composites with mesoporous and nano- porous fillers of silica and concluded that the combination of these fillers could produce restorative composites with optimal mechanical properties. More recently, Atai et al. [20] also showed that experimental composites with nanoporous silica fillers, produced through a sintering process, exhibited higher flexural strength, elastic modulus and fracture toughness than a microfilled composite.
Due to the frequent pH changes existing in the oral environment, the action mechanism of restorative biomaterials loaded with calcium phosphate particles occur through the release of Ca²+ and PO4³- that supersaturate the medium, incorporating
themselves to the enamel matrix, thereby enhancing it resistance against the acids produced by the cariogenic oral biofilm [21, 22]. Another factor that substantially contributes to diminish the caries risk is the increase in the availability of F- into the oral cavity. Thus, the development and the usage of composites capable of release high levels of Ca²+, PO4³- and F- might prevent the development of caries at the tooth-restoration interfaces, as well as to induce the remineralization of the hard dental tissues exposed to the bacterial acids [23].
The earlier studies involving the development of remineralizing composites containing calcium phosphate fillers have used microsized fillers particles [24-26].
However, with the introduction of the nanotechnology to the dentistry [27-29], new studies with composites loaded with different calcium phosphate nanofillers have been shown promising results regarding enamel remineralization [30, 31]. The main advantage of these nanofillers is the optimal release of Ca²+ and PO4³- due to their high surface area to volume ratio. Therefore, the purpose of the present study was to synthesize remineralizing restorative composites with sintering silica-hydroxyapatite (Si-HAp) nanoporous fillers loaded with sodium fluoride (NaF), and characterize their physicochemical properties. The tested hypotheses were: 1) the NaF-charged composites would remineralize carious lesions in enamel; 2) particles silanization would not influence the remineralizing potential of the composites and 3) particles silanization would not influence the physicochemical properties of the composites
2. Material and methods
2.1. Production of nanoporous Si-HAp fillers
Silica nanofillers of 40nm (Aerosil OX 50, Evonik, USA) mixed with crystal hydroxyapatite of 20 nm (synthesized at Physics Research Brazilian Centre - CBPF, Rio de Janeiro, Brazil) in an proportion of 50/50 wt.% were previously treated with acetone p.a. (Sigma Aldrich Chemical, Inc Milwaukee, WI, USA) and mixed for 20 min in an magnetic stirrer (Q261A11, Quimis, Rio de Janeiro, Brazil), in order to decrease Its agglomeration. Next, they were sintered for 15 min at 900 °C, with a heating rate of 20 °C / min. The sintered blocks were crushed for 30 min in a
micronizing mill (Glen Creston – McCrone Micronising Mill. Londres, Reino Unido) to obtain nanoporous Si-HAp nanofillers. The confirmation of the nanoporous structure of the fillers was observed by transmission electron microscopy – TEM – (JEM- 2100F, JEOL LTD., Japan) and by Multpoint Brunauer-Emmett-Teller (BET) method.
2.1.1. Transmission electron microscopy (TEM)
The Si-HAp fillers were dissolved in acetone at room temperature in order to decrease its agglomeration and dripped over the copper grids with amorphous carbon film. After, the sample was inserted into a sample-holder. The JEM-2100 microscopy, was handled at 200 kV, with 0,25 nm of point to point resolution. This microscopy was equipped with two cameras to the record of the images: ES 500W Model 782 and MultiScan Camera model 794 (Gatan, Inc.). The first camera is dedicated to video record and acquisition of images in low and intermediate magnification. The second camera is dedicated to high-resolution images record. To acquire and process the images in high resolution, it was used digital cameras attached to the JEM-2100. The frames were extracted using computer programs, analyzed on tools from DigitalMicrographTM (Gatan, Inc.) and interpreted using Java Electron Microscopy Software (JEMS).
2.1.2. Analysis of Brunauer, Emmett and Teller (BET)
An Accelerated Surface Area and Porosimetry Equipment (ASAP 2020, Micrometrics, Norcross, GA, USA) on Liquid N2 temperature was used to BET analysis. Calcined samples of each composite were packed in a muffle at 200 ºC for 4 h, with a heating rate of 10 °C/min and cooled to 140°C for 6 h. Latter, they were packed in vacuum (approximately 4 μHg) at room temperature and next it was raised to 240 °C until reaching the pressure of approximately 4 μHg again, in order to fully eliminate the H2O. The analysis consisted of determining the specific area by the mult-point BET, and the isothermals were generated from 40 points of adsorption and 40 points of desorption. The volume of pores was determined by the Barrett-Joyner- Halenda (BJH) method.
2.2. Synthesis of experimental composites
Four experimental resin composites were synthesized (Table 1). The organic matrix of all composites consisted of (wt.%): 2,2-Bis[p-(2’-hydroxyl-3’-methacryloxy propoxy)phenyl]propane (Bis-GMA) and triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA) (Essthec, Inc. Essington, PA, USA), with a mass ratio of 70:30. The composites had 40 wt.% of matrix and 60 wt.% of Si-HAp nanoporous fillers. In two composites (SiLF and F), the fillers were immersed during 24 h in 10% NaF aqueous solution, and maintained for 7 days in an dryer at 40 °C (Q317M, Quimis, Rio de Janeiro, Brazil).
Next, the fillers of two composites (SiLF and SiL) were silanized with α- methacryloxypropyl-1-trimethoxysilane (α-MPS). The sodium fluoride was diluted in deionized water, and the mixture was taken for 30 min at 60 °C until obtain a homogeneous solution without NaF precipitation.
The silanization of the particles were carried out using the method described by Chen & Brauer [32]. The minimum amount of silane used to cover the particles (X) was calculated according to the following equation:
Where A is the surface area of 1g of the Si-HAp fillers (BET of the Si-HAp fillers = 18 m².g-¹), ω is the surface area of coverage per 1 g of silane (MPTS = 2525 m².g-1) and f is the amount of silica and hydroxyapatite fillers with 20 nm average diameter per g.
The Si-HAp fillers, the silane, the solvent (cyclohexane, 100 mL) and n- propylamine (0.1 ± 0.01 g) were mixed at room temperature for 30 min, and then at 60 ºC for 30 min in a magnetic stirrer (Model Q261A11 – Quimis, Rio de Janeiro, Brazil). This mixture was placed in a rotating evaporator (Model G344B1 – Quimis, Rio de Janeiro, Brazil) at 60 ºC to volatilize the solvent and the subproducts, until only the dry products remained. The resulting powder was heated at 90 ºC for 1 h in the rotating evaporator to condensate the silane in the surface of the fillers and, finally, dried in a dryer (Model Q317M-22 – Quimis, Rio de Janeiro, Brazil) at 50ºC for
48 h. The NT filler did not receive the previous treatment of its particles, being the control group.
Table 1
Composition of the experimental composites.
Finally, the photosensitizer (camphorquinone = 0.5 wt.%) and the reducing agent (ethyl N, N-dimethyl- 4-aminobenzoato – EDMAB = 1.0 wt.%) (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA) were added and the composites were centrifuged using three one-minute cycles at 1500 rpm (DAC 150.1 FVZ SpeedMixer centrifuge, FlackTek Inc., Herrliberg, Germany). The nanocomposite (3M, ESPE, St Paul, MN, USA) was used as a commercial control to the enamel remineralization analysis.
All the specimens in the present study were light-cured with a LED light unit (Radii-Cal, SDI, Victoria, Australia) using an irradiance of 650 mW/cm2 for 40 s.
2.3. Remineralizing potential evaluation
Fig 1 illustrates the experimental setup of this part of the study.
Composite Si-HAp fillers surface treatment
SiLF Silanization + Treatment of fillers with 10% NaF SiL Silanization
F Treatament of fillers with 10% NaF NT No surface treatment
2.3.1. Preparation of cavities
Twenty-five caries free human molars had its roots removed at the cememtoenamel junction and the crowns were sectioned in the mesiodistal direction (Isomet 1000 precision saw, Buëhler, Lake Bluff, IL, USA). Cylindrical cavities ( = 2 mm, deep = 1.5 mm) were prepared in the bucal and palatine surfaces of each tooth fragment, using a diamod bur (#2294, KG Sorensen, Cotia - SP - Brazil) in a high-speed hand-piece fixed in a special sample aligning device. Afterwards the cavities were randomly divided into five groups (n = 10), according to the five tested composites.
Afterwards, the tooth fragments were immersed in deionzed water, dryed with tissue paper, hybridized with phosphoric acid 37% for 15 s (FGM, Joinville - SC - Brazil) and Adper Single Bond 2 (3M, St Paul, MN, USA) According to the manufacturer's instructions and the cavities were bulk restored with the experimental composites that were ligth-cured.
2.3.2. Biofilm induction on the specimens
The tooth fragments with the previously restored were cavities were sterilized with ethylene oxide and placed on 24-well plates (TPP, 24 ZellkulturFestplatte F), with the restoration surfaces facing up. S. mutans ATCC 25175 (American Type Culture Collection, Rio de Janeiro, RJ, Brazil) was cultured in 20 ml of brain heart infusion (BHI) (Difco, Sparks, USA) broth supplemented with 2 % sucrose at 37 °C in an anaerobic condition for 24 h. Afterwards, the bacterial suspension was adjusted to an optical density of 0.5 at 550 nm using an UV/Vis Spectrophotometer (Beckman Coulter DU® 530, LifeScience, San Diego, CA, USA) in accordance to the McFarland scale (Biomérieux Brazil S.A., RJ, Brazil). The suspension was diluted by 1:100. Ten µl of this suspension was added into each well, containing a tooth fragment, with 2 ml of BHI broth supplemented with 2 % sucrose [33]. The 24-well plates were incubated at 37 °C in an anaerobic condition for 72 h. During the seven days of the biofilm formation, the growth medium was changed every 24 h.
2.3.3. pH-cycling
Half of each restoration and subjacent enamel were protected with a acid- resistant varnish, and the fragments submitted to pH cycling for 15 days: Alternate immersion in demineralizing solution (1 h): 3.0 mmol/L of CaCl2, 1.8 mmol/L of KH2PO4, 0.1 mmol/L of lactic acid and 1% of carboxymethylcellulose, pH = 4.0, and Remineralizing solution (23 h): 1.2 mmol/L of CaCl2, 0.72 mmol/L of K2HPO4, 2.6 µmol/L of NaF and 50 mmol/L of buffer TRIS, pH = 7. Each fragment was immersed in 20 mL of each solution, kept at 37°C and changed daily.
Fig 1. Scheme describing the preparation of specimens. Procedures realized before and after the biofilm formation and Des-Re cycling. These procedures precede the acquisition of the images through micro-CT and evaluation of density profiles. The specimens uncovered area (enamel/restoration), have been exposed in direct contact to the demineralizing and remineralizing solutions; for 1 h and 23 h, respectively.
2.4. Evaluation of lesions mineral content
2.4.1. Micro-CT acquisition and reconstruction procedures
The specimens were scanned in a high energy micro-CT (Skyscan 1173, Bruker micro-CT, Kontich, Belgium). Specimens were wrapped in parafilm™ during the scanning procedures to avoid desiccation. Acquisition parameters included:
70kV, 114µA, detector size 2240 X 2240 pixels, 8.19µm pixel size, 1mm thick Al filter, 1s exposure time, 0.5° rotation step over 360°, frame averaging of 5, random movements of 40. Scanning time was approximately 85 minutes for each specimen.
After acquisition, cross-sections of each specimen were reconstructed using a proprietary software (NRecon, Bruker) using standardized parameters, namely: ring artifact correction of 10, 75% beam hardening correction, no noise reducing filters and input of minimum (0) and maximum (0.15) contrast limits.
2.4.1.1. Evaluation of density profiles
The mineral content of the lesions was evaluated by means of mineral density profiles. The reconstructed stack was imported into a 3D visualization software interface (Dataviewer, Bruker) and a volume of interest (VOI), at the center of the restoration ( 2.5mm thickness) was selected (Fig. 2 A). The selected VOI was imported in ImageJ (Fiji implementation) and ten slices were selected for evaluation of density profiles. Fig. 2 B shows one of the evaluated slices. In each selected slice, two profiles of density values along a path were obtained (one at the exposed and one at the covered enamel region). The profiles were taken at each pixel starting from the enamel surface up to 250µm deep into the enamel layer.
Fig 2. (A) 3D rendering of one specimen showing composite restoration at the center and its relation to enamel and dentin. Dotted yellow rectangle shows selected VOI and dotted red rectangle shows cut plane for image in B. (B) Micro-CT slice passing through the middle of the composite restoration (coronal cut). Red line depicts covered enamel region while green line shows enamel exposed to pH cycling. Both lines show path where mineral density values were taken. White arrows shows carious lesions. Black arrow points to the carious dentin tissue.
2.5. Physicochemical characterization
2.5.1. Degree of Conversion (DC%)
Increments of each resin composite were inserted into a teflon mold (0.785 mm3) positioned onto an ATR crystal of the FT-IR spectrometer (Alpha-P/Platinum ATR Module, Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany) and the spectra between 1600 and 1800 cm-1 were recorded with 120 scans at a resolution of 4 cm-1. Afterwards, the increments were light-cured and the spectra were recorded again (n = 5). The DC% was calculated from the ratio between the integrated area of absorption bands of the aliphatic C=C bond (1638 cm-1) to that of aromatic C=C bond (1608 cm-1), used as an internal standard, which were obtained from the cured and uncured increments, using the following equation:
aliphaticC C aromaticC C uncured cured C aromaticC C
aliphaticC x
DC ( )/( )
) /(
) 1 (
100
%
2.5.2. Flexural strength (FS) and Young’s Modulus (YM)
Ten bar-shaped specimens were prepared for each experimental composite. The composite was bulk inserted into a stainless-steel mold with 10 mm x 2 mm x 1 mm dimensions, which was positioned upon a glass slide. After the mold was covered with a polyester strip and another glass slide, composites were light-cured from the top and bottom sides using an overlapping regimen. The specimens were wet polished with 1200 and 4000 grit SiC paper, stored in distilled water at 37°C for 24 h and submitted to three-point bending test in an universal testing machine (DL 2000, EMIC, SP, Brazil) with 6 mm span, at a cross-head speed of 1 mm/min. The flexural strength (FS) in MPa and the Young’s modulus (YM) in GPa were calculated using the following equations:
FS= 3lF 2wh2
YM= Fl3 4wh3d
where l is the span (mm) between supports, F is the failure load (N), h is the height (mm), w is the width (mm) and d is the deflexion of specimen during elastic regimen.
2.5.3. Roughness (Ra)
Five disk-shaped specimens (8.0 mm in diameter x 2.0 mm in thickness) were constructed for each experimental composite. The composite was bulk inserted into a
stainless-steel mold, which was positioned upon a glass slide. After the mold was covered with a polyester strip and another glass slide, the composites were light- cured from the top and bottom sides. After light-curing, the top surfaces of the specimens were wet polished with 1200, 2500 and 4000 grit SiC paper at 250 rpm for 60 s in each paper (DPU-10, Struers, Copenhagen, Denmark). All of the specimens had their surface roughness evaluated using a surface roughness tester (Surftest SJ 201, Mitutoyo, Tokyo, Japan). Four traces of roughness spaced at 45°, with a 0.8 mm cutoff and a speed of 0.1 mm/s, were recorded for each specimen, and the average surface roughness (Ra - µm) was determined. The Ra parameter was obtained using the following formula:
L
a f x dx
R L
0 ( )
1
where L is the length of the section and ƒ(x) is the displacement function.
The roughness of every specimen was considered as the arithmetic average of the four measures.
2.5.4. Hardness (KHN)
Five disk-shaped specimens (2.0 mm in diameter x 3.0 mm in thickness) were prepared for each experimental composite. The composite was bulk inserted into a stainless-steel mould, which was positioned upon a glass slide, After the mold was covered with a polyester strip and another glass slide, the composites were light- cured from the top and bottom sides. After light-curing, the top surfaces of the specimens were wet polished with 1200, 2500 and 4000 grit SiC paper at 250 rpm for 60 s in each paper (DPU-10, Struers, Copenhagen, Denmark). Five Knoop indentations (25 g / 15 seconds), spaced 200 µm apart were made in each specimen (Micromet 5104 - Full MHT software, Buëhler, Lake Bluff, IL USA). The average five indentations were taken as the KHN for each specimen.
2.5.5. Color (E) and Translucency (TP)
Five disk-shaped specimens (8.0 mm in diameter x 2.0 mm in thickness) were prepared for each experimental composite. The composite was bulk inserted into a stainless-steel mould, which was positioned upon a glass slide, After the mold was covered with a polyester strip and another glass slide, the composites were light- cured from the top and bottom sides. After light-curing, the top surfaces of the specimens were wet polished with 1200, 2500 and 4000 grit SiC paper at 250 rpm for 60 s in each paper (DPU-10, Struers, Copenhagen, Denmark). The color and the translucency were measured according to the CIE L*a*b* system by using a spectrophotometer (model CM2600d, Konica Minolta Sensing Inc, Osaka, Japan). A D65 illuminant was used with a 45° entrance angle and 0° observation angle geometry. Before the color measurement, the spectrophotometer was calibrated according to the manufacturer instructions and using the provided white calibration standard. In order to guarantee the consistency of consecutive and repeated measurements of CIE L*a*b* parameters, a device was developed that was precisely attached to the base unit of the spectrophotometer and where a white and black spectrophotometry ceramic standard (Konica Minolta Sensing Inc, Osaka, Japan) were positioned. This procedure allowed the color to be consistently measured in the central area and at the same position for all the specimens. The L*, a* and b* values of each specimen were separately measured in triplicate against the white and the black background. The color change (∆E) for each specimen was calculated from the mean ∆L*, ∆a*, ∆b* values, obtained against the white background, using the following formula:
2 / 1 2 2
2 ( *) ( *) ]
*)
[( L a b
E
,
where ∆L*, ∆a*, ∆b* are the differences in L*, a* and b* coordinates obtained in each measurement
The translucency parameter (TP) was calculated using the following formula:
where the subscript B and W letters represent the measurements against the black and white backgrounds, respectively.
2.5.6. Water sorption (Wsp) and Water solubility (Wsl)
Five disk-shaped specimens were prepared in a stainless-steel split mold (6.0 mm in diamenter and 1.0 mm in thickness) for each experimental composite.
The mold was placed upon a glass slide and filled with the composite. After placing a polyester strip and another glass slide over the matrix, the composite was compressed for 20 s with a device (500 g) to avoid porosities, and then ligth-cured.
After light-curing, the specimens were placed in a desiccator containing dehydrated silica gel and transferrred to an oven at 37°C. After 24 h, the specimens were daily weighed using an analytical balance with a precision of 0.01 mg (AUW 220D, Shimadzu, Tokyo, Japan) until reach a constant mass (m1) (three consecutive days with a mass variation less than ± 0.01 mg). The thickness and the diameter of each specimen was measured at four points spaced equally at circumference using a digital caliper (MPI/E-101, Mytutoyo, Tokyo, Japan) and the volume (V) was calculated in mm3. The specimens were then individually immersed in 10 mL of distilled water at 37°C for seven days and weighed in the same analytical balance to obtain m2. Afterwards, the specimens were submmited to the same process described to obtain m1 until a new constant mass was achieved (m3). Water sorption (Wsp) and water solubility (Wsl), in µg/mm3, were calculated using the following equations:
2.6. Statistical Analyses
The obtained data were analyzed using the Statgraphics Centurion XVI software (STATPOINT Technologies, INC, EUA). Initially, the normal distribution of errors and the homogeneity of variances were checked by Shapiro-Wilk’s test and Levene’s test. Based on these preliminary analyses, each variable was separately analyzed using one-way ANOVA and Tukey’s HSD post-hoc test. All analyses were performed at a significance level of α = 0.05.
3. Results
TEM analysis revealed the nanoporous structure of the sintered Si-HAp particles was clearly nanoporous (Fig. 3). Figures 3A and 3B show agglomerates of primary spherical silica and irregular hydroxyapatite particles after the sintering process. In a closer view (images 3C and 3D), its observed more detailed the nanometric characteristics (about 20 nm) of the particles of silica and hydroxyapatite.
Fig 3. Representative TEM images of sintered Si-HAp particles; (A and B) Si-HAp agglomerates; (C) closer view where it is observed a 20 nm spherical Si Particle; and (D) HAp particles with porous aspect.
Fig 4 shows the result of BET analysis. The surface area of the sintered Si- HAp particles calculated using the BJH method was 18 m²/g. Their nano-porous size calculated using the same method was 749 Å. These parameters characterize the Si- HAp structure as nanoporous and suitable to be loaded with NaF.
Fig 4. Isothermal adsorption-desorption and porous distribution: Si-HAp. The BET of the Si-HAp particles was made to confirm the porosities as well as the pore sizes of the hydroxyapatite nanofillers. Resulting in the confirmation of a surface around 18 m² / g and porosity of 749Å.
The results obtained by the acquisition of the images by the micro-CT and the analysis of the density profiles showed that the composites SiLF and F (NaF- loaded) promoted significant lower mineral loss in enamel than the composites without NaF (SiL and NT), (Fig. 5). The composite SiL presented the worst result regarding mineral loss (258.0 Vol%.Pixel), behaving in a similar way to Filtek Z350.
The lowest mineral loss was presented by F (- 574.4 µm Vol%.Pixel). All values of mineral loss were statistically different from each other SiL > NT > SiLF > F (ANOVA, Tukey HSD, p < 0.05)
To calculate the degree of demineralization / remineralization, the covered Z - exposed Z = ΔZ was used (mineral variation– Vol%.Pixel). The exposed area was in direct contact with the solutions used in the pH-cycling and, at the end of the cycle, when the SiLF and F composites were used, these exposed areas had a lower degree of enamel demineralization.
-400 -300 -200 -100 0 100 200 300 400 500 600 700
SiLF SIL F NT Z350
MINERAL VARIATION
Degree of Remineralization
Fig. 5 Remineralization of human enamel lesions after the pH-cycling. All the values are significantly different from each other (Tukey´s HSD, p < 0.05).
The results of the degree of conversion, flexural strength, Young’s modulus and roughness are summarized in Table 2. Regarding degree of conversion, one- way ANOVA detected statistically significant difference among the composites (p=0.0014), with the values of NT (63.8%) and SiLF (56.3%) being different from each other. With respect to flexural strength, there was statistical difference between groups (p < 0.05%). NT (80.2 MPa) and SiL (66.1 MPa) showed similar and highest flexural strength than SiLF (40.0 MPa) and F (41.1 MPa), which were not different from each other. Similarly, the Young’s modulus of SiL (6.9 GPa) and NT (7.0 GPa) were also similar and highest than those of SiLF (1.5 GPa) and F (1.5 GPa). SiLF presented the highest roughness (1.7 m), followed by F (1.4 m), (p < 0.05). The roughness of SiL (0,1 µm) and NT (0,1 µm) were not statistically different from each other (p > 0.05). It was not found statistical significance for hardness among the composites (p=0.3861).
