UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CÂMPUS DE JABOTICABAL
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE
unesp
DISCIPLINA – ECOTOXICOLOGIA
6a. Aula – Ensaios de avaliação de toxicidade aguda para organismos
bioindicadores terrestres de contaminação ambiental (minhocas)
Doutoranda Ana Carla Coleone de Carvalho - Assistente de Suporte Acadêmico II Dr. Joaquim Gonçalves Machado Neto - Prof. Responsável
6A. AULA ECOTOXICOLOGIA
1 - Introdução ecotoxicologia
2 - Bioindicadores terrestres: minhocas
3 - Toxicologia regulamentadora – (Registro)
4 – Testes toxicidade - minhocas
•
Termo “Ecotoxicologia” – criado em 1969 pelo Dr. Rene Truhaut;
Ecotoxicologia: estudo dos efeitos adversos de
substâncias químicas com o objetivo de proteger
espécies naturais e populações
(TRUHAUT, 1977).Ensaios ecotoxicológicos: testes que utilizam diferentes tipos de
organismos vivos representativos no ambiente para analisar os efeitos que
substâncias podem ter sobre eles
(RUBINGER, 2009).ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS
ou
BIOENSAIOS
:
São realizados para detectar a
toxicidade
de
efluentes
, determinar o grau,
ou o
efeito biológico
, de novos produtos químicos (ex.: produtos
farmacêuticos, etc.) - a cada dia mais lançados no meio ambiente, o que
podem causar nos indivíduos, nas comunidades e populações, para se evitar
as crises epidemiológicas e afins.
ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS
:
São realizados por métodos de
comparação entre uma substância "genérica" já conhecida
e a nova
substância desconhecida
,
para identificar os efeitos que as mesmas
causam quando inseridas no meio de cultura de células vivas
.
Na atualidade, substâncias químicas
desconhecidas são produzidas de forma
intencional ou como subprodutos de determinadas
atividades produtivas e necessitam de análise.
OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.
Agudos:
São "estudos experimentais feitos com
organismos-teste
que determinam se um
efeito adverso observado
ocorre em
um
curto período
de tempo (em geral até 14 dias) após
administração de
uma única dose
da substância testada ou após
OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.
Crônicos:
“Os organismos-teste
são observados durante uma
grande parte do tempo de vida
, quando acontece a exposição
ao agente-teste; os
efeitos crônicos persistem por um longo
período de tempo
, e podem ser evidentes imediatamente após
a exposição ou não”.
IMPORTÂNCIA
*OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER
UTILIZADOS PARA:
• Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes
líquidos;
• Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas;
• Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes
líquidos em corpos hídricos
(ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).IMPORTÂNCIA
*OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER
UTILIZADOS PARA:
• Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes
líquidos;
• Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas;
• Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes
líquidos em corpos hídricos
(ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).IMPORTÂNCIA
*OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER
UTILIZADOS PARA:
• Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes
líquidos;
• Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas;
• Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes
líquidos em corpos hídricos
(ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).IMPORTÂNCIA
• Avaliar a necessidade de tratamento de efluentes líquidos quanto
as exigências de controle ambiental;
• Avaliar a qualidade das águas (complementam a análise
físico-química dos laboratórios);
• Avaliar a sensibilidade relativa de organismos aquáticos;
• Estimar os impactos provocados em acidentes ambientais
(ARAGÃO
e ARAÚJO, 2006).
Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos
•Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.
•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,
dureza da água, etc.
•Duração do Ensaio
•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi
estáticos, de fluxo continuo).
Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos
•Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.
•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,
dureza da água, etc.
•Duração do Ensaio
•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi
estáticos, de fluxo continuo).
Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos
•Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.
•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,
dureza da água, etc.
•Duração do Ensaio
•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi
estáticos, de fluxo continuo).
Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos
•Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.
•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,
dureza da água, etc.
•Duração do Ensaio
•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi
estáticos, de fluxo continuo).
A suscetibilidade está ligada ao aparato
metabólico
de
cada
espécie
,
mas depende:
Comportamento, alimentação, modo de vida,
fases de desenvolvimento, etc.
IMPORTÂNCIA DAS MINHOCAS PARA O SOLO E VEGETAIS
RESTOS ORGÂNICOS NO SOLO (ANIMAIS E VEGETAIS) Nutrientes Microrg. úteis Penetração de ar no solo Penetração e retenção de água no solo VEGETAIS
GALERIAS FEZES DETRITÍVORAS - MORTOS
40% a 90% da biomassa de macrofauna da maioria dos ecossistemas tropicais (Fragoso et al. 1999) < Erosão do solo Homogenização do solo
FATORES LIMITANTES DO
CRESCIMENTO DAS MINHOCAS
- Umidade
- Matéria Orgânica em decomposição
POPULAÇÃO DE MINHOCAS NOS SOLOS
DE BOA PASTAGEM (MEINICKE, 1993)
- ADULTAS – 800/m
2, Peso = 400 g/m
2TOXICOLOGIA REGULAMENTADORA – (Registro )
Baseada em dados obtidos em
testes realizados pela toxicologia
descritiva
Responsável pelas decisões sobre um produto químico
Se oferece ou não riscos
ao ser comercializado
dentro de fins específicos
Remédios, cosméticos, aditivos em alimentos, agrotóxicos,
Normas sobre o total permitido no ambiente, nas águas, no
solo
Portaria Normativa N. 84 (15/10/96)
– IBAMA
Art. 4. Para efeito de classificação quanto ao Potencial de Periculosidade
Ambiental (PPA de agrotóxicos), seus componentes e afins o interessado
deverá apresentar a documentação completa conforme estabelecida nos
anexos I, III, IV, V e X
ANEXO IVPARTE C – CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS
PARTE D – TOXICIDADE PARA ORGANISMOS NÃO-ALVO
PARTE E – COMPORTAMENTO NO SOLO
PARTE F – TOXICIDADE PARA ANIMAIS SUPERIORES
D.1 – Microrganismos. D.2 – Algas.
D.3 – Organismos do solo (minhocas)
D.4 – Abelhas.
D.5 – Microcrustáceos. D.5.1 – Agudo. D.5.2 – Crônico D.6 -- Peixes. D.6.1 – Agudo. D.6.2 – Crônico.
D.7 – Bioconcentração em peixes.
D.8 – Aves. D.8.1 – Dose única. D.8.2 – Dieta. D.8.3 – Reprodução. D.9 – Plantas. D.9.1 – Fitotoxicidade para plantas não-alvo
IBAMA (1987) - PARTE D – TOXICIDADE PARA
ORGANISMOS NÃO-ALVO
Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) – IBAMA
Art. 3. A classificação quanto ao Potencial de Periculosidade Ambiental
(PPA) baseia-se nos parâmetros biocumulação, persistência, transporte,
toxicidade a diversos organismos, POTENCIAL MUTAGÊNICO,
TERATOGÊNICO, CARCINOGÊNICO, obedecendo a seguinte graduação:
Classe I – Produto altamente perigoso
Classe II – Produto Muito perigoso
Classe III – Produto Perigoso
TESTES PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE
AGROTÓXICOS PARA MINHOCAS
1- TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO (OECD, Protocolo nº 207) 2- TESTE DO SOLO ARTIFICIAL (OECD, Protocolo nº 207)
3- TESTE DO ARTISOL (EDWARDS, 1984) (IBAMA, 1987)
1. TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO
SUBSTRATO TESTE: Papel de filtro qualitativo padrão (WHATMAN nº 180. PESO = 85 mg/m2)
SOLUÇÃO: Água deionizada, concentrações crescentes (mg/cm2), colocar com pipeta sobre o papel.
SUBSTRATO CONTROLE: Papel + água deionizada.
RECIPIENTE: Frasco de vidro: 8,0 1 cm de altura e de 3 0,5 cm
CONDIÇÕES – Sala climatizada (20 2°C), ESCURO
AVALIAÇÃO DA MORTALIDADE: 48 h de exposição
ESPÉCIE – Eisenia foetida
RESULTADOS: % Mortalidade – CL50 (mg/cm2).
2 - TESTE DO SOLO ARTIFICIAL
SUBSTRATO TESTE: Substrato básico (10% de turfa (pH 6,0), finamente moída; 20% de caolinita; 69% de areia de quartzo industrial, com + de 50% de part. de 0,05 - 0,2
mm ; e 1% CaCO3 pulverizado)
UMIDADE: Água deionizada (25 - 42% peso. sub. básico)
CONDIÇÕES - Sala Climatizada (20 2°C), CLARO.
ANIMAIS – Adulto e com Clitélo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo Aclimatados por 24 h no substrato básico
TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente
AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição
SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.
RESULTADOS: % mortalidade - CL50 (mg/kg)
VANTAGEM – Resultados são usados para se estabelecer as dosagens no teste
3. TESTE DO ARTISOL (EDWARDS, 1984)
FUNDAMENTO: Exposição de minhocas adultas por 14 dias, em substrato ARTISOL
SUBSTRATO ARTISOL: 1.425 g de bolas de vidro com 1 - 1,5 cm ; 90 g de sílica amorfa - sílica gel em pó, impalpável; 215 ml de água destilada com a concentração da substância dissolvida.
Misturar tudo em um cristalizador de vidro.
Colocar 10 Animais adultos, com clitélo, manter por 14 dias em sala climatizada, 20 2°C, ESCURO.
AVALIAÇÃO: CL(I)50, 14 dias – Conc. Letal Inicial Média.
CONTROLE DE QUALIDADE:
a. < 10% de Mortalidade na testemunha
b. CL(I)50, 14 dias para a CLOROACETAMIDA deve estar entre: 35 a 160 mg/kg de sílica.
4 - TESTE SOLO NATURAL OU ARTIFICIAL
SUBSTRATO TESTE ARTIFICIAL: Pó da fibra de casca de coco (10%), caulim (20%) e areia industrial peneirada (70%)
UMIDADE: 40-60% da capacidade máxima de retenção de água
CONDIÇÕES - Sala Climatizada (25 2°C), fotoperíodo de 12h.
ANIMAIS – Adulto e com Clitelo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo Aclimatados por 24 h no substrato básico
TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente
AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição
SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.
4 - TESTE SOLO NATURAL OU ARTIFICIAL
SUBSTRATO TESTE ARTIFICIAL: Pó da fibra de casca de coco (10%), caulim (20%) e areia industrial peneirada (70%)
UMIDADE: 40-60% da capacidade máxima de retenção de água
CONDIÇÕES - Sala Climatizada (25 2°C), fotoperíodo de 12h.
ANIMAIS – Adulto e com Clitelo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo Aclimatados por 24 h no substrato básico
TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente
AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição
SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.
Cloroacetamida CL(I)50 = 110,06 mg/kg
Controle de Qualidade
IBAMA (Sílica)
35 < CL
(I)50< 160 mg/kg
ICHINOSE,
1992)
CL (I) 50 (mg/kg)
Intervalo de confiança
(mg/kg)
110,06
95,48 - 126,95
RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E
RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL
Cloroacetamida CL(I)50 = 110,06 mg/kg
Controle de Qualidade
IBAMA (Sílica)
35 < CL
(I)50< 160 mg/kg
ICHINOSE,
1992)
CL (I) 50 (mg/kg)
Intervalo de confiança
(mg/kg)
110,06
95,48 - 126,95
RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E
RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL
Benomil
Substrato CL (I) 50 Int. Confiança
Artisol 8,06 c 4,60 – 14,57
Areia 0,58 d 0,31 – 1,21
Latossolo Ver. Escuro 13,06 b 9,26 – 18,54
Latossolo Roxo 10,82 bc 6,42 – 18,67
Litossol 45,40 a 26,73 – 78,77
Parathion methyl
Substrato CL (I) 50 Int. Confiança
Artisol 73,61 b 52,15 – 109,65
Areia 8,81 d 7,10 – 10,94
Latossolo Ver. Escuro 86,69 b 64,14 – 117,79
Latossolo Roxo 53,59 c 40,54 -- 86,51
Litossol 191,73 a 132,25 – 269,73
Paraquat
Substrato CL (I) 50 Int. Confiança
Artisol 929,47 b 779,57 – 1.108,88
Areia 207,44 d 157,06 – 274,11
Latossolo Ver. Escuro 783,43 c 658,12 – 934,54
Latossolo Roxo 752,65 c 631,27 – 899,35
Litossol 1.458,80 a 1.316,01 – 1.618,26
Teste de Fuga – comportamental
(Bush et al., 2010)ISO 17512-1 (2007)
NBR ISO 17512-1 (ABNT, 2011)
- 10 organismos;
- 20 ± 4 ºC;
- 500 g;
- 48 h
- A amostra é considerada
tóxica: mais de 80% do total de
organismos expostos na amostra
do solo controle.
Teste de Fuga – comportamental
(Bush et al., 2010)ISO 17512-1 (2007)
NBR ISO 17512-1 (ABNT, 2011)
- 10 organismos;
- 20 ± 4 ºC;
- 500 g;
- 48 h
- A amostra é considerada
tóxica: mais de 80% do total de
organismos expostos na amostra
do solo controle.
Teste de Fuga – comportamental
(Bush et al., 2010)ISO 17512-1 (2007)
NBR ISO 17512-1 (ABNT, 2011)
- 10 organismos;
- 20 ± 4 ºC;
- 500 g;
- 48 h
- A amostra é considerada
tóxica: mais de 80% do total de
organismos expostos na amostra
do solo controle.
Machado (2016) - Os organismos da espécie Eisenia andrei
demonstraram sensibilidade ao agrotóxico glifosato,
evidenciando sua capacidade de detectar e evitar esta
substância química quando presente no solo, deste modo
podem ser utilizadas para auxiliar no monitoramento
AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE
AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992)
TOXICIDADE AGUDA
CL
50Con. Ambiental Estimada
CAE
RELAÇÃO
CL
50:
CAE
CL
50<
10 x
CAE
10 x CAE < CL50< 100 x CAECL
50>
100 x
CAE
80 < 10 x 10 Testes subletais Testes de campo 10 x 10 < 500 < 100 x 10 Estudos de efeitos sobre o peso, etc2.000 > 100 x 10
Provavelmente baixo Risco
AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE
AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992)
TOXICIDADE AGUDA
CL
50Con. Ambiental Estimada
CAE
RELAÇÃO
CL
50:
CAE
CL
50<
10 x
CAE
10 x CAE < CL50< 100 x CAECL
50>
100 x
CAE
80 < 10 x 10 Testes subletais Testes de campo 10 x 10 < 500 < 100 x 10 Estudos de efeitos sobre o peso, etc2.000 > 100 x 10
Provavelmente baixo Risco
Tratamento com água – todos os gravetos de macieira foram movimentados e uma grande parte carregada, total ou
parcialmente, para dentro do solo.
Tratamento com 0,27% de ethilparathion – redução na atividade das minhocas: apenas 4 gravetos foram movimentdos e 2 carregados para dentro do solo.
Tratamento com 0,005% de benomyl – redução na atividade das minhocas: só 1 graveto foi carregado
para dentro do solo e muitos não movimentados.
Tratamento com 0,025% de benomyl – redução drástica na atividade das minhocas. Maior efeito que
o ethilparathion em concentração semelhante.
Tratamento sem minhocas – testemunha com apenas o solo e os gravetos de folhas de macieira.
Efeito de agrotóxicos sobre minhocas, com base na eficiência em remover gravetos da nervura central de folhas de macieira com 12 horas de exposição no solo.
TESTES DE TOXICIDADE CRÔNICA
SOLO: ARTIFICIAL / ARTISOL / CAMPO
Avaliação de efeitos sobre:
- Crescimento (massa)
- Reprodução - produção de jovens
- Produção de casulos
- Comportamento
- Fisiologia, Morfologia
CONCENTRAÇÕES SUBLETAIS
ISO (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION), 1998, ISO 11268-2. Soil quality – Effects of polutants on earthworms (Eisenia fetida) – Part 2: determination of effects on reproduction. Geneva, ISO.
Amostra originada da garagem de ônibus:
- 96% dos organismos fugiram da seção contaminada para a seção onde estava o solo controle - amostra é tóxica, apresentando sua função de habitat limitada.
- A toxicidade foi confirmada pelos ensaios de letalidade e reprodução.
- 100% mortalidade adultos; - Não houve reprodução.
- Ensaio de comportamento: indicador
rápido da toxicidade da amostra e pode
ser aplicado como complementação da avaliação de áreas contaminadas.
Ação hormônios Baía Guanabara:
- minhocas engordaram 30%. - Não se reproduzem.
Sedimento da Foz do Rio Meriti:
- Todas minhocas morreram. - Acumulo de material pesado.
PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos para
minhocas
1 - Pesar 1 kg de substrato: Areia / Solo Argiloso / Solo orgânico em sacos plásticos.
2 - Colocar caldas com agrotóxicos, volume suficiente para manter
80% deumidade areia e solo orgânico - solo argiloso - * tratamentos
3 - Misturar a calda com o substrato dentro do saco plástico
4 - Colocar 10 minhocas, previamente pesadas, na superfície do substrato
5 - Fechar a “Boca” do saco plástico com arame plastificado