CUIABA 2019
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS
ADRIANA MARQUES FONTES OLIVEIRA SOARES
PADRÃO DE INGESTÃO DE AÇÚCAR E BIOFILME
SUPRAGENGIVAL COMO INDICADORES DE RISCO PARA A CÁRIE
DE ESTABELECIMENTO PRECOCE
ADRIANA MARQUES FONTES OLIVEIRA SOARES
PADRÃO DE INGESTÃO DE AÇÚCAR E BIOFILME
SUPRAGENGIVAL COMO INDICADORES DE RISCO PARA A CÁRIE
DE ESTABELECIMENTO PRECOCE
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências
Odontológicas Integradas, da Universidade de Cuiabá-UNIC como pré-requisito parcial para a obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profª Drª. Andreza Maria Fábio Aranha.
CUIABÁ 2019
Dados internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
S676p
SOARES, Adriana Marques Fontes Oliveira
Padrão de ingestão de açúcar e biofilme supragengival como indicadores de risco para a cárie de estabelecimento precoce. / Adriana Marques Fontes Oliveira Soares - Cuiabá-MT, 2019.
Xi. f.; cm. 59 p
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-graduação stricto sensu, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas. Universidade de Cuiabá, 2019.
Orientadora: Drª. Andreza Maria Fábio Aranha
1. Cárie Dentária. 2. Placa Dentária. 3. Pré-Escolar. 4. Dieta Cariogênica. I. Avaliação do padrão de exposição ao açúcar e do perfil microbiológico do biofilme supragengival na cárie dentária na infância.
CDU: 616.314 Terezinha de Jesus de Melo Fonseca - CRB1/3261
ADRIANA MARQUES FONTES OLIVEIRA SOARES
PADRÃO DE INGESTÃO DE AÇÚCAR E BIOFILME SUPRAGENGIVAL COMO INDICADORES DE RISCO PARA A CÁRIE DE ESTABELECIMENTO PRECOCE
Dissertação apresentada à UNIC, no Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas. Área de concentração em Odontologia, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
Profa. Dra Andreza Maria Fábio Aranha (Orientador)
UNIC
Prof. Dr. Luiz Evaristo Ricci Volpato UNIC
Prof. Dr. Jonas de Almeida Rodrigues UFRGS
Dedico este trabalho a meu amado esposo, Glaucio Rocha Soares e a minha filha Dora, que sacrificaram seus sonhos para que os meus se concretizassem. O apoio de vocês foi fundamental para que esta jornada fosse mais tranquila. A meu esposo, minha eterna gratidão pois foi pai e mãe principalmente nos momentos de minha ausência, quando seu afago acalmou o coração daquela que mais amo. Meu amado esposo e filha, a vocês dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A Deus, Senhor da minha vida e da minha história, a quem devo além de agradecimentos, todo o mérito, louvor e gratidão;
A minha família, especialmente a meu amado esposo, Glaucio Rocha Soares, de quem sempre recebi todo apoio profissional e emocional;
A minha filha, Dora Oliveira Soares, razão da minha vida, que me sustenta com seu olhar amoroso, mesmo quando o coração estava repleto de saudade pela ausência necessária;
Aos meus pais, Carlos Antônio de Oliveira e Maria das Graças Fontes de Oliveira, vocês são os melhores pais do mundo, pois me deram todo apoio, amor e condições para que eu chegasse até aqui;
À Maria Florentina Rodrigues, a nossa amada e eterna “Tina”, que foi um anjo que Deus colocou para cuidar de nossa família;
Agradeço à minha Orientadora, Prof.ª Dra. Andreza Maria Fabio Aranha, que durante toda a jornada se fez muito presente, com uma dedicação incansável, caminhou comigo e por vezes, nos momentos de maiores dificuldades, até me carregou no colo, toda a minha admiração e gratidão;
Aos meus amigos da equipe de Odontopediatria, Andreza, Ana Thereza, Annelyze, Cíntia e Evaristo, minha eterna gratidão pelo apoio recebido, vocês são para mim como minha segunda família. Muito obrigada;
À Annelyze Podolan Kloster, Marizângela Camilo, Priscila Vieira, Maize Camilo e Maria do Livramento Silveira, por me ajudarem no momento da coleta, separando os pacientes para que eu pudesse realizar este trabalho. Muito obrigado;
Aos alunos de iniciação científica do grupo de pesquisa de Cárie na Infância, em especial os alunos, Caique Bezerra, Thais Eugênia e Isabella Finger, minha gratidão pela grande ajuda prestada;
À técnica do laboratório de biologia molecular, Andressa Ricci, por toda responsabilidade, dedicação e contribuição para com este estudo;
Ao Heitor Corrêa Simões, por ter disponibilizado as dependências da POLITEC para a realização da qPCR;
Aos professores, Zeila Attuy Gonçalves e Flávio Simões por acreditarem que eu poderia fazer parte da equipe de professores do Curso de Odontologia da Universidade de Cuiabá. Minha eterna gratidão;
A todos os docentes do Programa de pós-graduação em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Alessandra Nogueira Porto, Alex Semenoff Segundo, Alexandre Meireles Borba, Álvaro Henrique Borges, Andreza Maria Fábio Aranha, Cynthia Rodrigues de Araújo Estrela, Fábio Luís Miranda
Pedro, Luiz Evaristo Ricci Volpato, Mateus Rodrigues Tonetto, Matheus Coelho Bandéca, Orlando Aguirre Guedes e Tereza A. Delle Vedove Semenoff;
Aos amigos e colegas de curso, que fizeram toda a diferença nesse caminho percorrido. Formamos uma equipe, onde juntos ultrapassamos e vencemos cada desafio proposto;
Ao Coordenador do Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges;
Ao Diretor da Faculdade de Odontologia da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Dr. Alessandro Tadeu Correa Marques;
À Reitora da Universidade de Cuiabá – UNIC, Maria Angélica Motta da Silva;
Ao Pró-Reitor Acadêmico da Universidade de Cuiabá – UNIC, José Cláudio Perecin; Ao Diretor de Pós-Graduação Stricto Sensu da Kroton, Prof. Dr. Helio Suguimoto; À Coordenadora de Pesquisa e Pós-Graduação - Stricto Sensu da Universidade de Cuiabá – UNIC, Lucélia de Oliveira Santos;
À secretaria do Programa de Mestrado/ Doutorado da Universidade de Cuiabá nas pessoas de José Bohnenberger, Aline Nara, Nayere Souza e especialmente a Jonielson Souza Dias por ter sido atencioso e prestativo durante o cumprimento dos créditos;
A todas as crianças e seus responsáveis que permitiram que este estudo se concretizasse.
“Esforça-te e tem bom ânimo; não pasmes, nem te espantes: por que o Senhor teu Deus é contigo, por onde quer que andares”
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi investigar o papel do padrão de ingestão ao açúcar e do biofilme microbiano na severidade da cárie dentária na infância em diferentes faixas etárias. Para tal finalidade, 102 crianças entre 4 meses e 5 anos de idade foram selecionadas e divididas nos seguintes grupos: Grupo LC (crianças livres de cárie; N=32); Grupo CPI (crianças com cárie de estabelecimento precoce na infância; N=16); Grupo CSI (crianças com cárie severa na infância; N= 54). O exame clinico foi realizado pelos índices de placa visível (IPV) e cárie dentária (ceo-s/decíduos). O padrão de ingestão do açúcar (líquido, sólido e total) e as características sociodemográficas da família foram registradas. Amostras do biofilme supragengival foram coletadas, submetidas à extração do DNA e posterior identificação e quantificação microbiana por meio do qPCR (S. mutans, S. sobrinus, S. oralis, L. caseie C. albicans). Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística por meio dos testes do qui-quadrado, ANOVA e de Tuckey, considerando o nível de significância de 5%. A presença e a severidade da cárie dentária foram associadas aos menores graus de escolaridade e níveis socioeconômicos da família. Nas crianças menores que 3 anos de idade, foi observado maior IPV e nas crianças entre 3 a 5 anos, maior ceo-s. Quanto à exposição ao açúcar, foi observada uma correlação positiva entre o consumo de açúcar, independente da forma e, a presença da cárie dentária. A ingestão do açúcar líquido foi maior em todos os grupos e faixas etárias investigadas, a qual foi associada a CSI nas crianças com 3 a 5 anos de idade. Maior contagem total de microrganismos e de S. mutans foi observada no grupo de crianças com cárie. Correlações positivas foram observadas entre S. mutans e S. oralis (grupos CPI e CSI) e, S. mutans e C. albicans (grupo CSI). O açúcar é fundamental para o desenvolvimento da cárie dentária, sendo a frequência e sua forma líquida associadas à severidade da doença, enquanto que o papel da microbiota na progressão da doença ainda não foi estabelecido.
ABSTRACT
The purpose of this study was to investigate the role of the sugar exposure pattern and microbial biofilm in the severity of dental caries in childhood in different age groups. For this purpose, 102 children between 4 months and 5 years of age were selected and divided into the following groups: LC (caries free; N = 32); CPI (children with early childhood caries; N = 16); CSI (children with severe caries in childhood, N = 54). Clinical examination was performed by the scores of visible plaque (IPV) and dental caries (dmfs/primary teeth). Information about dietary habits pattern of sugar intake (liquid, solid and total) and sociodemographic characteristics of the family were recorded. Samples of dental plaque was collected, submitted to DNA extraction and subsequent bacterial identification and quantification by qPCR (S. mutans, S. sobrinus, S. oralis, L. casei e C. albicans). The data were submitted to statistical analysis using chi-square, ANOVA and Tuckey tests, considering a significance level of 5%. The presence and severity of childhood caries were associated with lower educational and socioeconomic levels of the family. In children younger than 3 years of age, a higher IPV was observed and, in children aged 3 to 5 years, higher dmfs. Regarding the sugar exposure, a positive correlation was observed between the consumption of sugar, regardless of the type and, the presence of dental caries. Intake of liquid sugar was higher in all groups and age groups investigated, which was associated with CSI in children 3-5 years of age. Higher total counts of microorganisms and S. mutans occurred in the group of children with caries. Positive correlations were observed between S. mutans and S. oralis (CPI and CSI groups) and, S. mutans and C. albicans (CSI group). Sugar is essential for the development of dental caries, with the frequency and its liquid form being associated with caries severity, while the role of the microbiota in the progression of the disease has not been established.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Apresentação das espécies microbianas e a sequência dos primers e sondas Taqman. ... 35 Tabela 2 - Caracterização da população total e dos grupos do estudo (LC, CPI e CSI)*de acordo com sexo, faixa etária, classe econômica e grau de escolaridade (Teste do qui-quadrado; p<0,05) ... 36 Tabela 3 - Apresentação dos índices de saúde bucal (IPV e ceo-s) nos diferentes grupos (LC, CPI, CSI)* e faixas etárias investigados (ANOVA; p<0,05) ... 37 Tabela 4 - Apresentação do padrão de ingestão ao açúcar diário nos diferentes grupos (LC, CPI e CSI; ANOVA; p<0,05) e faixas etárias investigadas (menor de 3 anos e 3 a 5 anos de idade; Teste de Tukey; p<0,05) ... 38 Tabela 5 - Análise do padrão de ingestão ao açúcar de acordo com a faixa etária e graus de severidade da cárie (ANOVA; P0,05) ... 38 Tabela 6 - Identificação e quantificação dos microrganismos investigados de acordo com os grupos de estudo (LC, CPI e CSI)*(ANOVA; p0,05). ... 39 Tabela 7 - Identificação e quantificação dos microrganismos investigados de acordo com a presença de cárie dentária (CPI + CSI; N=70) e ausência da doença (LC; N=32) (ANOVA; p0,05) ... 40 Tabela 8 - Apresentação da correlação da ingestão de açúcar com os índices de saúde bucal e perfil microbiológico (Correlação de Pearson; p<0,05) ... 40 Tabela 9 - Apresentação da correlação entre os microrganismos investigados no grupo LC (Correlação de Pearson; p<0,05) ... 41 Tabela 10 - Apresentação da correlação entre os microrganismos investigados no grupo CPI (Correlação de Pearson; p<0,05) ... 41 Tabela 11 - Apresentação da correlação entre os microrganismos investigados no grupo CSI (Correlação de Pearson; p<0,05) ... 42 Tabela 12 - Avaliação da correlação entre os microrganismos investigados no grupo com a presença de cárie dentária (CPI+ CSI; Correlação de Pearson; p<0,05) ... 42
LISTA DE ABREVIATURAS
AAPD Academia Americana de Odontopediatria ABEP Associação Brasileira de Empresa e Pesquisa
ABI Applied Biosystems
°C Grau Celsius
Ca/C. albicans Candida albicans
ceo-s Dentes decíduos cariados, com extração indicada e obturados por superfície
ceo-d Dentes decíduos cariados, com extração indicada e obturados por dente
CA Cárie ativa
CI Cárie inativa
CF Crianças livres de cárie
ECL Crianças com lesões de cárie cavitadas CCL Crianças com lesões cavitadas de cárie CPI Cárie de estabelecimento precoce na infância
CSI Cárie severa da infância
CPOD Dentes permanentes cariados, perdidos e obturados
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DMM Saliva artificial enriquecida com mucina DMM + s. Saliva artificial com 1% de sacarose
EUA Estados Unidos da América
FAPEMAT Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso
FOC Faculdade de Odontologia de Cuiabá
IP Polissacarídeos extracelulares
Lc/ L.casei Lactobacillus casei
LC Livres de cárie
MT Mato Grosso
mL Mililitro
mm Milímetros
NCBI National Center for Biotechonology
OMS Organização Mundial de Saúde
PA Película adquirida
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
Ph Potencial hidrogênico
PPSUS Programa de Pesquisa para o Sistema Único de Saúde qPCR Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real
RJ Rio de Janeiro
RPM Rotações por minuto
SP São Paulo
Sm/ S.mutans Streptococcus mutans
So/ S.oralis Streotococcus oralis
SSo/ S.sobrinus Streotococcus sobrinus
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UNIC Universidade de Cuiabá
UFC Unidade formadora de colônia
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 16
2.1 CÁRIE DE ESTABELECIMENTO PRECOCE NA INFÂNCIA (CPI) ... 16
2.1.1 Conceito e epidemiologia ... 16
2.1.2 Fatores etiológicos ... 17
2.1.3 Biofilme dentário e a Cárie de Estabelecimento Precoce na Infância ... 21
2.1.4 Candida albicanse a Cárie de Estabelecimento Precoce na infância ... 26
2.1.5 Estratégias de prevenção e tratamento ... 28
3 PROPOSIÇÃO ... 30
3.1 OBJETIVO GERAL... 30
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 30
4 METODOLOGIA ... 31
4.1 CÁLCULO DO TAMANHO DA AMOSTRA E RECRUTAMENTO DA POPULAÇÃO DO ESTUDO ... 31
4.2 QUESTIONÁRIOS DE AVALIAÇÃO ... 32
4.3 EXAME CLÍNICO BUCAL E COLETA DO BIOFILME SUPRAGENGIVAL ... 32
4.4 EXTRAÇÃO DO DNA ... 33
4.5 DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO MICROBIANA POR REAL TIME PCR (Q-PCR)... 34 4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 35 5 RESULTADOS ... 36 6 DISCUSSÃO ... 43 7 CONCLUSÃO ... 47 8 REFERÊNCIAS ... 48 ANEXOS ... 54
ANEXO 2 - Avaliação Sociodemográfica ABEP 2015 ... 57 APÊNDICES ... 58 APÊNDICE 1 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE.. ... 58
1 INTRODUÇÃO
A cárie de estabelecimento precoce na infância (CPI) é uma das doenças infecciosas mais frequentes no mundo e que afeta crianças na mais tenra idade, sendo, desta forma, um grande desafio para a saúde pública dos países desenvolvidos e em desenvolvimento, principalmente em comunidades mais carentes1-5. Estudos epidemiológicos realizados em diferentes regiões do mundo mostram uma grande variação da prevalência da doença, com taxas que variam de 2,1% a 85,5%3,5-6. No Brasil, foi observada uma prevalência de cárie aos 5 anos de idade entre 45,8 a 54,4%3,7, sendo que a estimativa é que cerca de 48,2% destes casos não tenham sido tratados3,8.
Na infância, a cárie dentária se apresenta de forma bastante peculiar, uma vez que as lesões se desenvolvem de maneira rápida e desenfreada em um período curto de tempo, podendo levar ao comprometimento do tecido pulpar, causando dor, desconforto, debilidade na funcionalidade oral e física, interferindo desta forma na qualidade de vida da criança9-13. O termo CPI caracteriza a doença pela presença de pelo menos uma ou mais superfícies dentárias cariadas (cavitadas ou não), um ou mais dentes ausentes (por cárie) ou, dentes restaurados, antes dos 6 anos de idade. Uma forma clínica mais agressiva foi denominada Cárie Severa da Infância (CSI), caracterizada pela presença de uma ou mais superfícies de dentes decíduos anteriores cavitados ou perdidos pela lesão cariosa, restaurados ou ainda, na presença de um ceo-s (índice de dentes decíduos cariados, perdidos ou restaurados) maior ou igual a 4 para a idade de 3 anos, maior ou igual a 5 para a idade de 4 anos ou, maior ou igual a 6 para a idade de 5 anos. Em crianças menores de 3 anos, qualquer sinal de cárie em superfície lisa é indicativo de CSI10.
A etiologia da cárie na infância é considerada multifatorial, uma vez que fatores socioeconômicos, microbianos, imunológicos e comportamentais (hábitos alimentares e de higiene bucal), estão relacionados ao risco de ocorrência e estágios de evolução da doença3,14-17. A microbiota cariogênica do biofilme supragengival é modulada pela dieta rica em açúcares, que dentre os diversos tipos, a sacarose é a mais cariogênica pelo rápido processo de fermentação, produção de ácidos que provocam queda do pH no biofilme dentário26, bem como alterações bioquímicas na estrutura dentária, resultando no desenvolvimento e agravamento da cárie14-15,17-22.
15
O biofilme supragengival e sua relação com a presença e severidade da cárie na infância tem sido investigado14-15,23-29. Embora a espécie Streptococcus mutans represente o principal microrganismo associado à cárie dentária, outras espécies bacterianas acidogênicas e acidúricas como os Streptococcos não-mutans, Actinimyces spp e Lactobacillus spp foram relacionadas com o desenvolvimento da doença14,18-19. As espécies, Bifidobacterium spp, Streptococcus sobrinus e Scardovia wiggsiae foram associadas com a severidade da cárie na infância14-15,24, entretanto o papel destes microrganismos na progressão da doença ainda permanece inconclusivo. Interessantemente, a presença da Candida albicans foi identificada em grande quantidade tanto no biofilme supragengival como na saliva de crianças com CPI e CSI, sendo que na forma mais severa da doença e em crianças com menos de três anos de idade, os níveis de C. albicans é significantemente maior30-31. Entretanto, o sinergismo da espécie fúngica com outros microrganismos do biofilme supragengival ainda não está bem esclarecido17-18,22-23,32.
A diversidade microbiana do biofilme supragengival e seu comportamento e interações dinâmicas frente à exposição ao açúcar da dieta têm sido investigados3,14,24,33-34. Os estudos demonstraram existir uma forte associação entre o padrão de consumo do açúcar com a CPI e CSI3,5,14,24-25,33-35. Os açúcares, principalmente a sacarose, quando consumida em alta frequência provoca uma disbiose, ou seja, uma alteração da microbiota do biofilme supragengival que resulta no início e na progressão da cárie dentária19.
O objetivo do presente estudo foi investigar o padrão de exposição ao açúcar,o biofilme supragengival nas diferentes faixas etárias e graus de severidade da cárie dentária na infância. A hipótese nula testada foi a de que o padrão de exposição ao açúcar e o perfil microbiológico do biofilme supragengival não afetam o desenvolvimento e a severidade da cárie dentária na infância.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CÁRIE DE ESTABELECIMENTO PRECOCE NA INFÂNCIA (CPI) 2.1.1 Conceito e epidemiologia
A Cárie de estabelecimento precoce na infância (CPI) é uma das doenças infecciosas mais frequentes no mundo e que afeta tanto adolescentes como crianças na mais tenra idade, sendo, desta forma, um grande desafio para a saúde pública dos países desenvolvidos e em desenvolvimento, principalmente em comunidades mais carentes1-5. A cárie dentária se apresenta de forma bastante peculiar na infância, uma vez que as lesões se desenvolvem de maneira rápida e desenfreada em um período curto de tempo, podendo levar ao comprometimento do tecido pulpar, causando dor, desconforto, debilidade na funcionalidade oral e física, interferindo dessa forma na qualidade de vida da criança9-13.
O termo Cárie de Estabelecimento Precoce na Infância (CPI) foi definido como a presença de pelo menos uma ou mais superfícies dentárias cariadas (cavitadas ou não), um ou mais dentes ausentes (por cárie) ou dentes restaurados antes de 6 anos de idade10. Na forma mais severa e agressiva, usa-se o termo Cárie Severa da Infância (CSI), caracterizada pela presença de uma ou mais superfícies de dentes decíduos anteriores cavitadas ou perdidas pela lesão cariosa, restauradas ou ainda, na presença de um ceo-s (índice de dentes decíduos cariados, perdidos ou obturados por superfície) maior ou igual a 4 para a idade de 3 anos, maior ou igual a 5 para a idade de 4 anos ou, maior ou igual a 6 para a idade de 5 anos. Em crianças menores de 3 anos, qualquer sinal de cárie em superfície lisa é indicativo de CSI10.
A CPI ainda é uma das doenças mais prevalentes em todo o mundo, sua incidência média varia de 2,1a 85,5% dependendo da região e país3,5-6. Em países desenvolvidos esse índice chega a ser de 1 a 12%36, já nos países em desenvolvimento, principalmente nas populações menos favorecidas os índices são bem mais altos e variam de 36% como no caso da Grécia a 89,2% em crianças do Catar37-38.
No Brasil, estudos epidemiológicos têm mostrado uma prevalência de CPI entre 45,8 a 54,4% de cárie em crianças aos 5 anos de idade, sendo que a estimativa é que cerca de 48,2% desses casos não serão tratados3,8. No último
17
levantamento epidemiológico realizado no Brasil por meio do Projeto SB Brasil, em 2010, foram examinados cerca de 7.217 crianças com 5 anos de idade, utilizando os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS)7. Os resultados deste levantamento epidemiológico mostraram uma redução da prevalência de cárie dentária de 59,4% (2003) para 53,5% (2010), enquanto que o índice de ceo-d (índice de dentes decíduos cariados, perdidos ou obturados por dente) médio diminuiu de 2,80 para 2,43, respectivamente. Embora tenha sido observada uma diminuição na prevalência de cárie dentária em pré-escolares no Brasil, esta doença ainda permanece alta e apresenta desigualdades regionais, com índices maiores nos estados onde as desigualdades socioeconômicas são marcantes. A região centro-oeste é a segunda região com maior prevalência de cárie em crianças brasileiras com 5 anos de idade, perdendo apenas para a região Nordeste7.
Existe uma grande dificuldade no controle da CPI, isso se deve ao seu caráter multifatorial, pois se trata de uma doença complexa envolvendo fatores biológicos, comportamentais e socioeconômicos3,5,14-17,24,28,33, sendo de fundamental importância para se determinar terapias preventivas e/ou de controle de progressão e severidade da cárie dentária na infância, o conhecimento de dados epidemiológicos1,5,36-38, etiologia3,5,8,14-15,24,28,33, fatores de risco3,13 e diagnóstico10,39.
2.1.2 Fatores etiológicos
A etiologia da cárie dentária na infância é multifatorial e está fortemente associada ao fator comportamental no que diz respeito às características da dieta do hospedeiro, principalmente frente a ingestão frequente de carboidratos fermentáveis e a higiene bucal inadequada, os quais interferem diretamente na qualidade da microbiota do biofilme supragengival, contribuindo para o desenvolvimento da cárie dentária na infância3,8,14,18-19,24-25,28,33.
O comportamento alimentar é um dos fatores etiológicos cruciais na causalidade da cárie dentária na infância3-5,33-34,40-41. A exposição frequente ao açúcar principalmente a sacarose, promove uma mudança significativa na composição das comunidades microbianas residentes, modulando o biofilme e tornando os microrganismos mais aptos a metabolizar os carboidratos e produzir ácidos que levam a desmineralização do esmalte e consequentemente o surgimento
dos primeiros sinais da doença e consequentemente o desenvolvimento e progressão da cárie dentária14,18-19,24-26,33.
Parisotto et al. (2010)14 através de um estudo transversal, avaliaram a relação entre a composição microbiológica do biofilme supragengival, exposição ao açúcar e fatores sociais, bem como a presença de biofilme visível em crianças pré-escolares de 3 a 4 anos nos diferentes estágios da cárie precoce. A população do estudo foi de 169 crianças examinadas de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS). A população foi dividida em três grupos: crianças livres de cárie (CF=53), crianças com lesões de cárie não cavitadas (ECL= 56) e crianças com lesões cavitadas de cárie (CCL=60). A presença de biofilme dentário, visível clinicamente, nos incisivos superiores foi registrada e em seguida, foi realizada a coleta do biofilme de todas as superfícies lisas vestibulares e linguais. A avaliação microbiológica do biofilme coletado foi realizada através de cultura para S. mutans e Lactobacillus. A avaliação da dieta foi realizada por meio do preenchimento pela mãe da criança de uma tabela de dieta de três dias consecutivos durante a semana, incluindo os horários da ingestão dos alimentos e bebidas, e o seu conteúdo, bem como o uso de mamadeira ou líquidos adoçados durante o dia ou a noite antes da criança dormir. Em seguida, a frequência diária líquida, sólida e o total de açúcar ingerido foi determinada. Informações socioeconômicas e o grau de escolaridade materna também foram registrados. Os resultados mostraram diferenças significativas na presença de S.mutans e Lactobacillus no grupo CCL quando comparado ao grupo CF. A presença destes microrganismos foi associada a alta exposição ao açúcar, especialmente sólido, presença de biofilme visível e de lesões cavitadas. Também foram observados maiores níveis de Lactobacillus no grupo ECL em relação ao CF. Os resultados deste trabalho sustentam que a dieta influenciou na composição microbiológica do biofilme dentário supragengival e que o estágio inicial da cárie dentária está relacionado a presença de S. mutans, enquanto que as cavidades estão fortemente relacionadas a presença de Lactobacillus.
Wulaerhan et al. (2014)33 avaliaram fatores de risco como dieta, níveis socioeconômicos e hábitos de higiene oral em crianças com cárie de estabelecimento precoce na infância (CPI). A população do estudo contou com 670 crianças de 3 a 5 anos de idade, de comunidades urbana e rural. Informações sociodemográficas, nível socioeconômico, grau de escolaridade do chefe da família,
19
residência e número de integrantes da família foram registradas. Em relação ao hábito de higiene bucal, foi registrado o início e frequência de escovação e o(s) responsável(eis) pela escovação. A exposição ao açúcar e a frequência de ingestão foram investigadas. Os questionários foram respondidos pela mãe (64%), pelo pai (25,8%) ou por avós ou tios (5,8%). O exame clínico dentário foi realizado por dois dentistas previamente calibrados, utilizando luz natural, espelho clínico e exploradores. O índice ceo-s foi registrado e o diagnóstico da cárie na infância (CPI e CSI) foi baseado nos critérios da Academia Americana de Odontopediatria (AAPD). Os resultados do estudo mostraram que a maioria das crianças (74,2%) foi diagnosticada com cárie dentária e a prevalência de CSI foi de 40,1%, sendo que quanto maior a idade da criança, maior a prevalência e a severidade da doença. Os segundos molares decíduos inferiores, seguidos dos incisivos superiores, foram os dentes mais acometidos. A CPI foi significativamente mais prevalente nas crianças oriundas de famílias com baixo nível socioeconômico, menor grau de escolaridade, menor renda familiar e, em famílias mais numerosas. Observou-se associação significativa entre a CPI e a frequência de alimentos açucarados, chocolates, guloseimas, leite, yogurt e frutas frescas. A prevalência de CPI foi maior no grupo de crianças que não tiveram atendimento odontológico prévio. A higiene bucal deficiente foi relacionada ao início tardio da escovação, baixa frequência diária da escovação dentária, falta de conhecimento dos pais sobre a saúde bucal e ausência de colaboração dos pais ou cuidadores no momento da escovação. Os autores concluíram que a frequência de exposição ao açúcar e hábitos de higiene bucal pobre afetaram negativamente na saúde dentária das crianças pré-escolares do estudo.
Com o objetivo de identificar e quantificar a microbiota nos diferentes graus de severidade da doença cárie, Colombo et al. (2017)15 coletaram saliva de 130 crianças, entre 36 a 60 meses de idade, para identificação e quantificação microbiana. A população do estudo foi dividida em 3 grupos: livres de cárie (LC=47), cárie de estabelecimento precoce na infância (CPI=40) e cárie severa da infância (CSI=49), classificadas de acordo com os critérios da Academia Americana de Odontopediatria (AAPD). A detecção e quantificação de microrganismos orais na saliva coletada foi realizada por meio da qPCR (Actinomyces naeslundii, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, S. mutans, S. mitis, S.oralis, S. salivarius, S.
sobrinus e Scardovia wiggsiae). Foram aplicados, questionários sociodemográficos, de higiene oral e dieta. O questionário de dieta, foi realizado por meio de um diário alimentar de três dias, a fim de se determinar a ingestão de açúcar líquido, sólido e total. Os resultados do estudo mostraram que a detecção e os níveis quantitativos de S. mutans, S. sobrinus, Bifidobacterium spp. e S. wiggsiae, foram significativamente maiores nas crianças com CSI em comparação às crianças dos grupos LC e CPI, enquanto que para S. salivarius foram significativamente mais altas nas crianças LC em comparação as crianças com CPI e CSI. Os níveis de S. mitis, S. oralis, A. naeslundii e Lactobacillus spp foram iguais nos grupos avaliados. As crianças com CPI apresentavam nível socioeconômico mais baixo, iniciaram a escovação dos dentes tardiamente e foram amamentadas por mais tempo em comparação às crianças com LC. Os níveis de S. mutans correlacionaram-se positivamente com S. wiggsiae e Bifidobacterium spp. Níveis socioeconômicos mais baixos, menor escolaridade da mãe e uso de mamadeira pela criança antes de dormir foram negativamente correlacionados com os níveis de S. salivarius. Concluiu-se então que, além de S. mutans, outras espécies bacterianas, incluindo Bifidobacterium spp, S. wiggsiae e S. sobrinus, estão associadas à severidade da doença cárie, embora seu papel no progresso da cárie dentária na infância ainda não esteja claro.
Feldens et al. (2018)41 realizaram um estudo de coorte prospectivo com 345 crianças brasileiras (12 meses aos 3 anos de idade) com o objetivo de analisar os padrões e frequência da alimentação na infância. O registro do consumo total de alimentos e bebidas durante 24 horas foi realizado, incluindo o uso de mamadeira e amamentação no seio materno. Além do diário alimentar, um questionário sociodemográfico também foi aplicado, incluindo idade da mãe, grau de instrução da mãe, estrutura familiar, renda familiar e classe social (ABEP, 2015). Após 38 meses, as mesmas crianças foram submetidas a um exame clínico dentário preconizado pela Organização Mundial da Saúde (2015)42, sendo consideradas, também, as lesões não cavitadas. A prevalência de CPI e CSI aos 38 meses (3 anos) foi comparada com o diário alimentar realizado pelas mães com as mesmas crianças aos 12 meses de idade. Os resultados mostraram uma prevalência de CPI e CSI de 54,8% e 32%, respectivamente. Aproximadamente metade das crianças (50,4%) amamentavam na visita de 12 meses, enquanto que 71,3% faziam o uso de
21
mamadeiras também. Aos 38 meses de controle, a prevalência de CPI foi maior nos grupos com alta frequência e exclusiva amamentação no peito, alta frequência e uso exclusivo de mamadeira e no grupo com alta a moderada frequência de alimentação mista. Uma maior prevalência de CSI foi observada tanto no grupo que amamentava no seio materno, como no grupo que associou amamentação e consumo de outros alimentos e bebidas com alta frequência. Concluiu-se que a frequência, independentemente, do uso de mamadeira, aleitamento materno ou alimentação mista foi positivamente correlacionada a CPI e CSI. Os autores sugerem que a prevenção de cárie em crianças da primeira infância deve ser baseada no aconselhamento aos pais para que aumentem os intervalos das mamadas, uma vez que alimentos complementares já tenham sido introduzidos. Limitar a frequência de lanches e bebidas com açúcar adicionado e buscar orientações com nutricionistas e cirurgiões-dentistas.
2.1.3 Biofilme dentário e a Cárie de Estabelecimento Precoce na Infância A literatura mostra que a doença cárie é multifatorial e complexa que envolve fatores comportamentais, sociodemográficos e biológicos3,8,14,18-19,28,24,33. Atualmente tem sido possível, através das tecnologias disponíveis desvendar a complexa ecologia e ações microbianas entre os biofilmes, voltados para a doença cárie na infância18-19,24-26,29.
Nas duas últimas décadas, com o surgimento de novas tecnologias, principalmente àquelas baseadas em identificação e sequenciamento de DNA, houve um grande progresso para a compreensão do microbioma oral e a etiologia da doença cárie através da identificação das espécies presente no biofilme dentário tanto em saúde quanto na doença cárie respectivamente43-44.
Biofilmes são comunidades microbianas firmemente aderidas a superfícies sólidas que estão embebidas em uma matriz extracelular e formam uma estrutura altamente organizada com potencial para causar infecções humanas19. A formação do biofilme dentário pode ser dividida em quatro estágios: (1) formação da película adquirida (PA), (2) fixação dos primeiros colonizadores bacterianos, (3) coagregação bacteriana e (4) multiplicação e sucessão microbiana45. A película adquirida (PA) é uma camada proteica acelular que recobre a superfície dentária,
cujas moléculas atuam como receptores, para a adesão seletiva de microrganismos à superfície dentária46-47. Até duas horas após a formação da PA, ocorre a fixação dos primeiros colonizadores bacterianos, S. sanguis, S. oralis, S. mitis e S. gordonii47-50. Estas espécies representam cerca de 95% dos Streptococcus e 56% da microbiota inicial. A microbiota inicial também é composta por Actinomyces e microrganismos Gram-negativos como Neisseria spp e Haemophilus spp47. Os Streptococcus do grupo mutans representam apenas 2% ou menos dos Streptococcus colonizadores iniciais. Capnocytophaga spp, Prevotella spp e Veillonela spp também podem estar presentes na colonização inicial do biofilme47. Existe uma fase adaptativa, ou seja, sem multiplicação celular antes que a colonização microbiana prossiga, uma vez que um rápido aumento de microrganismo só é observado após 8 a 12 horas47. Conforme o biofilme amadurece, ocorre a sucessão microbiana e, neste momento, tem-se a troca da comunidade de Streptococcus para a de Actinomyces. Os colonizadores secundários fixam-se as espécies pioneiras estabelecidas por meio de interações de receptores de adesina (coadesão)47,51. Resumidamente, os microrganismos pioneiros criam um ambiente mais atraente aos invasores secundários caso haja interferência de fatores externos, como por exemplo, consumo de sacarose ou cada vez mais desfavorável a eles seja pela falta de nutrientes, pelo acúmulo de produtos metabólicos inibitórios e/ou pelo aumento da anaerobiose. Desta forma, entende-se que o biofilme é uma estrutura biologicamente ativa47,51.
Os açúcares, principalmente a sacarose, estimulam a colonização de microrganismos patogênicos, que alteram a formação da matriz e a acidificação do biofilme dentário, provocando a disbiose, que é um desequilíbrio da microbiota do biofilme dentário supragengival, ou seja, as espécies indicativas de saúde como S. sanguinis, S. mitis, S. oralis, S. gordonni são substituídas por espécies acidúricas como S. mutans, Actinomyces spp e Lactobacillus spp que provocam a desmineralização do tecido dentário dando início ao processo da cárie dentária19. Em relação a presença de lesões cavitadas de cáries ativas, foi observado que as mesmas apresentam grandes quantidades de S. mutans, Streptococcus não mutans, Lactobacillus, Bifidobacterium, Actinimyces ssp e Scardovia spp, considerando essas comunidades patogênicas e as responsáveis pela progressão da cárie dentária52.
23
Palmer et al. (2010)24 investigaram as associações entre a dieta e a colonização de microrganismos cariogênicos em crianças de 2 a 6 anos de idade com CSI (N=72) e em crianças pós-tratamento odontológico com ausência de novas lesões de cárie (N=39;grupo controle). Os pais responderam os questionários de informações sociodemográficas e diário alimentar. O diário alimentar da criança, se baseou no consumo de alimentos líquidos e sólidos, nas últimas 24 horas do dia anterior,e o tempo em que a criança levava para consumir esses alimentos. A coleta do biofilme supragengival dos molares decíduos foi realizada e as amostras, submetidas à avaliação microbiológica por meio da PCR para S. mutans, S. sobrinus e Bifidobacterium. A população do estudo foi acompanhada por 3, 6 e 12 meses após tratamento dentário. Os resultados mostraram que crianças que haviam finalizado o tratamento odontológico, mas tiveram alta frequência de ingestão de leite, particularmente, entre as refeições, desenvolveram novas lesões de cárie. O grupo CSI consumiu mais açúcar na forma líquida e sólida entre as refeições e mais alimentos no período noturno do que as crianças livres de cárie. Na análise microbiológica, no grupo de crianças com CSI foram detectados S. mutans, S. sobrinus e Bifidobacterium. Não houve diferenças no biofilme microbiano entre as crianças com CSI no início do estudo e, àquelas que apresentaram ou não recorrência de novas lesões. Os autores concluíram que a dieta alimentar cariogênica é responsável por modular o biofilme dentário supragengival, o qual provoca uma disbiose oral, tornando os microrganismos mais acidogênicos e acidúricos e levando ao início e progressão da doença cárie.
Parisotto et al. (2015)25 avaliaram a relação entre CPI e os polissacarídeos extracelulares insolúveis (IP) no biofilme supragengival, frente a exposição ao açúcar e presença de microrganismos cariogênicos. A população do estudo foi composta por 65 crianças, entre 3 e 4 anos de idade,sendo 51% do sexo feminino e 49% do sexo masculino. O diagnóstico de cárie foi realizado com base nos critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS), acrescentando o diagnóstico de lesões iniciais de mancha branca ativa. O biofilme dentário supragengival foi coletado pelo menos uma hora após a ingestão de alimentos e a escovação dentária. O material coletado foi armazenado e processado seguindo protocolo específico para a avaliação microbiológica de cultura em ágar para S. mutans (SM), Total de Microrganismos (TM), Lactobacillus (LB). A análise da formação de
polissacarídeos extracelulares (IP) também foi realizada. Um diário alimentar de 3 dias consecutivos foi realizado com o auxilio das mães para avaliar a exposição ao açúcar líquido, sólido e total, o qual incluiu os alimentos e bebidas consumidas nas refeições e lanches, registrando-se, também, a hora da ingestão. Para determinar as alterações de prevalência de cárie na população estudada, apenas os exames clínicos para diagnóstico de cárie foram repetidos após 1 ano. Assim, de acordo com as mudanças na prevalência de cárie, as crianças foram divididas em 3 grupos: Cárie inativa (CI), Livres de cárie (LC) e Cárie ativa (CA). Os resultados mostraram existir uma correlação positiva entre a prevalência de cárie e a frequência de consumo do açúcar, a presença de microrganismos cariogênicos, alto índice de placa e concentrações altas de IP, o que poderiam explicar as mudanças na atividade de cárie em crianças pré-escolares após período de 1 ano. Foi observada uma correlação positiva entre a prevalência de cárie em pré-escolares com a presença de S. mutans, Total de microrganismos, Lactobacillus, além da sacarose sólida ingerida diariamente e a presença de biofilme supragengival clinicamente visível (IPV) nos incisivos superiores. As crianças com quantidade de biofilme dentário superior a 2,36g/mg apresentaram 6,8 vezes mais chances de desenvolver a cárie dentária do que em crianças com concentrações mais baixas. Com relação aos achados microbiológicos, no grupo de crianças onde houve a detecção de Lactobacillus, estas foram 13 vezes mais propensas a desenvolver cárie do que crianças com níveis indetectáveis deste microrganismo. Crianças que tinham presença de IPV nos incisivos superiores apresentaram 4,3 vezes mais probabilidade de desenvolver cáries em 1 ano do que aquelas que não apresentavam. Crianças expostas ao açúcar sólido mais de 2 vezes ao dia apresentaram 5 vezes mais chances de desenvolver lesões cariosas do que aquelas com menor exposição ao açúcar. Desta forma, os autores concluíram que os polissacarídeos extracelulares insolúveis, o açúcar sólido/sacarose, o biofilme supragengival visível e a presença de microrganismos cariogênicos estão associados a presença e ao desenvolvimento da cárie dentária em crianças pré-escolares.
Neves et al. (2016)26 avaliaram a queda de pH do biofilme frente a exposição do leite humano de crianças com e sem CPI. Neste estudo, uma população de 16 crianças com mais de 24 meses foi avaliada, a qual foi dividida em
25
dois grupos distintos, crianças livres de cárie (LC) e crianças com cárie de estabelecimento precoce na infância (CPI; crianças com pelo menos 4 lesões ativas não cavitadas ou mais de uma lesão ativa cavitada). Os grupos LC e CPI foram submetidos a um estudo cruzado realizado em duas fases, durante as quais as crianças foram amamentadas ou o biofilme foi exposto a 10% de sacarose. A sequência de tratamento utilizada para cada criança foi aleatoriamente distribuída. Após um intervalo de 2 semanas, os tratamentos foram invertidos, sendo que todas as crianças do estudo foram submetidas aos dois tipos de tratamento (amamentação e/ou exposição a 10% de sacarose). O pH do biofilme supragengival foi avaliado em 3 momentos, pH em repouso, após 5 minutos e 30 minutos, respectivamente, após os tratamentos terem sido administrados. Ao final da avaliação da acidogenicidade do biofilme, estes foram coletados para a comparação microbiológica (Total de microrganismos, S. mutans e Lactobaciluus spp). A saliva não estimulada também foi coletada para análise microbiológica. Os resultados mostraram que a amamentação não diminuiu o pH do biofilme supragengival de crianças livres de cárie, mas a sacarose provocou uma queda do pH significativa após 5 minutos, tanto para o grupo LC como para o grupo CPI. A análise microbiológica mostrou uma contagem significantemente maior de S. mutans no biofilme e na saliva das crianças com CPI em comparação com o grupo LC. Com base nesses resultados, foi concluído que o leite humano não provoca uma queda significativa nos níveis de pH no biofilme supragengival, sugerindo que a cárie, nessa faixa etária de 24 meses, é associada ao consumo de produtos alimentares açucarados.
Signori et al. (2018)53 avaliaram o efeito do leite humano isolado e associado à sacarose na cariogenicidade de biofilmes. O modelo de biofilme de microcosmo utilizado foi realizado por meio de discos de esmalte obtidos de dentes bovinos, previamente preparados. A saliva humana foi usada como inóculo para a organização de um biofilme multiespécies. Os espécimes foram inoculados e incubados por uma hora, com saliva (400l) de um doador sadio, do sexo masculino de 19 anos de idade, não tabagista, livre de cárie e com condição periodontal saudável. Os biofilmes, foram cultivados sob exposição alternada de mucina (DDM), por 18 horas e o tratamento por 6 horas. A cariogenicidade de seis condições de crescimento foi investigada, sendo elas, saliva artificial enriquecida com mucina (DMM), saliva artificial com 1% de sacarose (DMM+s), leite humano com DMM, leite
humano com DMM+s, leite bovino com DMM e leite bovino com DMM+s. Os biofilmes foram incubados sob atmosfera anaeróbica (5-10% CO2, <1% O2) a 37 °C, durante os 5 dias de crescimento. A microdureza superficial (%SHC) da superfície dos espécimes, a composição microbiológica dos biofilmes e pH do sobrenadante foram investigados. Os resultados deste estudo mostraram que em todos os grupos houve perda da dureza na superfície do esmalte, 2,8% no grupo DMM, 24,7%, no grupo do leite humano com DMM, 46,9% no grupo do leite humano com DMM+s, 4,7% no grupo do leite bovino com DMM e 88,2% no grupo do leite bovino com DMM+s. Um padrão de flutuação de pH foi observado para cada grupo, o grupo leite bovino apresentou os maiores valores de pH em relação aos demais grupos de tratamento, exceto para o grupo controle DMM. Após 18 horas, os grupos submetidos ao leite humano e bovino apresentaram diferenças, porém quando cada leite foi associado a sacarose os valores de pH foram semelhantes nos dois grupos. Em relação a avaliação microbiológica, os maiores níveis de microrganismos totais foram encontrados no grupo de leite bovino com DDM+s. Nenhum crescimento foi observado para Lactobaccilus e microrganismos acidúricos no grupo DMM. O grupo leite bovino apresentou maior quantidade de microrganismo acidúricos em comparação com o grupo leite humano. Concluiu-se então que tanto o leite humano, quanto o leite bovino, apresentam potencial cariogênico, embora diferindo da sacarose em termos de perda mineral, ou seja, ambos tem o mesmo potencial cariogênico, porém quando adicionado a sacarose esse potencial cariogênico é aumentado.
2.1.4 Candida albicans e a Cárie de Estabelecimento Precoce na infância
A Candida albicans é um fungo oportunista que faz parte da microbiota bucal normal, que quando em equilíbrio (simbiose),tem-se um estado de saúde, do contrário frente a um desequilíbrio (disbiose), como consequência ocorre um aumento deste fungo que leva ao desenvolvimento da doença. Estudos têm demonstrado que a Candida tem a grande capacidade de aumentar-se em número, principalmente em estados imunes baixos, ou quando algum outro fator leve ao desiquilíbrio da microbiota 30-32,54-55. As crianças tornam-se o grupo mais propenso a desenvolver a doença candidíase, principalmente devido a baixa imunidade, já que existe uma imaturidade imunológica própria da idade55.
27
Nas duas últimas décadas, inúmeros estudos demonstraram a associação entre altos níveis de Candida albicans e a cárie dentária16-19,22-23,30-32, sendo esta fortemente relacionada a severidade da doença (CSI)18-19,31,55. Há evidências de uma interação simbiótica entre Candida albicans e Streptococos mutans18-19,31,55. Essa interação acontece quando a Candida albicans co-adere ao S. mutans que juntos cooperam entre si, produzindo e fornecendo substratos que favorecem o crescimento de ambos. Desta forma, tem-se o S. mutans co-infectado pela Candida albicans, o que aumenta a virulência do biofilme exposto à sacarose19.
Thomas et al. (2016)30 avaliaram a relação entre a Candida albicans com a CSI. A população total do estudo foi de 40 crianças, divididas em dois grupos distintos: crianças livres de cárie (LC; N=20) e crianças com cárie severa (CSI; N=20). Ambos os grupos foram subdivididos de acordo com as idades de 12 a 36 meses e 37 a 71 meses de idade. Foram excluídos do estudo crianças que faziam terapia com medicação antifúngica ou esteroides e nos casos de ausência de consentimento dos pais para participação do estudo. O exame clínico dentário foi realizado, a fim de classificar os grupos de crianças com cárie severa da infância (CSI) e livres de cárie (LC), de acordo com os critérios da Academia Americana de Odontopediatria (AAPD, 2008/2009)56. A saliva não estimulada e o biofilme de todas as superfícies dentárias, lesões cariosas e mucosa foram coletados. A avaliação microbiológica foi realizada por meio de cultura em ágar. Os resultados demonstraram que os níveis de Candida albicans foram maiores no grupo CSI do que no grupo LC. O uso de chupeta foi associado a maior frequência de Candida albicans. Os autores concluíram que existe uma associação entre a Candida albicans e a CSI. Os autores afirmam que a população avaliada foi pequena e que mais estudos devem ser realizados com o objetivo de esclarecer o exato papel da Candida albicans na severidade da cárie dentária.
Xiao et al. (2016)31 investigaram a relação da Candida albicans em crianças com CSI através da saliva e biofilme supragengival coletados dos filhos e das mães. A população total deste estudo contou com cerca de 18 crianças com CSI e 17 crianças livres de cárie (LC), ambas com suas respectivas mães. Os critérios de inclusão da população do estudo foram crianças entre 12 a 71 meses, de ambos os sexos. Os índices de ceo-s, foram utilizados para o diagnóstico da cárie dentária na infância e o índice de placa visível (IPV) também foi registrado. Informações
sociodemográficas, da prática de higiene bucal, antecedentes de infecções anteriores por fungos e uso de antimicrobianos foram obtidas. Com relação a avaliação microbiológica, a Candida albicans e S. mutans foram identificados em cultivo em ágar do material coletado (esfregaço da mucosa, saliva e biofilme supragengival). Na avaliação por parentesco, foram utilizados os testes REAG-B e MLST, métodos com o objetivo de analisar se existe grau de parentesco genético para Candida albicans entre mãe e filho e associação com a CSI. Os resultados mostraram que S.mutans foi detectado em ambas as amostras de saliva e biofilme supragengival em todos os indivíduos. A Candida tropicalis, Candida krusei e Candida glabrata também foram identificadas em 6% das crianças com CSI e suas respectivas mães. Os resultados apontaram para uma forte correlação entre S. mutans e C. albicans na CSI. Entre os 12 pares de genes entre mãe-filho que carregavam C. albicans na cavidade oral, a análise do REAG-B mostrou pares idênticos em 61,1%. Em relação aos pares mãe-filhos livres de cárie, apenas 1 par de mãe-filhos tinham Candida albicans em suas amostras, e os resultados do REAG-B indicaram que as cepas entre mãe e filho eram idênticas. Os resultados deste estudo mostraram que as crianças com CSI e suas mães estavam infectadas com altos níveis de Candida albicans, e que a maioria das cepas fúngicas eram geneticamente relacionadas, sugerindo que a mãe pode ser uma fonte primária para aquisição de Candida albicans para a cavidade oral de crianças com CSI. Uma forte correlação também foi identificada entre Candida albicans e S. mutans, sugerindo uma relação simbiótica entre esses dois reinos no contexto da cárie dentária da infância.
Jean et al. (2018)16 avaliaram um grande conjunto de dados de registro eletrônico de saúde de seis hospitais infantis americanos para investigar uma possível relação entre infecção com cândida oral (Candidíase na infância) ou outras infecções no primeiro ano de vida, e o risco ao desenvolvimento de cárie severa na infância (CSI). A população de estudo incluiu crianças entre 1 e 12 meses de vida, que tiveram pelo menos uma visita hospitalar nos primeiros 12 meses de idade, e pelo menos uma visita hospitalar adicional entre 13 e 71 meses de idade com o pediatra. Os resultados revelaram que a candidíase oral na infância está fortemente associada a CSI, e que cuidados preventivos podem ser estabelecidos. Outro fator importante é fortalecer a inter-relação entre médicos pediatras e odontopediatras a
29
fim de implementar medidas preventivas e terapêuticas para a CPI, já que o médico pediatra só pode detectar grandes cavidades, mas não lesões iniciais como as manchas brancas ativas.
2.1.5 Estratégias de prevenção e tratamento
O consumo de açúcar por crianças até 5 anos de idade tem sido apontada como principal fator na causalidade da doença cárie na infância 3,5,15,24-26,33-34,40-41
.
Chi e Scott (2019)35, propuseram uma revisão com base em dados da Pesquisa Nacional de Saúde e Nutrição dos EUA de 2011 a 2012, sobre o consumo de açúcar e a sua relação com a cárie dentária na infância, tendo como objetivo traçar estratégias futuras e políticas baseadas em evidências, para prevenção de doenças orais e sistêmicas, que reduzem a saúde e afetam a qualidade de vida. Os autores sugeriram para este fim algumas recomendações, sendo uma das mais importantes as intervenções sociocomportamentais no sentido de orientar pais ou cuidadores com relação ao consumo de açúcar. Os autores ressaltam que hoje exclusivamente na odontologia, o tratamento da cárie dentária é baseado em estratégias a nível dentário como tratamentos com verniz fluoretado, selantes ou tratamentos restauradores ao invés de determinantes sociodemográficos, comportamentais e sociais.
3 PROPOSIÇÃO 3.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente estudo foi investigar o padrão de ingestão ao açúcar e microbiota do biofilme supragengival nos diferentes graus de severidade da cárie dentária na infância e faixas etárias.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar as características sociodemográficas nos diferentes grupos investigados;
2. Avaliar os índices de saúde bucal nos diferentes grupos investigados; 3. Avaliar o padrão de ingestão ao açúcar (tipo e frequência) nos diferentes grupos e faixas etárias investigadas;
4. Identificar e quantificar a microbiota do biofilme supragengival nos diferentes estágios da cárie dentária;
5. Avaliar a correlação entre o padrão de exposição ao açúcar e o perfil microbiológico do biofilme supragengival;
6. Avaliar a correlação entre os microrganismos investigados nos diferentes estágios da cárie dentária.
31
4 METODOLOGIA
4.1 CÁLCULO DO TAMANHO DA AMOSTRA E RECRUTAMENTO DA POPULAÇÃO DO ESTUDO
De agosto de 2017 a abril de 2018, bebês e crianças menores de 6 anos de idade que compareceram à Clínica de Atenção Básica à Criança da Faculdade de Odontologia de Cuiabá, UNIC-MT, foram convidados a participar do presente estudo.
O cálculo amostral do estudo foi realizado sobre a população total elegível, considerando nível de significância de 5%, poder estatístico de 0,80 e intervalo de confiança mínimo de 0,05 a 0,10 (National Statistical Service & Sample Size Calculator Definitions - NSS), sendo necessários no mínimo 87 participantes.
Para composição da população do estudo, foram considerados os seguintes critérios de inclusão: pré-escolares com boa saúde geral, de ambos os sexos, com idades entre 4 meses e 5 anos de idade. Não foram incluídos, os indivíduos com doenças sistêmicas ou com malformações congênitas, crianças que faziam uso crônico de medicamentos ou que tenham sido submetidos à aplicação de verniz ou gel fluoretado nas últimas 48h, crianças que fizeram uso de antibióticos em menos de três meses e, casos de impossibilidade de coleta de dados clínicos e/ou do biofilme supragengival.
A partir dos critérios de inclusão e exclusão, dos 113 pré-escolares convidados a participar do estudo, 102 foram incluídos na população final, os quais foram divididos em 3 grupos: Grupo LC (crianças livres de cárie; N=32); Grupo CPI (crianças com cárie precoce na infância; N=16); Grupo CSI (crianças com cárie severa na infância; N= 54).
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Cuiabá-UNIC (CAAE: 66085517.6.0000.5165/2017; Anexo 1). Os pais ou responsáveis legais pelas crianças selecionadas que aceitaram participar do estudo, assinaram o Termo de Consentimento Livre Esclarecido (TCLE; Apêndice 1).
4.2 QUESTIONÁRIOS DE AVALIAÇÃO
Os pais ou responsáveis legais pelas crianças responderam questionários de avaliação do nível socioeconômico da família e grau de escolaridade do chefe da família pelos critérios da ABEP (Associação Brasileira de Empresa de Pesquisa, 201579; Anexo 2), que classifica a população em 6 estratos de acordo com a renda média familiar (valor bruto) e o poder de compra: (A1=R$11.480,00; A2=R$8295,00 B1=R$4754,00; B2=R$2656,00; C1=R$1459,00; C2=R$962,00 D=R$680,00; E=R$415,00); e o grau de escolaridade em 5 níveis: Nível 1- analfabeto/Fundamental I incompleto, Nível 2- Fundamental I completo/Fundamental II incompleto, Nível 3- Fundamental II completo/ Médio incompleto, Nível 4- Médio completo/Superior incompleto, Nível 5- Superior completo). A avaliação do padrão de exposição ao açúcar foi realizada por meio de um diário alimentar de 3 dias em que foi registrado o consumo de qualquer alimento ou bebida e os horários de ingestão, incluindo o uso de mamadeira ou bebidas adoçadas, durante dia e noite. Em seguida, a frequência diária de exposição ao açúcar líquido, sólido e total foi determinada pela média dos 3 dias14,15,25.
4.3 EXAME CLÍNICO BUCAL E COLETA DO BIOFILME SUPRAGENGIVAL
O exame clínico foi realizado por um único examinador previamente calibrado, de acordo com as condições preconizadas pela Organização Mundial da Saúde42. A calibração foi realizada através de pacientes e os mesmos não foram incluídos na amostra final. A higiene bucal foi mensurada, por meio do índice de placa visível (IPV)57, registrando a presença ou não de biofilme visível nas faces vestibular, mesial e distal de todos os dentes decíduos. A avaliação da cárie dentária foi realizada por meio do índice ceo-s (análise das superfícies cariadas, extraídas e restauradas dos dentes decíduos), utilizando espelho bucal clínico (Duflex, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). As lesões de cárie incipientes, manchas brancas ativas (MBA), foram consideradas quando as mesmas eram visíveis clinicamente, sem a necessidade de profilaxia prévia ou secagem da superfície, e a prevalência de cárie foi considerada quando os valores foram maiores do que zero.
Amostras do biofilme supragengival foram coletadas por meio de swabs esterilizados (Absorve, Cotia,SP, Brasil), através de um esfregaço das superfícies
33
vestibulares e oclusais de todos os dentes decíduos presentes na boca58. Em seguida, os swabs de cada indivíduo foram colocados em microtubos tipo eppendorf (Hexasystems, São Paulo, SP, Brasil) e mantidos a temperatura de - 80°C até seu processamento.
4.4 EXTRAÇÃO DO DNA
A extração do DNA genômico das amostras obtidas foi realizada com auxílio do kit PureLink™ Genomic DNA Purification (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), seguindo-se as instruções do fabricante.
Inicialmente, foram adicionados 1.000 µL de água ultrapura nos microtubos eppendorf com o material coletado. O material foi previamente homogeneizado em agitador mecânico (vórtex, QL 901, Biomixer, Hexasystems, São Paulo, Brasil) por 30 segundos e 500 µL da amostra foram centrifugados (3 min x 10.000 rpm). Após remoção do sobrenadante, 180 μL de PureLink™ Genomic Digestion Buffer/Lysozima foram adicionados. As amostras foram novamente agitadas por 30 segundos em vórtex para a ressuspensão do pellet e então, incubadas em banho-maria a 37oC por 30 minutos. Em seguida, 20 μL de Proteinase K (vórtex 30s) e 200uL do Genomic Lysis/Binding Buffer (vórtex 30s) foram adicionados ao pellet formado e cada microtubo foi incubado à 55ºC por 120 minutos. A cada 20 minutos, os microtubos foram agitados por 30 segundos em vórtex. Sequencialmente, 200 μL de etanol absoluto foram adicionados e o microtubo agitado por 5 segundos até a formação de uma solução homogênea. Todo o lisado foi transferido para uma coluna (contendo membrana de sílica -PureLink™ Spin Column) acoplada a um tubo de coleção, cujo conjunto foi centrifugado à 10.000 rpm por 1 min. Em seguida, foram realizados dois enxágues da membrana com 500 μL de Wash Buffer 1 (10.000 rpm por 1 minuto) e Wash Buffer 2 (10.000 rpm por 3 minutos).
Finalmente, 30μL de PureLink™ Genomic Elution Buffer foram utilizados na eluição do DNA fixado na membrana de sílica (10.000 rpm por 1 minuto). O produto final foi armazenado em ultrafreezer (-80oC).
4.5 DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO MICROBIANA POR REAL TIME PCR (Q-PCR)
A identificação e quantificação microbiana absoluta das amostras foram realizadas por meio da q-PCR (StepOne, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), usando pares de primers específicos por sistema de amplificação com sondas Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os primers empregados foram desenhados de acordo com a sequência específica altamente conservada do gene 16S do DNA ribossomal microbiano pelo Software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/) (Tabela 1). Em seguida, foram testados através do Programa NCBI BLAST do National Centerfor Biotechnology Information Server (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Para o preparo da curva padrão, foi utilizado DNA extraído de culturas puras (ct) das bactérias-alvo.
A qPCR foi empregada conforme descrito anteriormente59. Resumidamente, a amplificação da qPCR foi realizada por meio da reação total com um volume da mistura de 20uL. Cada reação foi composta por 10uL do Kit TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, São Paulo, SP, Brasil), 200nM de primer específico de cada patógeno, 50-100nM da sonda específica de cada patógeno e 2uL de DNA purificado das amostras coletadas. As amostras foram submetidas a uma amplificação inicial a 50o.C por 2 minutos, seguida de 40 ciclos a 95o.C por 15 segundos e 60o.C por 1 minuto e finalizada com uma amplificação final a 95o.C por 10 minutos. As amostras foram processadas juntamente com as curvas-padrão (controle positivo) de cada microrganismo, em triplicata e, os valores médios foram utilizados para cálculo dos níveis microbianos. As reações foram realizadas respeitandose uma eficiência de amplificação entre 110% a 93% (slope= 3,10 a -3,50) e um coeficiente de correlação (R2) 0,98%. A água esterilizada foi utilizada como controle negativo.
35
Tabela 1 - Apresentação das espécies microbianas e a sequência dos primers e sondas Taqman.
ESPÉCIES MICROBIANAS
PRIMERS
E SONDAS SEQUÊNCIA
Escherichia coli Forward 5’-TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA-3’
(Universal) Reverse 5’-TGCGGGACTTAACCCAACA-3’
(ATCC 2592) Probe 5’-CACGAGCTGACGACA(AG)CCATGCA-3’TAMRA Streptococcus oralis
(ATCC 1055)
Forward 5’-TTG GCT CAA TTC CCT TTG AC-3’ Reverse 5’-GTC CAA ACA AGC CAC CAC TT-3’
Probe 6FAM 5’-ACA ACA TAT CAA CAG GCG CA-3’TAMRA Streptococcus mutans
(ATCC 25175)
Forward 5’-GCC TAC AGC TCA GAG ATG CTA TTC T-3’ Reverse 5’-GCC ATA CAC CAC TCA TGA ATT GA-3’
Probe 6FAM 5’-TGG AAA TGA CGG TCG CCG TTA TGA A-3’TAMRA Streptococcus sobrinus
(ATCC 27607)
Forward 5’-TTC AAA GCC AAG ACC AAG CTA GT-3’ Reverse 5’-CCA GCC TGA GAT TCA GCT TGT-3’
Probe 5’-6FAM-CCTGCTCCAGCGACAAAGGCAGC-3’TAMRA
Lactobacillus casei Forward 5’-ACA GTT GCT TCT GGC CGT AT-3’
(ATCC 393) Reverse 5’-GCT TCA CCA AGA TCC AAG GT-3’
Probe VIC 5’-GAA GCC AGA TGT TAT CAA GTC TAC C-3’MGB-NFQ
Candida albicans Forward 5’-GGG TTT GCT TGA AAG ACG GTA-3’
(ATCC 26790) Reverse 5’-TTG AAG ATA TAC GTG GTG GAC GTT A-3’
Probe 6-FAM-5’-ACC TAA GCC ATT GTC AAA GCG ATC CCG-3’TAMRA
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística, utilizando os softwares SPSS V20, Minitab 16 e Excel Office 2010. No presente estudo, a hipótese nula foi rejeitada quando o valor de p foi menor ou igual a 0,05.
Para avaliar as associações entre grupo etário (<3 anos e 3-5 anos de idade), presença e graus de severidade da cárie dentária (LC, CPI e CSI) e as características socioeconômicas e a exposição ao açúcar, foi usado o teste do qui-quadrado. Para comparar o padrão de ingestão de açúcar (açúcar sólido, líquido e total) e o perfil microbiológico do biofilme supragengival, nos diferentes grupos etários avaliados, foi usada a análise de variância (ANOVA), a qual foi complementada, quando necessário, pelo teste post-hoc de Comparações Múltiplas de Tuckey para comparar os grupos aos pares e determinar com precisão entre quais grupos ocorreu a diferença. A correlação entre os microrganismos foi analisada pelo teste de correlação de Pearson.
