MINISTÉRIO DA SAÚDE FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Doutorado em Biologia Parasitária
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR, EVOLUÇÃO VIRAL E PERFIL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIRRETROVIRAIS EM UMA POPULAÇÃO DE PACIENTES INFECTADOS
POR HIV-1 E/OU HIV-2 RESIDENTES EM DIFERENTES ILHAS DO ARQUIPÉLAGO DE CABO VERDE
ISABEL INÊS MONTEIRO DE PINA ARAÚJO
Rio de Janeiro Maio de 2014
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
ISABEL INÊS MONTEIRO DE PINA ARAÚJO
Epidemiologia molecular, evolução viral e perfil de resistência aos antirretrovirais em uma população de pacientes infectados por HIV-1 e/ou HIV-2 residentes em diferentes ilhas do arquipélago de Cabo Verde
Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Parasitária
Orientadora: Prof. Dra. Mariza Gonçalves Morgado
RIO DE JANEIRO Maio de 2014
FICHA CATALOGRÁFICA A SER ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DE MANGUINHOS PARA A VERSÃO FINAL DA TESE.
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
AUTORA: ISABEL INÊS MONTEIRO DE PINA ARAÚJO
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR, EVOLUÇÃO VIRAL E PERFIL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIRRETROVIRAIS EM UMA POPULAÇÃO DE PACIENTES INFECTADOS POR HIV-1 E/OU HIV-2 RESIDENTES EM DIFERENTES ILHAS DO ARQUIPÉLAGO DE CABO VERDE
ORIENTADORA: Prof. Dra. Mariza Gonçalves Morgado Aprovada em: _____/_____/_____
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Francisco Inácio Nastos - Presidente (ICICT/Fiocruz) Prof. Dra. Selma Andrade Gomes (IOC/Fiocruz)
Prof. Dr. Marcelo Alves Soares (IB/UFRJ) Suplentes:
Prof. Dra. Natália Motta de Araújo (IOC/Fiocruz) Prof. Dr. André Felipe Andrade dos Santos (IB/UFRJ)
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Dedicatória
A todos aqueles que receberam um diagnóstico positivo para HIV. A todos que trabalham para uma vida positiva desses e de toda comunidade.
vi AGRADECIMENTOS
Decorridos mais de 20 anos, desde a primeira vez que pisei em solo brasileiro, fico muito feliz quando alguém me diz que não pareço estrangeira e/ou que já sou uma brasileira. Sinceramente, eu também me sinto parte desse país e impregnada dos seus sabores. Pois é..., considero-me hoje uma “brasiola” (brasileira + kriola). Por isso, um muito obrigado a todos os brasileiros por me receberem tão bem e permitirem que eu fizesse parte de sua história.
À minha orientadora Dra. Mariza Morgado, pesquisadora brilhante, mas que também foi amiga, companheira e mãe.
Ao CNPq pela aprovação e financiamento do projeto através do “Edital 12/2008 – PROÁFRICA”.
À CAPES pela bolsa de auxílio financeiro, através do Programa Estudante Convênio de Pós-Graduação (PEC-PG).
Ao Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz, por me permitir fazer parte do seu corpo discente e participar na manutenção da tradição de excelência em ensino e pesquisa.
À Universidade de Cabo Verde, pelo apoio em todos os momentos e principalmente por conceder-me dois anos de licença para o doutorado.
Ao Ministério da Saúde em Cabo Verde, por aprovar, acreditar e ser parte desse trabalho.
Minha homenagem e agradecimento a todos os pacientes que gentilmente aceitaram participar do estudo e a Adelaide Lima, Ana Isabel dos Santos Lima, Avelino Andrade, Ana Paula Dias Santos, António Moreira, Aretha Fortes, Benvindo Cruz, Cesarina Cruz, Claudia Santos, Claudino Mendonça, Didier Andrade, Dulce Mascarenhas, Elsa Almeida, Jaqueline Cid, Jessica Ramos, Joana Alves, Jorge Barreto, José Rocha, Júlio Lima, Lionite Correia, Liziana Barros, Maria da Luz Lima, Marina Oliveira, Myriam Rodrigues, Peter Ubah Okeke e Regina Timas, profissionais que tornaram possível esse trabalho.
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Aos pesquisadores Ana Carolina Vicente, Monick Guimarães e Gonzalo Bello pela perspicácia científica, colaboração substancial, apoio constante e por tornarem possível a elaboração do primeiro artigo do trabalho.
Aos meus colegas e amigos do LabAids – IOC/Fiocruz, pela ajuda em todas as etapas do trabalho e principalmente pela amizade, companheirismo e alegria. Se sou mais mimada hoje, a culpa é vossa.
Ao GP AMOO pela oportunidade de ser corpo e família na sexta e durante a semana.
À minha igreja do Nazareno da Praia e à Milda pelo suporte e presença apesar do oceano.
À minha prima Iolanda pelos estímulos e pelo envio de todos os documentos solicitados.
À minha família no Brasil (Ramos) e à minha família Brasileira (Bratfich) pelo amparo e pela oportunidade de ver os nossos laços se apertarem cada vez mais.
À minha amiga Monick que embelezou a minha vida com sua simplicidade, amizade e muito carinho. Vou sentir muitas saudades!
À minha amiga Sy, que me mostrou muitas belezas do Rio de Janeiro e do Brasil, mas principalmente o exemplo de amor cristão e de compromisso com Deus. E nesses quatro anos, nos tornamos nada mais nada menos que... irmãs.
A todos que me visitaram no meu humilde “apertamento”, contribuindo para que os meus dias no Rio fossem mais divertidos.
À minha família pelo apoio incondicional e por ensinar-me a celebrar a vida. “Ó profundidade da riqueza da sabedoria e do conhecimento de Deus! Quão insondáveis são os seus juízos, e inescrutáveis os seus caminhos! Quem conheceu a mente do Senhor? Ou quem foi seu conselheiro? Quem primeiro lhe deu, para que ele o recompense? Pois dele, por ele e para ele são todas as coisas. A ele seja a glória para sempre! Amém.” Romanos 11:33-36
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Epígrafe
“A vida inventa! A gente principia as coisas, não sabe por que, e desde aí perde o poder de continuação – porque a vida é mutirão de todos, por todos remexida e temperada.”
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EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR, EVOLUÇÃO VIRAL E PERFIL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIRRETROVIRAIS EM UMA POPULAÇÃO DE PACIENTES INFECTADOS
POR HIV-1 E/OU HIV-2 RESIDENTES EM DIFERENTES ILHAS DO ARQUIPÉLAGO DE CABO VERDE
RESUMO
TESE DE DOUTORADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
x
O diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV-1 e HIV-2 teve início em Cabo Verde em 1987, mas pouco se sabe a respeito da diversidade genética desses vírus nessas ilhas, localizadas na costa Ocidental Africana. Neste estudo, caracterizamos a epidemiologia molecular do HIV-1 e HIV-2 em Cabo Verde, analisamos a origem dos principais clados de HIV introduzidos no país e descrevemos a ocorrência de mutações de resistência aos antirretrovirais (DRM) em indivíduos virgens de tratamento (ARTn) e pacientes em tratamento (ARTexp) oriundos das diferentes ilhas. Amostras de sangue, dados sociodemográfico e clínico-laboratoriais foram obtidos de 221 indivíduos HIV positivos entre 2010-2011. As amostras foram sequenciadas na região da polimerase (1300 pares de bases) e análises filogenéticas e de bootscan foram realizadas para a subtipagem viral. Os algoritmos disponibilizados nos sites Stanford HIV Database e HIV-GRADE e.V. Algorithm Homepage foram utilizados para avaliar a existência de DRM em pacientes positivos para HIV-1 e HIV-2, respectivamente. Os estudos evolutivos e filogeográficos foram realizados através do programa BEAST. Entre os 221 pacientes analisados, sendo 169 (76,5%) HIV-1, 43 (19,5%) HIV-2 e 9 de (4,1%) co-infectados pelo HIV-1 e pelo HIV-2, 67% eram do sexo feminino. As medianas de idade foram de 34 (IQR = 1-75) e 47 (IQR = 12-84) para o HIV-1 e HIV-2, respectivamente. A infecção pelo HIV-1 é causada pelo subtipo G (36,6%), CRF02_AG (30,6%), subtipo F1, (9,7%), URFs (10,4%), subtipo B (5,2%), CRF05_DF (3,0%), subtipo C (2,2%), CRF06_cpx (0,7%), CRF25_cpx (0,7%) e CRF49_cpx (0,7%), e todas as infecções por HIV-2 pertencem ao grupo A. De acordo com as análises filogeográficas e de origem do HIV, estima-se que o HIV-2 foi o primeiro tipo viral introduzido em Cabo Verde e possui relações filogenéticas com sequências referências de Portugal. O HIV-1 entrou no país mais tarde, primeiramente pelo subtipo G, evidenciando relações com sequências da África Central e de Portugal. Transmissão de DRM (TDRM) foi observada em 3,4% (2/58) de pacientes HIV-1 ARTn (1,7% NRTI, NNRTI 1,7%), mas não entre os infectados com HIV-2. Entre os pacientes ARTexp, DRM foi observada em 47,8% (33/69) dos infectados pelo HIV-1 (37,7% NRTI, NNRTI 37,7%, 7,4% de PI, 33,3% para duas classes) e 17,6% (3/17) nos infectados pelo HIV-2 (17,6%, 11,8% NRTI PI, 11,8% para ambas as classes). Este estudo indica que Cabo Verde tem um cenário epidemiológico molecular complexo e único dominado pelo HIV-1 subtipo G, CRF02_AG e F1 e HIV-2 grupo A, sendo esse o primeiro tipo viral introduzido em Cabo Verde. A ocorrência de TDRM e o nível relativamente elevado de DRM entre os pacientes tratados constituem uma preocupação, pelo que o monitoramento contínuo dos pacientes em ARTexp, incluindo genotipagem são políticas públicas a serem implementadas.
xi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
MOLECULAR EPIDEMIOLOGY, VIRAL EVOLUTION AND PROFILE OF DRUG RESISTANCE MUTATIONS AMONG HIV-1 AND/OR HIV-2 INFECTED PATIENTS
FROM DISTINCT ISLANDS OF THE CAPE VERDE ARCHIPELAGO
ABSTRACT
PHD THESIS IN PARASITOLOGIC BIOLOGY
xii
HIV-1 and HIV-2 have been detected in Cape Verde since 1987, but little is known regarding the genetic diversity of these viruses in this archipelago, located near the West African coast. In this study, we characterized the molecular epidemiology of HIV-1 and HIV-2, analyzed the origin of the major clades of HIV introduced in Cape Verde and described the occurrence of drug resistance mutations (DRM) among antiretroviral therapy naïve (ARTn) patients and patients under treatment (ARTexp) from different Cape Verde islands. Blood samples, socio-demographic and clinical-laboratory data were obtained from 221 HIV-positive individuals during 2010-2011. Genetic sequencing of the pol region (1300bp) was obtained and phylogenetic and bootscan analyses were performed for viral subtyping. The evolutionary and phylogeographic studies were performed using the program BEAST. 1 and HIV-2 DRM were evaluated for ARTn and ARTexp patients using the Stanford HIV Database and HIV-GRADE e.V. Algorithm Homepage, respectively. Among the 221 patients (169 [76.5%] HIV-1, 43 [19.5%] HIV-2 and 9 [4.1%] HIV-1/HIV-2 co-infections), 67% were female. The median ages were 34 (IQR=1-75) and 47 (IQR=12-84) for HIV-1 and HIV-2, respectively. HIV-1 infections were due to subtypes G (36.6%), CRF02_AG (30.6%), F1 (9.7%), URFs (10.4%), B (5.2%), CRF05_DF (3.0%), C (2.2%), CRF06_cpx (0.7%), CRF25_cpx (0.7%) and CRF49_cpx (0.7%), whereas all HIV-2 infections belonged to group A. According the HIV phylogeographic analyses, it is estimated that HIV-2 was the first viral type introduced in Cape Verde and has phylogenetic relationships with referral sequences of Portugal. The HIV-1 was introduced in the country later on, due to infections with subtype G, showing phylogenetic relationships with sequences from Central Africa and Portugal. Transmitted DRM (TDRM) was observed in 3.4% (2/58) of ARTn HIV-1-infected patients (1.7% NRTI, 1.7% NNRTI), but not among those with HIV-2. Among ARTexp patients, DRM was observed in 47.8% (33/69) of HIV-1 (37.7% NRTI, 37.7% NNRTI, 7.4% PI, 33.3% for two classes) and 17.6% (3/17) of HIV-2-infections (17.6% NRTI, 11.8% PI, 11.8% both). This study indicates that Cape Verde has a complex and unique HIV-1 molecular epidemiological scenario dominated by HIV-1 subtypes G, CRF02_AG and F1 and HIV-2 group A. The occurrence of TDRM and the relatively high level of DRM among treated patients are of concern. Continuous monitoring of patients on ART, including genotyping, are public policies to be implemented.
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
ÉPIDÉMIOLOGIE MOLÉCULAIRE, ÉVOLUTION VIRALE ET PROFIL DES MUTATIONS DE RÉSISTANCE AUX ANTIRÉTROVIRAUX DANS UNE POPULATION DE PATIENTS INFECTÉS PAR LE VIH-1 ET/OU VIH-2 RÉSIDANT
DANS LES DIFFÉRENTES ÎLES DE L'ARCHIPEL DU CAP-VERT
RÉSUMÉ
THÈSE DE DOCTORAT EN BIOLOGIE PARASITAIRE
xiv
Le diagnostic sérologique de l’infection par VIH-1 et VIH-2 a commencé au Cap-Vert en 1987, mais on en sait peu sur la diversité génétique de ces virus, dans ces îles situées sur la côte ouest-africaine. Dans cette étude, nous caractérisons l’épidémiologie moléculaire du VIH-1 et VIH-2 au Cap-Vert, nous analysons l’origine des principaux clades du VIH introduits dans le pays, et nous décrivons l’apparition de mutations de résistance aux antirétroviraux (DRM) chez les individus vierges de traitement (ARTn) et les patients sous traitement (ARTexp) provenant des différentes îles. Des échantillons de sang, ainsi que des données sociodémographiques, cliniques et de laboratoire ont été obtenus à partir de 221 personnes séropositives entre 2010 à 2011. Les échantillons ont été séquencés dans le pol (1300bp) et des analyses phylogénétiques et de bootscan ont été réalisées pour le sous-typage viral. Les algorithmes disponibles sur les sites Internet Stanford HIV Database et HIV-GRADE e.V. Algorithm Homepage ont été utilisés pour évaluer la présence de DRM chez les patients positifs pour le VIH-1 et VIH-2, respectivement. Les études évolutives et phylogéographiques ont été réalisées à l’aide du programme BEAST. Parmi les 221 patients analysés, dont 169 (76,5%) VIH-1, 43 (19,5%) VIH-2 et 9 (4,1%) co-infectés par le VIH-1 et VIH-2, 67% étaient des femmes. L’âge médian a été de 34 (IQR = 1-75) et 47 (IQR = 12-84) pour le VIH-1 et VIH-2, respectivement. L’infection par le VIH-1 est causée par le sous-type G (36,6%), CRF02_AG (30,6%), le sous-type F1, (9,7%), URFs (10,4%), le sous-type B (5.2 %), CRF05_DF (3,0%), le sous-type C (2,2%), CRF06_cpx (0,7%), CRF25_cpx (0,7%) et CRF49_cpx (0,7%), et toutes les infections par le VIH-2 appartiennent au groupe A. Selon les analyses phylogéographiques et de l’origine du VIH, on estime que le VIH-2 a été le premier type viral introduit au Cap-Vert et qu’il entretient des relations phylogénétiques avec des séquences références du Portugal. Le VIH-1 est entré plus tard dans le pays, d’abord par le sous-type G, montrant des séquences de relations avec l’Afrique centrale et le Portugal. La transmission de DRM (TDRM) a été observée chez 3,4% (2/58) des patients VIH-1 ARTn (1,7% NRTI, NNRTI 1,7%), mais pas chez les personnes infectées par le VIH-2. Parmi les patients ARTexp, les DRM ont été observées chez 47,8% (33/69) des infectés par le VIH-1 (37,7% NRTI, NNRTI 37,7%, 7,4% de PI, 33,3% pour les deux classes) et 17,6% (3/17) chez les patients infectés par le VIH-2 (17,6%, 11,8% NRTI PI, 11,8% pour les deux catégories). Cette étude indique que le Cap-Vert a un scénario épidémiologique moléculaire complexe et unique, dominé par le VIH-1 sous-type G, CRF02_AG et F1 et le VIH-2 du groupe A, celui-ci étant le premier type viral introduit au Cap-Vert. L’apparition de TDRM et le niveau relativement élevé des DRM chez les patients traités représentent une préoccupation, à telle enseigne que la surveillance continue des patients sous TARV, y compris le génotypage sont des politiques publiques à mettre en œuvre.
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
EPIDEMIOLUJIA MOLEKULAR, IVOLUSON VIRAL Y PERFIL DI RAZISTÉNSIA PA ANTIRETROVIRAL NA UN GRUPU DI PASIENTI INFETADU PA HIV-1 Y/Ô HIV-2 KI TA MORA NA DIFERENTIS ILHAS DI ARKIPÉLAGU DI KABU VERDI
EPIDEMIOLUJIA
RIZUMU
TESI DI DOTORADU NA BIOLOJIA PARASIARIA
xvi
Na Kabu Verdi, testi sorolójiku pa djobe antikorpus anti-HIV-1 y 2 kumesa ta fazedu na 1987, má sabedu poku sobri diversidadi jenétiku di es vírus, na kes ilha li, ki ta fika na kósta osidental di África. Nes studu, nu karateriza epidemiolojia molekular di HIV-1 y HIV-2 na Kabu Verdi, nu djobe oriji di kes prinsipal subtipu di HIV ki entra na Kabu Verdi y nu diskreve kazus di mutason ki ta da razisténsia pa antiretroviral (DRM) na kenha ki ka sta na tratamentu y na pasienti ki sta na tratamentu, di diferentis ilha. Na 2010 y 2011, nu konsigi amostra di sangi, dadus sosio-demográfikus y kliniku-laboratorial di 221 algen HIV puzitivu. Nu sekuensia rijion pol (1300bp) di kes amostra li y nu fase análizi di filojenia y di bootscan pa nu sabe subtipu di vírus. Pa studa ivoluson y filojiografia di vírus nu uza prugrama BEAST. Pa djobe si kes amostra ten mutason di razisténsia pa antiretroviral nu uza prugrama di saite di Stanford HIV Database pa HIV-1 y HIV-GRADE e.V. Algorithm Homepage pa HIV-2. Di kes 221 pasienti ki studadu, 169 (76,5%) ten HIV-1, 43 (19,5%) ten HIV-2 y 9 (4,1%) ten HIV-1 y HIV-2; 67% é mudjer. Mediana di idadi foi 34 (IQR = 1-75) pa HIV-1 y 47 (IQR = 12-84) pa HIV-2. Infeson pa HIV-1 é provokadu pa subtipu G (36,6%), CRF02_AG (30,6%), subtipu F1, (9,7%), URFs (10,4%), subtipu B (5,2%), CRF05_DF (3,0%), subtipu C (2,2%), CRF06_cpx (0,7%), CRF25_cpx (0,7%) y CRF49_cpx (0,7%), y tudu infeson provokadu pa HIV-2 é di grupu A. Di akordu ku análizi di filojiografia y di oriji di HIV, ta parse ma purmeru tipu di vírus ki entra na Kabu Verdi foi HIV-2 y e ten rilason filogenétiku ku sekuénsias konxidu di Portugal. Transmison di mutason di razisténsia pa antiretroviral (TDRM) atxadu na 3,4% (2/58) pasienti virjen di tratamentu (ARTn) (1,7% NRTI, NNRTI 1,7%), má ka atxadu na algen infetadu pa HIV-2. Na kes pasienti ki sta ku tratamentu (ARTexp), DRM atxadu na 47,8% (33/69) di algen infetadu pa VIH-1 (37,7% NRTI, 37,7% NNRTI, 7,4% PI, 33,3% na dôs tipu di ramedi) y 17,6% (3/17) na kes infetadu pa HIV-2 (17,6% NRTI, 11,8% PI y 11,8% pa tudu dôs). Kel studu li ta mostra ma Kabu Verdi ten un kuadru di epidemiulujia mulekular konpléksu, diferenti y partikular ku más HIV-1 di subtipu G, CRF02_AG y F1 y HIV-2 grupu A, ki foi purmeru tipu di virus ki entra na Kabu Verdi. Prezénsa di TDRM y kuantidadi di DRM na kes pasienti ki sta ta tratadu, é un priokupason, y purisu monitoramentu kontinuadu di kes algen li y inkluzon di jenotipaji é pulítika di saúdi públika ki debe ser kolokadu na prátika.
xvii ÍNDICE PÁGINA RESUMO IX ABSTRACT xi RÉSUMÉ xiii RIZUMU xv I. INTRODUÇÃO 1 1.1) O Vírus 2 1.1.1) Origem 4
1.1.2) Infecção e Replicação Viral 7
1.1.3) Patogenia 9
1.1.4) Transmissão 11
1.2) Diversidade e Epidemiologia Molecular 12
1.3) Tratamento e Resistência 18
1.4) Cabo Verde 25
1.4.1) Características Geográficas e Sócio-demográficas 26
1.4.2) HIV em Cabo Verde 28
1.5) Justificativa 32
II. OBJETIVOS 34
2.1) Objetivo Geral 34
2.2) Objetivos Específicos 34
III. MATERIAL E MÉTODOS 35
3.1) População de Estudo 35
3.2) Manejo de Amostras 36
3.3) Tipagem molecular do HIV 36
3.4) Análise de estruturação geográfica entre ilhas e regiões de Cabo
Verde 39
3.5) Análise da origem dos principais clados de HIV introduzidos em
Cabo Verde 39
3.6) Análise de Mutação de Resistência 41
3.7) Análise Estatística 41
xviii
IV. RESULTADOS 43
4.1) Caracterização Genética do HIV-1 e HIV-2 46
4.2) Análise dos dados sociodemográficos e clínicos de pacientes HIV-1
de Cabo Verde, de acordo com a diversidade molecular 56 4.3) Estudo de relações de transmissão entre Regiões 60
4.4) Análise Filogeográfica e Origem do HIV 61
4.5) Identificação e caracterização de Mutações de resistência a drogas ARV em pacientes virgens de tratamento e pacientes sob tratamento infectados pelo HIV-1 e HIV-2
73
V. DISCUSSÃO 79
VI. CONCLUSÕES 94
VII. PERSPECTIVAS 97
VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 98
IX. APÊNDICES 114
Apêndice 1 - Termo de Consentimento Livre Esclarecido
Apêndice 2 - Ficha Clínica e de Investigação Soro-Epidemiológica Apêndice 3 - Artigo publicado
xix ÍNDICE DE FIGURAS
Página Figura 1: Estrutura do HIV destacando o RNA, as proteínas do Gag (MA:
Matriz, CA: Capsídeo e NC: Nucleocapsídeo); Pol (Pro: Protease, IN: Integrase e RT: Transcriptase Reversa) e Env (TM: Transmembrana e SU: Superfície)
3
Figura 2: Representação do genoma viral do HIV-1 e HIV-2 destacando genes estruturais (gag, pol e env); genes acessórios (vif, vpr, vpu/vpx, rev, tat e nev) e LTR´s
4
Figura 3: Árvore Filogenética SIV/HIV 6
Figura 4: Ciclo Replicativo do HIV representando as fases iniciais e tardias da replicação viral
9 Figura 5: Curso clínico da infecção pelo HIV evidenciando a fase aguda, a
latência clínica e a fase sintomática
11 Figura 6: Distribuição mundial dos subtipos e formas recombinantes do
HIV-1
17 Figura 7: Alvos terapêuticos dos Antirretrovirais. São apresentados as
cinco classes de antirretrovirais e os alvos de atuação
21 Figura 8: Localização e distribuição das ilhas de Cabo Verde 26 Figura 9. Gráfico representativo da diversidade molecular do HIV-1 em
Cabo Verde
46 Figura 10: Árvore filogenética da região pol do HIV-1 indicando os
subtipos de HIV-1 encontrados nas amostras de Cabo Verde
48 Figura 11: Árvore filogenética da região pol do HIV-1 com os principais
CRFs e URFs das amostras de Cabo Verde
50 Figura 12a) Árvore filogenética da região pol do HIV-1 com os URFs das
amostras de Cabo Verde.
52 Figura 12b) Análise de BootScan dos principais HIV-1 URF 53 Figura 13: Árvore filogenética da região pol do HIV-2 das amostras de
Cabo Verde
55 Figura 14: Distribuição dos principais subtipos e formas recombinantes do
HIV-1 encontrados em Cabo verde de acordo com o local de residência
59 Figura 15: Análise Bayesiana de amostras africanas e europeias
classificadas como HIV-2A na região da pol
62 Figura 16: Análise Bayesiana de amostras classificadas como subtipo G
do HIV-1 na região da pol
65 Figura 17: Árvore filogenética de ML de amostras do subtipo G e
CRF14_BG do HIV-1 na região da pol
67 Figura 18: Análise Bayesiana de amostras do subtipo G de Cabo Verde
classificadas como clado GCV-I e sequências relacionadas selecionadas a partir da árvore de ML (Fig. 15).
69
Figura 19: Análise Bayesiana de amostras africanas e europeias classificadas como CRF02_AG do HIV-1 na região da pol
xx LISTA DE TABELAS
Página Tabela 1: Características sociodemográficos e clínicas de 221 indivíduos
soropositivas para o HIV de Cabo Verde distribuídas de acordo com o tipo viral
45
Tabela 2: Características sociodemográficos e clínicas das 134 sequências dos indivíduos soropositivos para o HIV-1 distribuídas de acordo com caracterização molecular
57
Tabela 3: Teste de agrupamento filogenético das sequências de HIV de
Cabo Verde de acordo com a região geográfica de origem 60 Tabela 4: Origem e data de introdução das principais variantes de HIV-1 e
HIV-2 que circulam em Cabo Verde. 63
Tabela 5: Origem e data de introdução do clado GCV-I. 70 Tabela 6: Distribuição das Mutações de Resistência a Drogas em
xxi LISTA DE QUADRO
Página Quadro 1: Esquema Terapêutico usado em Cabo Verde para tratamento
de pacientes infectados pelo HIV-1 e HIV-2 30
Quadro 2: Distribuição dos indivíduos participantes do estudo de acordo
com a ilha de residência 35
Quadro 3: Mutação de resistência do HIV-1 de acordo com a classe de
xxii Lista de Siglas e Abreviaturas
3TC Lamivudina
Aids Síndrome da Imunodeficiência Adquirida ARTv Virgens de tratamento antirretroviral ARTexp Em uso de tratamento antirretroviral ARV Antirretroviral
AZT Azidotimidina ou zidovudina
CA Capsídeo
Capes Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior CCR-5 Receptor de células humanas para quimiocina da família CC tipo 5 CCR7 Receptor de células humanas para quimiocina da família CC tipo 7 CD Cluster of differentiation
CEDEAO Comunidade Econômica dos Estados da África Ocidental CRF Forma(s) recombinante(s) circulante(s)
CTL Linfócito T citotóxico CV Carga viral
CXCR-4 Receptor de células humanas para quimiocina da família CXC d4T Estavudina
DRM Mutações de resistência a drogas DRV Darunavir
DNA Ácido desoxirribonucléico
DNAc Ácido desoxirribonucleico complementar dNTPs Deoxinucleotídeo Trifosfato
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra Acético EFV Efavirenz
env Envelope
FDA Food and Drug Administration Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz
GALT Tecido Linfoide Associado à Mucosa gag Grupo de Antígeno Especifico
Gp Glicoproteína do envelope do HIV-1 HAART Terapia Antirretroviral Altamente Ativa
Highly Active Antiretroviral Therapy HBV Vírus da hepatite B
HCV Vírus da Hepatite C
HIV-1 Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 HIV-2 Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 2 HLA Antígeno Leucocitário Humano
HTLV Vírus Linfotrópico T Humano
IEC Informação, Educação e Comunicação IFN-γ Interferon gama
Igs Imunoglobulinas
xxiii IN Integrase
INI Inibidores da integrase
INNTRs Inibidores Não Nucleosídicos da Transcriptase Reversa
INTRs Inibidores Nucleosídicos/Nucleotídios da Transcriptase Reversa IOC Instituto Oswaldo Cruz
LabAids Laboratório de AIDS e Imunologia Molecular LPV Lopinavir
LTR Longa sequência terminal repetitiva
MA Matriz
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade NC Nucleocapsídeo
NFV Nelfinavir
nef Negative Factor NVP Nevirapina NK Natural killer
OMS Organização Mundial da Saúde
PBMC Células Mononucleares do Sangue Periférico PCR Reação em cadeia da polimerase
PI Inibidores da protease pol Polimerase
PR Protease
PEC-PG Programa de Estudante Convênio de Pós-Graduação PTV Prevenção da Transmissão Vertical
rev Regulator of Virion gene expression RTV Ritonavir
RNA Ácido ribonucleico RT Transcriptase Reversa
RT-PCR Transcrição Reversa seguida da Reacção da Polimerase em Cadeia SIV Do inglês, Vírus da Imunodeficiência Símia
SU Proteína de superfície do envelope viral TAMs Mutações de resistência análogo à timidina tat Transcriptional Activator
TARV Tratamento com antirretroviral
TDRM Mutações transmitidas de resistência a drogas TM Proteína transmembrana
Uni-CV Universidade de Cabo Verde
Unaids Programa Conjunto das Nações Unidas sobre HIV/Aids URF Formas de Recombinantes Únicas
vif Viral Infection Factor vpr Viral Protein r
vpu Viral Protein u vpx Viral Protein x
1
I. INTRODUÇÃO
O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (aids), continua a ser um desafio no século XXI, mesmo após decorridos mais de 30 anos da sua descoberta (Barré-Sinoussi et al., 1983). As estatísticas em todo o mundo e em regiões específicas nos mostram o quão longe e grande é esse desafio. Apesar do conhecimento adquirido, meios de diagnóstico, tratamento e monitoramento cada vez mais potentes e acessíveis a pessoas e áreas anteriormente inacessíveis, o número de novos casos por dia supera o número de casos que iniciam o tratamento por dia. Desde a descoberta dos primeiros casos de aids no início dos anos 80, 65 milhões de pessoas contraíram o HIV em todo o mundo, das quais 25 milhões morreram. Segundo relatório anual da Unaids, no final de 2012, 35,3 milhões de pessoas viviam com o HIV, cerca de 8 milhões receberam tratamento antirretroviral, houve 2,3 milhões de novas infecções e 1,6 milhões morreram devido às complicações da doença (Unaids, 2013).
Sendo o continente africano, principalmente a África subsaariana, a região mais afetada pelo HIV a nível mundial, esforços têm sido feitos a fim de diminuir o impacto da aids nessa região. Assim, em sete anos, o número de africanos em tratamento com antirretrovirais passou de um milhão, em 2005, para 7 milhões, em 2012 e consequentemente com redução de mortes devido à aids em 32%, no mesmo período (UNAIDS, 2013a; Unaids.org, 2013). De modo geral, as crescentes campanhas de prevenção aliadas ao diagnóstico precoce, prevenção da transmissão vertical e o acesso ao tratamento, têm contribuído para um ligeiro, mas contínuo abrandamento no número de casos novos, da diminuição do número de crianças soropositivas e de mortes relacionadas à aids.
2 1.1) O Vírus
O HIV é um retrovírus da família Retroviridae, sub-família Lentivirinae e gênero Lentivirus, nome esse que caracteriza o comportamento do vírus, devido ao longo período existente entre a infecção e o desenvolvimento da doença causada pelo vírus (Haase, 1986). Os retrovírus são vírus RNA capazes de copiar seu genoma em uma dupla fita de DNA e integrar-se ao genoma da célula hospedeira, graças às enzimas Transcriptase Reversa (RT) e Integrase (IN) (Turner and Summers, 1999), respectivamente.
A partícula viral, de formato esférico tem um diâmetro de aproximadamente 90-120nm (Fig. 1). É formada pelo Envelope (env), constituído do mesmo material da membrana celular que engloba as glicoproteínas. Logo abaixo vem a matriz proteica envolvendo o capsídeo de formato cônico. O capsídeo por sua vez envolve o nucleocapsídeo, onde se encontra o genoma viral. O genoma do HIV é composto por duas cópias de RNA de fita simples positiva de 9,5kb de comprimento e nove genes com funções específicas, denominados gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu ou vpx (no caso de HIV-1 e HIV-2, respectivamente) e nef, flanqueados por longas sequências terminais repetitivas (LTRs) (Girard et al., 2011; Sundquist and Kräusslich, 2012). Os genes responsáveis pela codificação de proteínas estruturais e enzimáticas são, na ordem 5´ - 3´: gag (group-specific antigen), responsável pela codificação das proteínas da matriz, capsídeo e do nucleocapsídeo; pol (polimerase), que codifica as enzimas envolvidas na replicação e integração viral – Transcriptase Reversa (RT), Protease (PR) e Integrase (IN), e env (envelope), que codifica as glicoproteínas do envelope como a subunidade externa (gp120) e a subunidade transmembranar (gp41), que se associam de forma não covalente formando uma unidade trimérica na superfície do virion, Tat (Transcriptional Activator) e rev (Regulator of Virion gene expression.) são genes regulatórios e vif
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(Viral Infection Factor), vpr (Viral Protein r), vpu (Viral Protein u) ou vpx (Viral Protein x) e nef (Negative Factor) são genes acessórios, essenciais à eficiente produção do vírus in vivo (Fig. 2) (Girard et al., 2011). Os LTRs são indispensáveis à integração do provírus no DNA da célula hospedeira (Turner and Summers, 1999).
Figura 1. Estrutura do HIV destacando o RNA, as proteínas do Gag (MA: Matriz, CA: Capsídeo e NC: Nucleocapsídeo); Pol (Pro: Protease, IN: Integrase e RT: Transcriptase Reversa) e Env (TM: Transmembrana e SU: Superfície). Obtida a partir de Rodrigues, 2011 (Ana Rodrigues, 2011)
4 HIV-1
HIV-2
Figura 2. Representação do genoma viral do HIV-1 e HIV-2 destacando os genes estruturais (gag, pol e env), os genes acessórios (vif, vpr, vpu/vpx e nev), os genes regulatórios (rev e tat) e a extremidade LTR´s. Adaptado de Freed, 2004 (Freed, 2004).
1.1.1) Origem
A infecção pelo HIV é descrita como uma zoonose provocada por transferências de vírus que infectam primatas do continente Africano para o homem (Sharp and Hahn, 2011). A emergência do HIV na população humana é resultante de exposições e transmissões entre espécies do Vírus da Imunodeficiência Símia (SIV) que infecta primatas não-humanos. Os principais primatas envolvidos nessa transmissão, estão representados na Figura 3 e são principalmente chimpanzés da espécie Pan troglodytes troglodytes e macacos da espécie Cercocebus torquatus atys, para HIV-1 e HIV-2 respectivamente (Wertheim and Worobey, 2009). Sendo assim, o HIV-1 é geneticamente mais próximo do SIV isolado do chimpanzé, com 75 – 85% de homologia, enquanto que o HIV-2 é geneticamente mais próximo do SIV isolado do Sooty mangabey, com 30 – 40% de homologia (Sharp and Hahn, 2011). No entanto, não está descartada a hipótese de ter havido hospedeiros intermediários entre chimpanzés e humanos.
rev gag pol vif 3´ LTR tat nef env vpr vpu rev 5
´ LTR gag pol vif
3´ LTR tat nef env vpx vpr 5´ LTR 5´ LTR
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A descoberta de novos métodos de análise e equipamentos cada vez mais sofisticados têm favorecido datações cada vez mais precisas quanto à origem do HIV. Por exemplo, Korber et al., com a utilização de supercomputadores e técnicas baseadas na evolução filogenética do vírus, estimaram que o HIV-1 grupo M teve sua origem em 1931 [1915-1941] (Korber et al., 2000). No entanto, quatro anos mais tarde, e na posse de metodologias ainda mais sofisticadas essa estimativa passa para 1908 (1884-1924), enquanto que para HIV-1 grupo O essa previsão é para 1920 (1890-1940) (Wertheim and Worobey, 2009). A estimativa de origem para o HIV-2A e B é de 1940 [1924-1956] e 1945 [1931-1959] respectivamente (Wertheim and Worobey, 2009). Estudos baseados em métodos de inferência através do relógio-molecular e baseado na observação de mudanças de nucleotídeos podem contribuir para determinar o momento em que houve a transmissão dos primatas não-humanos para o homem, tornando-se uma investigação primordial e prioritária em matéria de HIV/aids.
A África Oriental é considerada o epicentro da infecção pelo HIV-1 (Reeves and Doms, 2002). Os primeiros relatos de infecção pelo HIV-1 na África foram provenientes da África Oriental e Central (Le Guenno, 1989). Estudos apontam que o HIV-1 está presente na África Central desde o início do século XX, onde são encontrados praticamente todos os grupos e subtipos de HIV-1 e de onde emergiram no início da década de 30 (1931; IC 1915-1945) (Korber et al., 2000); e cerca de 50-60 anos após já se apresentava em praticamente todos os países do mundo. A África Ocidental é considerada o epicentro da epidemia pelo HIV-2, que parece estar presente nessa região desde meados do século XX, com foco em países como Guiné-Bissau, Cabo Verde, Gâmbia e Senegal (De Cock et al., 1993; Léonard et al., 1993; Marlink et al., 1994; Reeves and Doms, 2002).
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Figura 3. Árvore Filogenética SIV/HIV obtida a partir de Rambaut, 2004 (Rambaut et al., 2004)
7 1.1.2) Infecção e Replicação Viral
O HIV infecta uma grande variedade de células do sistema imune, entre elas os macrófagos, linfócitos T e células dendríticas, dentre outros tipos celulares, que apresentam o receptor celular denominado CD4+ expresso por essas células e moléculas denominadas de co-receptores (Balasubramaniam and Freed, 2011). O ciclo replicativo do HIV pode ser dividido em fases iniciais e tardias, como representado na Figura 4. A entrada do vírus na célula inicia-se com a adsorção da partícula viral através de duas glicoproteínas do envelope viral (Gp120 e Gp41). A Gp120 reconhece o receptor CD4+ na superfície da célula provocando mudanças conformacionais e recrutamento dos co-receptores da família das quimiocinas, que são, principalmente, as moléculas denominadas CCR5 e CXCR4, essenciais para a adsorção e entrada do vírus na célula. A seguir, a gp41 efetua a fusão das membranas viral e celular, propiciando a introdução do capsídeo viral no citoplasma da célula hospedeira. Uma vez dentro da célula, a replicação do HIV é idêntica aos demais retrovírus conhecidos. A transcriptase reversa transforma o RNA em DNA complementar (cDNA), que é transportado para o núcleo e se integra ao genoma da célula hospedeira pela ação da enzima Integrase, produzindo assim o provírus (Girard et al., 2011). Esse, por sua vez, prossegue os passos até a produção de uma nova partícula viral ou pode permanecer latente, fato esse relacionado à não ativação das células T, tendo as células hospedeiras como reservatórios. Esses reservatórios, compostos por linfócitos TCD4+, recentemente demonstrados como sendo, principalmente, de fenótipo de memória central (Stockinger et al., 2006), monócitos, macrófagos e células dendríticas, são encontrados no tecido linfoide. No entanto, outras células do sistema nervoso central, gastrointestinal e urogenital masculino podem servir como reservatórios virais.
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Para produção de nova partícula viral é necessário a ativação celular para que haja transcrição do genoma viral. O gene tat codifica uma proteína transativação que impede a cessação prematura do provírus transcrito através da ligação da extremidade 5´das moléculas de RNAm, aumentando a produção de RNAm (Girard et al., 2011). Estes são transportados para o citoplasma com auxílio da proteína rev e traduzidos pelos ribossomos. O gene rev codifica uma proteína que se liga a um elemento de sequência específica, o que permite o seu transporte a partir do núcleo para o citoplasma, e a expressão das proteínas estruturais gag, pol e env. Rev controla, assim, a chave a partir de uma fase precoce do ciclo, quando apenas proteínas reguladoras são sintetizadas, para uma fase tardia, quando as proteínas estruturais são sintetizadas e há produção de vírions (Girard et al., 2011). Essas proteínas interagem entre si iniciando a montagem do vírion e o seu brotamento. A maturação da partícula viral acontece após rearranjo das proteínas virais e alterações conformacionais induzindo à ativação da protease, responsável por clivar as poliproteínas percursoras gag-pol, indispensáveis para que essa partícula tenha capacidade infectiva (Turner and Summers, 1999).
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Figura 4. Ciclo Replicativo do HIV representando as fases iniciais e tardias da replicação viral. obtida a partir de Turner & Summers, 1999 (Turner and Summers, 1999)
1.1.3) Patogenia
A história natural da infecção pelo HIV é caracterizada por um quadro de síndrome viral aguda – Fase aguda; por um período assintomático – Fase assintomática ou Latência Clínica, e por um período de doença – Fase Sintomática (Fauci et al., 1996). A diferença no comportamento nessas três fases da infecção levou à classificação de 3 modelos de progressão para a doença entre os indivíduos infectados pelo HIV-1, nomeados de progressores rápidos – que constituem cerca
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de 10 a 15% dos infectados e progridem para aids num período de 2 a 3 anos; progressores típicos – que constituem a maioria dos indivíduos infectados (70 – 80%) e possuem um tempo de latência entre a infecção e os sintomas da doença entre 6 a 8 anos; e os não-progressores representando 5% dos casos, constituídos por indivíduos que permanecem assintomáticos por períodos longos (10 a 15 anos de infecção) (Fauci et al., 1996). Em relação ao HIV-2, sabe-se que a progressão para a doença ocorre naturalmente de forma mais lenta em relação ao HIV-1, sugerindo que indivíduos não-progressores são a maioria entre os infectados pelo HIV-2 (Nyamweya et al., 2013).
Na primeira fase da infecção, denominada de síndrome viral aguda, há uma rápida depleção de linfócitos TCD4+, que rapidamente é recuperada e poderá ocorrer síndrome febril (Girard et al., 2011). Diferentemente de muitos outros vírus em que a infecção induz a uma imunidade protetora persistente, no HIV, a resposta imune da fase aguda não é capaz de eliminar o vírus (Girard et al., 2011). Logo após inicia-se um período assintomático extenso, que pode variar entre 2 a 10 ou mais anos. Essa fase é caracterizada por valores normais de CD4+ e replicação viral mínima num primeiro momento. Sabe-se, no entanto, que nessa fase há infecção de novas células CD4+ e outras células do sistema imune, causando uma replicação viral acentuada e consequentemente infecção e perda gradual de linfócitos TCD4+ (Girard et al., 2011). Após este período inicia-se então a Fase Sintomática, pois a depleção imunológica provocada contribui para a perda da imunidade celular e, consequentemente, o aparecimento de infecções oportunistas e neoplasias levando à fase de doença (Girard et al., 2011). A Figura 5 representa de forma esquemática essas fases. A introdução cada vez mais precoce da terapia antirretroviral tem contribuído sobremaneira para alterar essa história natural, permitindo um controle
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precoce da replicação viral, manutenção da imunidade e redução da morbidade e mortalidade na infecção pelo HIV (Cohen et al., 2012; Montaner et al., 2014).
Figura 5. Curso clínico da infecção pelo HIV evidenciando a fase aguda, a latência clínica e a fase sintomática. Adaptado de Pantaleo et al., 1993 (Pantaleo et al., 1993)
1.1.4) Transmissão
A transmissão do HIV se dá por fluídos orgânicos nomeadamente sangue e seus derivados, esperma, fluído vaginal e leite materno. As principais vias de transmissão são a sexual e vertical (mãe – filho).
A transmissão através de transfusão de sangue e seus derivados, manipulação e uso de materiais infectados e acidentes com materiais contaminados, tiveram grande impacto no número de casos novos de HIV no inicio da epidemia, quando ainda era insípido o conhecimento das vias de transmissão e dos meios de diagnóstico. O rastreio em Bancos de Sangue, o uso de material estéril e de
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proteção individual em caso de manuseio de sangue e outros fluidos biológicos foram formas eficazes na prevenção da transmissão do HIV em grande escala. O uso de preservativos nas relações sexuais, as campanhas de Informação, Educação e Comunicação (IEC) para a prevenção massivamente levada a cabo em todas as regiões e atingindo todas as pessoas e ao mesmo tempo priorizando grupos com maiores vulnerabilidades, foram essenciais para o maior conhecimento da nova epidemia e consequentemente um agir responsável que minimiza a transmissão. Simultaneamente, programas de Prevenção da Transmissão Vertical (PTV) foram assumidos como prioridade por governos e países, facilitando o rastreio da infecção durante a gravidez e priorizando medidas e tratamento que evitem a transmissão de mãe para o recém-nascido. Mais recentemente, o tratamento antirretroviral, como medida de prevenção da transmissão sexual, por diminuir a carga viral e consequentemente a capacidade de transmissão (Cohen et al., 2012), tem sido adotado e encorajado por várias organizações e países (UNAIDS, 2013b).
1.2) Diversidade e Epidemiologia Molecular
Sendo um vírus RNA, o HIV tem alta taxa de variabilidade genética e antigênica, principalmente devido à frequência de replicação e a falta de correção da RT, elevando a taxa de mutação e de recombinação por ciclo viral. Outro fator descrito que contribui no incremento da diversidade genética do HIV-1 é a ação das APOBECs principalmente a APOBEC3G. Sabe-se que o DNAc sofre deaminação por ação das APOBECs, levando à hipermutação G A do DNAc viral, que se acumula ao longo do genoma viral (Mangeat et al., 2003; Zhang et al., 2003). Devido a sua grande variabilidade, associado, entre outros fatores, a diferentes eventos zoonóticos, várias cepas são encontradas ao redor do mundo, o que obrigou, em 1993, o estabelecimento de uma classificação filogenética dos dois vírus. A
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classificação atual de HIV com base nos genomas virais completos foi proposta em 2000, agrupando-as em dois tipos, o HIV-1 e HIV-2.
As amostras que pertencem ao tipo mais comum, o HIV-1, são divididas em quatro grupos, M, N, O e P (Vallari et al., 2011). No grupo M, responsável pela pandemia, as amostras são divididas em nove subtipos (AD, FH, J e K) sete sub-subtipos (A1-A5, F1-F2), e um grande número de formas recombinantes Circulantes (CRFs) (Brian Foley and Korber, 2013). As CRFs são atualmente representadas por 61 formas, que têm o mesmo padrão genético, com segmentos correspondentes a diferentes subtipos ou mesmo CRFs, e estão presentes em pelo menos três indivíduos não relacionados epidemiologicamente (Brian Foley and Korber, 2013). Além dos CRFs, a grande maioria das linhagens recombinantes identificadas corresponde a Formas Recombinantes Únicas (URF), as quais são bastante frequentes em regiões onde mais de um subtipo circulam. Os subtipos têm distribuição geográfica específica e seu papel na transmissão e patogenicidade é objeto de discussão.
Já o HIV-2 é classificado em grupos de A a H (Damond et al., 2004; Sharp and Hahn, 2011). Apenas os grupos A e B do HIV-2 estão bem caracterizados, sendo o HIV-2A aquele melhor caracterizado, tratando-se da variante circulante que predomina na África Ocidental (Faria et al., 2012; Peeters et al., 2013). Somente um recombinante CRFR01_AB (Ibe et al., 2010) foi descrito e recentemente uma nova linhagem numa amostra da Costa do Marfim foi caracterizado (Ayouba et al., 2013).
Esse amplo espectro de variantes genéticas está em constante expansão, como consequência da alta taxa de evolução do HIV. A análise da evolução de HIV-1 em várias populações tem mostrado um aumento progressivo da distância entre as variantes genéticas contemporâneas (diversidade intra-população), bem como o vírus que causa a doença original em função do tempo (divergência intra-população)
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(Abebe et al., 2001; Korber et al., 2000; Kuiken et al., 1993; Leitner and Albert, 1999; Lemey et al., 2003; Li et al., 1988; Liu et al., 2004; Lukashov and Goudsmit, 1997; Robbins et al., 2003; Salemi et al., 2001; Sharp et al., 2001; Yusim et al., 2001). A taxa de divergência intra-população com base na região do env, considerada a mais variável do genoma do HIV foi estimada em cerca de 1,0x10-3 substituições/local/ano, cerca de cinco milhões de vezes mais rápida do que a taxa média de desenvolvimento dos genes nucleares de mamíferos (Drummond et al., 2005; Li et al., 1988). Esta rápida evolução de HIV-1 provoca a ocorrência de populações virais cada vez mais complexas, e dentro de cada região, dificultando o diagnóstico, a produção de drogas eficazes como na probabilidade de obtenção de uma vacina eficaz contra o HIV.
Por outro lado, a ocorrência de novas variantes do HIV se deve à extensa migração das populações através das atividades de trabalho, turismo e guerras (deslocamentos militares), entre outros, contribuindo com a contínua dispersão de novas variantes a populações mais distantes. Por exemplo, a presença de diferentes subtipos virais e formas recombinantes, predominantes no continente africano têm sido identificadas em indivíduos soropositivos em Cuba, cujas introduções são atribuídas a participação de soldados cubanos em Angola durante as décadas de 70 e 80, assim como às missões de ajuda humanitária realizadas por Cuba em diferentes países do continente africano (Cuevas et al., 2002; Thomson et al., 2005). Estes fatos representam exemplos claros de como os tipos, subtipos e CRFs do HIV são transportados e podem potencialmente se estabelecer em novas regiões, assim como se recombinarem com variantes virais previamente existentes que, em associação com a alta taxa de evolução viral, contribuem para ampliar a diversidade do HIV no mundo.
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Em relação à distribuição dos subtipos de HIV-1, a nível mundial o subtipo C perfaz cerca de 48% do total das infecções diagnosticadas, seguidos do subtipos A e B (12%), CRF02_AG (8%), CRF01_AE (5%), subtipo G (5%) e D (2%), como representado na Figura 6. Os demais subtipos F, H, J and K não contribuem com mais de 1% do total das infecções. Outros CRFs e URFs contribuem com 4% cada no total das infecções, podendo chegar a 16% quando combinados todos os CRFs e a 20% quando somados todos os recombinantes (CRFs e URFs) (Hemelaar et al., 2011).
No continente africano, assim como em outros continentes, o HIV-1 é o principal responsável pela epidemia de aids, onde circula praticamente todos os subtipos de HIV-1 descritos, sendo o subtipo C a forma predominante, devido à contribuição do sul da África, onde a maioria das infecções é devido a este subtipo (Fig. 6) (Hemelaar et al., 2011). À exceção dessa região, a maioria das infecções é devida ao subtipo A, seguido do CRF02_AG e subtipo G (Fig. 6) (Hemelaar et al., 2011). O subtipo B, embora seja o mais prevalente na Europa Ocidental, no continente americano e na Oceania, é pouco encontrado no continente Africano (Fig.6). A grande variedade de subtipos de HIV-1 circulantes no Congo, a alta diversidade intra-subtipos e o alto número de recombinações possíveis do vírus, tal como as diferentes cepas não classificadas, são fatos que demonstram o quão antiga e madura é a epidemia nessa região, sugerindo que ela seja o epicentro da disseminação do HIV-1 grupo M (Vidal et al., 2000). Os grupos O, N e P do HIV-1 por sua vez, são encontrado principalmente na África Central e em indivíduos originários de Camarões (Ayouba et al., 2001; Plantier et al., 2009; Roques et al., 2004).
A África Ocidental é considerada o epicentro da epidemia pelo HIV-2, que parece estar presente nessa região desde meados do século XX, com foco em
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países como Guiné-Bissau, Cabo Verde, Gâmbia e Senegal (De Cock et al., 1993; Léonard et al., 1993; Marlink et al., 1994; Reeves and Doms, 2002). O HIV-2 é encontrado também na Costa do Marfim, Benin e países como Angola e Moçambique, que embora localizados mais ao Sul são países com contatos estreitos com Cabo Verde e Guiné-Bissau, principalmente por terem tido os mesmos colonizadores (Léonard et al., 1993; Markovitz, 1993).
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Figura 6. Distribuição Mundial dos subtipos e formas recombinantes do HIV-1. Obtida a partir de Hemelaar, 2011 (Hemelaar et al., 2011)
18 1.3) Tratamento e Resistência
Desde a descoberta do HIV o desenvolvimento de drogas antirretrovirais tem sido alvo de inúmeras investigações, tanto por parte de centros de pesquisas governamentais, como por parte da indústria farmacêutica. Em alguns momentos isso tem gerado disputas e quebra de patentes, como forma de garantir acesso e eficiência no tratamento, como medida de interesse em saúde pública.
O tratamento antirretroviral, atuando em diferentes etapas do ciclo de replicação do vírus, bloqueia a replicação viral e, consequentemente, a infecção de novas células do sistema imune e o seu consequente comprometimento, reduzindo a morbidade e a mortalidade dos pacientes infectados pelo HIV. De fato, um ano após a descoberta do HIV/aids, estudos pioneiros já demonstravam o aumento no número de linfócitos TCD4+ circulantes após 6 semanas de tratamento com AZT (Yarchoan et al., 1986). Isso fez com que o primeiro medicamento autorizado para tratamento da infecção fosse a Zidovudina (AZT), um Inibidor Nucleosídico da Transcriptase Reversa (NRTI). As primeiras drogas comerciais contra o HIV tinham como alvos a Transcriptase Reversa e, logo a seguir, a Protease, impedindo a replicação e maturação viral e, consequentemente, a infecção de novas células. A introdução em meados da década de 90 da terapia combinada com 3 ou mais drogas atuando em diferentes alvos do ciclo de replicação viral, denominada “Terapia Antirretroviral Altamente Ativa” mais conhecida como HAART, sigla em inglês de Highly Active Antiretroviral Therapy, teve um grande impacto na diminuição da mortalidade e morbidade devido à aids (Menéndez-Arias, 2013).
Atualmente existem 29 drogas antirretrovirais em uso aprovadas pelo Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos (Tang and Shafer, 2012). Essas drogas têm como alvos de atuação fases e mecanismos essenciais da replicação viral, tanto atuando no próprio vírus como na célula hospedeira e podem ser
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classificadas em seis classes de drogas, a saber: Inibidores Nucleosídeos/Nucleotídeos da enzima transcriptase reversa (NRTI), Inibidores Não-Nucleosídeos (NNRTI), Inibidores da protease (PI), Inibidores da integrase (INI), Inibidores de Entrada e de Fusão.
A RT é a enzima responsável por converter o RNA viral de fita simples em DNA de fita dupla, capaz de se integrar no genoma da célula infectada (Menéndez-Arias, 2013). Os NRTI atuam como inibidores competitivos, ou substratos alternativos, mimetizando um nucleosídeo ou nucleotídeo, durante ligação e incorporação na cadeia nascente de DNA, impedindo a formação do DNA viral. Já os NNRTI são pequenas moléculas hidrofóbicas que atuam como inibidores alostéricos da TR, ligando-se diretamente a bolsa hidrofóbica próxima ao sítio ativo da enzima, impedindo que a RT reconheça o RNA viral. Os PI reproduzem peptídeos virais capazes de se ligarem ao sítio ativo da PR, inibindo sua ação de processamento da poliproteína gag-pol e, consequentemente a maturação viral. Os INI ligam-se à IN e bloqueiam a integração do DNA viral no genoma da célula infectada. Os inibidores de Fusão e Entrada são peptídeos que atuam interagindo, respectivamente, com a gp41 da superfície viral bloqueando sua ação ou são antagonistas do CCR5, ligando-se ao CCR5 na superfície da célula hospedeira (von Recum and Pokorski, 2013)
Segundo normas da Organização Mundial da Saúde (OMS) é indicado o tratamento a qualquer indivíduo infectado pelo HIV-1 com contagem de CD4 inferior a 350 cels/mm3 (Organization, 2010). O tratamento deve iniciar com um esquema chamado de primeira linha, normalmente composto por duas drogas NRTI + 1 NNRTI. Em caso de falha terapêutica, intolerância ou infecção por vírus já resistente, pode-se optar pelo regime de segunda linha, que inclui duas drogas NRTI + 1 PI. A
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terceira linha é indicada para pacientes que falham ou não toleram o tratamento de segunda linha e pode incluir NRTI, NNRTI e PI.
A infecção pelo HIV-2 coloca-se como um desafio e implica normas diferenciadas no tratamento. O maior tempo de fase de latência em relação ao HIV-1, dificuldades na detecção e avaliação da carga viral, ausência ou número incipiente de ensaios clínicos e estudos observacionais específicos, são condições que dificultam o manejo dos pacientes infectados pelo HIV-2. No entanto, características intrínsecas ao vírus, que o fazem naturalmente resistente aos NNRTI e inibidores de fusão, e que os IP em uso para a infecção pelo HIV-1 se mostram fracos ou sem atividade inibitória frente ao HIV-2, são condições que dificultam o tratamento. Além disso, em pacientes infectados pelo HIV-2 a seleção de mutações de resistência acontece mais rapidamente do que em HIV-1 (Menéndez-Arias and Alvarez, 2014).
O tratamento com antirretrovirais tem contribuído para uma maior sobrevida e qualidade de vida dos pacientes, pois diminui tanto a mortalidade como a morbidade. Além da diminuição das infecções oportunistas, devido à reconstituição e manutenção da resposta imune, o uso de ARV contribui também para a diminuição da transmissão por todas as vias conhecidas. A forma de atuação das diferentes drogas está ilustrada na Figura 7.
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Figura 7. Alvos terapêuticos dos Antirretrovirais. São apresentados as cinco classes de antirretrovirais e os alvos de atuação. Obtida a partir de Chen et al., 2007 (Chen et al., 2007)
Os benefícios e o sucesso do tratamento podem ser comprometidos por outros fatores intrínsecos e extrínsecos ao paciente. A sensibilidade e tolerância aos princípios ativos de cada medicamento, os efeitos tóxicos dos mesmos, a forma e requisitos de administração e a posologia são informações que podem reduzir a adesão e regularidade no tratamento e consequentemente a sua eficácia. A intolerância aos fármacos e a descontinuidade no tratamento são condições que
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favorecem e podem levar ao aparecimento de vírus resistentes aos antirretrovirais, levando à falha no tratamento e consequentemente aumento da carga viral, depleção dos linfócitos TCD4+ e aparecimento das infecções oportunistas.
A resistência ao tratamento consiste na redução ou perda da capacidade de atuação dos fármacos nos seus respectivos alvos da replicação viral, impedindo o surgimento de novas partículas virais. A pressão seletiva exercida pelos fármacos, acoplada à especificidade do HIV em produzir polimorfismos, faz com que haja falhas durante o ciclo replicativo, produzindo variantes virais resistentes aos fármacos usados.
A alta taxa de mutação do HIV, chegando a um nucleotídeo por ciclo replicativo, e a estimativa de que cerca de 1010 virions são produzidos por dia em indivíduos infectados isentos de tratamento, revela a quantidade de quasispécies virais produzidas, acentuada também pela alta taxa de recombinação entre as diferentes variantes que infectam uma célula. Essas mutações ocorrem em todo o genoma, incluindo nos sítios alvos da terapia e, na presença da droga, estas variantes podem ser selecionadas. É rara a ocorrência de mutações resistentes a drogas na ausência de pressão seletiva dos ARV (Tang and Shafer, 2012).
As mutações de resistência são classificadas em primárias, quando essa mutação por si só reduz ou bloqueia a susceptibilidade do vírus à droga. Já as mutações acessórias não causam resistência a drogas por si só, mas indicam a presença da pressão seletiva pelas drogas e que a população viral está evoluindo para resistência (Morand-Joubert et al., 2006). Resistência a drogas é hoje o principal fator que contribui para a falha terapêutica (Menéndez-Arias, 2013), colocando-nos o desafio da necessidade de monitoramento contínuo dos pacientes, a fim de que sejam detectadas mutações, o quanto antes, que podem conferir resistência a ARV. Essas mutações podem surgir tanto devido à pressão seletiva
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provocada pelo uso dos ARV (resistência adquirida), como podem ser adquiridas pela transmissão de cepas já resistentes (resistência transmitida), dificultando ainda mais a adesão e uma combinação favorável de tratamento. Esse monitoramento se torna ainda mais urgente em situações e países com poucos recursos, onde a oferta de ARV é limitada e a ruptura de estoque dos mesmos acontece com frequência (Tang and Shafer, 2012). Adesão, tolerância e toxicidade, constituem as principais limitações para o uso adequado da terapia, apesar dos avanços e esforços na melhoria da potência, segurança e simplificação das doses necessárias (Menéndez-Arias, 2013). Resistência aos antirretrovirais tem sido descrita para todas as classes existentes. As mutações de resistência mais frequentes são as que causam resistência aos inibidores da RT e PR. No caso dos NRTI as mais comuns são: M184I e M184V que conferem alto nível de resistência à 3TC e FTC e às denominadas “Mutações de resistência ao análogo de timidina” conhecida por TAMs, da sigla em inglês “thymidine analogue resistance mutations”, normalmente causadas pelo uso de AZT e d4T (Menéndez-Arias, 2013). NNRTI de primeira geração, tais como nevirapina e efavirenz, que possuem uma baixa barreira genética de resistência, sendo uma das mutações mais frequentes a K103N (Menéndez-Arias, 2013).
A resistência transmitida se coloca como um desafio, principalmente em situações onde o tratamento está disponível em larga escala, mas não a infraestrutura para a genotipagem. Altas frequências de mutações de resistência entre pacientes virgens de tratamento podem implicar na inutilidade do uso de antirretrovirais nesses pacientes, como acontece em outras doenças como a malária (Pennings, 2013). Apesar dessa possibilidade, a frequência de mutações de resistência transmitida baixa é variável, situando-se entre 7 a 17% entre os casos novos diagnosticados em países desenvolvidos e abaixo de 7% entre os pacientes
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de desenvolvimento médio e baixo (Ayouba et al., 2009; Price et al., 2011; Ssemwanga et al., 2012; Tang and Shafer, 2012). Segundo a classificação da OMS, três níveis de resistência transmitida são propostos (baixo: <5%, intermediário: 5-15% e alto: >5-15%) servindo de base para estabelecimento de políticas públicas locais para seu monitoramento e controle (Organization, 2012). As mutações transmitidas mais comumente encontradas conferem resistência principalmente aos NRTI e NNRTI, sendo menos comum entre os PIs (Pennings, 2013). Segundo Gupta e cols, não existe uma correlação entre a alta taxa de mutações de resistência entre os pacientes em tratamento (resistência adquirida) e entre os pacientes virgens de tratamento (resistência transmitida), mas tem sido descrito aumento de resistência transmitida após implementação da ART (Gupta et al., 2012). Apesar da maior frequência de TDRM nos países desenvolvidos em relação aos menos desenvolvidos, o impacto é menor nos países desenvolvidos devido à prática do teste de genotipagem em pacientes recentemente diagnosticados. Com isso, há possibilidade de que haja uma escolha ideal de drogas para tratamento, diminuindo a morbidade e aumentando a sobrevida e qualidade de vida do infectado (Wittkop et al., 2011). Em situações em que a genotipagem não está disponível em grande escala e para pacientes virgens de tratamento, há risco de que a combinação de ARV seja ineficiente para diminuição da carga viral, além do fato que, normalmente nessas condições, são poucos os medicamentos de 2ª linha disponíveis (Pennings, 2013). Por isso, torna-se recomendável o teste de genotipagem em pacientes recentemente infectados e/ou virgens de tratamento antes do início da terapia com antirretroviral.
25 1.4) Cabo Verde
Cabo Verde é um arquipélago localizado no Oceano Atlântico, a 445 quilômetros da costa Ocidental Africana (Fig. 8), "achado" por exploradores portugueses em 1460 sem presença humana. Europeus livres e os escravos trazidos da costa africana formaram o povo caboverdeano. A independência do arquipélago foi em 5 de julho de 1975. Em 2010 a população era de 491.875 habitantes - uma população jovem, com uma idade média de 26,8 anos (Verde, 2010). Tem uma densidade populacional de 100 habitantes/Km2, sendo as ilhas de Santiago e S. Vicente as mais populosas. A taxa de crescimento médio anual da população passou de 1,4% em 2000 para 1,2 em 2013 e a taxa bruta de mortalidade de 5,8/1000 para 5,05/1000. A esperança de vida à nascença foi estimada em 2011, em 74,16 anos. A fecundidade tem decrescido lentamente, situando-se em 2011 em 2,37 filhos por mulher (Estatística, 2013). O português é a língua oficial, mas a língua nacional é o crioulo cabo-verdiano, que foi definida na constituição de 1999 como língua co-oficial em construção e em paridade com a língua portuguesa. O clima é tropical seco, com chuvas irregulares entre agosto e outubro, sendo aos restantes meses do ano o período seco. Possui uma rica fauna e flora, caracterizada por suas espécies endêmicas. A fauna e a flora marinha são muito abundantes, além de constituir rota de migrações de várias espécies. Na dimensão sociopolítica o país destaca-se pela sua estabilidade econômica e ausência de qualquer tipo de conflito (Verde, 2014).
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Figura 8. Localização e distribuição das ilhas de Cabo Verde
1.4.1) Características Geográficas e sociodemográficas
Com uma superfície de 4.033 Km2, o país é composto de 10 ilhas e 8 ilhéus, que se dividem em dois grupos, consoante a posição das ilhas relativamente aos ventos Alísios do continente. Assim, o grupo de Barlavento é composto pelas ilhas de Santo Antão, S. Vicente, Santa Luzia (desabitada), S. Nicolau, Sal e Boavista; e o grupo Sotavento é composto por Santiago, Maio, Fogo e Brava. Praia é a principal cidade e capital do país, situada na ilha de Santiago. A segunda maior cidade é Mindelo, localizado na ilha de S. Vicente.
Sotavento foi a primeira região a ser povoada, começando por Santiago, entre 1462 e 1466, seguida pela ilha do Fogo em finais do século XV e Maio no ano de 1718. Maio foi povoada por uma população preferencialmente escrava, trazida da Costa Ocidental Africana, principalmente da Guiné-Bissau (Andrade, 1996; Carreira, 1983; Graça, 2007).
Barlavento
Sotavento
S al
