Análise da estrutura-função das saponinas purificadas QS21 de Quillaja saponaria Molina e CP05 de Calliandra pulcherrima Benth e dos seus potenciais adjuvantes na vacina FML contra a leishmaniose visceral murina
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia
“Prof. Paulo de Góes”, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências (Microbiologia).
Orientadora: Profa. Clarisa B. Palatnik de Sousa.
Rio de Janeiro 2006
Ficha catalográfica
Nico, Dirlei
Análise da estrutura-função das saponinas purificadas QS21 de Quillaja saponaria Molina e CP05 de Calliandra pulcherrima Benth e dos seus potenciais adjuvantes na vacina FML contra a leishmaniose visceral murina/ Dirlei Nico. – Rio de Janeiro: UFRJ/IMPPG, 2006.
xi, 125 fl. Il.; 31 cm.
Orientadora: Clarisa B. Palatnik de Sousa.
Dissertação (mestrado) – UFRJ/IMPPG/ 2006 Referências Bibliográficas: f. 63-77.
1-Adjuvantes 2- Saponina 3- Leishmania
I. Palatnik de Sousa, CB. II.Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Microbiologia “Prof. Paulo de Góes”. III. Título
Trabalho realizado no Laboratório de Biologia e Bioquímica de Leishmania, Departamento de Microbiologia Geral do Instituto de Microbiologia “Prof. Paulo de Góes” da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da Profa.Clarisa B.
Palatnik de Sousa.
Aos meus queridos pais, Maria Aparecida e Adrialino Aos meus grandes e verdadeiros amigos
Agradecimentos
A Deus pela sua presença, infinita sabedoria e iluminação sempre que pedi. Pela oportunidade de ser sempre testada e poder vencer as lutas de cada dia.
Aos Meus pais Maria Aparecida e Adrialino, pelos afagos mesmo que à distância, dedicação, exemplo de trabalho, caráter e honestidade.
À Profa. Clarisa pela orientação neste trabalho, pela oportunidade de aprender cada vez mais e por sempre me ajudar a alcançar a melhor opção. Pela dedicação e confiança neste trabalho.
Ao Prof. Parente e Profa. Bernadetepelas saponinas.
À Fernanda, se não fosse você tudo teria sido mais difícil. Muito obrigada pela amizade, cuidados, brincadeiras, passeios e tantas outras coisas....
À Roberta, pela oportunidade e incentivo. Você deu o primeiro passo para iniciar essa longa caminhada. Obrigada por acreditar em mim!
À Lucieri, você sempre me deu muita força e me ensinou a acreditar mais em mim.
À Gulnarapela dedicação e paciência. Pela companhia nos momentos de dificuldade e em todos os momentos que sempre precisei de seus conhecimentos e de sua experiência laboratorial.
À Juliana,sempre pronta a ajudar e aliviar as minhas dores físicas.
À Luciana,pela amizade e companheirismo.
Ao Sr Luiz e ao Sr Nivaldo, pela atenção e prestação de serviços de limpeza e organização.
À todas as “meninas” do laboratório 36pelas incontáveis horas extras e dias de intensa agitação. Pela solidariedade nos experimentos, paciência nos tantos momentos de sensibilidade e lágrimas. Mesmo com tanto trabalho e inquietações, acredito que sempre nos divertimos bastante!!!!
À Carla, sua amizade tem promovido uma grande diferença. Obrigada pela companhia, compreensão, conversas, carinho e amizade. E pela disposição em me ajudar sempre.
À Luciana Búrigo,sempre pronta para uma boa conversa, sempre amiga.
A todos os laboratórios do CCS, colegas, amigos e funcionários pelo auxílio fornecido sempre que necessário.
Ao Instituto de Microbiologia “Prof. Paulo de Góes” da UFRJ na pessoa da sua Diretora Profa. Ângela Hampshire de Carvalho Santos.
Aos professores e secretárias do curso de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia) na pessoa da Coordenadora Profa. Thaís Souto-Padrón.
À Dilma, pela demonstração de educação, respeito e bom tratamento aos alunos. Pelas palavras de incentivo e compreensão, seu trabalho foi sempre muito bem executado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), ao Programa RHAE- CNPQ (Programa de recursos humanos em áreas estratégicas), e ao Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX) e Programa Cientista de Nosso Estado da Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro-(FAPERJ) pelo auxílio á pesquisa e pelas bolsas dispensados durante a realização deste trabalho.
Recebam meu sinceroMUITO OBRIGADA!
RESUMO
Saponinas são conjugados de triterpenos, alcalóides ou esteróides e carboidratos que apresentam potencial adjuvante nas preparações vacinais. As saponinas QS21 de Quillaja saponaria Molina e CP05 deCalliandra pulcherrimaBenth têm açúcares ligados no C-3 e no C-28 do triterpeno. A QS21 apresenta um grupo aldeído no C-4, e dois normonoterpenos na cadeia de carboidrato acilada no C-28 do triterpeno. Já a saponina CP05 carece do aldeído, porém apresenta três monoterpenos ligados ao C-28 e açúcares ligados ao C-3 e ao C-28 do triterpeno.
Analisamos comparativamente as saponinas CP05 e QS21, íntegras ou oxidadas com 50mM de periodato de sódio, ou alternativamente, a saponina CP05 íntegra ou, com a fração hidrofóbica, as frações glicídicas ligadas ao C-28 e/ou ao C-3 removidas por hidrólises químicas, com relação ao seu potencial adjuvante na vacinação contra leishmaniose com o antígeno FML de Leishmania (L.) donovani, no modelo murino de leishmaniose visceral americana. Os resultados obtidos permitiram identificar a relevância das cadeias de carboidrato e parcialmente da cadeia hidrofóbica na toxicidade secundária, a importância do carboidrato associado ao C-28 na indução global de anticorpos, do aldeído no C-4 da QS21 na indução de IgG2a e da sapogenina na indução de IgG1. A cadeia hidrofóbica influencia predominantemente a indução de intradermorreação (IDR) e de proliferação de linfócitos in vitroe parcialmente na expansão de linfócitos CD4 e CD8. As cadeias de carboidrato por outro lado, também estão envolvidas com a secreção de interferon-ã relacionada à expansão de CD4+ e finalmente com a redução da carga parasitária e a sobrevivência gerada pela vacinas. Finalmente, caracterizamos a saponina CP05 de Calliandra pulcherrima Benth como um novo candidato a adjuvante para vacinação contra a leishmaniose visceral. Estes resultados contribuirão para o futuro desenvolvimento de adjuvantes sintéticos.
SUMMARY
Saponins are conjugate of triterpenes, steroidal glycolakaloid or steroids and carbohydrates which show adjuvant potential in vaccine formulations. The QS21 saponin fromQuillaja saponariaMolina and the CP05 saponin fromCalliandra pulcherrimaBenth have sugar units linked to the C-3 and C-28 triterpene nucleus. QS21 has an aldehyde group attached to the C-4 triterpene and two normonoterpenes in the C-28 triterpene acylated sugar chain, while the CP05 saponin lacks the aldehyde group but shows three monoterpenes linked to the C-28 triterpene acylated hydrophobic chain.
We comparatively analyzed the CP05 and QS21 saponins, either intact or oxidized with 50mM Na periodate, or alternatively, the intact CP05 saponin, or the saponin with the hydrophobic chain, the glycidic fractions attached to C-28 and /or C-3 removed by chemical hydrolysis, regarding their adjuvant potential in vaccination against visceral leishmaniasis with the FML antigen of Leishmania (L.) donovani, in the murine leishmaniasis model. Our results disclosed the relevance of the carbohydrates and partial contribution of the hydrophobic moiety in the mild toxicity of CP05, of the C-28 associated carbohydrates in the global anti-FML antibody response, of the QS21 C-4 attached aldehyde in the IgG2a subtype induction and of the sapogenin in the IgG1 subtype increase.
The hydrophobic chain modulates the IDR induction and the in vitro splenocyte proliferation and has also participation in the expansion of the CD4+ and CD8+
lymphocyte populations. The carbohydrate moieties, on the other hand, are involved in the IFNã secretion by the CD4+ cells and in the reduction of parasite burden and survival increase, due to the vaccine treatments. Our results also pointed out the CP05 saponin from Calliandra pulcherrimaBenth as a potential new adjuvant candidate for vaccination against visceral leishmaniasis and contributed to the future development of synthetic adjuvants.
Lista de abreviaturas APC – Células apresentadoras de antígenos
BCG - Bacilo de Calmette-Guérin BHI – infusão de cérebro e coração CHO – função química aldeído Con A – concanavalina A
CP05 – saponina CP05 daCalliandra pulcherrimaBenth CTL – linfócitos citotóxicos
DC – célula dendrítica
DDAB - dimetil-dioctadecil-brometo de amônia DEAE – dietil-amino-etil dextrana
DMSO – sulfóxido de dimetila DNA – ácido desoxirribonucléico FCA – adjuvante de Freund completo FIA – adjuvante de Freund incompleto FML – ligante de fucose e manose HIV – vírus da imunodeficiência IDR -intradermorreação
IFN-ã – interferon ã
ISCOM – complexo imunoestimulante IL – interleucina
KDa- quilodalton
LDU -“Leishman Donovan Units of Stauber“
LD1S –Leishmania donovanicepa 1S-Sudão LV – Leishmaniose visceral
MDP - muramil dipeptídio
MHC – complexo maior de histocompatibilidade MPL – monofosfolipídio A deSalmonella minnesota NK – “natural Killer”
OMS – Organização Mundial de Saúde
PRRs – receptores de reconhecimento de patógenos QS –Quillaja saponaria
Sc– subcutânea
ÍNDICE
Página
I – Introdução 1
1.1 Adjuvantes 1
1.2 Tipos de adjuvantes 3
1.2.1 Adjuvantes imunoestimulatórios 4
1.2.2 Outros adjuvantes não particulados 5
1.2.3 Sistemas de liberação particulados para o antígeno 6
1.2.3.1 Patículas lipídicas 7
1.2.3.2 Micropartículas como adjuvantes 9
1.2.3.3 Outros adjuvantes particulados 9
1.3 A saponina deQuillaja saponariaMolina: QS21 9 1.4 A saponina deCalliandra pulcherrimaBenth: CP05 12
1.5 Leishmanioses 15
1.5.1 A Leishmaniose visceral no Mediterrâneo e nas Américas 16
1.5.2 Formas de controle 18
1.6 Vacinação contra Leishmaniose 19
1.7 A vacina FML 20
II- Objetivos 23
III- Material e Métodos 24
3.1 Obtenção do antígeno FML deL.(L.) donovani(LD1S) 24 3.1.1 Manutenção de amostras deL. (L.) donovani(LD1S)in vitro 24 3.1.2 Obtenção de massa de células para extração do FML 24 3.1.3 Extração e purificação do complexo glicoprotéico FML de
promastigotas deL.(L.) donovani 24
3.2 Obtenção da saponina CP05 deCalliandra pulcherrima 25
3.3 Obtenção da saponina QS21 25
3.4 Avaliação comparativa do efeito da degradação dos carboidratos na função adjuvante das saponinas QS21 e CP05, no modelo de leishmaniose visceral murina
25
3.4.1 Teste de toxicidadein vivo 27
3.5 Avaliação comparativa do efeito seletivo da remoção da cadeia de monoterpenos, ou da fração completa ligada no C-28 (monoterpenos e açúcares), ou de ambas as frações ligadas ao C-3 e ao C-28 do triterpeno, na função adjuvante da saponina CP05
27
3.5.1 Obtenção das frações da saponina CP05 e testein vivo 27
3.6 Ensaios imunológicos 28
3.6.1 Análise dos níveis de IgG total e subtipos, IgA e IgM –
Utilizando o método do FML-ELISA 28
3.6.2 Resposta de intradermorreação (IDR) ao lisado deL.(L.) 29
donovani
3.6.3 Proliferaçãoin vitrode esplenócitos totais contra antígenos de
Leishmania 29
3.6.4 Dosagem de IFN-ã nos sobrenadantes de esplenócitos 31 3.6.5 Fenotipagem de esplenócitos por citometria de fluxo 32 3.7 Determinação de carga parasitária – LDU (“Leishman Donovan
Units”) 32
3.8 Análise estatística 32
IV- Resultados 33
4.1 Avaliação comparativa do efeito da degradação dos carboidratos na fração adjuvante das saponinas QS21 e CP05, no modelo de leishmaniose visceral murina
33
4.2 Avaliação comparativa do efeito seletivo da remoção da cadeia de monoterpenos, ou da fração completa ligada no C-28 (monoterpenos e açúcares), ou de ambas as frações ligadas ao C-3 e ao C-28 do triterpeno, na função adjuvante da saponina CP05
35
V- Discussão 52
VI- Conclusões 62
VII- Referências Bibliográficas 63
VIII- Anexos 78
IX- Outras publicações no período 92
I – Introdução
1.1 Adjuvantes
O termo adjuvante é oriundo do latimadjuvareque significa ajudar. São substâncias adicionadas a antígenos imunogênicos que imunopotencializam a resposta imune contra os mesmos. Essas substâncias vem sendo usadas para melhorar a eficácia de vacinas desde a década de 1920 (Cox & Colter, 1997). A pesquisa por novas substâncias adjuvantes tem sido crescente nos últimos anos, uma vez que, essas substâncias promovem resultados bastante satisfatórios no desenvolvimento de vacinas de baixa eficácia.
Originalmente os adjuvantes eram classificados de acordo com os seus mecanismos de ação:
1) Imunomodulação, que consiste na habilidade de modificar a produção de citocinas, a produção de anticorpos específicos e de isotipos (revisado por Coxet al., 2006).
2)Estimulação de resposta citotóxica.Para este fim, os adjuvantes geralmente necessitam da presença do antígeno no citosol possibilitando a ligação do antígeno com a molécula de complexo maior de hiscompatibilidade 1(MHC-1). Acredita-se que o adjuvante promova a interação do antígeno com a membrana celular ou endossomal tornando o antígeno disponível no citosol (revisado por Coxet al., 2006).
3)Indução de imunidade de mucosa.Os adjuvantes desta via simulam patógenos que são reconhecidos por receptores da mucosa intestinal. Utilizam-se, por exemplo, as toxinas coléricas ou de Escherichia coli termolábil modificadas geneticamente, de maneira que possam ser reconhecidas pelo epitélio sem induzirem a patologia digestiva (Singh &
O’Hagan, 2003).
4) Capacidade de direcionamento (alvo), revelando a capacidade do adjuvante de entregar o antígeno para as células efetoras do sistema imune (revisado por Cox et al., 2006).
5)Geração de depósito,que é a capacidade que o adjuvante apresenta de reter o antígeno no sítio de administração e, assim promover sua liberação lentamente. Desse modo, obtém- se como resultado um estímulo mais prolongado (revisado por Coxet al., 2006).
Os adjuvantes atuam na modulação da resposta imune, agindo como intermediários
estimulatórios mais fortes (Schijns, 2003). Durante os últimos anos, muitos outros adjuvantes tem sido estudados e novas formulações têm sido desenvolvidas, incluindo proteínas produzidas por tecnologias recombinantes e peptídeos sintéticos (Allison, 1998).
A classificação dos adjuvantes também pode ser baseada na sua natureza química, propriedades químicas e físicas, capacidade de estimular a resposta Th1 ou Th2, ou ainda pela capacidade de estimular a imunidade inata ou adaptativa (Marciani, 2003).
Mais recentemente foi considerado importante o conceito da “localização geográfica” que implica na necessidade do contato íntimo das células do sistema imune (revisado por Schijns, 2003). Acredita-se que os adjuvantes, no local da aplicação da vacina, auxiliem ao antígeno no envio do sinal 1 para os órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos drenantes), diretamente ou através de células apresentadoras de antígeno e/ou dendríticas sentinelas (Schijns, 2003). De acordo com o tipo de adjuvante, pode-se mudar o tempo de contato da vacina com o sistema imune, o local de aplicação e concentração do antígeno utilizado. Assim, os adjuvantes podem garantir uma concentração adequada de antígeno exposta durante um período de tempo suficiente (Schijns, 2003).
Um grupo de células dendríticas (DC) imaturas que circulam pelos tecidos periféricos funcionam como "sentinelas", captando e removendo os antígenos exógenos e transportando-os até os linfonodos, onde já sob a forma de células dendríticas maduras, apresentam os antígenos processados às células T. As células dendríticas são as APCs (células apresentadoras de antígeno) mais eficazes, entretanto, macrófagos também podem desenvolver esta função (Singh & O’Hagan, 2003; Schijns, 2003; revisado por O`Hagan &
Rappuoli, 2006).
O sistema imune deve reconhecer entre antígenos "self" e antígenos "non-self"
infecciosos. Entre os "non-self" existem antígenos conservados de microorganismos como:
LPS, lipoproteínas bacterianas, peptidoglicanas e motivos CpG, que são abundantes em DNA de bactérias e menos em DNA eucariontes. Estas estruturas são conhecidas como PAMPs ("pathogen associated microbial patterns"). São reconhecidos por receptores em células do sistema imune tais como os "Toll", receptores para manose, ou receptores para complemento, chamados coletivamente de PRRs ("Pathogen Recognition Receptors") . Estes receptores estão presentes em várias APCs inclusive em DC. A ativação dos PRRs pelos PAMPs induz uma ativação intracelular de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e
o aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias de membrana, o que resulta na ativação subseqüente do sistema imune (Singh & O’Hagan, 2003; Schijins, 2003; O’Hagan
& Rappuoli, 2006; Cox,et al., 2006).
Sabe-se, por exemplo, que o LPS, o Lipídio A e o MPL (monofosforil lipídio A de Salmonella minnesota) são reconhecidos através do receptor Toll 4; as seqüências de CpG de DNA são reconhecidas através do receptor Toll 9; o RNA viral através do Toll 3; a flagelina através do Toll 5; a peptidoglicana, lipoproteínas e zimosan através dos Toll 1-6 (Rhodes , 2002; revisado por Coxet al.,2006).
Os adjuvantes então, simulando os antígenos “non-self” infecciosos, facilitam a geração e aumento da expressão dos sinais co-estimulatórios na superfície de APCs, como por exemplo: as famílias de ligantes B7, os ligantes CD40 e citocinas mediadoras.
Dois sinais simultâneos são necessários para a estimulação eficiente das células T.
Ao mesmo tempo em que as APCs apresentam o antígeno processado via MHCII aos receptores TCR dos linfócitos, os ligantes B7 se ligam aos CD28 na superfície dos linfócitos fazendo a co-estimulação, o que resulta na ativação das células T. As células T ativadas expressam um novo receptor, o CTLA-4, que se liga com alta afinidade ao B7 bloqueando-o, e assim regulando a ativação de células T (Rhodes, 1996; Marciani, 2003).
Alguns estudos revelam que os ligantes B7-1 promovem uma maior ativação de linfócitos TH1 e que os ligantes B7-2 promovem a ativação de linfócitos TH2 (Marciani, 2003). A elucidação da estrutura do ligante B7 e do mecanismo da co-estimulação promoveu o desenvolvimento de adjuvantes e imunoterápicos que podem simular ou substituir o B7 (Rhodes, 1996).
Os adjuvantes, portanto, podem auxiliar nos mecanismos ligados à síntese dos membros da família B7, ligantes CD40 e citocinas. Além disso, alguns adjuvantes podem além de atuar facilitando o sinal 1 e 2, atuar no envio de um sinal 3 que influencia na qualidade da resposta imune (Schijns, 2003).
1.2 Tipos de adjuvantes: imunoestimulatórios e particulados
Atualmente a capacidade de um adjuvante formar partículas ou não, tem sido um dos critérios mais utilizados para agrupá-los de modo comparativo e racional.
1.2.1 Adjuvantes imunoestimulatórios:
•MPL - Monofosforil Lipídio A. É um derivado de LPS deSalmonella minnesota, que por sua vez, pode ser classificado como um PAMP. Assim como LPS, age no receptor Toll4 das células apresentadoras de antígenos profissionais, que promovem a liberação de citocinas IL2, IFN-ã que induzem resposta TH1. Foram gerados vários derivados sintéticos de acordo com o estudo da função-estrutura do MPL, entre eles o RC-529 (Singh &
O’Hagan, 2003).
•Motivos CpG (dinucleotídios citosina fosfodiéster guanina). Oriundos de DNA bacteriano, se encontram ausentes em DNA de vertebrado (que é metilado). Os CpG não metilados apresentam-se em seqüências flanqueadoras (1 a 16 nucleotídeos) que são reconhecidas pelo sistema imune inato como se fosse DNA derivado do patógeno. As respostas ao CpG são mediadas pelo receptor Toll9. O efeito adjuvante, indutor de resposta Th1 do CpG, é maximizado pela conjugação com proteínas ou em formulações de sistemas de liberação (revisado por Singh & O’Hagan, 2003 e Coxet al., 2006).
•Saponinas da Quillaja saponaria Molina. São substâncias bastante utilizadas em vacinas veterinárias (Schetters et al., 2006; Morein et al., 2004 e Borja-Cabrera et al., 2002) e humanas (Slovin et al., 2005; Ragupathi et al., 2003). Destacam-se pela capacidade de induzirem potente resposta Th1, aumentarem os níveis de IgG2a, IFN-ã e IL2. Um dos mecanismos de ação propostos é que as saponinas se intercalam nas membranas celulares através da sua fração hidrofóbica ocasionando a formação de poros, o que facilita a apresentação do antígeno pela via MHC-1 e assim, promovem o aumento da resposta CTL. Também foi descrito que a presença do grupo aldeído no C-4 permite que a saponina mimetize o ligante B7 aumentando o estímulo de APCs sobre linfócitos helper CD4 (TH1) (revisado por Marciani, 2003; Singh & O'Hagan, 2003).
Denominam-se saponinas, moléculas complexas de alto peso molecular, que se apresentam sob a forma de conjugados naturais de triterpenos, esteróides ou glico- alcalóides esteroidais com uma ou mais cadeias de açúcares (Osbourn, 1996a; Osbourn, 1996b). O termo saponina faz referência à sua propriedade clássica detergente, que por sua vez, está relacionada com a natureza anfipática da molécula (uma porção glicídica que é
hidrofílica e uma aglicona ou sapogenina que é hidrofóbica). Algumas funções farmacológicas podem ser atribuídas as saponinas: atividade anti-tumoral; anti-úlceras;
forte efeito fungicida e importante atividade adjuvante (Osbourn, 1996a; Osbourn 1996b).
A Quil–A é uma mistura de saponinas da Quillaja saponaria Molina que contém: a QS-7, QS-17, QS-18 e QS21 (Kensil et al., 1991). A saponina QS21 mostrou-se a mais potente de todas na produção de anticorpos (IgG2b e IgG2a), sendo menos letal para camundongos, e também como forte adjuvante em testes clínicos fase I e II em humanos, contra HIV-1, malária e melanoma e contra pneumococos em indivíduos idosos (revisado por Soltysik et al., 1995). A saponina QS21 promove aumento das respostas Th1, Th2 e também da resposta CTL.
Em condições alcalinas ou em soluções aquosas, a saponina QS21 não é estável e perde a fração ligada no C-28, que é responsável pela sua toxicidade e pela resposta CTL (Kensilet al., 1998). Recentemente, a QS21 está sendo usada em combinação com a QS-7 que não possui os normonoterpenos e, portanto, não é hemolítica. A QS21 pode ser usada por via intranasal, oral e sistêmica injetando-se em concentrações menores que pela via subcutânea (Kensilet al.,1998).
1.2.2 Outros adjuvantes não particulados
•Citocinas. São glicoproteínas com peso molecular de aproximadamente 20 kDa que desempenham várias atividades. A citocina IL-2 tem sido testada extensivamente em humanos como um imunopotencializador, gerando ativação de resposta de células T CD8+
(Kornbluth & Stone, 2006).
As atividades de IL-12 despertaram maior interesse, pois destacam-se como indutora precoce de IFN-γ, pela promoção da diferenciação de células T helper progenitoras para Th1 (Handman, 2001), além de induzir (indiretamente, através do IFN-γ) a diferenciação de células B para secretarem subtipos citofílicos de imunoglobulinas. Devido a estas características, atualmente tem sido testado amplamente o potencial adjuvante da IL-12 para promoção da imunidade celular e humoral, principalmente no caso de patógenos intracelulares (protozoários do gênero Leishmania, por exemplo) (Singh & O’Hagan, 1999). Adicionalmente, as citocinas podem ser tóxicas, apresentando um potencial de auto- imunidade (Singh & O’Hagan, 1999).
•Polímeros de carboidratos.Os principais polímeros de carboidratos utilizados são as mananas e glucanas. Estas são utilizadas em vacinas experimentais misturadas ou conjugadas aos imunógenos. De modo geral, podem estimular macrófagos (via receptor para manose e via dectina) e induzir resposta celular do tipo Th1 (Cox et al., 2006).
•Polissacarídeos derivados. São oriundos de dextranas sulfatadas de alto peso molecular ou ainda de dietil-amino-etil dextranas (DEAE). São bastante utilizados em vacinas veterinárias. A sua ação provável se efetua através da saturação de células de Kuppfer e na promoção de mitogenicidade dos linfócitos T ou B (Cox et al., 2006).
•Muramil dipeptídio (MDP). O N-acetil muramil-L-alanil-D-isoglutamina é um análogo sintético do componente ativo da parede de micobactérias. Quando administrado com salina, aumenta a resposta humoral. Por outro lado, quando associado ao adjuvante completo de Freund (FCA) ou lipossomas, aumenta a resposta celular. Adicionalmente, derivados com aminoácidos hidrofílicos induzem Th2, enquanto derivados hidrofóbicos estimulam Th1 (Cox et al., 2006).
1.2.3 Sistemas de liberação particulados para o antígeno:
Os adjuvantes particulados (emulsões, micropartículas, complexos imunoestimulantes (ISCOMS), lipossomas, virossomas, partículas virais) possuem dimensões comparáveis aos patógenos que são combatidos pelo sistema imune. Uma possibilidade interessante é a inclusão de adjuvantes imunoestimulatórios em formulações particuladas, restringindo a sua liberação sistêmica ou modulando a resposta desejada (Singh & O’Hagan, 2003).
•Sais de alumínio. Os sais de alumínio são insolúveis e formam precipitados com tamanho que varia de 100 a 1000 ç m. O imunógeno está ligado por interações eletrostáticas ao gel pré-formado ou durante a sua formação (Cox & Coulter, 1997). Estão entre os poucos adjuvantes licenciados para utilização em humanos (Singh & O’ Hagan, 1999) e promovem o efeito de depósito do antígeno, estimulando a formação de granulomas, síntese de IL-1, ativação do complemento e imunidade mediada por anticorpos (Nicklas, 1992). É um dos adjuvantes mais utilizados, com capacidade de induzir resposta imune Th2 que está associada à produção de IL-4 e anticorpos IgE (O`Hagan & Rappuoli, 2006). Em camundongos, a alumina estimula principalmente IgE e IgG1 (Nicklas, 1992).
•BCG. O Bacilo Calmette-Guérin, cepa atenuada de Mycobacterium bovis, é amplamente utilizado na imunização contra a tuberculose. No desenvolvimento da resistência específica adquirida contra antígenos de micobactérias, a vacinação com o BCG induz resposta imune modificada para antígenos heterólogos e potencialização de resposta humoral e celular contra antígenos protéicos. Observa-se produção de anticorpos IgG2a e indução de resposta Th1. A administração de uma vacina BCG-Leishmania demonstrou produção de altos níveis de IFN-ã e estímulo da produção de IL-12 (revisado por Masihi, 2003). O BCG tem sido associado como imunopotencializador em vários esquemas de vacinação. Uma infecção com o BCG induz: a ativação local ou sistêmica de macrófagos, aumento dos níveis de IFN-ã, a formação de granuloma e estimulação de linfócitos CD4+e CD8+. O poder adjuvante do BCG tem sido avaliado em vacinas contra as diversas doenças, como babesiose, malária e leishmanioses (camundongos, cães, macacos e humanos) (revisado por Masihi, 2003).
1.2.3.1 Partículas lipídicas:
• Adjuvante completo de Freund (FCA), é uma emulsão água-óleo, bastante potente, porém apresenta determinada toxicidade e sua formulação contém micobactérias mortas. Já o adjuvante incompleto de Freund (FIA), é uma emulsão isenta de micobactérias mortas. O FIA tem sido utilizado em vacinas veterinárias possuindo um forte poder adjuvante, porém, não é utilizado em preparações vacinais para humanos. É composto por microgotas de água que são estabilizadas por um surfactante numa fase oleosa contínua (óleo mineral ou esqualeno). O clássico (FIA), consiste de uma emulsão água-óleo, de óleo mineral estabilizado pelo agente emulsificante Arlacel A. A emulsão promove a retenção do antígeno no local da injeção e, desta forma acarreta uma resposta granulomatosa. Promove a indução de resposta imune celular e humoral (Singh &
O’Hagan, 2003).
•Emulsões óleo/água: São microgotas de óleo (esqualeno de tamanho aproximado 200ηm) estabilizadas por surfactantes (Tween 80 ou Span 85) em fase aquosa. Este adjuvante foi avaliado como seguro e potente para vacinas humanas com os vírus HIV, HSV e influenza (Singh & O’Hagan, 2003). Neste sentido, foram realizados testes clínicos
em mais de 30 mil indivíduos, sendo bem tolerado e seguro. Syntex é um adjuvante em óleo biodegradável (esqualeno) que contém um componente de parede celular bacteriana treonil muramil dipeptídeo e um surfactante. Por outro lado, o esqualeno em emulsão óleo/água, o MF59, se mostrou seguro e eficaz e está sendo aplicado em vacinas veterinárias e licenciado para uso humano na Itália. As emulsões tem sido usadas como sistemas de liberação de QS21 e MPL (Singh & O’Hagan, 2003).
•Lipossomas. Consistem de partículas artificialmente preparadas de bicamadas fosfolipídicas, separados por um compartimento aquoso. Originalmente, os lipossomas foram desenvolvidos para serem utilizados como carreadores de drogas e outras substâncias biologicamente ativas (revisado por Singh & O’Hagan, 2003). Experimentalmente, os lipossomas têm sido utilizados como adjuvantes com vários antígenos. Os lipossomas podem variar na dimensão, composição (diferentes fosfolipídios e conteúdo de colesterol), carga (resultado da carga dos componentes fosfolipídios) e estrutura (uni ou multilamelar).
Eles estimulam resposta humoral e celular (revisado por Singh & O’Hagan, 2003).
•Virossomas. São lipossomas unilamelares contendo principalmente fosfatidilcolina com hemaglutinina do vírus Influenza intercalando a membrana. Tal processo utiliza propriedades de direcionamento e fusogenicidade das proteínas do vírus Influenza, o que resulta numa eficaz liberação dos antígenos encapsulados dentro dos citoplasmas para indução de CTL (revisado por Singh & O’Hagan, 2003).
•Arqueossomas. São vesículas preparadas com lipídios polares de Archaea, sendo que em alguns estudos demonstraram que os arqueossomas apresentam maior poder adjuvante que os lipossomas (revisado por Singh & O’Hagan, 2003).
•ISCOMs. São partículas de 40 ç m compostas de colesterol, fosfolipídios e saponinas de Quillaja saponaria Molina. Essa preparação reduz a toxicidade destas saponinas, diminuindo sua ação hemolítica (revisado por Singh & O’Hagan, 2003 e por Moreinet al., 2004). No ISCOM a saponina encontra-se ligada ao colesterol e não interage livremente com as membranas celulares. Está estabelecido que os ISCOMs induzem resposta Th1 e Th2 e de citocinas pró-inflamatórias (Cox et al., 2006). Os ISCOMs têm sido estudados em vários modelos animais e uma vacina contra Influenza eqüina, usando ISCOMs, está licenciada na Suíça (revisado por Singh & O’Hagan, 2003; Morein et al., 2004; Coxet al., 2006).
•Niossomas: São vesículas lipídicas não-iônicas que tem demonstrado potentes respostas em modelos de animais pequenos (revisado por Singh & O’Hagan, 2003).
1.2.3.2 Micropartículas como adjuvantes:
São partículas muito pequenas e sólidas de 10-1000nm e 1-100µm formadas por polímeros biodegradáveis. De modo geral, apresentam boa resposta imune, induzem depósito com longo prazo de duração e constituem a melhor opção para vacinas múltiplas com dose única (revisado por Singh & O’Hagan, 2003). Prolongam o tempo de contato do antígeno com o sistema imune, que é necessário e importante na indução de resposta imune celular (O’Hagan & Rappuoli, 2006). A sua preparação é difícil devido a sua alta heterogeneidade. Entre os benefícios dos sistemas de liberação controlada, pode-se citar a liberação em sítios específicos; proteção do antígeno contra degradação e maior eficiência, o que pode gerar a diminuição no número de doses. Entre os sistemas mais utilizados, estão as micro-esferas de polilactídeo co-glicolídeos (PLGA) (revisado por Singh & O’Hagan, 2003 e por O’Hagan & Rappuoli, 2006).
•Poliésteres de polilactídeo co-glicolídeos. São polímeros compostos de micro- partículas que se usam como adjuvantes e que já são usados como sistema de liberação de antígenos e em suturas. Induzem resposta CTL. Estas moléculas apresentam bons resultados como adjuvantes em vacinas de DNA (revisado por Singh & O’Hagan, 2003 e por O’Hagan & Rappuoli, 2006).
1.2.3.3 Outros adjuvantes particulados
Entre os testados, porém com menor atenção:os sais de cálcio, o estearil-tirosina, o γ-inulina e o algamulina (hidróxido de alumínio +γinulina) (Singhet al.,2006).
1.3 A saponina deQuillaja saponariaMolina: QS21.
A espécie é uma árvore nativa das regiões de montanhas do Chile, sendo muito utilizada pela população local como estimulante da mucosa gástrica, para combater problemas respiratórios, no tratamento de infecções cutâneas e reumatismo crônico.
Entretanto, os efeitos tóxicos incluem irritação das mucosas, dores de cabeça, fraqueza
muscular, vômitos e diarréia. Portanto, a sua utilização por gestantes deve ser evitada. O extrato das cascas é comercializado industrialmente (Cheeke, 1999).
AQuillaja saponariaMolina pertence à família botânica Rosaceae (Figuras 1 e 2).
O seu nome é derivado da palavra indígena chilena quillean, que significa “para lavar”, uma vez que suas cascas (parte utilizada) produzem espuma abundante e persistente quando agitadas na água (Schenkelet al., 2002).
A saponina QS21, purificada das cascas de Quillaja saponaria Molina tem sido intensivamente investigada quanto à sua atividade imunoestimulante e potencial utilização como adjuvante em vacinas. Ela faz parte de formulações testadas em testes clínicos em humanos contra HIV-1 (gp 120), melanoma e malária com apoio da OMS (Kensil, 1998).
A sua estrutura química é caracterizada pela presença de um núcleo triterpênico com um grupo aldeído em C-4 e duas cadeias de oligossacarídeos ligados ao C-3 e ao C-28 do
Figura 2. Flores deQuillaja saponariaMolina
Fonte: http://pharm1.pharmazie.unigreifswald.de/gallery/gal- rosa
Figura 1. Árvore deQuillaja saponariaMolina
Fonte: http://pharm1.pharmazie.unigreifswald.de/gallery/gal-rosa
triterpeno, respectivamente (Figura 3). A cadeia ligada ao C-28 é acilada por dois normonoterpenos através de uma ligação éster a fucose. O grupo aldeído possui extrema relevância e confere singularidade a essa saponina (revisado por Marciani, 2003).
Figura 3.Estrutura química da saponina QS21
A exposição do aldeído em C-4 promove a formação de imina ou base de Schiff, que é uma reação entre aldeídos e grupamentos amino (NH2) expostos por duas moléculas (Rodhes, 1996) em vários sistemas biológicos. Em 1975, foi descrito o fenômeno de mitogênese oxidativa resultante da geração química ou enzimática de aldeídos na superfície celular de linfócitos, que induz a sua subseqüente ativação (Novogrodsky & Katchalsky, 1972). Este fato sugeriu que a formação de bases de Schiff fosse essencial na interação entre células APC e células T. Alguns aldeídos formam iminas com grupamentos amino-å na superfície de células T produzindo a co-estimulação necessária para ativação da células T, simulando, porém de maneira independente, a ação dos ligantes B7-1 sobre os receptores CD28. A formação da imina resulta no transporte de Na+e K+, que juntamente com a sinalização via receptor de célula T ativa a proteína quinase (MAPK) ERK2 e, assim promove o aumento da mobilização de Ca2+, favorecendo o aumento da produção de IL-2 e IFN-ã, finalizando com a promoção de resposta Th1 (revisado por Marciani, 2003).
O trabalho de Soltysik et al. (1995) demonstrou que, impedindo a exposição do aldeído através de conjugação do mesmo com glicina, etilamina ou etilendiamina, são
H O O H
H
H
H
1 3
2
4 5
6 7
8 9
10 11
12 13 14 15
16 17
18
19 20
21 22
23 24
25 26
27 28
29 30
O
O O
HO
O HO
OH HO
O HO
HO OH
HO O OH
O O
HO OH OH O O
OH O
O
OH HO O
OH HO
OH O
O
O
OH O O
O
OH H
O
OH HO O
HO
gerados derivados de QS21 que perdem a atividade indutora de anticorpos e de linfócitos citotóxicos, confirmando a importância do grupamento aldeído no C-4. Assim mesmo, um tratamento com Borohidreto de Sódio na saponina QS21 permite a redução do aldeído do triterpeno a álcool (Pillionet al., 1996), alterando as suas funções biológicas.
Por outro lado, outra peculiaridade das saponinas daQuillaja saponaria Molina é a sua cadeia lipofílica de normonoterpenos, à qual tem sido atribuída a potencialização da resposta citotóxica CD8+ (CTL) e os efeitos de toxicidade secundária obviamente indesejados (Marciani, 2003). Vários trabalhos realizados tentam remover a fração composta de normonoterpenos (Marciani et al., 2001; Marciani, 2003) para diminuir toxicidade secundária e até substituí-la por outros componentes lipofílicos de menor toxicidade (Marcianiet al.,2000). Alternativamente, a deacilação de saponinas deQuillaja saponaria Molina ocorre espontaneamente em solução aquosa ou em condições alcalinas (Higuchiet al., 1987; Clelandet al.,1996; Pillionet al., 1996; Guoet al., 2000; Liuet al., 2002; Oliveira-Freitaset al., 2006).
1.4 A saponina deCalliandra pulcherrimaBenth: CP05
A espécie é um arbusto nativo do Brasil bastante utilizado na região sudeste com finalidades ornamentais (Figura 4 e 5). A planta é empregada também como forrageira, sendo que o seu consumo provoca o aumento da produção de leite em rebanhos de caprinos e bovinos. A população do interior utiliza as folhas da planta em infusão para combater as febres intermitentes de malária (revisado por Taniet al.,1996).
A partir das folhas de Calliandra pulcherrima Benth, obtém-se uma saponina triterpênica (Figura 6), que possui muitas semelhanças com a saponina da QS21 de Quillaja saponaria Molina. Sua elucidação estrutural apresentou duas cadeias oligossacarídicas grandes associadas ao C-3 e ao C-28. Semelhante à QS21, três açúcares compõem a cadeia ligada ao C-3 e 5 açúcares, a cadeia ligada ao C-28 (Marciani, 2003;
Silva et al., 2005). Na cadeia ligada ao C-28, três monoterpenos alternados com açúcares, em lugar dos dois apresentados pela QS21, estão ligados via fucose por meio de uma ligação éster ao C-28. Uma diferença fundamental entre a saponina QS21 e a saponina CP05 é que esta não apresenta nenhum grupamento aldeído no triterpeno (Silva et al., 2005).
Figura 4. Arbusto de Calliandra pulcherrima Benth, destacando-se as folhas
Fonte:http://tropicals.com/pics/garden/200 4/2/2598s.jpg
Figura 5. Flores deCalliandra pulcherrimaBenth
Fonte:http://tropicals.com/pics/garden/2004/
2/2598s.jpg
Figura 6.Estrutura química da saponina CP05
Um estudo preliminar comparativo entre a QS21 e a CP05 como adjuvantes do antígeno FML (Ligante de Fucose e Manose) no modelo murino revelou que o índice hemolítico, a indução de tipos e subtipos de anticorpos e a resposta de intradermorreação contra o lisado de Leishmania donovani foi semelhante para ambas. Porém, a resposta induzida por QS21 foi 1,5 a 2 vezes maior que a de CP05, em IgG total, IgG2a e IgG3. Se por um lado, a QS21 estimulou IgG2a e IgG2b, a CP05 induziu predominantemente IgG2b.
Talvez esta diferença tenha relação com a ausência de aldeído no triterpeno da CP05 (Silva et al., 2005, Chame-Barreto, 2006). Ambas as saponinas QS21 e CP05 se destacam muito pela complexidade e tamanho das suas cadeias glicídicas e presença de cadeias lipofílicas.
Assim mesmo, tanto os grupamentos lipofílicos como o aldeído em C-4 da QS21 são achados inusuais e muito peculiares.
O extenso número de evidências do potencial adjuvante protetor da QS21 (Soltysik et al., 1995; Cox & Coulter, 1997; Kensil et al., 1998; Marciani et al., 2001, Palatnik de Sousaet al.,2004) e as suas semelhanças com a saponina CP05 daCalliandra pulcherrima Benth, de função desconhecida, nos estimularam a iniciar o estudo do potencial adjuvante desta última.
O O
OH O
O
N HO
O
HO H
O O
HO O OH
O
HO OH OH
1 2 3
4 5
6 1 2 3
4 5
2 1 3
4 5
O OH
30
O O
1 2
3 4
5 6
7 8 10 9
11 12
13
14
15 16
18 17
19 20
21
22
23 24
25 26
27
28
29 H
1 2
3 4
5 6
O
HO OH
O HO
O
HO O HO
O
O
HO O HO
O O
O
1 2 7
6
2 1 3
4 5
1 2 7
6
2 1 3 4
1 2 7
6
2 1 3 4
O O
O OH
O 6
O O HO
OHOH OH O
HO OH
O O
HO OH
OH 5 4 2
3 1 4 5
3 2 1 1
2 3
4 5
1 2
3 4 5
6 6
5
5
MT'
MT"
MT'''
Xyl'''
Qui
Xyl''''
Ara'
Ara''
GlcNAc
Glc'
Rha
Glc'' Xyl'
Xyl''
1.5 Leishmanioses
As leishmanioses são enfermidades causadas por protozoários intracelulares do gênero Leishmania. Em 1903, Sir William Leishman e Charles Donovan descreveram a existência do agente etiológico da leishmaniose, a partir de lâminaspost-mortemde baço de pacientes da Índia, que tinham morrido com quadros febris sugestivos de malária, porém sem demonstração dos plasmódios (Ross, 1903).
A leishmaniose tegumentar é uma doença de caráter zoonótico que acomete o homem e diversas espécies de animais silvestres e domésticos, podendo se manifestar através de diferentes formas clínicas e sendo considerada uma doença polimórfica e espectral da pele e das mucosas. Já a leishmaniose visceral é uma enfermidade infecciosa generalizada e crônica, de caráter zoonótico no Mediterrâneo e no Novo Mundo sendo também consideradas diversas formas clínicas, podendo ocorrer desde casos de cura espontânea até manifestações clínicas severas (revisado por Handman, 2001).
As leishmanioses são infecções endêmicas em 88 países, sendo 72 destes países em desenvolvimento. Estima-se que exista uma prevalência de 12 milhões de casos de leishmaniose no mundo atualmente (WHO, 2006). O número de novos casos de várias formas de leishmanioses por ano é estimado em 1,5 milhões dos quais 500.000 são de leishmaniose visceral. Dos casos de leishmaniose visceral, 90% encontra-se em Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão e Brasil, enquanto que 90% dos casos de leishmaniose cutânea encontram-se em Afeganistão, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria (WHO, 2006). No Brasil, aproximadamente 90% dos casos humanos de leishmaniose visceral se concentravam no Nordeste até 1993. Em 2002, 64,02% dos casos correspondem ao Nordeste sendo que a epidemia se estendeu pelo Norte (14,12%), Centro-Oeste 8,22% e Sudeste (13,63%) do país (MS-SINAN, 2003).
1.5.1 A Leishmaniose visceral no Mediterrâneo e nas Américas
A leishmaniose visceral é causada por várias espécies: Leishmania (Leishmania) donovani e a Leishmania (Leishmania) infantum no Velho Mundo e a L. (L.) chagasi nas Américas. A leishmaniose visceral humana nas Américas e no Mediterrâneo é uma zoonose de canídeos. Os parasitas são transmitidos de raposas e canídeos silvestres a cães peridomiciliares e destes aos seres humanos nos ambiente domiciliares, através de picadas de insetos flebotomíneos. No Mediterrâneo, a doença é causada por L. (L.) infantum e o principal vetor é o Phlebotomus perniciosus. Entretanto, no Novo Mundo, a doença é causada porL. (L.) chagasi e é transmitida pelo inseto flebotomíneoLutzomya longipalpis (Guargaet al., 2000). A emergência da leishmaniose visceral zoonótica (LVZ) constitui um severo e preocupante problema de Saúde Pública.
Recentemente se reconheceu a identidade da L. (L.) infantume da L. (L.) chagasi.
Mediante o estudo e o auxílio de técnicas enzimáticas e genéticas concluiu-se que as diferenças entre amostras de L. (L.) infantum e deL. (L.) chagaside diversas procedências são muito restritas. Desse modo, L (L.) chagasi passa a ser sinônimo de L. (L.) infantum (Maurícioet al., 2000).
O ciclo biológico do parasita é heteroxênico, desse modo, durante o seu desenvolvimento apresenta dois estágios: uma forma flagelada extracelular denominada promastigota (móvel e alongada com 10-20 µm), que se desenvolve no hospedeiro invertebrado do gênero Lutzomya (Novo Mundo) e Phlebotomus (Velho Mundo) e uma forma amastigota (esférica com diâmetro de 3-7 µm de diâmetro), que prolifera dentro de fagolisossomo de macrófagos. Os promastigotas são inoculados na pele do hospedeiro vertebrado, juntamente com a saliva, no momento da picada do vetor e são fagocitados por células do sistema monocítico fagocitário (macrófagos, monócitos e células dendríticas), diferenciando-se em formas amastigotas. Os parasitas intracelulares multiplicam-se por divisão binária e chegam a romper os macrófagos infectados. Ao romper a célula, tais formas são liberadas para infectar outros macrófagos e outros fagócitos, assumindo uma localização final, na pele, no baço, no fígado, na medula óssea e nos linfonodos. O ciclo se fecha quando os flebotomíneos picam os reservatórios vertebrados e ingerem as formas amastigotas. Finalmente, os amastigotas atingem o tubo digestivo do vetor, onde após
passarem por várias etapas diferenciam-se em promastigotas infectivas (Awasthi et al., 2004).
A leishmaniose visceral é a forma mais grave da doença, sendo sua evolução gradual e podendo atingir crianças e adultos. É uma doença crônica e freqüentemente letal se não for tratada logo após o aparecimento dos sintomas. Também é conhecida pelas seguintes denominações: febre de Dum-dum ou esplenomegalia tropical, na Índia; calazar infantil ou anemia esplenomegálica, na Bacia do Mediterrâneo e calazar, leishmaniose visceral, calazar americano ou neotropical, nas Américas. Os sintomas em humanos podem ser caracterizados por febre prolongada, mal-estar, anasarca, anemia, linfoadenomegalia generalizada, hepatoesplenomegalia, hipergamaglobulinemia, caquexia e progressiva imunossupressão celular. Também pode ocorrer evolução assintomática, aguda, subaguda ou crônica da doença. O tempo de incubação é variável, desde dias até anos (revisado por Handman, 2001).
A co-infecção de Leishmania e HIV têm ocasionado reativação da doença em pacientes assintomáticos ou de pacientes considerados curados de leishmaniose. Isso indica que o parasita pode ser considerado um oportunista. Isso pode levar, geralmente, resistência ao tratamento, assim como, aceleração no progresso da AIDS (Robertset al.,2000).
O diagnóstico da leishmaniose visceral depende muitas vezes do histórico epidemiológico e da clínica do paciente, sendo estes requisitos básicos no diagnóstico diferencial. Contudo, muitas outras doenças tropicais apresentam quadros semelhantes, por exemplo, malária e esquistossomose. A pesquisa direta dos parasitas pode definir o resultado, para isso, pode ser realizada a punção principalmente de medula óssea ou mais raramente, de baço, seguidas de coloração das lâminas com o corante de Giemsa e observação ao microscópio das formas amastigotas (Herwaldt, 1999). Este método é muito agressivo e penoso para o paciente, que pode sofrer complicações como hemorragias.
A sorologia é extremamente útil para triagem de casos e também em inquéritos epidemiológicos (Badaró et al., 1983; Palatnik de Sousaet al., 1995; revisado por Singh, 2006). A dosagem de proteínas e a eletroforese do soro, com alteração da relação albumina/globulina e hipergamaglobulinemia acentuada, são sugestivas. Outros exames como hemograma acusando anemia, leucopenia, monocitose e linfocitose são auxiliares no diagnóstico (revisado por Singh, 2006).
O diagnóstico precoce é de fundamental importância nos casos de calazar, pois quanto mais precoce, melhores as perspectivas no sucesso na terapia e diminuição de casos fatais são esperados. Outro fator importante é a existência de indivíduos na população com infecção subclínica. Estes indivíduos podem ser doadores assintomáticos de sangue infectado com Leishmania gerando o calazar transfusional (Palatnik de Sousaet al.,1996;
Le Fichouxet al., 1999).
O tratamento contra a leishmaniose é bastante difícil e desconfortável para o paciente. Os antimoniais pentavalentes: antimoniato de meglumina (Glucantime) e estibogluconato de sódio (Pentostan), foram as primeiras drogas a serem utilizadas na terapia e continuam até os dias atuais como terapia de escolha no tratamento da leishmaniose visceral. Tais drogas exigem hospitalização para a administração endovenosa e promovem muitas reações adversas. Com o aumento do número de casos de leishmaniose visceral e o aparecimento de resistência ou de recidivas da doença, os antimoniais pentavalentes começaram a apresentar ineficácia em alguns casos, havendo necessidade de novas estratégias terapêuticas para combater a doença. Assim, o uso de Anfotericina B e a Pentamidina foi introduzido na terapia. Muitas novas terapias têm sido sugeridas, chegando a mais de 60 tratamentos testados (revisado por Murray, 2004). Um aminoglicosídeo denominado Paromomicina, também tem sido testado nas regiões do Kênia, Índia e Sudão, e apresentado bons resultados (cerca de 95% de cura) com menor toxicidade (revisado por Murray 2004). Atualmente, a Miltefosina (Hexadecilfosfocolina) originalmente desenvolvida como um agente anti-neoplásico, é uma droga oral que apresenta propriedades anti-leishmania, porém demonstra toxicidade gastrointestinal (Murray, 2004).
1.5.2 Formas de controle
Conforme recomendações da Organização Mundial da Saúde, o controle da leishmaniose é baseado em três medidas (Tesh, 1995):
1) Detecção e tratamento de casos humanos: promove a redução de morbidade e de mortalidade.
2) Sacrifício ou tratamento de cães infectados: Baseia-se nos aspectos clínicos e na sorologia dos animais.
3) Controle do vetor e dos animais reservatórios:combate aos flebotomíneos adultos e larvas. O uso de inseticidas no interior de residências visa reduzir o ciclo peridoméstico e desse modo, a transmissão do parasita, porém esse efeito é apenas temporário, além de ocorrer resistência ao inseticida com o uso prolongado (Tesh, 1995).
Com o ressurgimento da leishmaniose visceral e a sua importância evidente na Saúde Pública, faz-se necessário o desenvolvimento de novas armas de combate à doença.
Nas áreas endêmicas do Brasil, o controle da leishmaniose visceral envolve a detecção de cães infectados por análise sorológica usando ensaios de imunofluorescência (IF) e sacrifício dos cães soropositivos (Borja-Cabreraet al., 1999).
O controle epidemiológico, portanto, ainda se baseia no sacrifício de cães infectados, tendo sido criticado pela sua falta de eficácia (Costa & Furtado Vieira, 2001).
Modelos matemáticos (Dye, 1996) indicam que o desenvolvimento de uma vacina humana e/ou canina constituiria uma forma eficiente de se controlar a doença.
1.6 Vacinação contra Leishmaniose
A pesquisa de vacinas contra a leishmaniose foi iniciada há muitos anos. O estabelecimento das condições de crescimento de formas promastigotas em cultura, por Nicole e Manceau em 1908, foi um ponto inicial para o desenvolvimento das primeiras vacinas utilizando formas vivas de Leishmania (revisado por Handman, 2001). A primeira geração de vacinas contra leishmaniose foi obtida por manipulação de parasitas mortos com ou sem adjuvantes, tendo sido utilizadas em testes clínicos em populações humanas nas áreas endêmicas, contra a forma cutânea da doença principalmente (Antunes et al., 1986;
Convitet al., 1987; Vélezet al.,2000) e mais recentemente contra a forma visceral (Khalil et al.,2000). A segunda geração de vacinas pode ser dividida em três categorias de acordo com sua composição: vacinas vivas contendo genes de Leishmania ou usando Leishmania geneticamente modificada (Cruz,et al, 1991; Souzaet al., 1994; Tituset al., 1995); vacinas de frações ou subunidades recombinantes ou sintéticas definidas (Russo, et al., 1991;
Skeiky et al., 1995; Gurunathan et al., 1997) e vacinas com frações parcialmente purificadas (Palatniket al., 1989; Jaffeet al., 1990; Jardimet al., 1991;). As vacinas de 3a geração contêm genes de antígenos clonados em um vetor de promotor eucariótico injetado e traduzido diretamente no músculo (Xu & Liew, 1994; Handman, 2001; Ramiro et al.,
2003, Rafatiet al., 2005; Aguilar Be et al., 2005; Gamboa-León et al 2006). Mesmo com tantos avanços nos estudos baseados em formulações vacinais, ainda não se tem disponível uma vacina contra a leishmaniose visceral humana utilizada na rotina clínica.
1.7 A vacina FML
O antígeno FML (Ligante de Fucose e Manose) é um complexo glicoprotéico, isolado de promastigotas de L. (L.) donovani (obtido por extração aquosa) que inibe a infecçãoin vitrode macrófagos peritoneais de camundongos por promastigotas (Palatnik et al.,1989) e amastigotas, sendo um potente imunógeno (Palatnik de Sousa et al.,1993). A glicoproteína de 36KDa, (gp36), pertencente ao complexo FML, é uma banda reconhecida pelos soros de pacientes com calazar (Palatnik de Sousa et al., 1996) sendo um marcador específico para o diagnóstico do calazar em humanos e um forte imunógeno em vacinas de 2ª (Paraguai de Souzaet al., 2001) e de 3ª geração (Santanaet al.,2002; Aguilar-Beet al., 2005; Gamboa-Leónet al., 2006). O antígeno FML apresenta em sua composição açúcares neutros: fucose, manose, glicose, galactose (Palatnik et al., 1989). Ensaios sorológicos realizados com o FML-ELISA (FML como antígeno) demonstraram 100% de sensibilidade e 96-100% de especificidade no diagnóstico do calazar humano e canino, de pacientes infectados por L. (L.) chagasi(Palatnik de Sousaet al., 1995; Borja-Cabrera et al., 1999). Portanto, o FML comporta-se como um antígeno específico, sendo efetivo no diagnóstico e prognóstico da infecção humana por L. (L.) chagasi embora isolado de L. (L.) donovani (revisado por Borja-Cabreraet al., 1999).
Os estudos de vacinação utilizando o antígeno FML começaram com a formulação de FML e saponina Riedel de Haen em vacinação profilática no modelo de camundongo Balb/c (Palatnik de Sousaet al., 1994a) e de hamster CB (Palatnik de Sousaet al., 1994b).
Santos et al., (1999) compararam diferentes adjuvantes (saponina, Al(OH)3,adjuvantes de Freund) no modelo de camundongos heterocruzados Swiss Albino. Com a vacina FML- saponina foi observada redução na carga parasitária de 85 % e aumento de IgG total, IgG2a, e IgG2b, revelando que a saponina foi o melhor adjuvante estudado.
Recentemente, testes de fase III de eficácia foram realizados na área endêmica de São Gonçalo do Amaranto, RN, utilizando a vacina-FML em cães, induzindo 92% (da Silva et al., 2000) e 95% (Borja-Cabreraet al., 2002) de proteção, em cães vacinados naturalmente
expostos (76% e 80% de eficácia vacinal, respectivamente). Assim sendo, vacina FML- QuilA induziu proteção por até 3,5 anos após a vacinação (Borja-Cabrera et al., 2002).
Neste período, os cães vacinados mostraram alta soropositividade e reação intradérmica (IDR) positiva ao lisado de promastigotas de Leishmania e não foi detectado DNA de Leishmania, nem por PCR de sangue ou medula, nem presença de parasitas na punção de medula. Controles de salina, por outro lado, mostraram PCR positivos para DNA de Leishmania, amastigotas em punção de medula e sorologia para FML com intradermorreação negativa. A vacina FML-QuilA induziu proteção significante, com ação duradoura e forte efeito protetor contra o calazar canino, no campo (Borja-Cabrera et al., 2002). A vacina FML-saponina R foi aplicada em 31 cães naturalmente infectados, quando soropositivos por FML-ELISA, mas ainda completamente assintomáticos (Borja-Cabreraet al., 2004). Vinte e dois meses depois da vacinação completa, 90% dos cães permaneciam assintomáticos, sadios, com proporções normais de linfócitos CD4+, e CD21+, indicando a sua condição não infecciosa (Guarga et al., 2002). Estes cães se mantêm sadios, 4 anos após a vacinação inicial (Palatnik de Sousa CB, comunicação pessoal). Também, níveis elevados de linfócitos T CD8+ e ausência de parasitas foram evidenciados, indicando que a vacina FML-saponina R foi efetiva também na imunoterapia contra a leishmaniose visceral em cães infectados assintomáticos (Borja-Cabreraet al., 2004).
Recentemente a formulação FML-saponina foi licenciada para comercialização no Brasil sob o nome de Leishmune ®. A vacinação profilática com Leishmune ® em 600 cães de área endêmica tem demonstrado 97% de proteção após 22 meses de aplicação (Borja–Cabreraet al., 2005). O princípio ativo adjuvante de ambas as saponinas QuilA e a saponina R da Riedel de Haen é a saponina QS21 de Quillaja saponaria Molina (Palatnik de Sousaet al., 2004). A purificação da saponina Riedel de Haen em cromatografia de troca iônica revelou que os princípios ativos da mesma são a saponina QS21 e saponinas deaciladas, ambas com forte efeito adjuvante na vacinação contra o calazar murino (Oliveira Freitaset al., 2006).
Considerando a importância atribuída pela literatura aos aldeídos e normonoterpenos na função adjuvante da saponina QS21 da Quillaja saponaria Molina, e as semelhanças da saponina QS21, em potência e estrutura, com a nova saponina CP05 da Calliandra pulcherrima Benth, procederemos no presente trabalho, a tratar quimicamente
ambas as saponinas visando elucidar a responsabilidade de cada uma das suas frações no efeito biológico respectivo. Utilizaremos para tal fim o modelo de vacinação profilática com a vacina FML contra a leishmaniose visceral murina.
II- Objetivos:
1. Avaliar comparativamente o efeito da degradação dos carboidratos na função adjuvante das saponinas QS21 e CP05, no modelo de leishmaniose visceral murina.
2. Avaliar comparativamente o efeito seletivo da remoção da cadeia de monoterpenos, ou da fração completa ligada no C-28 (monoterpenos e açúcares), ou de ambas as frações ligadas ao C-3 e ao C-28 do triterpeno, na função adjuvante da saponina CP05, no modelo de leishmaniose visceral murina.
III - Material e Métodos:
3.1 Obtenção do antígeno FML deL. (L.) donovani(LD1S):
3.1.1 Manutenção de amostras deL. donovani(LD1S)in vitro
A amostra deLeishmania (L.) donovani(LD-1S/MHOM/SD/00-strain 1S) é oriunda do laboratório do Dr. D. M. Dwyer do National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA. A amostra foi mantida através de passagens semanais em tubos de vidro de 13 cm com tampa de rosca, contendo meio BHI 37 g/L , 0,02 g/L de ácido fólico, 0,01 g/L de hemina e 10% de soro fetal bovino inativado. As culturas foram mantidas em estufa a temperatura de 28º C.
3.1.2 Obtenção de massa de células para extração do FML
Para obtenção da massa de células, 5 mL de culturas de promastigotas na fase logarítmica de crescimento foram transferidos para frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 70 mL de fase líquida conforme descrito acima, e incubados sob agitação (150 rpm) a 28º C por períodos de 3 dias. As culturas foram amplificadas para frascos Erlenmeyer de 3 L contendo 1 L de fase líquida e incubadas nas mesmas condições até atingir a fase estacionária. Em seguida, as células foram centrifugadas a 6000g x 10 min., lavadas três vezes em solução salina 0,9% NaCl e conservadas a -20º C até a extração (Palatniket al., 1989).
3.1.3 Extração e purificação do complexo glicoprotéico FML de promastigotas de L.
(L.) donovani
As células foram rapidamente descongeladas e extraídas duas vezes com água destilada em banho de gelo, sob forte agitação (Palatnik et al., 1989). Os extratos foram recolhidos por centrifugação a 6000g x 15 min. O sobrenadante foi removido e aquecido até 100º C. O material desnaturado foi separado por centrifugação a 48.200g x 10 min e descartado. O extrato aquoso obtido foi liofilizado, fracionado por cromatografia de gel filtração em coluna de BioGel P-10 (BIO-RAD) (120 cm x 2 cm; 100-200 mesh, Bio-Rad Laboratórios, Richmond, Calif). A eluição foi monitorada através de dosagens de
carboidratos, proteínas e leitura da absorbância a 220 ç m e 260 ç m. A fração correspondente ao volume de exclusão, contendo o FML (Ligante de Fucose Manose) foi separada, concentrada, liofilizada e seu perfil eletroforético foi analisado em gel de poliacrilamida (Palatniket al., 1989).
3.2 Obtenção da saponina CP05 deCalliandra pulcherrima
Estes foram gentilmente cedidos pelo Professor José Paz Parente e pela Professora Bernadete Pereira da Silva do Laboratório de Química de Plantas Medicinais, do Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais da UFRJ. A saponina CP05 foi obtida a partir de folhas frescas da planta conforme descrito (Silva et al., 2005) através de extração com MeOH e cromatografia em coluna de Sephadex LH-20 e de sílica gel. A CP05 foi revelada em cromatografía de camada delgada pelo método do orcinol-sulfúrico (mancha azul-escura) como uma substância homogênea com Rf0,50 (Silvaet al.,2005).
3.3 Obtenção da saponina QS21
A saponina QS21, gentilmente cedida pelo Professor José Paz Parente e pela Professora Bernadete Pereira da Silva do Laboratório de Química de Plantas Medicinais, do Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais da UFRJ, foi extraída a partir da mistura comercial Riedel de Haen, Saponin pure (8047-15-2) EINECE (West Germany) através de cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-celulose e cromatografia de exclusão em coluna de Sephadex G-50 e G-25, conforme descrito por Oliveira-Freitas et al. (2006), fornecendo uma substância (QS21) homogênea com Rf0,45 detectada por cromatografia em camada delgada (Silvaet al.,2005).
3.4 Avaliação comparativa do efeito da degradação dos carboidratos na função adjuvante das saponinas QS21 e CP05, no modelo de leishmaniose visceral murina.
As amostras das saponinas cedidas pelo Professor José Paz Parente e pela Professora Bernadete Pereira da Silva do Laboratório de Química de Plantas Medicinais, do Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais da UFRJ foram tratadas com periodato de sódio (NaIO4, 0,05 M) à temperatura ambiente (Mislovicováet al., 2002), no escuro. A reação foi
