O antígeno FML (Ligante de Fucose e Manose) é um complexo glicoprotéico, isolado de promastigotas de L. (L.) donovani (obtido por extração aquosa) que inibe a infecçãoin vitrode macrófagos peritoneais de camundongos por promastigotas (Palatnik et al.,1989) e amastigotas, sendo um potente imunógeno (Palatnik de Sousa et al.,1993). A glicoproteína de 36KDa, (gp36), pertencente ao complexo FML, é uma banda reconhecida pelos soros de pacientes com calazar (Palatnik de Sousa et al., 1996) sendo um marcador específico para o diagnóstico do calazar em humanos e um forte imunógeno em vacinas de 2ª (Paraguai de Souzaet al., 2001) e de 3ª geração (Santanaet al.,2002; Aguilar-Beet al., 2005; Gamboa-Leónet al., 2006). O antígeno FML apresenta em sua composição açúcares neutros: fucose, manose, glicose, galactose (Palatnik et al., 1989). Ensaios sorológicos realizados com o FML-ELISA (FML como antígeno) demonstraram 100% de sensibilidade e 96-100% de especificidade no diagnóstico do calazar humano e canino, de pacientes infectados por L. (L.) chagasi(Palatnik de Sousaet al., 1995; Borja-Cabrera et al., 1999). Portanto, o FML comporta-se como um antígeno específico, sendo efetivo no diagnóstico e prognóstico da infecção humana por L. (L.) chagasi embora isolado de L. (L.) donovani (revisado por Borja-Cabreraet al., 1999).
Os estudos de vacinação utilizando o antígeno FML começaram com a formulação de FML e saponina Riedel de Haen em vacinação profilática no modelo de camundongo Balb/c (Palatnik de Sousaet al., 1994a) e de hamster CB (Palatnik de Sousaet al., 1994b).
Santos et al., (1999) compararam diferentes adjuvantes (saponina, Al(OH)3,adjuvantes de Freund) no modelo de camundongos heterocruzados Swiss Albino. Com a vacina FML-saponina foi observada redução na carga parasitária de 85 % e aumento de IgG total, IgG2a, e IgG2b, revelando que a saponina foi o melhor adjuvante estudado.
Recentemente, testes de fase III de eficácia foram realizados na área endêmica de São Gonçalo do Amaranto, RN, utilizando a vacina-FML em cães, induzindo 92% (da Silva et al., 2000) e 95% (Borja-Cabreraet al., 2002) de proteção, em cães vacinados naturalmente
expostos (76% e 80% de eficácia vacinal, respectivamente). Assim sendo, vacina FML-QuilA induziu proteção por até 3,5 anos após a vacinação (Borja-Cabrera et al., 2002).
Neste período, os cães vacinados mostraram alta soropositividade e reação intradérmica (IDR) positiva ao lisado de promastigotas de Leishmania e não foi detectado DNA de Leishmania, nem por PCR de sangue ou medula, nem presença de parasitas na punção de medula. Controles de salina, por outro lado, mostraram PCR positivos para DNA de Leishmania, amastigotas em punção de medula e sorologia para FML com intradermorreação negativa. A vacina FML-QuilA induziu proteção significante, com ação duradoura e forte efeito protetor contra o calazar canino, no campo (Borja-Cabrera et al., 2002). A vacina FML-saponina R foi aplicada em 31 cães naturalmente infectados, quando soropositivos por FML-ELISA, mas ainda completamente assintomáticos (Borja-Cabreraet al., 2004). Vinte e dois meses depois da vacinação completa, 90% dos cães permaneciam assintomáticos, sadios, com proporções normais de linfócitos CD4+, e CD21+, indicando a sua condição não infecciosa (Guarga et al., 2002). Estes cães se mantêm sadios, 4 anos após a vacinação inicial (Palatnik de Sousa CB, comunicação pessoal). Também, níveis elevados de linfócitos T CD8+ e ausência de parasitas foram evidenciados, indicando que a vacina FML-saponina R foi efetiva também na imunoterapia contra a leishmaniose visceral em cães infectados assintomáticos (Borja-Cabreraet al., 2004).
Recentemente a formulação FML-saponina foi licenciada para comercialização no Brasil sob o nome de Leishmune ®. A vacinação profilática com Leishmune ® em 600 cães de área endêmica tem demonstrado 97% de proteção após 22 meses de aplicação (Borja–Cabreraet al., 2005). O princípio ativo adjuvante de ambas as saponinas QuilA e a saponina R da Riedel de Haen é a saponina QS21 de Quillaja saponaria Molina (Palatnik de Sousaet al., 2004). A purificação da saponina Riedel de Haen em cromatografia de troca iônica revelou que os princípios ativos da mesma são a saponina QS21 e saponinas deaciladas, ambas com forte efeito adjuvante na vacinação contra o calazar murino (Oliveira Freitaset al., 2006).
Considerando a importância atribuída pela literatura aos aldeídos e normonoterpenos na função adjuvante da saponina QS21 da Quillaja saponaria Molina, e as semelhanças da saponina QS21, em potência e estrutura, com a nova saponina CP05 da Calliandra pulcherrima Benth, procederemos no presente trabalho, a tratar quimicamente
ambas as saponinas visando elucidar a responsabilidade de cada uma das suas frações no efeito biológico respectivo. Utilizaremos para tal fim o modelo de vacinação profilática com a vacina FML contra a leishmaniose visceral murina.
II- Objetivos:
1. Avaliar comparativamente o efeito da degradação dos carboidratos na função adjuvante das saponinas QS21 e CP05, no modelo de leishmaniose visceral murina.
2. Avaliar comparativamente o efeito seletivo da remoção da cadeia de monoterpenos, ou da fração completa ligada no C-28 (monoterpenos e açúcares), ou de ambas as frações ligadas ao C-3 e ao C-28 do triterpeno, na função adjuvante da saponina CP05, no modelo de leishmaniose visceral murina.
III - Material e Métodos:
3.1 Obtenção do antígeno FML deL. (L.) donovani(LD1S):
3.1.1 Manutenção de amostras deL. donovani(LD1S)in vitro
A amostra deLeishmania (L.) donovani(LD-1S/MHOM/SD/00-strain 1S) é oriunda do laboratório do Dr. D. M. Dwyer do National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA. A amostra foi mantida através de passagens semanais em tubos de vidro de 13 cm com tampa de rosca, contendo meio BHI 37 g/L , 0,02 g/L de ácido fólico, 0,01 g/L de hemina e 10% de soro fetal bovino inativado. As culturas foram mantidas em estufa a temperatura de 28º C.
3.1.2 Obtenção de massa de células para extração do FML
Para obtenção da massa de células, 5 mL de culturas de promastigotas na fase logarítmica de crescimento foram transferidos para frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 70 mL de fase líquida conforme descrito acima, e incubados sob agitação (150 rpm) a 28º C por períodos de 3 dias. As culturas foram amplificadas para frascos Erlenmeyer de 3 L contendo 1 L de fase líquida e incubadas nas mesmas condições até atingir a fase estacionária. Em seguida, as células foram centrifugadas a 6000g x 10 min., lavadas três vezes em solução salina 0,9% NaCl e conservadas a -20º C até a extração (Palatniket al., 1989).
3.1.3 Extração e purificação do complexo glicoprotéico FML de promastigotas de L.
(L.) donovani
As células foram rapidamente descongeladas e extraídas duas vezes com água destilada em banho de gelo, sob forte agitação (Palatnik et al., 1989). Os extratos foram recolhidos por centrifugação a 6000g x 15 min. O sobrenadante foi removido e aquecido até 100º C. O material desnaturado foi separado por centrifugação a 48.200g x 10 min e descartado. O extrato aquoso obtido foi liofilizado, fracionado por cromatografia de gel filtração em coluna de BioGel P-10 (BIO-RAD) (120 cm x 2 cm; 100-200 mesh, Bio-Rad Laboratórios, Richmond, Calif). A eluição foi monitorada através de dosagens de
carboidratos, proteínas e leitura da absorbância a 220 ç m e 260 ç m. A fração correspondente ao volume de exclusão, contendo o FML (Ligante de Fucose Manose) foi separada, concentrada, liofilizada e seu perfil eletroforético foi analisado em gel de poliacrilamida (Palatniket al., 1989).