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RESPOSTAS ANTIOXIDATIVAS EM NÓDULOS DE CAUPI INOCULADO COM BRADYRHIZOBIUM
1ANTIOXIDATIVE RESPONSES IN COWPEA NODULES INOCULATED WITH BRADYRHIZOBIUM
Rayssa Dias Batista Ryhara Dias Batista Gil Rodrigues Santos
Aurenivia Bonifacio Universidade Federal do Tocantins- UFT
Artenisa Cerqueira Rodrigues Universidade Federal Rural de Pernambuco
RESUMO
O nitrogênio é considerado elemento essencial para as plantas, pois está presente na composição das mais importantes biomoléculas. As plantas podem obter esse nitrogênio através do processo de fixação biológica pela simbiose entre a planta e as bactérias fixadoras de nitrogênio. A fixação biológica do nitrogênio pode ser afetada por fatores bióticos e abióticos que provocam estresse oxidativo na planta. O sistema antioxidativo enzimático envolve enzimas, como por exemplo dismutase de superóxido (SOD), catalase (CAT), peroxidase de fenóis (POX), que conferem proteção oxidativa às plantas. Desta forma, objetivo deste trabalho foi avaliar o metabolismo antioxidativo em nódulos de plantas de feijão-caupi inoculadas com Bradyrhizobium sp. (estirpe BR 3267). Os resultados mostraram que a inoculação com Bradyrhizobium sp. foi efetiva e resultou em baixo acúmulo de amônia e diminuição do estresse oxidativo. Concluiu-se que a inoculação de caupi com Bradyrhizobium sp. foi efetiva em estimular as enzimas envolvidas no processo oxidativo (SOD, POX e CAT). Estas enzimas foram eficientes na remoção das espécies reativas de oxigênio e promoveram proteção oxidativa para plantas de caupi.
Palavras-chave: espécies reativas de oxigênio; nitrogênio; Vigna unguiculata
ABSTRACT
The nitrogen is considered essential element for plants, because it is present in the composition of the most important biomolecules. Plants can get that nitrogen through the biological fixation process by symbiosis between the plant and the nitrogen-fixing bacteria.
The biological nitrogen fixation can be affected by biotic and abiotic factors that provokes oxidative stress in the plant. Enzymatic antioxidant system involving enzymes, such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), phenols peroxidase (POX), that confer oxidative protection to plants. Thus, the aim of this work was to evaluate the antioxidative metabolism in nodules of cowpeas inoculated with Bradyrhizobium sp. (strain BR 3267). The results showed that inoculation with Bradyrhizobium sp. was effective and resulted in low ammonia accumulation and reduction of the oxidative stress. It was concluded that the inoculation of cowpea with Bradyrhizobium sp. was effective in stimulates the enzymes
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Trabalho premiado no 10º Seminário de Iniciação Científica da Universidade Federal do Tocantins, realizado
de 24 a 28 de novembro de 2014, em Palmas-TO.
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involved in the oxidative process (SOD, POX and CAT). These enzymes was efficient in the removal of reactive oxygen species and providing oxidative protection in cowpea plants.
Keywords: reactive oxygen species; nitrogen; Vigna unguiculata
Recebido em 07/09/2015. Aceito em 24/09/2015. Publicado em 03/12/2015.
INTRODUÇÃO
O nitrogênio é o nutriente mineral mais requerido pelas plantas e sua limitação influi diretamente no crescimento vegetal em ambientes naturais, bem como na produtividade agrícola. A deficiência do nitrogênio resulta em alterações na formação de raízes, na fotossíntese, na produção e translocação de fotoassimilados e na taxa de crescimento das plantas (Lea e Azevedo, 2006; Cattivelli et al., 2008; Andrews et al., 2009). A disponibilização do nitrogênio para as leguminosas pode ocorrer pela absorção direta do solo ou através do nitrogênio atmosférico (N
2), que é obtido pelo processo de fixação biológica do nitrogênio através da simbiose entre a planta e as bactérias fixadoras de nitrogênio (rizóbios), sendo este processo fortemente afetado em condições de estresse (Nguyen et al., 2009;
Rodrigues et al., 2013).
As plantas frequentemente estão expostas a estresses bióticos e abióticos que prejudicam o seu crescimento, desenvolvimento e sua produtividade. Estas situações estressantes restringem, em todo mundo, o desenvolvimento das espécies vegetais, devido aos seus efeitos negativos na taxa de sobrevivência, no crescimento vegetal ou acúmulo de biomassa, na produção de grãos e, ainda, na produtividade da maioria das culturas economicamente importantes (Mahajan e Tuteja, 2005; Cattivelli et al., 2008). Além disso, o déficit hídrico pode desencadear efeitos secundários, tais como o estresse oxidativo (Munns e Tester, 2008; Foyer et al., 2009).
O estresse oxidativo resulta de um desequilíbrio entre a produção e remoção de espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs são moléculas extremamente reativas e podem causar danos metabólicos irreversíveis, tais como a peroxidação de lipídios, danos nas membranas celulares e degradação de proteínas, que podem ocasionar perda de viabilidade celular e comprometer drasticamente o desempenho e produtividade vegetal (Mittler, 2006;
Foyer et al., 2009). As moléculas mais comuns de EROs são o radical superóxido (O
2•-) e o
peróxido de hidrogênio (H
2O
2) (Foyer et al., 2009). A produção dos EROs é uma das
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principais respostas bioquímicas das células a estresses bióticos e abióticos (Møller et al., 2007; Nguyen et al., 2009).
As EROs estão presentes naturalmente em diversos compartimentos celulares participando de processos vitais, tais como a fotossíntese e a fixação biológica do nitrogênio (Chang et al., 2009; Nguyen et al., 2009; Becana et al., 2010). Assim, as EROs podem atuar tanto indicadores celulares de situações de estresse como também mensageiros secundários envolvidos na resposta ao estresse e seus níveis precisam ser mantidos sob controle (Antón et al., 2006; Møller et al., 2007). Para isso, a célula conta com sistemas de defesa composto de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos que está presente em várias organelas e atua de forma coordenada na proteção oxidativa (Asada, 2006; Foyer et al., 2009; Miller et al., 2010).
O sistema antioxidativo enzimático é constituído principalmente pelas enzimas oxidativas dismutases de superóxido (SOD), catalases (CAT), peroxidase de fenóis (POX), peroxidases de ascorbato (APX), redutases de glutationa (GR), redutases de monodehidroascorbato (MDHAR) e redutases de dehidroascorbato (DHAR), enquanto que o sistema não enzimático é constituído principalmente por componentes hidrofílicos, tais como o ácido ascórbico (ASA) e a glutationa (GSH) (Asada, 2006; Munns e Tester, 2008; Foyer et al., 2009). Estes componentes do sistema antioxidativo encontram-se presentes em várias organelas e atuam de forma coordenada para conferir proteção oxidativa (Møller et al., 2007;
Foyer et al., 2009).
Atualmente, existe um crescente interesse em compreender os processos envolvidos na resposta oxidativa em situações de estresse biótico e abiótico, entretanto ainda não se sabe quais os “níveis críticos” dos indicadores que levam à sinalização ou dano oxidativo e como os organismos promotores podem atuar neste processo. Assim, um melhor conhecimento acerca da interação rizóbio-caupi pode fornecer subsídios que ajudem na compreensão destes mecanismos fisiológicos e bioquímicos que são acionados na defesa antioxidativa. Tais dados podem fornecer variáveis que ajudem a manter a sanidade vegetal e melhorar a adaptação das espécies vegetais aos ambientes adversos. Diante do exposto, esse trabalho tem como objetivo avaliar o metabolismo antioxidativo em nódulos de caupi inoculadas com Bradyrhizobium sp.
MATERIAIS E MÉTODOS Obtenção do microrganismo
Antes da inoculação, foi realizada a multiplicação da estirpe a ser utilizada nos
tratamentos experimentais. A estirpe BR 3267 de Bradyrhizobium sp. foi crescida em frascos
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Erlenmeyer contendo 50 mL de meio de cultura YM (extrato de levedura e manitol) mantidos em agitação constante (200 rpm; 28 °C) por 96 h. Na produção dos inoculantes, 10
9UFC mL
-1
de meio de cultura YM contendo o Bradyrhizobium sp. (estirpe BR 3267) foi misturado à turfa (50 mL de meio de cultura 150 g
-1de turfa).
Condução do experimento e determinações
O experimento foi conduzido em casa de vegetação localiza no campo experimental da Universidade Federal do Tocantins (Campus Universitário de Gurupi). As sementes de caupi cv. “Vinagre” foram desinfestadas e semeadas em vasos contendo 3,0 Kg de solo não- esterilizado como substrato, onde se efetuou calagem e adubação de acordo com análise química do solo e recomendação para a cultura. Para instalação dos tratamentos, as sementes foram inoculadas com Bradyrhizobium sp. BR 3267. Além disso, utilizou-se duas testemunhas: a testemunha absoluta, plantas não inoculadas; e uma testemunha nitrogenada, plantas não inoculadas e suplementadas com nitrogênio mineral.
Sete dias após a semeadura realizou-se o desbaste deixando apenas duas plantas por vaso. Durante todo o período experimental, as plantas foram irrigadas manualmente com solução nutritiva de Hoagland e Arnon (1950) modificada por Silveira et al. (1998) e isenta de nitrogênio. A adubação nitrogenada realizada adicionando-se sulfato de amônia (fonte de nitrogênio) à solução nutritiva. A coleta dos nódulos foi realizada aos 35 dias após a germinação das sementes, período de maior fixação biológica do nitrogênio em nódulos de caupi. Após coletados, os nódulos foram devidamente identificados, acondicionados e armazenados em freezer -80 °C até o momento das determinações.
Mensuração da concentração de amônia, carboidratos solúveis totais e aminoácidos livres totais em nódulos de caupi
Após a coleta dos nódulos, procedeu-se a obtenção do extrato para a determinação da
concentração de amônia, carboidratos solúveis totais e aminoácidos livres totais. Para tal, 50
mg de nódulos frescos foram misturados com 1,5 mL de água deionizada e levados ao banho-
maria a 95 °C por 1 h. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 3.000 g (20 min) e o
sobrenadante recolhido e utilizado. Para a determinação de amônia, utilizou-se o método do
fenolato-hipoclorito (Weatherburn, 1967). Alíquotas do extrato previamente obtido foram
misturadas com 2,5 mL de uma solução contendo Fenol 1% e nitroprussiato de sódio 0,005%
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e 2,5 mL da solução contendo NaOH 0,5% e NaClO 2,52%. Os tubos foram mantidos a 37 °C por 20 min e então lidos em espectrofotômetro a 625 nm. A concentração de amônia foi calculada e expressa em μmol g
-1MF (massa fresca).
Para a determinação da concentração dos carboidratos solúveis totais (Dubois et al., 1956), misturou-se fenol 5% (v/v) e 2,5 mL de ácido sulfúrico concentrado ao extrato aquoso diluído. Os tubos foram agitados em vórtex e, após atingirem a temperatura ambiente, realizou-se as leituras em espectrofotômetro a 490 nm. O teor de carboidratos solúveis foi calculado com base na curva-padrão de glicose e os dados expressos em mmol kg
-1MF. Para a determinação do nível de aminoácidos livres totais (Yemm & Cocking, 1955), alíquotas do extrato previamente obtido foram pipetadas para tubos rosqueáveis e adicionou-se tampão citrato 0,2 M (pH 5,0) e ninhidrina a 5% (diluída em KCN 0,2 mM). Os tubos foram fechados, agitados e mantidos a 100 °C por 15 min. Posteriormente, os tubos foram resfriados em banho de gelo e adicionou-se etanol 60%. As amostras foram lidas a 570 nm e os resultados expressos em μmol g
-1MF.
Determinação da concentração do peroxido de hidrogênio em nódulos de caupi
Para a determinação da concentração do peroxido de hidrogênio foi utilizada a metodologia descrita por Brennan & Frenkel (1977) com algumas modificações. Nódulos frescos (100 mg) foram pesados e macerados na presença de 1,0 mL de TCA 5%. As amostras foram centrifugadas a 10.000 g por 5 min a 4°C, o sobrenadante foi coletado e o precipitado descartado. Do sobrenadante, foram recolhidas alíquotas de 100 μL que foram diluídas e misturadas com TiCl4 20% em HCl 11 mM (v/v) e NH
4OH. Após uma série de centrifugações a 10.000g por 5 min a 4°C e lavagens do precipitado, o “pellet” foi resuspendido em H
2SO
41 M e TCA 5% e o volume final lido em espectrofotômetro a 415 nm. As concentrações de H
2O
2foram obtidas a partir de curva padrão e os dados foram expressos em μmol H
2O
2g
-1MF.
Mensuração da atividade das enzimas antioxidativas em nódulos de caupi
Após a coleta dos nódulos de caupi, foram obtidos os extratos proteicos que foram
utilizados na determinação da atividade das enzimas antioxidativas dismutase do superóxido
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(SOD), peroxidase de fenóis (POX) e catalase (CAT). Para tal, 100 mg de nódulos frescos foram macerados na presença de N
2líquido até a obtenção de farinha homogênea.
Posteriormente, adicionou-se tampão TRIS-HCl 50 mM (pH 7,5) contendo DTT 5 mM, PVP 3%, PMSF 1 mM e MgCl2 10 mM) e macerou-se o homogenato por três minutos. Ao final, o extrato proteico foi centrifugado a 15.000 g por 10 min a 4 °C e o sobrenadante recolhido e utilizado nas determinações das enzimas SOD, CAT e POX.
A atividade da SOD (EC 1.15.1.1) foi determinada conforme metodologia descrita por Gianopolitis & Ries (1977). Alíquotas do extrato proteico foram transferidas para tubos ensaio protegidos da luz, contendo: tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,8); EDTA 0,1 mM; L-metionina 13 mM; e NBT 75 μM. A reação foi realizada em câmara iluminada por lâmpada de 30 watts (30 μmol de fótons m
-2s
-1) e foi iniciada pela adição de riboflavina 2 mM. A reação foi interrompida após cinco minutos pelo desligamento da luz. Os tubos foram revestidos por filme escuro e lidos em espectrofotômetro a 540 nm. A atividade da enzima foi estimada com base na inibição do NBT e uma unidade de atividade foi considerada como a quantidade da enzima necessária para inibir 50% da sua redução (Beauchamp & Fridovich, 1971) e expressa em UA g
-1MF min
-1.
A atividade de POX (EC 1.11.1.7) foi mensurada segundo método proposto por Amako et al. (1994). Alíquotas de 0,1 mL do extrato proteico foram transferidas para tubos ensaio e misturadas com tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) contendo pirogalol 20 mM e peróxido de hidrogênio 0,1 mM. A atividade de POX foi calculada com base no coeficiente de extinção molar do pirogalol (2,47 mM
-1cm
-1) e expresso em μmol pirogalol g
-1MF min
-1. Para a atividade da CAT (EC: 1.11.1.6), utilizou-se o método de Havir & McHale (1987). Alíquotas do extrato proteico foram adicionados ao tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) a 30 °C e o decaimento da absorbância a 204 nm foi acompanhado em espectrofotômetro por três minutos. A atividade da enzima foi calculada com base no coeficiente de extinção molar de 36 M
-1cm
-1(240 nm) para o H
2O
2e expressa em μmol H
2O
2g
-1MF min
-1.
Delineamento experimental e análise estatística
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado com quatro repetições.
Cada repetição foi formada por um vaso, que continha duas plantas de caupi. A análise dos
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dados foi realizada através do programa ASSISTAT. Inicialmente, realizou-se a análise da normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk. Comprovada a normalidade, procedendo-se à análise de variância (ANOVA) e o teste de Tukey para comparação das médias, ambos a 5% de probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observou-se uma maior concentração de amônia nos nódulos da testemunha nitrogenada e na testemunha absoluta, enquanto que nas plantas inoculadas com Bradyrhizobium sp. BR 3267 houve menor concentração de amônia nos nódulos (Figura 1A).
Embora o resultado inicial da fixação biológica do nitrogênio atmosférico (N
2) seja o amônio (NH
3), acúmulos acentuados deste composto inorgânico indicam que houve uma menor capacidade de utilização deste composto na produção de aminoácidos e/ou proteínas (Lea e Azevedo, 2006). Dentre os inúmeros nutrientes que afetam os vegetais, o nitrogênio - elemento mais abundante na atmosfera terrestre - é considerado mais limitante, pois sua deficiência resulta em alterações na formação de raízes, na fotossíntese, na produção e translocação de fotoassimilados e na taxa de crescimento das plantas (Andrews et al., 2009;
Rodrigues et al., 2013).
Figura 1. Concentração de amônia livre (A), carboidratos solúveis totais (B) e aminoácidos livres totais (C) em nódulos de plantas de caupi inoculadas com Bradyrhizobium sp. BR 3267 (IN) e nas testemunhas absoluta (TA) e nitrogenada (TN). Letras diferentes mostram diferença estatística pelo teste de Tukey (P > 0,05).
Figure 1. Concentration of free ammonia (A), total soluble carbohydrates (B) and total free amino acid (C) in plant cowpea nodules inoculated with Bradyrhizobium sp. BR 3267 (IN) and in absolute control (TA) and nitrogen control (TN). Different letters displays statistical differences by Tukey test (P > 0.05).
O acúmulo da amônia livre, relatado em nosso estudo, pode também estar relacionado ao aumento da proteólise nos nódulos radiculares, evento que pode ser expressivo em nódulos ineficientes. A proteólise é um mecanismo degradativo de proteínas e este processo
A
TA TN IN
Amônia livre (mmol [NH4+ ] kg-1 massa seca) 0,0 0,6 1,2 1,8 2,4
B
TA TN IN
Carboidratos solúveis totais (µmol g-1 massa fresca) 0 100 200 300 400
C
TA TN IN
Aminoácidos livres totais (µmol g-1 massa fresca) 0 40 80 120 160 a
b c a
a
b
a
b
c