UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Programa de Pós-Graduação em Veterinária

Dissertação

Influência das proteínas do plasma seminal sobre a

qualidade do sêmen ovino congelado

Karina Lemos Goularte

Pelotas, 2009

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Karina Lemos Goularte

Influência das proteínas do plasma seminal sobre a

qualidade do sêmen ovino congelado

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento: Reprodução Animal).

Orientador: Thomaz Lucia Junior

Dados de catalogação na fonte:

( Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744 )

G694i Goularte, Karina Lemos

Influência das proteínas do plasma seminal sobre a qualidade do sêmen ovino congelado / Karina Lemos Goularte. - Pelotas, 2009.

48f.

Dissertação ( Mestrado em Reprodução Animal ) –Programa de Pós-Graduação em Veterinária Faculdade de Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. - Pelotas, 2009, Thomaz Lucia Junior, Orientador.

1. Proteínas 2. Plasma seminal 3.Sêmen congelado 4. Ovinos I Lucia Junior, Thomaz (orientador) II .Título.

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Banca examinadora:

Dr. Thomaz Lucia Junior (Orientador) Dra. Denise Calisto Bongalhardo

Dr. Ivan Bianchi

Dedico este trabalho aos meus pais, Julieta e Ubirajara, pela oportunidade da realização de um sonho. Pelo apoio, incentivo e aconchego nos momentos necessários.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por iluminar meu caminho, guiar meus passos e decisões e, confortar meu coração.

Agradeço aos meus pais, Julieta Iriema Lemos Goularte e Ubirajara da Rosa Goularte, pelos ensinamentos que me foram dados, pelos valores que me foram apresentados e, por ser o que sou. Eles me ensinaram a buscar meus sonhos e, um deles, posso dizer que já consegui. Tenho muito a percorrer ainda, porém tenho certeza que eles estarão sempre ao meu lado apoiando minhas decisões.

À minha avó, Otillia Lettnin Lemos pelo cuidado, preocupação, paciência e companhia nas horas de lazer.

À minhas irmãs Cristina e Fabiana pelo apoio, amizade e incondicional ajuda nos momentos necessários.

Ao meu namorado Murilo pela compreensão, amizade, amor e irrestrito apoio na minha realização pessoal e profissional.

Ao meu cunhado Leonardo Ferreira Dutra pela ajuda e incentivo para o aperfeiçoamento de meus conhecimentos.

Ao meu orientador professor Dr. Thomaz Lucia Junior pela confiança, amizade, apoio, incentivo, ensinamentos e oportunidade de conviver e trabalhar com pessoas maravilhosas.

Aos amigos e colegas de Pós-Graduação Carine Dahl Corcini e Rafael Adolfo Tonieto, cujo convívio foi de extrema importância para o aprimoramento de meus conhecimentos, e ainda, ajudaram na execução deste trabalho.

Aos estagiários Alexander Gonçalves, Gustavo Desire Antunes Gastal, Jonas Rafael Schneider, Raquel Schiavon Schiavon e Stela Gheller, pela amizade, auxílio na execução deste trabalho e pelos momentos de alegria proporcionados.

Aos colegas e amigos do Laboratório de Biotécnicas da Reprodução Animal, Fernando, Leandro, Rudy, Valéria e Valquíria pela ajuda fornecida e pela oportunidade de convívio.

Ao Dr. Denilson, pesquisador da Embrapa Clima Temperado pela ajuda fornecida para interpretação dos géis de poliacrilamida.

À minha colega e amiga Carine Dahl Corcini pela ajuda para interpretação dos géis de poliacrilamida, e por todo auxílio fornecido durante esses dois anos de pós-graduação.

Aos laboratórios do Centro de Biotecnologia (CENBIOT) pela disponibilidade de uso dos mesmos, bem como de seus materiais na realização do trabalho.

Aos professores e funcionários da Faculdade de Veterinária e do Centro de Biotecnologia pela preocupação com minha formação e pela disponibilidade em ensinar e tirar dúvidas.

Ao Professor Dr. Milton Amado, coordenador do Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas, pela amizade, carinho, disponibilidade em ajudar e ensinar, pelos cuidados oferecidos aos animais alocados na cabanha pertencente ao Biotério.

Ao Gerson, funcionário do Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas, pela dedicação e cuidado para com os animais alocados na cabanha.

À Irgovel® pelo fornecimento da ração Irgovinos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.

A todas as pessoas que ajudaram ou apoiaram para a realização deste trabalho.

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Resumo

GOULARTE, Karina Lemos. Influência das proteínas do plasma seminal sobre a qualidade do sêmen ovino congelado. 2009. 48f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal de Pelotas.

A expansão de programas de inseminação artificial (IA) em ovinos com sêmen congelado tem sido limitada pela necessidade de deposição intrauterina do sêmen e pela associação inconsistente entre as técnicas convencionais de avaliação da qualidade do sêmen e a fertilidade in vivo. Uma das alternativas para incrementar a eficiência de programas de IA seria o mapeamento do conteúdo protéico do plasma seminal, em busca de marcadores para fertilidade. O objetivo do presente trabalho foi estudar o perfil protéico do plasma seminal de machos ovinos e avaliar a sua associação com a qualidade de amostras de sêmen congelado. Os ejaculados dos machos ovinos foram divididos em duas alíquotas. A primeira foi utilizada para criopreservação, em dois diluentes: D1 (tris+gema de ovo+glicerol); e D2 (tris+gema de ovo+trealose). A segunda alíquota foi usada para a busca de proteínas do plasma seminal através da eletroforese unidimensional. A presença ou ausência das proteínas foi associada com parâmetros de qualidade seminal: motilidade e integridade da membrana espermática, ambas pré-congelamento e pós-descongelamento, e integridade de acrossoma pós-descongelamento. A motilidade espermática pós-descongelamento não diferiu (P > 0,05) entre D1 (18,6 ± 2,3) e D2 (23,4 ± 2,7). A integridade da membrana espermática pós-descongelamento foi semelhante (P > 0,05) para D1 (12,6 ± 1,4) e D2 (15,3 ± 1,7). Também não houve diferença (P > 0,05) entre D1 e D2 quanto à integridade do acrossoma pós-descongelamento (23,0 ± 1,5 e 21,3 ± 1,8, respectivamente). A análise intra-machos identificou 17 bandas proteicas associadas com os parâmetros avaliados, sendo que 10 destas associaram-se da mesma maneira, em diferentes machos. Na análise inter-machos, a banda com 11 kDa foi associada com menor integridade da membrana espermática pré-congelamento, a banda com 24 kDa foi associada com a redução na motilidade e na integridade da membrana pós-descongelamento e a banda com 45 kDa foi associada com menor integridade da membrana pré-congelamento (P < 0,05). Portanto, essas três bandas protéicas seriam potenciais marcadores para infertilidade com sêmen congelado, pois sua ausência foi associada com incremento na qualidade seminal, independentemente do efeito dos machos doadores de sêmen.

Palavras-chaves: proteínas, plasma seminal, sêmen congelado, ovinos.

Abstract

GOULARTE, Karina Lemos. Influence of seminal plasma proteins on frozen ram semen quality 2009. 48p. Master’s Dissertation – Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal de Pelotas.

The expansion of artificial insemination (AI) programs with frozen ram semen has been limited by the need of intrauterine semen deposition and by the inconsistency of the association between the conventional methods used to evaluate semen quality and in vivo fertility. An alternative to improve the efficiency of AI programs would be the profiling of the protein content of the seminal plasma to search for fertility markers. The objective of the present study was to study the protein profile of ram seminal plasma and to evaluate its association with parameters of frozen semen quality. Ejaculates were split in two samples. The first sample was frozen in two extenders: T1 (Tris + egg yolk + glycerol); and T2 (Tris + egg yolk + threalose). The second sample was submitted to unidimensional electrophoresis to identify proteins in the seminal plasma. The presence of the identified proteins was associated with parameters of semen quality: sperm motility and membrane integrity, both pre-freezing and post-thawing, and post-thawing acrosome integrity. Post-thawing sperm motility did not differ (P > 0.05) for T1 (18.6 ± 2.3) and T2 (23.4 ± 2.7). Post-thawing sperm membrane integrity was similar (P > 0.05) for T1 (12.6 ± 1.4) and T2 (15.3 ± 1.7). There was also no difference (P > 0.05) between T1 and T2 with regard to post-thawing acrosome integrity (23.0 ± 1.5 e 21.3 ± 1.8, respectively). An intra-ram analysis identified 17 proteins associated with the evaluated parameters: 10 of them presented similar associations for distinct rams. In the inter-ram analysis, an 11 kDa band was associated with lower pre-freezing sperm membrane integrity, a 24 kDa band was related to reduced post-thawing sperm motility and membrane integrity, and a 45 kDa band was associated with lower pre-freezing sperm membrane integrity (P < 0.05). Thus, those three protein factors would be potential markers for ram infertility with frozen semen because their absence was associated with improved semen quality, regardless of individual ram effects.

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Lista de Tabelas

Tabela 1 Motilidade espermática e integridade de membrana espermática pré-congelamento (PRE) e pós-descongelamento (POS), e integridade do acrossoma pós-descongelamento (8 coletas)

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Tabela 2 Motilidade espermática, integridade da membrana espermática e Integridade do acrossoma, após o descongelamento, por diluente

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Tabela 3 Número de bandas protéicas identificadas por eletroforese unidimensional por macho (8 coletas)

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Tabela 4 Motilidade e integridade da membrana espermática pré-congelamento, em função da presença de proteínas do plasma seminal por eletroforese unidimensional (7 carneiros x 8 coletas)

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Sumário

3.1 Danos na célula espermática associados à criopreservação... 15

3.2 Diluentes e crioprotetores para congelamento de sêmen ovino... 17

3.3 Composição e funções do plasma seminal... 18

3.4 Relação entre o perfil protéico do plasma seminal ovino e a qualidade do sêmen criopreservado... 22 4. Metodologia... 24

4.1 Coleta de sêmen... 24

4.2 Processamento do ejaculado e criopreservação... 24

4.3 Caracterização das proteínas do plasma seminal (PS)... 26

4.4 Análise estatística... 27

5. Resultados... 28

6. Discussão... 35

7. Conclusão... 38

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1. Introdução

Biotécnicas de reprodução assistida, tais como a inseminação artificial (IA), foram introduzidas na ovinocultura com o objetivo de acelerar o ganho genético de animais superiores, visando o incremento da eficiência reprodutiva (SMITH, 1986). A criopreservação do sêmen amplia as vantagens da IA, permitindo a eliminação do contato físico entre animais e limitando a proliferação de doenças sexualmente transmissíveis. Os primeiros registros sobre congelamento bem sucedido de sêmen ovino são de Bernstein & Petropavlovsky (1937) (citado por SALAMON & MAXWELL, 2000) que usaram uma solução de glicerol (1M, 9,2%) para armazenar espermatozóide de mamíferos (coelhos, cobaias, ovinos, bovinos, suínos, equinos) e de aves domésticas a - 21°C. Porém, a IA não é amplamente utilizada na espécie ovina, em função de diversos fatores limitantes: a anatomia da cérvice ovina que impede a passagem de catéteres; a ausência de uma técnica de IA eficaz, simples e de baixo custo; e a limitação dos métodos de avaliação da qualidade de sêmen criopreservado para estimar a capacidade fecundante das células espermáticas (NAQVI et al., 1998; LUZ et al., 2000).

A baixa fertilidade com sêmen congelado é atribuída, em geral, às alterações na estrutura das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, em função da ocorrência de choque térmico durante o processo de criopreservação (PARKS & GRAHAM, 1992). Sendo assim, a reduzida fertilidade obtida com sêmen ovino congelado pode ser atribuída a diversos processos ocorridos durante a criopreservação, como o choque térmico, o estresse osmótico e o efeito citotóxico decorrente da adição e remoção de substâncias crioprotetoras, além da desidratação celular e formação de cristais de gelo (WATSON, 2000). Tais alterações levam à queda na motilidade das células espermáticas e a perda da sua viabilidade no trato genital feminino (SALAMON & MAXWELL, 2000), tornando os espermatozóides de ovinos mais sensíveis ao choque térmico, em comparação com os de bovinos, coelhos ou humanos (WATSON, 1981; HOLT & NORTH, 1984; FISER & FAIRFULL, 1989). As diferenças na eficiência reprodutiva obtida com sêmen criopreservado, entre diferentes espécies, também refletem particularidades destas espécies, principalmente no que se refere à composição e estrutura da membrana plasmática (DARIN-BENNETT & WHITE, 1977).

Existem quatro métodos de IA para ovinos: vaginal, com deposição do sêmen no saco vaginal; cervical, com deposição do sêmen na entrada da cérvice; transcervical, com deposição do sêmen após a cérvice; e laparoscópica, com deposição do sêmen diretamente nos cornos uterinos (AX et al., 2004). A IA vaginal é realizada apenas com sêmen fresco ou fresco diluído, com taxas de concepção de 40-65%. Na IA cervical pode ser utilizado sêmen resfriado, com taxas de concepção de 60-70%, ou sêmen congelado, com taxas de concepção inferiores (30-35%). A IA transcervical permite a obtenção de 90% de prenhez com sêmen fresco, mas as taxa de prenhez são reduzidas para 22-51%, com sêmen congelado. A IA laparoscópica é a única técnica que permite o emprego do sêmen congelado com a obtenção de índices de concepção de até 80% (AX et al., 2004).

Em geral, a qualidade seminal é estimada por métodos convencionais, tais como motilidade, morfologia e concentração espermática, que nem sempre são precisos para predizer a fertilidade de amostras de sêmen ou para detectar diferenças entre machos (GATTI et al, 2004). Métodos como as avaliações da integridade da membrana plasmática e do acrossoma do espermatozóide, têm sido usadas na avaliação da qualidade espermática após o descongelamento, mas suas associações com a fertilidade in vivo também são pouco consistentes (O’ MEARA et al., 2008). Portanto, os métodos para a avaliação da qualidade do sêmen criopreservado ainda precisam ser aperfeiçoados.

Estudos recentes têm relatado grande variação na composição bioquímica do sêmen, constituído de plasma seminal e espermatozóides, em distintos indivíduos ou em função de fatores como a estação do ano (DOMINGUEZ et al., 2008). Esta variação interfere na qualidade das amostras de sêmen criopreservado, com reflexos sobre a sua capacidade fertilizante. A composição bioquímica do sêmen pode ser avaliada através da técnica de eletroforese, que vem sendo utilizada para o diagnóstico de algumas patologias ou na diferenciação de indivíduos quanto a sua fertilidade (KILLIAN et al., 1993). Algumas proteínas identificadas no plasma seminal podem ser associadas com a congelabilidade do sêmen (JOBIM et al., 2003; RONCOLETTA et al., 1999) e com algumas características espermáticas (ROMITTO et al., 2003). O plasma seminal também exerce efeitos fisiológicos no trato genital da fêmea, tais como auxílio no transporte espermático até o oviduto (WILLMEN et al., 1991), interação com o endométrio induzindo mudanças na expressão de citoquinas e infiltração de leucócitos que persistem até o nono dia da gestação e que parecem

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influenciar o desenvolvimento embrionário pré-implantação (O’LEARY et al., 2004). Desta forma, a detecção de fatores protéicos do plasma seminal que possam ser empregados como marcadores bioquímicos pode ser usada como um critério para a predição da fertilidade masculina (FRASER et al., 2006), bem como, torna-se essencial para a identificação de propriedades e funções de proteínas envolvidas nos mecanismos de regulação das funções do trato reprodutivo masculino (STRZEZEK et al., 2005). Desta forma, o conteúdo protéico do plasma seminal de várias espécies domésticas vem sendo mapeado, através da técnica de eletroforese, na busca de marcadores bioquímicos relacionados à fertilidade (RONCOLETTA et al., 1999; CARDOZO et al. 2006). Inicialmente, a proteômica focou na análise quantitativa das proteínas, porém, mais recentemente, também tem analisado as funções das proteínas (YANAGIDA, 2002). Portanto, o estudo do perfil protéico do plasma seminal de machos ovinos seria justificado pela possível identificação de bandas protéicas, cuja presença ou ausência, possa ser associada com parâmetros de qualidade seminal.

2. Objetivos

- Estudar o perfil protéico do plasma seminal de machos ovinos;

- Avaliar a associação do perfil protéico do plasma seminal com a qualidade de amostras de sêmen congelado;

- Identificar, no plasma seminal ovino, marcadores associados com a qualidade do sêmen após o descongelamento.

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3. Revisão de literatura

3.1 Danos na célula espermática associados à criopreservação

O processo de criopreservação de sêmen envolve várias etapas: redução na temperatura; desidratação celular; congelamento e descongelamento (MEDEIROS et al., 2002). Durante esta seqüência de etapas, a célula espermática está exposta à ocorrência de choque térmico, ocasionado pela mudança abrupta de temperatura, que pode ser prevenido através do controle da taxa de refrigeração do sêmen ou pela adição de componentes protetores aos diluentes. A queda rápida de temperatura durante a refrigeração do sêmen de 30°C para 0°C causa um tipo específico de estresse, conhecido como choque térmico (WATSON, 2000), que é relacionado à mudanças de fase nos lipídios da membrana, se diferenciando dos transtornos causados pelo congelamento e descongelamento, os quais incluem estresse mecânico e osmótico. Portanto, a queda da temperatura deve seguir uma curva de congelamento lenta o suficiente para prevenir a formação intracelular de gelo no espermatozóide, mas que também seja rápida o suficiente para minimizar os efeitos nocivos de uma exposição prolongada do espermatozóide a um ambiente hiperosmótico, com altas concentrações de solutos (HOLT, 2000).

As lesões celulares associadas à criopreservação (crioinjúrias) podem decorrer de danos físicos nas células, em função da formação de cristais de gelo, ou de danos causados pelo aumento na concentração de solutos, na medida em que maior conteúdo de gelo vai sendo formado (PEGG, 2002). No sêmen ovino, alguns aspectos do processo de criopreservação levam a membrana plasmática espermática a apresentar maturação excessiva, o que aumenta a proporção de espermatozóides precocemente capacitados e com reação acrossômica (SALAMON & MAXWELL, 1995). Estes processos podem ser favorecidos pelo maior ingresso de cálcio no interior da célula espermática, durante a refrigeração (WATSON, 2000). O choque térmico reduz a permeabilidade seletiva da membrana ao íon Ca2+ (BAILEY, 2000), podendo, ainda, diminuir, de forma irreversível, a motilidade e a atividade metabólica dos espermatozóides (WHITE, 1993).

A criopreservação afeta a composição lipídica e a organização da membrana plasmática do espermatozóide ovino (HINKOVSKA-GALCHEVA et al., 1989). A susceptibilidade da membrana plasmática ao choque térmico durante o resfriamento

é inversamente proporcional à quantidade de colesterol presente na membrana (DROBNIS et al., 1993). Os espermatozóides de ovinos apresentam um baixo nível de colesterol em sua membrana. Portanto, são considerados sensíveis a danos durante o resfriamento, quando comparados a espécies como humanos e coelhos. Portanto, a composição lipídica da membrana espermática é um importante fator associado com a viabilidade e a resistência a lipídio-peroxidação e ao choque térmico.

A presença de uma elevada taxa de ácidos graxos insaturados na membrana plasmática não apenas predispõe os espermatozóides de mamíferos ao choque térmico, como também aumenta a sua susceptibilidade aos danos oxidativos causados pelas reações oxigênio-espécie específicas (ROS). Estes ácidos graxos são altamente predispostos ao ataque dos radicais livres e conseqüentemente, a lipídio-peroxidação (LPO). O acúmulo de peróxidos de lipídios na superfície do espermatozóide causa disfunção e morte celular (BILODEAU et al., 2002). Além da exposição ao oxigênio durante a criopreservação, a ROS pode ser gerada pelo espermatozóide e leucócitos presentes no sêmen (AITKEN & CLARKSON, 1987).

A LPO ocorre pela redução das moléculas de oxigênio em superóxidos, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila e pela destruição da matriz lipídica pela ação das ROS, responsáveis por formar compostos redutores do oxigênio (BUCAK et al., 2008). A LPO acarreta alterações na estrutura e na permeabilidade das membranas celulares, provocando perda da seletividade iônica, liberação do conteúdo de organelas e formação de produtos citotóxicos (FERREIRA & MATSUBARA, 1997). Quando encontrados em baixa concentração, as ROS são fisiológicas, agindo como mediadoras da função espermática normal, estando envolvidas na manutenção da capacidade fertilizante, na capacitação e na reação acrossômica dos espermatozóides (GRIVEAU et al., 1997). No entanto, em excesso, as ROS prejudicam a motilidade e capacidade de fertilização dos espermatozóides (BAUMBER et al., 2000). Em ovinos e bovinos, a ativação de um aminoácido aromático oxidase, após a morte dos espermatozóides, seria uma importante fonte de produção de ROS no sêmen (UPRETI et al., 1998).

O sistema anti-oxidante formado por glutationa redutase (GSH), glutationa peroxidase (GSH-PX), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) seria um mecanismo de defesa contra a lipídio-peroxidação no sêmen, com ação importante na manutenção de sua motilidade e viabilidade (BILODEAU et al., 2001). Marti et al.

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(2008) descreveu três enzimas anti-oxidantes presentes no sêmen ovino, que têm suas atividade e distribuição modificadas pelo processo de criopreservação. A SOD é a enzima mais afetada, sendo reduzida em 65% após o descongelamento, enquanto que as atividades da GSH e GSH-PX foram menos afetadas pela criopreservação. Estudos recentes tem avaliado a inclusão de anti-oxidantes, como cisteamina, taurina, trealose e selênio, na composição de diluentes para congelamento de sêmen ovino, com o objetivo de melhorar a motilidade e a integridade da membrana espermática após o descongelamento (BUCAK et al., 2007; TONIETO, 2008).

3.2 Diluentes e crioprotetores para congelamento de sêmen ovino

A diluição do sêmen é feita para proteger os espermatozóides durante os processos de resfriamento, congelamento e descongelamento, podendo ser modificada por razões técnicas, em função do número de fêmeas a serem inseminadas com cada ejaculado, ou para padronizar o número de espermatozóides em cada dose de sêmen congelado. Aos diluentes, devem ser adicionadas macromoléculas, como lipoproteínas e fosfolípidios, que possuam atuação como estabilizadoras da membrana plasmática ou como crioprotetoras (PARKS & GRAHAM, 1992). Também devem ser fornecidas fontes de nutrientes para o metabolismo espermático e um meio tampão para a manutenção do pH. O diluente TRIS-glicose, elaborado por Salamon & Visser (1972), é uma das formulações mais usadas na criopreservação de sêmen ovino (EVANS & MAXWELL, 1987), na qual o Tris hidroxymethyl aminomethane (TRIS) (HAHN, 1972) atua como tampão e a glicose como fonte energética para os espermatozóides.

A gema de ovo é um constituinte comum de diluentes para sêmen criopreservado, protegendo a membrana plasmática dos espermatozóides contra o choque térmico decorrente do congelamento e do descongelamento (SALAMON & MAXWELL, 2000). O efeito crioprotetor da gema de ovo é atribuído a presença, em sua composição de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (MOUSSA et al., 2002; AMIRAT et al., 2004), que compete com os peptídeos catiônicos presentes no plasma seminal, os quais são prejudiciais à membrana espermática, além de formar um complexo contra as proteínas do plasma seminal (BERGERON & MANJUNATH, 2006). A substituição da gema de ovo pela LDL em um diluente para

criopreservação do sêmen caprino foi associada com incremento em 10% na motilidade pós-descongelamento, quando comparado com um diluente controle com inclusão de gema de ovo (AHMAD et al., 2008). Para sêmen bovino, Amirat et al. (2004) relataram uma maior motilidade pós-descongelamento com diluentes com inclusão de LDL, em comparação com diluentes incluindo gema de ovo . Em ovinos, resultados superiores referentes à motilidade e a integridade da membrana plasmática espermática foram observados com o uso de diluentes incluindo LDL como crioprotetor, em substituição à gema de ovo, na composição dos diluentes para sêmen ovino congelado (TONIETO, 2008).

O glicerol é um componente comum de diluentes usados para sêmen congelado de diferentes espécies domésticas, agindo como crioprotetor interno, em função de sua capacidade de penetração na célula através de difusão passiva pela membrana celular, permanecendo na membrana e no citoplasma (PARKS & GRAHAM, 1992). Porém, em função desta característica, o glicerol apresenta efeito citotóxico, conforme descrito para o sêmen de eqüinos, bovinos e ovinos (ALVARENGA et al., 2000), ainda que tal efeito pareça ser distinto nas espécies bovina e ovina (NAUK et al., 1970). A concentração de glicerol incluída nos diluentes para congelamento de sêmen é limitada por sua toxicidade (FAHY, 1986), a qual depende da curva de resfriamento e congelamento, composição do diluente e do método de adição do glicerol. Em função destas limitações, muitos agentes crioprotetores têm sido estudados na busca de um possível substituto para o glicerol. Watson (1995) relata que a concentração de glicerol mais adequada à criopreservação, oferecendo moderada toxicidade e melhor crioproteção, estaria entre 4 e 6%, sendo que, com concentrações superiores à 8%, danos celulares começariam a ocorrer.

Diversos açúcares têm sido incluídos nos diluentes para criopreservação de sêmen, para atuarem como substratos de energia, como componentes osmóticos ou como agentes crioprotetores, em função de seu alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico por atuarem como substitutos de eletrólitos (HOLT, 2000). Os açucares atuam na desidratação celular através da pressão osmótica, reduzindo o volume de água passível de ser congelada no interior da célula, de modo a reduzir as injúrias causadas pela cristalização de gelo (AISEN, 2002). Geralmente, dissacarídeos, como sacarose e trealose, são mais efetivos na função de estabilizar a bicamada lipídica da membrana plasmática espermática do que os

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monossacarídeos (DE LEEUW, 1993). Alguns estudos demonstraram o efeito benéfico da trealose na proteção da membrana de espermatozóides de pequenos ruminantes (AISEN et al. 2005; BERLINGUER et al., 2007). O efeito crioprotetor da trealose estaria relacionado ao seu efeito osmótico e a interações específicas com os fosfolipídios presentes na membrana (BAKÁS & DISALVO, 1991), atuando na desidratação celular, reduzindo a formação de cristais de gelo e acarretando, por conseqüência, a diminuição das crioinjúrias das organelas celulares. Desta forma, esse dissacarídeo confere maior flexibilidade à membrana espermática, tornando-a mais resistente aos danos causados pelo choque térmico (AISEN et al., 2005). A trealose também atua como antioxidante, protegendo a membrana contra o ataque de radicais livres, produzidos pelas ROS (BUCAK et al., 2007). Em suínos, a suplementação de diluentes com trealose conferiu grande capacidade crioprotetora após congelamento e descongelamento, promovendo melhorias na motilidade e na integridade da membrana espermática e do acrossoma (HU et al., 2008). A trealose também promove melhorias na motilidade espermática após a criopreservação de sêmen caprino (ABOAGLA & TERADA, 2003). Em ovinos, o uso de trealose em diluentes para sêmen criopreservado é associado não apenas com incremento nos parâmetros de qualidade seminal in vitro (BERLINGUER et al., 2007), como também com a fertilidade in vivo, após IA em ovelhas (AISEN et al., 2002).

3.3 Composição e funções do plasma seminal

O plasma seminal é oriundo de secreções dos túbulos seminíferos, epidídimos, ductos deferentes, ampolas, próstata, glândulas vesiculares e bulbo-uretrais (LITTLE & HOLYOAK, 1992), representando o meio através do qual os espermatozóides se locomovem pelo órgão genital masculino, mesmo antes da ejaculação. O plasma seminal é um mediador essencial para as funções espermáticas in vivo, desde a ejaculação até a fertilização. Sua composição inclui compostos orgânicos e inorgânicos, como íons, aminoácidos livres, lipídeos, carboidratos e proteínas, as quais são o constituinte orgânico mais abundante (PILCH & MANN, 2006). Alguns desses componentes apresentam funções específicas para a regulação da função espermática (STRZEZEK et al., 1992), como metabólitos ou componentes iônicos, que são essenciais para a manutenção da viabilidade da célula espermática (CATT et al., 1997). O efeito dos componentes do

plasma seminal sobre a habilidade fertilizante parece ser variável, em diferentes indivíduos (BRANDON et al., 1999). Além de apresentar ação bactericida, o plasma seminal neutraliza metabólitos espermáticos e nutre os espermatozóides no trato reprodutivo da fêmea (POLAKOSKI & KOPTA, 1982), sendo importante para função e sobrevivência espermática (EDWARDS et al., 1981). Em função disto, espermatozóides ejaculados morrem, quando a concentração do plasma seminal é reduzida por diluição ou lavagem (DOT et al., 1979).

Em função de serem o componente mais abundante na composição do plasma seminal, diversas proteínas exercem diferentes funções em estágios distintos do processo de fertilização. Além de influenciar no equilíbrio osmótico e na supressão da resposta imune feminina contra antígenos espermáticos, algumas proteínas especialmente enzimas catalíticas, estão envolvidas no metabolismo espermático (SHIVAJI et al., 1990). A identificação das propriedades e funções das proteínas envolvidas no mecanismo de regulação das funções do trato reprodutivo masculino é feita através da proteômica seminal (STRZEZEK et al., 2005). A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilssulfato de sódio (SDS) é um método muito utilizado para a análise de massas moleculares de proteínas oligoméricas (ROCHA et al., 2005). A eletroforese unidimensional (SDS-PAGE) permite a separação de proteínas apenas em função de seu ponto isoelétrico, o que pode ser considerado como uma limitação, em função de não proporcionar a quantificação das proteínas identificadas. Os primeiros estudos de separação de proteínas do plasma seminal de mamíferos por eletroforese foram realizados na década de 50 (LARSON & SALISBURY, 1954). Nesta época, considerou-se a hipótese de associação entre os elementos protéicos e a qualidade espermática (BERTOK & PASZTOR, 1957). Contudo, os efeitos das proteínas do plasma seminal sobre a função espermática são complexos e ainda não totalmente entendidos (STRZEZEK et al., 2005).

O conteúdo protéico do plasma seminal de mamíferos varia de 3 a 7%, dependendo da espécie (WHITE, 1988). O plasma seminal bovino contém uma família de proteínas coletivamente chamadas de proteínas BSP (MANJUNATH, 1984) designadas BSP-A1/-A2 e BSP-A3, com peso molecular aparente de 15 a 17 kDa, além da BSP-30, com peso molecular de 28-30 kDa,. A BSP-A1 e BSP-A2, com diferentes glicoformas, possuem cadeia polipeptídica idêntica e são coletivamente chamadas de PDC-109 (ESCH et al., 1983). As proteínas BSP

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revestem a membrana espermática e induzem efluxo de colesterol (THÉRIEN et al., 1998) e fosfolipídios (THÉRIEN et al., 1999) sendo o efluxo de lipídeos dependente do tempo e da concentração de proteínas BSP presentes no plasma seminal (THÉRIEN et al., 1998). Portanto, uma longa exposição dos espermatozóides às proteínas BSP contidas no plasma seminal, e/ou uma alta concentração destas proteínas, desestabiliza a membrana espermática em função da remoção de uma grande quantidade de colesterol e fosfolipídios (MANJUNATH et al., 2002a,b). Entretanto, as BSPs são importantes para o processo de fertilização, pois estas atuam na manutenção das funções dos espermatozóides no trato reprodutivo da fêmea, até que estes alcancem o sítio de fertilização (GWATHMEY et al., 2006).

Em búfalos, três proteínas foram descritas como sendo associadas com parâmetros de qualidade seminal (ASADPOUR et al., 2007). Os fatores com 24.5 e 55 kDa indicaram alta congelabilidade do sêmen. O fator com 24.5 kDa foi associada com incremento na motilidade espermática no sêmen fresco e viabilidade no sêmen descongelado, enquanto que o fator com 55 kDa foi associado com a viabilidade espermática do sêmen fresco. Já, a proteína com 45 kDa foi relacionada com baixa qualidade seminal, sendo associada com maior freqüência de espermatozóides com morfologia anormal após o descongelamento.

Em suínos, um fator polipeptídico de 26,6 kDa foi associado com redução na integridade da membrana plasmática do espermatozóide, após descongelamento (BIANCHI et al., 2008). Corcini (2008) descreveu dois potenciais marcadores relevantes para a qualidade do sêmen suíno, com 28 e 100 kDa. A presença da proteína de 28 kDa foi associada com maior integridade da membrana espermática e menor motilidade, em ambos os casos, após o descongelamento. A ausência da proteína de 100 kDa foi associada com aumento na integridade da membrana espermática pré-congelamento e pós-descongelamento.

Na espécie ovina, Maxwell et al. (1999) descreveram que o plasma seminal apresenta efeito benéfico sobre a função espermática e sobre fertilidade de sêmen congelado, após IA cervical. Posteriormente, duas proteínas do plasma seminal, com peso molecular de 14 e 20 kDa, foram descritas como possíveis responsáveis pela proteção conferida aos espermatozóides contra o choque térmico (BARRIOS et al, 2005), podendo também estar envolvidas no processo de fertilização. A imunoidentificação das proteínas BSP-A1/A2, previamente identificada no plasma seminal bovino, como constituintes também do plasma seminal de ovinos (JOBIM et

al., 2005), abriu novas possibilidades na investigação do papel dessas proteínas como marcadores de fertilidade (CARDOZO et al., 2008).

3.4 Relação entre o perfil protéico do plasma seminal ovino e a qualidade do sêmen criopreservado

Após a realização do SDS-PAGE, em gel com gradiente de 4-22 % de poliacrilamida, Barrios et al. (2000) visualizou vinte frações polipeptídicas com peso molecular entre menos que 12 a 200 kDa, no plasma seminal ovino. As bandas mais proeminentes foram aquelas menores do que 70 kDa. No entanto, Jobim et al. (2005) relataram vinte e uma bandas com peso molecular variando de 15 a 115 kDa, usando eletroforese bidimensional (2D-PAGE), um método que permite a separação de um grande número de proteínas a partir de sua massa molecular, sendo, portanto, uma técnica quantitativa e qualitativa. Apesar desta grande variação, as proteínas do plasma seminal ovino com baixo peso molecular (menor que 30 kDa) apresentam efeito benéfico sobre a função espermática.

A adição de proteínas do plasma seminal ao meio de diluição, antes do tratamento térmico, tem efeito benéfico imediato sobre a sobrevivência espermática (PÉREZ-PÉ et al, 2001a). A adição de duas proteínas, com 14 e 20 kDa, em um meio contendo espermatozóides ovinos, foi associada com a reparação de danos atribuídos ao choque térmico (BARRIOS et al., 2000; 2005).Este mesmo autor sugeriu ainda que, a proteína com 20 kDa é liberada da membrana plasmática assim que se inicia a capacitação espermática, sugerindo que esta proteína tenha um papel decapacitante, pois sua perda parcial contribuiria para o início da capacitação. De forma inversa, a indução da reação acrossômica seria mais associada com a quantidade da proteína com 14 kDa liberada da membrana plasmática espermática, em comparação com a proteína com 20 kDa. Através de observação citoquímica, foi evidenciado que a superfície espermática tem muitos sítios de ligação para as proteínas com 14 e 20 kDa, em especial na membrana acrossomal e no flagelo, o que sugere que estas proteínas atuem na regulação da capacitação e da reação acrossômica e na regulação da motilidade espermática (BARRIOS et al., 2005). Estas proteínas são secretadas pelas glândulas vesiculares (FERNÁNDEZ-JUAN et al., 2006) e a proteína com 14 kDa seria homóloga às BSPA1/A2 identificadas no plasma seminal bovino (ESCH et al., 1983). Em um estudo anterior, Jobim et al.

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(2005) relataram que duas proteinas do plasma seminal ovino, com 17-18 e 18-19 kDa, teriam estrutura homóloga à BSPA1/A2. Ainda, quatro proteínas estruturalmente semelhantes às BSP foram identificadas no plasma seminal caprino (VILLEMURE et al., 2003). O conjunto destes resultados indica que as proteínas BSP são bastante comuns no plasma seminal de mamíferos e, possivelmente, desempenham funções semelhantes. No entanto, a proteína com 20 kDa não é homóloga a nenhuma proteína já identificada (BARRIOS et al., 2005).

O conteúdo do plasma seminal também está sujeito a variação em função da estação do ano. Em ovinos, 13 fatores protéicos do plasma seminal apresentaram variação significativa, havendo diminuição do verão para o final do ano (CARDOZO et al, 2006). Neste mesmo estudo, de forma inversa, dois fatores protéicos, com 15.9 e 16.1 kDa, foram mais abundantes no verão, sendo associados negativamente com a viabilidade espermática. Tanto a concentração, como a composição protéica do plasma seminal, variam em função da estação do ano. A concentração protéica é mais elevada no outono, em comparação com as demais estações (DOMINGUEZ et al., 2008) Ainda, proteínas com 16,1, 17,4, 23,3, 40 e 55,5 kDa se mostraram mais freqüentes no outono, enquanto aquelas com 16,7, 25,2, 27,5 e 35 kDa foram menos freqüentes. A adição de plasma seminal coletado durante o outono ou inverno foi associada com melhoria na motilidade espermática, conforme também indicado por Barrios et al. ( 2000).

O baixo índice de fertilidade obtido com sêmen ovino criopreservado tem sido associado a várias alterações sofridas pela célula espermática durante os processos de resfriamento, congelamento e descongelamento. Com isso, inúmeros protocolos, bem como diluentes utilizados para o congelamento do sêmen, têm sido testados para o aumento desses índices, porém, sem sucesso. Por outro lado, a proteômica seminal tem obtido muitos avanços, identificando fatores no plasma seminal ovino que protegem a célula espermática, podendo estes, e outros, futuramente serem correlacionados com a qualidade do sêmen ovino criopreservado, sendo marcadores bioquímicos para a fertilidade ovina.

4. Metodologia

4.1 Coleta de sêmen

Como doadores de sêmen, foram utilizados sete machos, com idade entre 3 e 6 anos, sendo quatro da raça Crioula e três da raça Corriedale, os quais foram mantidos em uma cabanha pertencente ao Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas. Nesse local, também eram mantidas duas fêmeas que foram usadas como manequins para as coletas de sêmen. Todos os animais foram manejados sob as mesmas condições ambientais, alimentando-se de pasto nativo, característico do campo do município de Capão do Leão – RS, e sendo arraçoados uma vez ao dia com uma ração comercial para crescimento e engorda, com 15% de proteína bruta, 12% de matéria mineral, 1,5% de cálcio, 0,9% de fósforo, 2% de extrato etéreo e 13% de matéria fibrosa (Irgovino Premium®).

Foram realizadas oito coletas de sêmen de cada macho, durante os meses de maio e junho de 2008, totalizando 56 amostras. As coletas foram realizadas utilizando vagina artificial, previamente aquecida a 42°C, com o uso de uma fêmea imobilizada como manequim.

4.2 Processamento do ejaculado e criopreservação

Imediatamente após a coleta, uma alíquota de 400µL do ejaculado foi diluída para criopreservação. Esta alíquota foi dividida em duas partes iguais, ambas diluídas em condições isotérmicas (1:1 v/v) em dois diluentes: D1, contendo o diluente Tris (AISEN et al., 2005), com inclusão de 20% de gema de ovo e 5% glicerol; e D2, incluindo Tris, 20% de gema de ovo e 100mM de trealose (TONIETO, 2008). As amostras foram mantidas em tubos falcon, submersas em um Becker contendo água a mesma temperatura. O restante do ejaculado foi mantido em um tubo ependorf, para posterior centrifugação do plasma seminal.

A motilidade espermática foi aferida no sêmen fresco, imediatamente após a chegada da amostra no laboratório e, após o descongelamento, com visualização em microscopia óptica em aumento de 200 x, de uma alíquota de 10µl em uma lâmina coberta por lamínula, ambas previamente aquecidas a 37°C. A motilidade foi

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definida como o percentual de células com movimento progressivo visualizadas no campo do microscópio (BEARDEN & FUQUAY, 1997).

A avaliação da integridade da membrana espermática, indicativa da integridade estrutural ou funcional da célula espermática, foi realizada antes do congelamento e após o descongelamento das amostras, através das sondas fluorescentes Diacetato de Carboxifluoresceína (CFDA) e Iodeto de Propídio (IP), conforme descrito por Harrison & Vickers (1990). Ambos os marcadores foram obtidos de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). A avaliação foi feita sob aumento de 400x em microscópio de epifluorescência (Olympus BX 51, América INC, São Paulo, SP), em filtro WU com excitações de 450-490nm e emissão de 516 (CFDA) e 617nm (IP). Foi realizada a contagem de 100 células espermáticas por lâmina. As células que apresentavam fluorescência verde foram consideradas íntegras, enquanto as células com fluorescência vermelha foram consideradas danificadas.

A avaliação da integridade do acrossoma foi realizada somente após o descongelamento, com base na técnica descrita por Kawamoto et al. (1999). Inicialmente, amostras de 20µL foram centrifugadas a 86 x g por 10min, sendo o sobrenadante desprezado. Após, o pellet era re-suspenso em 80µL de PBS (Phosphate Buffer Saline) a 1% (Uptima, Montluçon cedex – França), sendo a amostra agitada e centrifugada novamente a 16000 x g por 10min. O sobrenadante era novamente desprezado e o pellet resultante re-suspenso em 20µL de PBS. A partir dessas amostras, foram confeccionados esfregaços em lâminas. Depois de secas, as lâminas foram submersas em álcool etílico absoluto 95,55% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) por 5min, sendo novamente lavadas em PBS. Em uma sala escura, adicionaram-se às amostras, por 10min, 20µL de Lectin from Arachis hypogaea FITC Conjugate (20 mg/mL) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Posteriormente, as lâminas foram lavadas em água deionizada e drenadas. Após esse procedimento, adicionaram-se 10µL de solução de Glicerol (Synth, Diadema-SP) com PBS (9:1 v/v). As lâminas foram avaliadas sob aumento de 1000 x, em microscópio de epifluorescência (Olympus BX 51, América INC, São Paulo, SP), em filtro WU com excitações de 450-490nm e emissão de 520nm. Após a contagem de 100 espermatozóides por lâmina, foram consideradas células com acrossoma integro aquelas que apresentavam fluorescência verde no acrossoma. Quando toda a célula não era corada e a coloração verde não era aparente, foi

considerado que o acrossoma não estava íntegro ou havia sofrido a reação acrossômica.

A contagem de espermatozóides para o cálculo da concentração foi realizada em Câmara de Neubauer. Após a diluição final, foi realizada a curva de resfriamento, mantendo-se as amostras a 5°C por 2h. Após, nas amostras do D1, foi acrescentado 5% de glicerol. Posteriormente, as amostras foram levadas para uma câmara fria a 5°C, onde foram envasadas em palhetas de 0,25mL, com concentração final de 100 x 106 espermatozóides. As palhetas foram colocadas em vapor de nitrogênio líquido, 5cm acima do nível do nitrogênio, por 10min, a uma temperatura aproximada de 90°C. Após esse período, as palhetas foram mergulhadas em nitrogênio líquido a -196°C e armazenadas até o descongelamento. Para as avaliações subseqüentes, as palhetas foram descongeladas em banho-maria a 37°C durante 30s (MAXWELL et al., 1995) e re-suspensas em um tubo falcon contendo 1,5mL de solução de citrato de sódio (2,9 g citrato de sódio em 100 mL de água deionozada).

4.3 Caracterização das proteínas do plasma seminal (PPS)

Após a coleta, alíquotas de 400µL do ejaculado foram centrifugadas duas vezes a 5.250 x g por 10min. Do sobrenadante resultante, retirou-se 10µL, aos quais foram adicionados 20µL de H2O deionizada e 15µL de tampão de amostra constituído de: 20% de Glicerol; 10% TRIS-HCl 0,6173M, pH 6,8 (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY, USA); 2% β-Mercaptoetanol (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA); 20% SDS (Dodecil sulfato de sódio a 10%) (Fisher Scientific, Suwanee, GA, USA); 2,5mg de Azul de bromofenol (Synth, Diadema, SP); e H2O deionizada. As amostras foram submetidas à desnaturação das proteínas em termociclador a 100°C por 10min.

A eletroforese unidimensional (SDS-PAGE) foi realizada com o sistema BIO-RAD Mini-Protean 3-Cell® (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), segundo Laemmli (1970). Foram feitas corridas com géis de poliacrilamida (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY, USA), concentrados a 15% (MAŇÁSKOVÁ & JONÁKOVÁ, 2007), primeiramente, com voltagem de 70V por 20min, para promover a concentração das proteínas e, após, a 140V por 70-80min, para promover a separação das mesmas. Como padrão, foi utilizado o marcador BenchMark Protein Ladder® (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Os géis foram corados com Coomassie Brilliant

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Blue (Bio-RadLaboratories, Hercules, CA, USA) por 20min a 60°C (SYNTIN et al., 1996). O descoramento dos géis foi feito em solução constituída por: 40% de metanol (Synth, Diadema, SP); 10% de ácido acético glacial (Synth, Diadema, SP); e 50% de H2O deionizada, por 1h, em banho-maria a 60°C. A análise foi baseada na visualização e distinção das bandas protéicas formadas durante a eletroforese. Os dados obtidos da eletroforese foram analisados pelo software TotalLab TL100® v. 2006 (Nonlinear Dynamics, London, UK).

4.4 Análise estatística

Distribuições de freqüências foram geradas para avaliar a presença de PPS em cada macho, caracterizada como variável binomial (presente ou ausente). Cinco respostas foram comparadas em função da presença de PPS: motilidade espermática (pré-congelamento e pós-descongelamento); integridade da membrana espermática (pré-congelamento e pós-descongelamento); e integridade do acrossoma pós-descongelamento. Em função de não apresentarem distribuição normal, de acordo com o teste de Shapiro-Wilk (P < 0,05), estas variáveis foram submetidas à transformação arco-seno. Porém, para fins de interpretação, seus resultados foram relatados na escala original.

Uma análise inter-machos foi conduzida por análise de variância com medidas repetidas, considerando como variáveis independentes o diluente utilizado, a coleta, o efeito dos machos dentro de cada diluente e as PPS identificadas nos ejaculados. Uma análise intra-machos foi feita através de análise de variância convencional, para cada macho, considerando como variáveis independentes o diluente utilizado e as PPSs identificadas no seu ejaculado, incluindo ainda a coleta como co-variável. As comparações entre médias foram realizadas através do teste de Tukey nos dois tipos de análise. Todas as análises estatísticas foram conduzidas com o software Statistix 8.0®.

5. Resultados

As médias para motilidade e integridade da membrana espermática pré-congelamento foram iguais a 71,3 ± 13.9% e 49,9 ± 22,6%, respectivamente. Após o descongelamento, a motilidade foi igual a 21,0 ± 18,8%, a integridade da membrana foi igual a 14,0 ± 11,4% e a integridade do acrossoma foi igual a 22,1 ± 12,3%. As estatísticas descritivas para as avaliações de qualidade seminal pré-congelamento e pós-descongelamento, por macho, são mostradas na Tabela 1. Não houve diferença entre os diluentes (P > 0,05), nas avaliações realizadas pós-descongelamento (Tabela 2).

Tabela 1: Motilidade espermática e integridade de membrana espermática pré-congelamento (PRE) e pós-despré-congelamento (POS), e integridade do acrossoma pós-descongelamento (8 coletas). Macho Motilidade (%) Integridade da membrana (%) Integridade do acrossoma (%)

PRE POS PRE POS

1 77,5 ± 6,8 16,9 ± 16,6 52,3 ± 18,9 15,7 ± 11,8 26,9 ± 18,1 2 60,0 ± 10,3 15,6 ± 15,0 32,7 ± 16,9 10,0 ± 6,9 23,9 ± 13,4 3 70,0 ± 16,3 22,5 ± 21,1 54,9 ± 22,7 12,8 ± 10,7 19,0 ± 12,8 4 77,5 ± 10,0 24,4 ± 16,3 56,2 ± 19,8 13,1 ± 7,2 20,9 ± 9,9 5 71,3 ± 18,2 13,8 ± 20,9 44,3 ± 29,6 12,3 ± 14,2 17,8 ± 9,3 6 68,8 ± 12,0 20,0 ± 19,0 49,0 ± 19,8 9,9 ± 9,0 23,6 ± 10,3 7 73,8 ± 14,5 33,8 ± 17,5 59,8 ± 20,5 23,8 ± 13,6 23,0 ± 9,7 Média ± desvio padrão.

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Tabela 2: Motilidade espermática, integridade da membrana espermática e Integridade do acrossoma, após o descongelamento por diluente.

Avaliação D1 D2

Motilidade (%) 18,6 ± 2,3 23,4 ± 2,7

Integridade de membrana (%) 12,6 ± 1,4 15,3 ± 1,7 Integridade do acrossoma (%) 23,0 ± 1,5 21,3 ± 1,8 Média ± erro padrão da média não diferem (P > 0,05)

D1 = Tris + gema de ovo + glicerol D2 = Tris + gema de ovo + trealose.

A realização do SDS-PAGE permitiu a identificação de 26 bandas, sendo que apenas o macho 1 apresentou todas as 26 bandas. Os machos 5 e 7 apresentaram 24 bandas e os machos 2 e 3 apresentaram 21 bandas. Já o macho 4 apresentou 23 bandas e o macho 6 apresentou 22 bandas. O peso molecular das bandas identificadas em todos os machos variou de 10 a 130 KDa (Tabela 3).

De acordo com a análise inter-machos, sete PPS foram associadas com os parâmetros avaliados. Na ausência da proteína com 24 kDa, a motilidade (28,9 ± 3,2) e a integridade de membrana pós-descongelamento (19,5 ± 1,8) foram maiores (P < 0,05) do que na sua presença (17,5 ± 1,9 e 11,5 ± 1,1, respectivamente). A integridade do acrossoma pós-descongelamento foi maior (P < 0,05) na presença da proteína com 31 kDa (27,0 ± 2,5) do que na sua ausência (21,3 ± 0,9). A presença das proteínas com 15, 19 e 80 kDa foi associada com maior motilidade pré-congelamento (P < 0,05), enquanto a ausência das proteínas com 11 e 45 kDa foi associada com maior integridade de membrana pré-congelamento (P < 0,05) (Tabela 4).

Tabela 3: Número de bandas protéicas identificadas por eletroforese unidimensional em todos os machos (8 coletas).

Banda (kDa) Macho

1 2 3 4 5 6 7 10 1 1 1 1 1 1 1 14 6 6 6 7 6 6 6 15 6 5 5 3 4 4 5 17 1 4 3 2 2 2 4 18 3 4 4 5 5 3 4 19 2 5 5 3 3 3 2 20 4 3 4 2 2 2 2 38 1 3 3 5 3 5 4 45 4 6 7 5 3 6 4 80 4 4 5 5 5 4 4 90 4 2 2 2 2 4 3 110 3 4 3 2 3 2 2 130 1 1 2 1 2 2 2

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Tabela 4: Motilidade e integridade de membrana espermática pré-congelamento, em função da presença de proteínas do plasma seminal por eletroforese unidimensional (7 carneiros x 8 coletas)*

Proteína (kDa) Motilidade (%) Integridade de membrana (%)

11 Ausência 55,4 ± 2,2ª Presença 14,3 ± 11,8b 15 Ausência 66,1 ± 1,5b Presença 75,0 ± 1,2ª 19 Ausência 68,4 ± 1,0b Presença 72,7 ± 1,3ª 45 Ausência 39,2 ± 5,3ª Presença 30,5 ± 5,9b 80 Ausência 66,0 ± 1,8b Presença 75,0 ± 1,4ª a,b

Médias ± erro padrão da média diferem por pelo menos P < 0,05. *Espaços vazios indicam ausência de associação

De acordo com a análise intra-machos, as proteínas com 31, 45 e 80 kDa, também mencionadas acima na análise inter-machos, foram associadas com parâmetros de qualidade seminal, para os machos 1, 2 e 6. No macho 1, a proteína com 45 kDa, quando presente foi associada com menor integridade de membrana pré-congelamento (42,1 ± 6,4%) do que quando ausente (62,4 ± 5,1%) (P < 0,05). Porém, para o macho 2, a presença desta mesma proteína foi associada com maior integridade de membrana pré-congelamento (38,8 ± 3,9%) do que quando ausente (14,5 ± 6,2%) (P < 0,05). A presença da proteína com 31 kDa foi associada com maior integridade do acrossoma (33,5 ± 4,5%) do que quando ausente (22,1 ± 2,7%), apenas para o macho 6 (P < 0,05). Na presença da proteína com 80 kDa, o macho 1 apresentou maior integridade de membrana pré-congelamento (61,4 ± 2,9%) do que na ausência desta proteína (43,1 ± 7,9%) (P < 0,05), o que também foi observado com relação à motilidade pós-descongelamento (21,3 ± 6,1 e 12,5 ± 5,6, respectivamente) (P < 0,05). Para o macho 2, a ausência desta mesma proteína foi associada com maior integridade da membrana pós-descongelamento (14,1 ± 2,4%)

do que na presença desta proteína (5,9 ± 1,5%) ( (P < 0,05). E, da mesma maneira para o macho 5, a ausência desta proteína foi associada com maior integridade do acrossoma (25,3 ± 2,6%) do que na sua presença (13,3 ± 2,4%) (P < 0,05).

Além das três bandas protéicas mencionadas acima, a análise intra-machos identificou associação entre os parâmetros de qualidade seminal e outras 14 bandas (com 10, 14, 16, 17, 18, 20, 21, 28, 39, 60, 65, 90, 110 e 130 kDa).

A integridade de membrana pré-congelamento foi associada com as bandas com 10, 14, 17, 20, 39, 45, 60, 65 e 130 kDa (P < 0,05, para todas as bandas). Foi observada associação positiva com relação à presença da banda com 10 kDa para o macho 3, enquanto que, para o macho 5, o beneficio foi associado à ausência desta banda. Em comparação com os ejaculados nos quais esteve presente, a ausência da banda com 14 kDa foi associada com incremento na integridade de membrana pré-congelamento para os machos 3 (50,1 ± 7,0% e 69,5 ± 2,1%, respectivamente) e 7 (55,0 ± 5,6% e 74,3 ± 9,4 respectivamente). A integridade de membrana pré-congelamento também foi associada com a ausência das seguintes bandas protéicas, em comparação com a presença destas no ejaculado: banda com 17 kDa para o macho 7 (72,8 ± 6.1% e 46,9 ± 5,3%, respectivamente); banda com 20 kDa para o macho 4 (62,7 ± 3,4% e 36,8 ± 14,0%, respectivamente); banda com 39 kDa para o macho 1 (55,8 ± 6,5% e 48,8 ± 7,1%, respectivamente); banda com 60 kDa para os machos 5 (47,9 ± 10,5% e 40,6 ± 11,0%, respectivmente) e 7 (61,2 ± 7,7% e 59,0 ± 7,1%, respectivamente). Ainda, a presença da banda com 65 kDa associou-se positivamente com a integridade da membrana pré-congelamento, em comparação com a sua ausência, para os machos 5 (58,0 ± 7,0% e 42,3 ± 8,3%) e 6 (57,5 ± 2,5% e 47,9 ± 5,6%). A presença da banda com 130 kDa foi associada com maior integridade da membrana pré-congelamento (66,0 ± 9,0%) do que quando ausente (54,8 ± 5,5%), para o macho 4. No entanto, para o macho 1, a ausência desta banda foi associada com maior integridade da membrana (56,6 ± 4,2%), do que quando estava presente (22,0 ± 2,0%).

A motilidade espermática pós-descongelamento associou-se com as bandas com 18, 20, 39 e 65 kDa (P < 0,05, para todas as bandas). A presença da banda com 18 kDa foi associada com aumento na motilidade, em comparação com os ejaculados nos quais esteve ausente, para os machos 2( 23,8 ± 5,0% e 7,5 ± 4,1%, respectivamente) e 6 (38,3 ± 6,5% e 9,0 ± 3,1%, respectivamente). A presença da banda com 20 kDa foi associada com aumento na motilidade, em comparação com

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os ejaculados nos quais esteve ausente, para o macho 4 (37,5 ± 7,5% e 20,0 ± 4,3%, respectivamente). Para o macho 3, a motilidade foi maior na presença da banda com 39 kDa (30,0 ± 11,3%), do que nos ejaculados nos quais esta esteve ausente (18,0 ± 5,1%). Para o macho 6, a motilidade foi maior na presença da banda com 65 kDa (25,0 ± 5,0%), em comparação com os ejaculados sem a presença desta banda (19,3 ± 5,4%). Por outro lado, a ausência da banda com 16 kDa foi associada com acréscimo na motilidade pós-descongelamento, em comparação com os ejaculados com presença desta banda, para o macho 1 (18,6 ± 4,5% e 5,0 ± 5,0%, respectivamente). Para o macho 3, a motilidade pós-descongelamento foi maior nos ejaculados com ausência da banda com 90 kDa (23,3 ± 5,7%) do que naqueles nos quais esta banda esteve presente (20,0 ± 14,1%).

A integridade da membrana espermática pós-descongelamento foi associada com as bandas com 10, 14, 17, 28, 80 e 110 kDa (P < 0,05, para todas as bandas). Para o macho 4, nos ejaculados com presença da banda com 10 kDa, a integridade da membrana foi maior (27,0 ± 1,0%), do que naqueles nos quais esta banda esteve ausente (11,1 ± 1,4%). A integridade da membrana foi maior em ejaculados com presença da banda com 110 kDa (14,5 ± 4,0%) do que na sua ausência (11,8 ± 3,7%), para o macho 3. Para o macho 2, a integridade da membrana foi superior em ejaculados com ausência da banda com 80 kDa (14,1 ± 2,4%) em comparação com aqueles com presença desta banda (5,9 ± 1,5%). A integridade da membrana, para o macho 3, foi maior na ausência da banda com 14 kDa (17,0 ± 5,8%) do que na sua presença (11,4 ± 3,0%). Para o macho 4, a ausência das bandas com 17 e 28 kDa foi associada com incremento na integridade da membrana pós-descongelamento (14,8 ± 2,1% e 14,3 ± 2,4%, respectivamente, em comparação com ejaculados com presença destas bandas (8,3 ± 2,3% e 11,2 ± 2,7%, respectivamente).

A integridade do acrossoma pós-descongelamento foi associada com as bandas com 18, 21, 31, 80 e 110 kDa (P < 0,05, para todas as bandas). A presença da banda com 18 kDa foi relacionada com maior integridade do acrossoma (24,6 ± 3,2%) do que nos ejaculados sem esta banda (14,7 ± 2,4%), para o macho 4. Para o macho 6, a presença da banda com 31 kDa foi relacionada com maior integridade do acrossoma (33,5 ± 4,5%) em comparação com a ausência desta banda (22,1 ± 2,7%). A ausência da banda com 21 kDa, para o macho 7, foi associada com maior integridade do acrossoma (25,1 ± 2,2%) em comparação com ejaculados com presença desta banda (8,0 ± 1,0%). Para o macho 5, a ausência da banda com 21

kDa implicou em maior integridade do acrossoma (25,3 ± 2,6%) em comparação com a ausência desta banda (13,3 ± 2,4%) . Ainda, para o macho 4, a integridade do acrossoma foi superior em ejaculados com ausência da banda com 110 kDa (22,8 ± 2,9%) em comparação com aqueles nos quais esta banda esteve presente (15,3 ± 4,0%).

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6. Discussão

Do total de vinte e seis proteínas identificadas neste estudo, dezessete foram associadas com parâmetros de qualidade seminal. Em um estudo usando SDS-PAGE bidimensional com 12% de acrilamida (JOBIM et al., 2005), vinte e uma proteínas foram encontradas no plasma seminal ovino, com peso molecular entre 15 e 115 kDa, sendo que a maioria apresentava peso molecular inferior a 30 kDa. A análise inter-machos indicou que as proteínas com 11, 24 e 45 kDa poderiam ser potenciais marcadores para infertilidade de machos ovinos com sêmen congelado. A ausência das proteínas com 11 e 45 kDa foi associada com maior integridade de membrana espermática pré-congelamento, enquanto que a ausência da proteína com 24 kDa foi associada com a motilidade e a integridade de membrana, ambas após o descongelamento. Em búfalos, uma proteína com 45 kDa foi associada com acréscimo nas anormalidades morfológicas de espermatozóides após congelamento e descongelamento (ASADPOUR et al., 2007). Neste mesmo trabalho, uma banda de 24,5 kDa foi associada com a acréscimo na motilidade no sêmen fresco e na integridade de membrana com sêmen congelado, o que seria contraditório aos nossos resultados, supondo que esta proteína seja a mesma proteína com 24 kDa identificada no presente estudo.

A análise intra-machos permitiu avaliar como uma mesma proteína atua em diferentes indivíduos. Algumas das proteínas identificadas apresentaram efeito semelhante com relação a parâmetros de qualidade seminal, em diferentes machos. A proteína com 14 kDa, quando presente no plasma seminal dos machos 3 e 7, foi associada com menor integridade de membrana pré-congelamento. Uma proteína denominada RSVP14, em função de apresentar peso molecular de 14 kDa e de ser sintetizada nas glândulas vesiculares (FERNÁNDEZ-JUAN et al., 2006) foi descrita como sendo associada a regulação da capacitação e/ou reação acrossômica (BARRIOS et al., 2005). A RSVP14 poderia pertencer a um mesmo grupo de proteínas com peso molecular entre 15,1 e 15,6 kDa descritas em outro estudo (CARDOZO et al, 2008). Outro fator com efeito similar em indivíduos distintos é a proteína com 17 kDa, cuja presença no plasma seminal foi associada com menor integridade de membrana pré-congelamento, no macho 7, e pós-descongelamento, no macho 4. De forma semelhante, a presença da proteína com 60 kDa associou-se com menor integridade de membrana pré-congelamento, nos machos 5 e 7.

Portanto, ainda que não tenham sido apresentado efeito significativo na análise intra-machos, o efeito aparentemente consistente destas três proteínas em diferentes indivíduos sugere que estas devam ser investigadas com mais detalhe, em futuros estudos.

A análise intra-machos identificou sete proteínas (com 10, 20, 39, 45, 80, 110 e 130 kDa) com padrões variáveis de atividade em indivíduos diferentes, podendo refletir diferenças na composição do plasma seminal entre os machos e entre os ejaculados do mesmo macho (GRAHAM, 1994; CABALLERO et al. 2004). Tais diferenças podem se refletir em níveis distintos de fertilidade in vivo, conforme demonstrado após IA cervical em ovelhas com sêmen congelado (O’ MEARA et al., 2005). Dentre estas sete, a proteína com 20 kDa também seria uma candidata para avaliação em futuros estudos, em função de que uma proteína com o mesmo peso molecular, denominada RSVP20, foi descrita como associada com maior motilidade espermática para sêmen ovino (BARRIOS et al., 2005; FERNÁNDEZ-JUAN et al., 2006). No presente estudo, a proteína 20 kDa, no macho 4, foi associada com maior integridade de membrana pré-congelamento, quando ausente do plasma seminal, no entanto, quando presente, foi associada com maior motilidade pós-descongelamento.

No presente estudo, a ausência de uma proteína com 28 kDa foi associada com maior integridade de membrana pós-descongelamento, no macho 4. Ainda que este efeito tenha sido observado somente para um individuo, este fator merece ser estudado futuramente, pois uma proteína com o mesmo peso molecular foi descrita como um potencial marcador para qualidade de sêmen suíno criopreservado, exatamente em função de sua associação com maior integridade da membrana espermática pós-descongelamento, quando presente no plasma seminal, além de ser associada com maior motilidade pré-congelamento e pós-descongelamento, quando ausente do plasma seminal (CORCINI, 2008).

Outro fator que merece ser investigado futuramente é a proteína com 18 kDa cuja presença no plasma seminal foi associada com maior motilidade pós-descongelamento nos machos 2 e 6 e com maior integridade de acrossoma no macho 4. Supondo que esta proteína seja a mesma identificada em eqüinos como sendo associada negativamente com a fertilidade (BRANDON et al., 1999), estes resultados seriam contraditórios.

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Na análise inter-machos, a integridade do acrossoma foi associada apenas com a presença da proteína com 31 kDa. Na análise intra-machos, as proteínas com 18, 21 e 110 kDa também foram associadas com a integridade do acrossoma, em indivíduos distintos. Em suínos, a presença de uma proteína com 80 kDa foi associada com integridade do acrossoma pós-descongelamento em torno de 70%, apenas em um macho com qualidade seminal inferior aos demais indivíduos incluídos no estudo (CORCINI, 2008).

Ainda que não tenham sido observadas diferenças na qualidade seminal pós-descongelamento entre os diluentes, estudos anteriores relatam que diluentes incluindo trealose seriam mais eficientes na preservação da integridade da membrana espermática pós-descongelamento (AISEN et al., 2005; TONIETO, 2008). Estas diferenças na resposta podem ter ocorrido devido à variação entre os machos utilizados em cada experimento ou entre o padrão racial dos mesmos (MAXWELL, 1980; EVANS, 1991; WINDSOR, 1997). Ainda que o local utilizado para a coleta das amostras, avaliação e criopreservação do sêmen tenha sido o mesmo, os indicadores de qualidade do sêmen pós-descongelamento obtidos no presente trabalho foram inferiores aos obtidos por Tonieto (2008). Estas diferenças podem ter ocorrido em função de que os experimentos foram conduzidos em épocas diferentes durante o ano, o que implica em diferenças na temperatura ambiente.

Na eletroforese unidimensional, as proteínas são separadas em função do seu ponto isoelétrico, enquanto a concentração do gel determina o tamanho das proteínas que passarão pelos poros. O uso do gel com 15 % de acrilamida favoreceu a busca de proteínas com peso molecular maior que 18 kDa (WEBER & OSBORN, 1969), mas também permitiu a separação de proteínas com peso molecular entre 10-17 kDa. Informações mais precisas sobre as proteínas com baixo peso molecular identificadas no presente estudo como associadas com a qualidade de sêmen ovino congelado poderiam ser obtidas em futuros estudos, com o uso de eletroforese bidimensional (2D-PAGE) com concentração do gel de segunda dimensão de 15%, que permite a separação de proteínas em maior quantidade e com alta resolução, podendo ser usada para proteínas já isoladas e purificadas (CANCEL et al., 1997; GERENA et al., 1998).