OTIMIZAÇÃO DE UM MEIO DE CULTURA PARA A PRODUÇÃO DE
PROTEASES POR Bacillus sp. SMIA-2 E PROPRIEDADES DA
ENZIMA
SILVANIA ALVES LADEIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO – 2009
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OTIMIZAÇÃO DE UM MEIO DE CULTURA PARA A PRODUÇÃO DE
PROTEASES POR Bacillus sp. SMIA-2 E PROPRIEDADES DA
ENZIMA
SILVANIA ALVES LADEIRA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal
Orientadora: Profa. Meire Lelis Leal Martins
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO – 2009
OTIMIZAÇÃO DE UM MEIO DE CULTURA PARA A PRODUÇÃO DE
PROTEASES POR Bacillus sp. SMIA-2 E PROPRIEDADES DA
ENZIMA
SILVANIA ALVES LADEIRA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal
Aprovada em 11 de Fevereiro de 2009
Comissão Examinadora:
_________________________________________________________________
Profa. Raquel Vieira de Carvalho(Doutora, Produção Vegetal)-UFES
Prof. Victor Haber Perez (Ph.D. Engenharia Química)-UENF
Silvia Menezes de Faria Pereira (Doutora, Engenharia e Ciências dos Materiais)-UENF
Profa. Meire Lelis Leal Martins ( Ph.D. Microbiologia)-UENF (Orientador)
iii
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus, por mostrar-me o caminho certo e colocar pessoas maravilhosas na minha vida;
A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) pela oportunidade de realização do curso;
A UENF pela concessão da bolsa de estudo;
À Professora Meire Lelis Leal Martins pela orientação, profissionalismo, conduta, apoio, confiança e amizade;
Ao professor Víctor Haber Perez, co-orientador, pela enorme ajuda e confiança;
Aos professores integrantes da banca examinadora, Víctor Haber Perez, Raquel Vieira de Carvalho e Sílvia Menezes de Faria Pereira por terem aceitado a contribuir com este trabalho;
Às amigas Marcela e Andréia por estarem sempre ao meu lado (literalmente), no laboratório ou fora dele e tornarem assim momentos de trabalho, cansaço e até mesmo de desespero em momentos divertidos e agradáveis;
Ao meu namorado-amigo Francisco, pelo carinho, incentivo, e por abraçar meus sonhos como os seus próprios;
Às demais colegas do Laboratório de Tecnologia de Alimentos: Thamy, Luciana Coutinho e Luciana Konda pela colaboração, troca de experiência e amizade;
iv
Ao secretário Paulo Sérgio, pela disponibilidade, atenção e presteza em todos os momentos;
A Sílvia Menezes de Faria Pereira, por toda atenção, pelos seus ensinamentos, incentivo, amizade e carinho;
A todos os funcionários do LTA, pela presteza;
Aos amigos-irmãos de todas as horas: Laura, Raquel, Luciana e César; Aos amigos de longe, mas sempre muito presentes em minha vida: Rosane, Claudiane, Míriam, Tatiana, Elaine, Felipe, Rosângela e Júlio;
Aos meus pais, irmãos e cunhados pelo imenso incentivo, respeito e amor sempre demonstrado. Agradeço por acreditarem em mim;
Em especial à minha irmã Wânia, por acreditar em mim, por toda ajuda material ou não e por ser a grande responsável pelo que sou;
Aos meus lindos sobrinhos, pelo carinho, pelos beijinhos e pelo amor sem julgamentos;
A todos que contribuíram para a realização deste trabalho, os meus sinceros agradecimentos.
v SUMÁRIO RESUMO ...xi ABSTRACT... xiii 1. INTRODUÇÃO ... 1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 4 2.1. Enzimas... 4
2.2. Microrganismos termofílicos e suas enzimas ... 7
2.3. Proteases... 11
2.4. Aplicações industriais das proteases... 13
2.5. Aproveitamento de Resíduos Agroindustriais ... 15
3. TRABALHOS ... 18
3.1. USO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS NA PRODUÇÃO DE PROTEASE POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA: OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA USANDO A TÉCNICA DE PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ... 18 RESUMO... 18 ABSTRACT ... 19 1. INTRODUÇÃO ... 20 2. MATERIAL E MÉTODOS ... 22 2.1. Microrganismo... 22
2.2. Preparação do meio de cultura e condições de fermentação ... 22
vi
2.4. Métodos analíticos ... 23
2.4.1. Determinação do Crescimento Celular ... 23
2.4.2. Determinação da produção de protease através de ensaio enzimático ... 24 2.4.3. Determinação da proteína ... 24 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 25 4. CONCLUSÃO... 34 5. AGRADECIMENTOS ... 35 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 35
3.2. PRODUÇÃO E PARCIAL CARACTERIZAÇÃO DE PROTEASES DE Bacillus sp. SMIA-2 CULTIVADO EM PROTEÍNAS DO SORO, ÁGUA DE MACERAÇÃO DE MILHO E PECTINA ... 39
RESUMO... 39
ABSTRACT ... 40
1. INTRODUÇÃO ... 40
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 42
2.1. Microrganismo e condições da cultura... 42
2.2. Ensaio enzimático ... 43
2.3. Determinação da proteína... 43
2.4. Efeito do pH na atividade e estabilidade da protease ... 44
2.5. Efeito da temperatura na atividade e estabilidade da protease ... 44
2.6. Efeito do Ca+2 e Mn+2 na estabilidade térmica da protease ... 45
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 45
3.1. Perfil do crescimento do microrganismo e atividade proteásica... 45
3.2. Efeito do pH na atividade e estabilidade da protease ... 48
3.3. Temperatura ótima e estabilidade térmica ... 49
3.4. Efeito do Ca+2 e Mn+2 na estabilidade térmica da protease ... 50
4. CONCLUSÃO... 53
5. AGRADECIMENTOS ... 53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 53
4. RESUMO E CONCLUSÕES... 57
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação das enzimas segundo a IUBMB ... 6 Tabela 2. Classificação e divisão das proteases... 12
3.1. USO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS NA PRODUÇÃO DE PROTEASE POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA: OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE
CULTURA USANDO A TÉCNICA DE PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
Tabela 1. Matriz experimental do planejamento 23 Central composto com pontos estrelas... 23 Tabela 2. Resultados do planejamento estatístico, Central Composto Ortogonal, para a produção de protease pelo Bacillus sp. SMIA-2... 26 Tabela 3. Análise de variância (ANOVA) usando o programa Design expert referente às variáveis dependentes, em nível de confiança de 95% ... 30
viii
LISTA DE FIGURAS
3.1. USO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS NA PRODUÇÃO DE PROTEASE POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA: OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE
CULTURA USANDO A TÉCNICA DE PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
Figura 1. Efeito das variáveis independentes estudadas e de suas interações: a) produção de protease; b) crescimento microbiano (D.O. 600nm) do Bacillus sp SMIA-2, para um nível de confiança de 95% (p<0.05)... 28 Figura 2. Efeito da interação entre as variáveis independentes sobre a produção de protease e o crescimento celular de acordo com o planejamento experimental em nível de 95% de confiança: a) Gráfico tridimensional da superfície de resposta para a produção de protease (X3=-1); b) Gráfico de cubo
para a produção de protease; c)Gráfico tridimensional da superfície de resposta para o crescimento celular (X3=-1); d) Gráfico de cubo para
crescimento celular ... 31 Figura 3. Otimização gráfica simultânea para a produção de protease e o crescimento celular durante fermentação em Skaker do Bacillus sp. SMIA-2 ... 32
ix
Figura 4. Cinética de crescimento celular, produção de protease e pH durante a fermentação de Bacillus sp. SMIA-2 à temperatura de 50°C e 150 rpm, referente à condição de máxima produção de protease ... 34
3.2. PRODUÇÃO E PARCIAL CARACTERIZAÇÃO DE PROTEASES DE
Bacillus sp. SMIA-2 CULTIVADO EM PROTEÍNAS DO SORO, ÁGUA DE MACERAÇÃO DE MILHO E PECTINA
Figura 1. Crescimento ( ), atividade da protease ( ) secretada por Bacillus sp. SMIA-2 e pH ( ), quando cultivado em meio líquido contendo pectina de maçã (5,0 g.L-1), proteínas do soro (1,0 g.L-1) e água de maceração de milho (3,0 g.L -1) por 54 horas a 50oC... 46
Figura 2. Crescimento ( ) e atividade da protease ( ) secretada por Bacillus sp. SMIA-2 e pH ( ), quando cultivado em meio líquido contendo pectina de maçã (3,0 g.L-1), proteínas do soro (3,0 g.L-1) e água de maceração de milho
(3,0 g.L-1) por 54 horas a 50oC... 47 Figura 3. pH ótimo ( ) e estabilidade ( ) da protease secretada por Bacillus sp. SMIA-2, em meio líquido contendo pectina de maçã (3,0 g.L-1), proteínas do soro (3,0 g.L-1) e água de maceração de milho (3,0 g.L-1).(100% de atividade = 62,8 U/mg proteína)... 48 Figura 4. Temperatura ótima ( ) e estabilidade térmica ( ) da protease secretada por Bacillus sp. SMIA-2, crescido em meio líquido contendo pectina de maçã (3,0 g.L-1), proteínas do soro (3,0 g.L-1) e água de maceração de
milho (3,0 g.L-1). (100% de atividade = 65,18 U/mg proteína)... 50
Figura 5. Termoestabilidade da protease produzida por Bacillus sp SMIA-2 a 60oC em presença de CaCl
2 (10mM) + glicina (1mM) (O), MnSO4(10mM) +
x
Figura 6. Termoestabilidade da protease produzida por Bacillus sp SMIA-2 a 70oC em presença de CaCl2 (10mM) + glicina (1mM) (O), MnSO4(10mM) +
xi
RESUMO
LADEIRA, Silvania Alves; M.S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Fevereiro, 2009. OTIMIZAÇÃO DE UM MEIO DE CULTURA PARA A PRODUÇÃO DE PROTEASES POR Bacillus sp. SMIA-2 E PROPRIEDADES DA ENZIMA. Orientadora: Profa: Meire Lélis Leal Martins. Co-orientador: Prof.
Victor Haber Perez
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Tecnologia de Alimentos da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), em Campos dos Goytacazes-RJ, com o objetivo de estudar a produção da enzima protease pelo termofílico Bacillus sp. cepa SMIA-2 e avaliar algumas de suas características. A produção de protease por este microrganismo, cultivado em meio líquido contendo baixa concentração de pectina como fonte de carbono e suplementado com proteínas de soro de leite e água de maceração de milho, alcançou o máximo em 30 horas com níveis de 72 U/mg de proteína. Uma redução na concentração de pectina de 5,0 g.L-1 para 3,0 g.L-1, e aumento
na concentração de proteínas de soro de leite de 1,0 g.L-1 para 3,0 g.L-1 no meio de cultura, melhorou a atividade da enzima e suas características. A produção máxima de atividade enzimática pelo Bacillus sp. SMIA-2 foi observada quando o microrganismo foi crescido a 50oC, pH 6,5 e 150 rpm. Estudos sobre a
caracterização da protease revelaram que a temperatura ótima desta enzima foi 70oC. A enzima manteve mais de 80% de sua estabilidade por 2 horas a
temperaturas de 40oC a 60oC, enquanto que a 90oC, 100% da sua atividade foi
xii
foi estável a 60oC por 90 minutos e manteve cerca de 90% de sua atividade residual por 2 horas. No entanto, a 70°C em 30 minutos a protease apresentava apenas cerca de 10 % de sua atividade, sendo que nesta temperatura, nem a mistura Ca2+ + glicina, nem a mistura Mn2+ + glicina ajudaram na manutenção de sua atividade.O pH ótimo da enzima encontrado foi de 8,5. A enzima manteve aproximadamente 80% de sua atividade após sua incubação por 2 horas em pH entre 6,0 e 12,0, mostrando-se estável a uma grande faixa de pH.
xiii
ABSTRACT
The present work was carried out at the Laboratório de Tecnologia de Alimentos of the Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, (UENF), in Campos dos Goytacazes (RJ) city, with the objective of studying the protease production by thermophilic Bacillus sp. strain SMIA-2 and to evaluate some characteristics of the enzyme. Protease production by this organism cultivated in liquid cultures containing low pectin concentration as carbon source and supplemented with whey protein and corn steep liquor, reached a maximum in 30 hours with levels of 72 U/mg protein. Reducing pectin concentration from 5.0 g.L-1 to 3.0 g.L-1, and increasing the whey protein from 1.0 g.L-1 to 3.0 g.L-1 in the medium improved the enzyme activity. In addition, was observed that the maximum enzyme activity was found when the organism was cultivated at 50oC, pH 6.5 and 150 rpm. Studies on the protease characterization showed that the optimum temperature of this enzyme was 70oC. The enzyme retained more than
80% of its activity after 2 hours at temperatures between 40oC and 60oC, while at 90oC, 100% of its activity was lost. However, in the presence of 10mM of CaCl
2 + 1
mM glicina the enzyme was stable at 60oC for 90 minutes and retained about 90%
of its residual activity after 2 hours. On the other hand, after 30 minutes at 70 °C the protease retained only 10 % of its activity. In this condition, the presence of 10mM of CaCl2 + 1 mM glicina not improved the enzyme stability. The optimum pH
xiv
after 2 hours at pH between 6,0 and 12.0, showing to be stable in a great range of pH.
1. INTRODUÇÃO
Enzimas são macromoléculas protéicas de estrutura globular terciária ou quaternária, termolábeis e não dialisáveis, responsáveis pela aceleração de reações química termodinamicamente possível, isto é, atuam reduzindo a barreira energética destas reações, que mantêm e regulam os processos vitais. Ocorrem em todos os organismos vivos sejam plantas ou animais, desde os mais simples, como formas unicelulares de vida, aos mais desenvolvidos. Em meados do século XX, as enzimas começaram a ser extraídas das células produtoras para utilização em produtos e processos industriais. As enzimas passaram a substituir catalisadores químicos nas indústrias, fato este favorecido pelas condições de pH e temperatura. Atualmente os catalisadores biológicos têm modificado inúmeros setores industriais, devido à sua presença em todos os seres vivos, dos quais podem ser extraídas e aplicadas, livres ou imobilizadas, em sistemas diferentes daquele que as originou (Hamú, 2007). Elas tornaram-se importantes na Medicina, na indústria química, no processamento de alimentos, na agricultura e nas atividades do dia-a-dia do lar, como na preparação de alimentos e na limpeza doméstica (Silva, 2006).
Conforme Leadlay (1993), as enzimas são de especial importância em fermentações industriais, uma vez que todos os processos de fermentação resultam da atividade enzimática de microrganismos. Com sua ação, regulam a velocidade de muitas reações químicas presentes neste processo. A denominação enzima, proposto em 1867 pelo fisiologista alemão Wilhelm Kühne,
deriva da expressão grega en zymç, que significa “em fermentação”.
Segundo Mussato et al. (2007), o mercado mundial de enzimas industriais é estimado em US$ 2,3 bilhões anuais e tem três segmentos: enzimas técnicas (destinadas a indústrias de tecidos e de produtos de limpeza), enzimas para alimentos e bebidas e enzimas para ração animal. As principais enzimas de aplicação industrial são proteases, amilases, lípases, celulases, xilanases e fitases, e as maiores empresas produtoras são européias: Gist-Brocades (Holanda), Genencor International (Finlândia) e Novo Nordisk (Dinamarca). A última detém sozinha, cerca de metade do mercado mundial de enzimas industriais.
A protease é o tipo de enzima mais importante do ponto de vista industrial. Podem ser utilizadas em diversas atividades industriais tais como processamento de alimentos, bebidas, formulação de detergentes, processamento de couro e pele, no amaciamento de carne e formulação de medicamentos, indústrias têxteis, entre outros (Ghorbel, 2003; Haki e Rakshit, 2003; Silva Neves et al, 2006; Genckal e Tari, 2006).
A produção comercial de uma enzima envolve as etapas de produção, separação, recuperação e purificação da enzima. De acordo com Rodrigues (1993), os equipamentos para os processos de separação e purificação podem representar até 90% do custo final de um produto obtido por fermentação. A possibilidade da obtenção de um produto enzimático, com alta concentração, e que dispense estas etapas (ou parte delas), pode vir a ser uma técnica economicamente vantajosa, podendo ser utilizada pela agroindústria que nem sempre necessita de produtos altamente puros.
O elevado custo da produção de enzima é o principal obstáculo para sua aplicação industrial. Devido à promissora aplicabilidade das proteases, principalmente como constituintes em detergentes, sua produção deveria ser intensificada utilizando para esse fim os meios de cultivos com baixos custos (Chauhan e Gupta, 2004). Estima-se que por volta de 30-40% do custo envolvido na produção de proteases esteja relacionada ao meio de cultura utilizado para o crescimento do microrganismo. Portanto sua otimização é de grande importância para a redução dos custos de sua produção (Kona et al., 2001; Joo e chang, 2006). Em escala industrial, exoenzimas como as proteases alcalinas são produzidas com meios de cultura complexos contendo glicose e outros substratos
de alto custo. Para uma vantajosa aplicação industrial, é necessário um elevado crescimento de microrganismos em meios mais econômicos (Shikha et al, 2007).
Alguns trabalhos têm sido publicados a respeito do papel de uma variedade de fontes de carbono e de nitrogênio na produção de proteases. O melaço de cana e o açúcar refinado são algumas das fontes de carbono mais empregadas; e o extrato de malte, extrato de levedura, água de maceração de milho são fontes de nitrogênio utilizadas geralmente para produção de protease (Reddy et al, 2007).
No Brasil, em 2005, as importações de enzimas chegaram a US$ 31 milhões e as exportações a US$ 3 milhões, mostrando que o mercado brasileiro é essencialmente importador, indicando desvantagem tecnológica e estratégica em termos de produção e uso das enzimas no país, embora apresente um enorme potencial para produzi-las, por dois motivos em especial: abundância de matéria orgânica (resíduos agrícolas, como palha de arroz, soro de leite, bagaço de cana, entre outros, que constitui substrato de baixo custo para fermentações e a enorme diversidade biológica, ainda pouco explorada, para a descoberta de novos organismos produtores de enzimas de interesse industrial (Mussatto et al.,2007).
Considerando o grande interesse comercial pelas proteases, é importante a descoberta de novas proteases com características diferentes, a partir de fontes diversificadas. Neste sentido, este trabalho tem como finalidade otimizar a produção de proteases por Bacillus sp. SMIA-2, utilizando substratos de baixo custo, como pectina e outros componentes de resíduos agroindustriais. Algumas características da enzima bruta foram também investigadas.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Enzimas
Enzimas são proteínas que apresentam atividade catalítica. As proteínas são heteropolímeros formados por aminoácidos ligados covalentemente por ligações peptídicas. A estrutura primária dessas macromoléculas corresponde à seqüência desses aminoácidos, que é geneticamente determinada. As cadeias polipeptídicas adotam configurações espaciais determinadas pela própria estrutura primária, bem como pelas interações entre seus aminoácidos constituintes. Assim, as interações entre aminoácidos adjacentes podem levar a formação de arranjos espaciais do tipo -hélice ou do tipo , que compõem a estrutura secundária. A estrutura terciária da enzima resulta das interações entre aminoácidos, não seqüencialmente próximos, que provocam torções e dobramento de regiões da macromolécula. A estrutura tridimensional terciária configura o sitio catalítico da enzima, que é determinante para sua atividade biológica. A estrutura quaternária refere-se a interações entre cadeias polipeptídicas e subunidades distintas e ocorre em algumas enzimas complexas de regulação. A conformação e a estabilização da estrutura molecular das enzimas são asseguradas por ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, pontes de dissulfeto, ligações iônicas e forças de Van de Waals. A atividade catalítica, bem como a estabilidade e a especificidade da enzima, dependem de sua estrutura tridimensional. Condições ambientais, tais como, pH, temperatura, forças iônicas do meio, afetam a estrutura da enzima e suas propriedades (Lima
et al., 2001).
Há muito tempo, o homem utiliza enzimas para catalisar uma série de reações. A produção de vinho, pão e queijo antedata os tempos bíblicos, embora não se conhecesse o mecanismo das reações envolvidas (Harger et al., 1982).
As enzimas são biocatalizadores, termolábeis e não deslizáveis que aceleram muito a velocidade de uma reação química termodinamicamente possível, isto é, atuam reduzindo a barreira energética destas reações. Elas efetuam processos metabólicos na célula viva. Ocorrem em todos os organismos vivos sejam plantas ou animais, desde os mais simples, como formas unicelulares de vida, aos mais desenvolvidos. São obtidas de três grandes fontes: vegetais superiores (papaína do mamão, bromelina do abacaxi, ficina do figo); animais superiores (enzimas pancreáticas, pepsina, catalase, renina) e microrganismos (como por exemplo, as amilases, proteases, pectinases, invertases, glicose-oxidases, celulases, fitases, glicose-isomerases), de origem fúngica ou bacteriana (Harger et al, 1982).
As enzimas são classificadas pelos substratos com que reagem e por sua especificidade de reação. Uma vez que a reação química catalisada por uma enzima é a propriedade específica que distingue uma enzima de outra, a IUBMB (União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular) dividiu as enzimas em seis grandes divisões (Tabela 1).
Tabela 1. Classificação das enzimas segundo a IUBMB
CLASSE REAÇÕES QUE
CATALISAM
EC Oxidorredutases Reações de
oxidação-redução
1 Transferases Reações de transferência
de grupos de uma molécula a outra.
2 Hidrolases Reações de hidrólise 3
Liases Clivagem de C-C, C-S e
certas ligações de C-N. 4 Isomerases Racemização de isômeros
ópticos ou geométricos 5 Ligases Formação de pontes entre
C e O, S, N acoplados a hidrólise de fosfatos de
alta energia.
6
C, carbono; N, nitrogênio; S, enxofre; O, oxigênio. (Fonte: Nelson e Cox, 2004)
Atualmente a nomenclatura mais aceita é a recomendada pela Enzyme Commission, segundo a qual, o nome de cada enzima pode ser identificado iniciando-se pelas letras E.C., seguida por um código numérico composto de quatro números separados por pontos. O primeiro número indica a qual das seis classes pertence a enzima, o segundo se refere a distintas subclasses dentro de cada grupo, o terceiro e o quarto se referem aos grupos químicos específicos que intervêm na reação (Lima et al, 2001).
Com base no local de ação, as enzimas podem ser consideradas de dois tipos: enzimas intracelulares, com atuação dentro da célula e enzimas extracelulares, com atuação fora da célula. As enzimas intracelulares sintetizam o material celular e também realizam reações catabólicas que suprem as necessidades energéticas da célula. Por outro lado, a principal função das enzimas extracelulares é a de executar as alterações necessárias à penetração dos nutrientes para o interior das células (Pelczar et al., 1998). De acordo com Gacesa e Hubble (1990) e Wiseman (1985), as enzimas extracelulares possuem uma série de vantagens sobre as intracelulares. Primeiro que por serem secretadas no meio de cultura, não requerem técnicas de ruptura celular que são
difíceis de aplicação em larga escala. Segundo porque o número de enzimas secretadas é limitado, sendo relativamente fácil separar a enzima de interesse no meio de crescimento e por fim, as enzimas extracelulares são mais compactas, sendo menos susceptíveis à desnaturação que as intracelulares.
A produção em larga escala industrial de enzimas microbianas não foi viável até depois da primeira metade do século 20. Isto se tornou possível somente após os melhoramentos da tecnologia de fermentação submersa que se seguiram ao desenvolvimento das fermentações para a produção da penicilina nos anos 40 (Chaplin e Bucke, 1992).
2.2. Microrganismos termofílicos e suas enzimas
Microrganismos capazes de crescer em temperaturas altas são chamados microrganismos termofílicos ou termófilos e são classificados em: termófilos moderados, quando a faixa de temperatura de crescimento está entre 20°C e 55°C; termófilos extremos, quando seu crescimento se dá em temperaturas de 65°C a 85°C; ou ainda hipertermófilos, quando cresce entre 85°C até 110°C. Os microrganismos termófilos moderados podem ser encontrados dentro dos domínios Bacteria, Archaea e Eukarya (fungos filamentosos); os microrganismos termófilos extremos serão encontrados dentro dos domínios Bacteria e Archaea; e os hipertermófilos apenas serão encontrados dentre o domínio Archaea (Madigan e Oren, 1999).
A adaptação de um determinado microrganismo à termofilia envolve adaptação da membrana citoplasmática, das proteínas e do DNA às temperaturas acima da faixa mesofílica. Essa adaptação à termofilia tem despertado grande interesse na biotecnologia, considerando que os mecanismos de termorresistência das biomoléculas desses microrganismos podem constituir modelos interessantes para a bioengenharia ou ainda, considerando o uso direto das mesmas em bioprocessos (Gomes et al., 2007). Os microrganismos termófilos produzem um número abundante de proteases intracelular e extracelular e peptidases com uma variedade de especificidades de substrato (Atomi, 2005).
Na natureza, em ambiente mesofílico, os organismos termófilos moderados desenvolvem-se em processo de compostagem durante a fase de alta
temperatura (acima de 40°C), sucedendo a microflora mesofílica (Chang et al., 2006). Nesse processo, podem ser distinguidas três fases: na primeira, a microbiota mesofílica cresce aceleradamente, assimilando, preferencialmente, as fontes de carbono prontamente assimiláveis e solúveis (açúcares, aminoácidos e ácidos orgânicos) ou polímeros de acesso mais fácil, gerando calor por reações metabólicas exotérmicas e elevando a temperatura para aproximadamente 40°C. Esse aumento de temperatura inibe o crescimento dos mesófilos e estimula a germinação dos esporos dos fungos e endósporos das bactérias termófilas, iniciando a segunda fase do processo. Nessa etapa, as fontes de carbono mais facilmente assimiláveis já estariam exauridas, restando os polissacarídeos constituintes da biomassa, como celulose, hemicelulose e pectina, cuja degradação requer intensa liberação de enzimas extracelulares. O resultado desse processo é a degradação do material vegetal a polímeros menores e um aumento da temperatura para próximo de 60°C. A terceira fase do processo caracteriza-se pela inibição do crescimento dos fungos e redução de atividade bioquímica no material, embora as atividades das bactérias extremófilas e hipertermófilas sejam continuadas (Maheshwari et al., 2000). Espera-se que fungos e bactérias termófilas moderadas sejam potenciais produtores de enzimas despolimerizantes (Gomes et al., 2007).
As diferenças entre as membranas de termófilos e de mesófilos consistem, principalmente, na substituição de ácidos graxos insaturados por ácidos graxos saturados, de modo que a membrana adquira um equilíbrio entre densidade e fluidez, necessário para a manutenção de sua integridade física e funcional em temperaturas elevadas. Os ácidos graxos saturados geram ambiente mais fortemente hidrofóbico que os insaturados, auxiliando na estabilidade da membrana em altas temperaturas (Haki e Rakshit, 2003).
A manutenção da estrutura do DNA é um fator imprescindível para a estabilidade de organismos termófilos, principalmente dos hipertermófilos. No citoplasma desses últimos tem sido detectada grande quantidade de 2,3-difosfoglicerato cíclico de potássio, cuja função é impedir danos químicos na molécula de DNA, como a perda de purina que pode ocorrer em altas temperaturas (Fields, 2001). Ainda, todos os hipertermófilos produzem uma única forma diferenciada de DNA topoisomerase chamada DNA Girase Reversa, a qual introduz superenovelamentos positivos no DNA, em contraste com os
superenovelamentos negativos gerados pela DNA Girase convencional. O superenovelamento positivo promove maior resistência do DNA à desnaturação térmica (Stetter, 1999; Haki e Rakshit, 2003). Seqüências codificantes de termófilos possuem altos teores de purinas, principalmente adenina (A), sugerindo que esse nucleotídeo exerce função adaptativa de estabilização da estrutura do RNA (Singer e Hickey, 2003).
Existe uma estreita relação entre o nicho ocupado por um microrganismo e as características de suas enzimas intra e extracelulares. Espera-se que microrganismos termófilos produzam enzimas extracelulares capazes de tolerar uma temperatura correspondente a, no mínimo, aquela ótima para seu crescimento. Estudos com enzimas de termófilos têm mostrado que essa relação é verdadeira, estimulando o isolamento de novas linhagens termófilas, assim como a caracterização das enzimas produzidas e o entendimento dos fatores que levam a sua estabilidade térmica (Egorova e Antranikian, 2005; Gomes et al., 2007).
Dentre os fatores que afetam a estabilidade e cinética das proteínas, o calor é que mais exige modificações das proteínas, dentro do contexto biológico. Enzimas estáveis em temperaturas elevadas são chamadas termozimas e hipertermozimas (Gomes et al., 2007).
As proteínas de microrganismos termófilos apresentam seqüências de aminoácidos, estrutura tridimensional e mecanismos catalíticos idênticos aos de suas similares mesofílicas. Algumas diferenças na composição de aminoácidos, nos mecanismos de manutenção do enovelamento e da estabilização da estrutura foram constatadas entre enzimas de mesófilos e termófilos, porém, os fatores de pressão seletiva (pressão, pH, temperatura) e as variações filogenéticas devem ser considerados (Niehaus et al., 1999). Evidências sugerem que organismos hipertermófilos foram as primeiras formas de vida na terra, e suas proteínas podem, portanto, servir como modelo para o entendimento da evolução das enzimas sob os pontos de vista biológico, químico e físico-químico (Gomes et al., 2007).
A proteína nativa é mantida por um delicado balanço de forças não co-valentes, como pontes de hidrogênio, pareamento de íons, interações hidrofóbicas e força de van der Waals. Com o aumento da temperatura, essas interações são rompidas e a proteína se desdobra. Algumas proteínas recuperam
sua conformação ativa após o resfriamento, porém, para a maioria, a desnaturação é irreversível (Gomes et al., 2007).
A estrutura espacial das proteínas é determinada por forças eletrostáticas entre grupos polares e ionizados e por efeitos hidrofóbicos envolvendo resíduos apolares (Jaenicke e Bohm, 1998). O efeito hidrofóbico é o principal mecanismo de termoestabilidade intrínseca da proteína e direciona o enovelamento, que resulta na estrutura nativa da molécula e diminui sua tendência ao desdobramento, tornando a molécula menos flexível e menos exposta à degradação por altas temperaturas, além da diminuição da exposição de aminoácidos termolábeis (Egorova e Antranikian, 2005). A maioria das termozimas descritas apresenta altos teores de aminoácidos hidrofóbicos e com resíduos aromáticos. Os aminoácidos mais hidrofóbicos são Isoleucina (Ile), Valina (Val), Leucina (Leu), Fenilalanina (Phe), Cisteina (Cys) e Metionina (Met). Tanto a integridade dos aminoácidos formadores da proteína, quanto a formação do núcleo hidrofóbico são essenciais para a sua viabilidade (Jaenicke e Bohm, 1998).
A elevada rigidez intrínseca da proteína termofílica, decorrente da estabilidade do enovelamento, requer alta temperatura de atividade (maior que 40°C) para promover o movimento térmico e o aumento da flexibilidade essencial para a atividade catalítica, ou seja, a adaptação da proteína às temperaturas extremas parece ser resultado de um equilíbrio entre o aumento da rigidez responsável pela estabilidade térmica e a flexibilidade requerida para exercer sua função fisiológica (Shiraki et al., 2001). Outra característica das enzimas termoestáveis é sua maior resistência à ação de proteases, uma vez que, quanto mais rígida for a molécula, menos expõe seu sítio de proteólise (Gomes et al, 2007).
As enzimas termoestáveis, de maneira geral, apresentam vantagens para a aplicação na indústria, visto que processos biotecnológicos conduzidos em elevadas temperaturas têm o risco de contaminação por microrganismos mesófilos significativamente reduzidos (Haki & Rakshit, 2003). As temperaturas mais elevadas favorecem a solubilidade de substratos e produtos, e aumentam as taxas de reação por redução da viscosidade e por aumento do coeficiente de difusão dos substratos (Egorova e Antranikian, 2005). Adicionalmente, a utilização de temperaturas mais altas faz com que a velocidade da reação seja aumentada,
necessitando de uma menor quantidade de enzima, pois um aumento de 10°C na temperatura promove um aumento de aproximadamente duas vezes na velocidade da reação (Zamost et al., 1991).
A descoberta de microrganismos termofílicos abriu novas oportunidades para descoberta de enzimas, que apresentam atividades em condições extremas de temperatura, possibilitando seu uso em muitos processos industriais onde esta condição é necessária (Hough e Danson, 1999). As enzimas termofílicas têm se mostrado tolerante a desnaturantes como detergentes e solventes orgânicos, sendo então, de interesse em síntese orgânica (Atomi, 2005).
Apesar dessas vantagens que as enzimas termofílicas oferecem para o uso rotineiro na indústria, a aplicação biotecnológica de microrganismos termofílicos tem sido muito limitada até agora. As razões para esta contradição são muitas, mas a principal delas está relacionada com o escasso número de linhagens termofílicas para a pesquisa de enzimas termoestáveis específicas, disponíveis em coleções (Aquino, 2000).
As enzimas industriais são utilizadas como beneficiadoras, e suas utilizações dependem do valor que agregam ao produto final. Apenas raramente, como ocorre no caso dos detergentes, o consumidor compra e utiliza as enzimas diretamente (Nascimento, 2005).
2.3. Proteases
De acordo com a IUBMB, as proteases estão inseridas no subgrupo 4 do grupo 3 (Hidrolases), pois por uma reação de hidrólise, elas clivam a proteína em peptídeos e aminoácidos, adicionando uma molécula de água à ligação peptídica (Berg et al., 2004)
As proteases são classificadas em dois grupos principais, que são as exopeptidases (EC 3.4.11-19) e endopeptidases ou proteinases (EC 3.4.21-99), dependendo do sitio de ação dessas enzimas na proteína. As exopeptidases iniciam o processo de degradação a partir das extremidades amino (N) ou carboxi-terminal (C) das proteínas, produzindo pequenos peptídios ou mesmo aminoácidos. As endopeptidases clivam a proteína alvo na sua parte interna, longe das extremidades amino e carboxi-terminal, gerando dessa forma, peptídeos maiores. Baseado no tipo do grupo funcional presente no sitio catalítico
da enzima, as carboxipeptidases foram subdivididas em serina-, metalo-, e cisteína- carboxipeptidases e as endopeptidases são ainda classificadas em quatro relevantes grupos, que são: serina (EC 3.4.21), cisteína (EC 3.4.22), aspártico (EC 3.4.23) e metalo (EC 3.4.24) proteases. Sendo que as serina peptidases possuem um resíduo de serina em seu centro ativo, enquanto as aspártico peptidases têm duas unidades de ácido aspártico no seu centro catalítico. Cisteína-proteases apresentam um aminoácido cisteína e as metalo-proteases usam um íon metal no seu mecanismo catalítico (Tabela 2) (Rao et al.,1998).
Tabela 2. Classificação e divisão das proteases Local de
clivagem no substrato
Sítio ativo da
enzima Aminoácidos removidos Número de resíduos de EC n° Exopeptidases Aminopeptidases Aminopeptidases 3.4.11 Dipeptidil-peptidases 3.4.14 Tripeptidil-peptidases 3.4.15 Sítio ativo da carboxipeptidase Carboxipeptidases Serinocarboxipeptidases 3.4.16 Metalocarboxipeptidases 3.4.17 Cisteínocarboxipeptidases 3.4.18 Endopeptidases Serinoproteases 3.4.21 Aspartatoproteases 3.4.23 Cisteinoproteases 3.4.22 Metaloproteases 3.4.24
Fonte: Rao et al., 1998
As proteases de plantas e animais não atendem à demanda mundial de enzimas, por isso tem sido cada vez maior o interesse pelas proteases de origem microbiana. Os microrganismos representam uma excelente fonte de proteases devido ao seu rápido crescimento, espaço limitado exigido para o seu cultivo, à diversidade bioquímica e facilidade de manipulação genética (Rao et al., 1998; Haki e Rakshit, 2003;). As proteases de maior valor industrial são obtidas principalmente dos microrganismos, e estes são os bacilos entre as bactérias, e o aspergilos, entre os fungos (Joo e chang, 2006). As enzimas de origem microbiana podem ser intracelulares ou extracelulares. As proteases
intracelulares são importantes para vários processos metabólicos e celulares, como na esporulação, diferenciação, e manutenção do “pool” de proteínas intracelular, enquanto que as proteases extracelulares são importantes para a hidrólise de proteínas no meio externo, permitindo a absorção dos nutrientes pelos microrganismos (Gupta et al., 2002b).
2.4. Aplicações industriais das proteases
A protease é a enzima mais significativa do ponto de vista industrial, ocupando 60% do mercado mundial de vendas de enzimas em um mercado estimado de US$ 2,3 bilhões (Banerjee, et al. 1999; Mussato et al., 2007). Dois terços das proteases produzidas industrialmente são de fonte microbiana (Moon e Parulekar, 1992). A maior aplicação destas enzimas é nas indústrias de alimentos, farmacêuticas e de detergentes. A maioria das proteases alcalinas é utilizada em detergentes em pó e tem uma menor utilidade no processamento de alimentos, como por exemplo, na maturação de cerveja e na produção de proteína hidrolisada (Phadatare et al., 1993). As proteases ácidas são importantes para aumentar a maciez da carne e na produção de alimentos fermentados por fungos de grão de soja, arroz e outros cereais (Nout e Roubouts, 1990). As proteases são também utilizadas na indústria de panificação para modificação de proteínas de trigo na produção de pão e em laticínios para coagular leite na fabricação de queijo (Boing, 1982). São utilizadas ainda no processamento de couro, recuperações da prata, produção de ração, bem como no tratamento de resíduos (Kumar e Takagi, 1999). A produção destas enzimas por diferentes microrganismos tem sido bastante relatada na literatura, especialmente por fermentação submersa (Romero et al., 2001; Ereno, 2005; Ramnani et al., 2005; Joo e chang, 2006; Oskouie et al., 2007; Reddy et al., 2007).
Proteases podem hidrolisar proteína proveniente de vegetais, peixes ou animais para produção de hidrolisados. A protease alcalina encontrada comercialmente tem especificidade para aminoácidos terminais hidrofóbicos. Usando-se esta enzima produz-se um hidrolisado com menos gosto amargo. O hidrolisado protéico comumente gerado a partir de caseína, soro de leite e proteína de soja é muito usado em formulações infantis. Outra potencial aplicação das proteases é no bioprocesso de recuperação de prata de filme de raio-X. Filme
de raio-X contém aproximadamente 1,5 a 2,0% (em peso) de prata em sua camada gelatinosa. A prática convencional de recuperação da prata pela queima provoca um grande problema de poluição ambiental. Assim, a hidrólise enzimática das camadas de gelatina do filme permite não só a recuperação da prata como também a reciclagem do filme a base de poliéster (Kumar e Takagi, 1999).
Proteases alcalinas têm a capacidade de tornar o couro mais elástico e degradar a queratina, possuindo uma grande eficácia no biotratamento do couro. As condições alcalinas permitem o inchaço das raízes do cabelo e subseqüente ataque das proteases sobre os pêlos permitindo sua fácil remoção. Apesar das fortes condições alcalinas, este processo é mais seguro e agradável ao meio ambiente do que os métodos tradicionais de tratamento com sulfeto de sódio (Malathi e Chakraborty, 1991).
As proteases desempenham um papel proeminente no amaciamento da carne, especialmente na carne bovina. Elas têm a habilidade de hidrolisar a proteína do tecido conjuntivo e das fibras musculares. O processo pode ser realizado por aspersão em pó da preparação enzimática ou por imersão em uma solução contendo a enzima ou ainda por injeção da protease na carne. Um método foi desenvolvido em que a enzima é introduzida diretamente no sistema circulatório do animal pouco antes de ser abatido ou logo após sua morte cerebral. Hidrolisados com maior grau de hidrólise (em torno de 90%) são utilizados na produção de pasta de carne, que é usada na fabricação de produtos à base de carne em conserva, sopas, e temperos, ou hidrolisados de osso, que pode ser utilizado como uma excelente matéria-prima para a produção de gelatina (Kumar e Takagi, 1999).
As proteases alcalinas fornecem um potencial de aplicação para o tratamento de resíduos da indústria alimentícia ou de atividades domésticas. Estas proteases podem solubilizar as proteínas nos resíduos e recuperar o efluente líquido. Trabalhos têm relatado o uso de processos enzimáticos em tratamento de efluentes de frigoríficos de aves, matadouros de bovinos, suínos, indústrias de laticínios, entre outros (Dalev, 1994; Mussatto et al., 2007).
A demanda industrial de preparações de enzimas proteolíticas com alta atividade, com especificidade e estabilidade apropriada ao pH, à temperatura, aos íons do metal, aos surfactantes e aos solventes orgânicos continua a estimular a busca para novas fontes de enzimas. As proteases com atividade e estabilidade
elevadas em altas temperaturas e ambientes alcalinos são interessantes para aplicações biotecnológicas (Ghorbel, 2003; Hadj-Ali et al., 2007). Sua aplicação principal está na indústria de detergentes porque o pH de detergentes está geralmente na escala de 9,0-12,0. As proteases alcalinas são usadas como aditivos nos detergentes para degradação de compostos tipicamente proteináceos como sangue, manchas de ovos e leite (Sellami-Kamoun et al., 2006). A principal vantagem da formulação de detergentes contendo enzimas é sua característica biodegradável, ideal para substituir produtos cáusticos, ácidos e solventes, que agridem o ambiente e provocam o desgaste de materiais e instrumentos (Ereno, 2005).
As enzimas utilizadas como aditivos em detergentes constituem cerca de 40% do mercado enzimático mundial. Sendo as proteases alcalinas responsáveis por uma grande parte deste mercado (Chauhan e Gupta, 2004). Em decorrência disso, proteases alcalinas com novas propriedades tem sido foco de interesse para a pesquisa (Reddy et al., 2007). As proteases utilizadas na indústria de detergentes são alcalinas (alta atividade em pH acima de 7,0), são termoestáveis e consistem geralmente em serino proteases secretadas por Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis. As metaloproteases não podem ser utilizadas devido à presença de agentes quelantes nas soluções de detergentes, que podem reduzir a atividade destas enzimas por seqüestrarem os íons metálicos necessários para seu mecanismo catalítico (Wiseman, 1985).
As enzimas proteolíticas usadas na formulação dos detergentes devem ter algumas características: atividade e estabilidade em pH alcalino, estabilidade e atividade boa em altas temperaturas (acima de 40°C), compatibilidade com os compostos do detergente como surfactantes, perfumes e descolorantes (estabilidade durante o armazenamento e a lavagem), especificidade para hidrólise de diferentes proteínas (Sellami-Kamoun et al., 2006), além de ser facilmente produzida em larga escala (Joo e Chang, 2006).
2.5. Aproveitamento de Resíduos Agroindustriais
A economia brasileira é uma das mais importantes economias do mundo baseadas na agricultura, produzindo e exportando café, cana-de-açúcar, soja, mandioca, frutas entre outros. Entretanto, a grande produção desses produtos
agrícolas gera uma grande quantidade de resíduos, que quando acumulados gera a deterioração do meio ambiente e perda de recursos, com contribuição significante para o problema da reciclagem e conservação da biomassa. Diversos processos são desenvolvidos para utilização desses materiais como fonte de carbono em bioprocessos, transformando-os em compostos químicos e produtos com alto valor agregado como álcool, enzimas, proteínas, ácidos orgânicos, aminoácidos, compostos de aroma, entre outros (Pandey et al., 2000; Uenojo e Pastore, 2007).
Vários resíduos agroindustriais são usados como fontes alternativas de substratos para a produção de enzimas, devido à disponibilidade local e por representar uma fonte alternativa de baixo valor comercial, principalmente quando o objetivo é a produção destas enzimas em larga escala (Hernandez et al., 2005).
Aproximadamente 40% dos custos de produção de enzimas por fermentação correspondem ao meio de cultivo. O uso de meios de cultura alternativos para produção de proteases por Bacillus tem sido relatado em muitos trabalhos científicos. Esses meios podem ser obtidos a partir de efluentes industriais ou de fontes alternativas, como substrato para crescimento de Bacillus, já foi relatado restos de refeição (Gessesse 1997), casca em pó de camarão e caranguejo (Yang et al., 2000), farinha de peixe (Ellouz et al., 2001), farelo de soja (Joo et al., 2002; Joo e Chang, 2005), farinha de sementes de amaranto (Pastor et al., 2001), penas de frango (Gessesse et al., 2003) e araruta (Kumar e Parrack, 2003).
A aplicação de resíduos agroindustriais em bioprocessos, além de fornecer substratos alternativos, ainda ajuda a solucionar os problemas de poluição que sua disposição no meio ambiente poderia causar. Com o advento de inovações biotecnológicas, principalmente na área de tecnologia de enzimas e fermentação, muitos caminhos novos têm sido abertos para sua utilização (Pandey et al., 2000). Soro de queijo é um subproduto obtido a partir da fabricação do queijo, corresponde ao sobrenadante da precipitação da caseína do leite, é dentre os subprodutos da indústria de laticínios, o constituinte de maior importância, tanto pelo volume gerado, como pela carga poluidora, que lançada em corpos receptores pode causar um grave problema ambiental. Aproximadamente 80% do volume do leite destinado à fabricação de queijos se transformam em soro. O soro
de queijo contém metade do extrato seco do leite, representado por lactose, proteínas solúveis e sais (Paolucci,1991; Dias et al., 2008).
Do soro rejeitado no Brasil (cerca de 1.000.000 t) poderiam ser extraídas 70.000 t de materiais, correspondendo a 50.000 t de lactose e 7.500 t de proteínas. A utilização do soro na elaboração de produtos lácteos, ou como substrato biotecnológico para produção de enzimas, contribui em muito para a redução do custo operacional da produção, bem como para a preservação do meio ambiente (Ferreira e Mosquim, 1998).
A produção de enzimas microbianas utilizando soro de queijo foi realizada por diversos pesquisadores (Kosikowski, 1979; Feijoo et al., 1999; Romero et al., 2001; Nascimento et al., 2007) e a produtividade enzimática aumentou com o uso deste substrato. Portanto, devido à sua rica composição, o soro de queijo é um substrato em potencial para a produção industrial de proteases microbianas.
O processamento de grãos como o milho, para a produção de óleos e outros produtos, gera resíduos como a água de maceração de milho. Esse subproduto tem sido usado como uma fonte barata de nutrientes. Este resíduo constitui uma rica fonte em carboidratos, aminoácidos, peptídeos, minerais, metais, vitaminas e fosfato (Rivas et al., 2004).
O amido e as substâncias pécticas também são fontes de carbono muito abundantes em muitos resíduos agrícolas, e por isso têm um alto potencial como substrato para preparação de meio de cultura de microrganismos mais viável economicamente.
As substâncias pécticas são macromoléculas glicosídicas de alto peso molecular que formam o maior componente da lamela média de células de vegetais superiores. Quimicamente é um complexo coloidal de polissacarídeos ácidos. São divididas em: protopectina, ácido pectínico, ácido péctico e pectina. As substâncias pécticas correspondem a até 4% do peso de resíduos agroindustriais como cascas de frutas cítricas, e podem ser usados como substratos em fermentação (Jayani et al., 2005; Uenojo e Pastore, 2007;).
3. TRABALHOS
3.1. USO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS NA PRODUÇÃO DE PROTEASE POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA: OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
USANDO A TÉCNICA DE PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
RESUMO
Silvania Alves Ladeira; Marcela Vicente Vieira Andrade; Andréia Boechat Delatorre; Victor Haber Perez ; Meire Lélis Leal Martins
Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF)/ Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA)/ Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA). Av. Alberto Lamego, 2000, Pq. Califórnia, Campos dos Goytacazes, RJ-Brasil, 28013-602.
Um microrganismo termofílico Bacillus sp. SMIA-2 produziu protease quando crescido em meio de cultura contendo pectina de maçã, proteínas de soro de queijo e água de maceração de milho, com concentrações variando de 3,0 a 10,0 g.L-1 , de acordo com um experimento central composto 23 com seis pontos
150 rpm e pH inicial 6.5. A enzima produzida foi medida em função da atividade enzimática do extrato bruto usando azo-caseina como substrato. Os resultados revelaram que o meio de cultura afetou a ambos, crescimento celular e produção de enzima. Posteriormente foi feita a otimização gráfica e numérica. A produção enzimática atingiu valores máximos de aproximadamente 70 U/mg de proteína em 30 horas de fermentação, sugerindo que o processo é parcialmente associado ao crescimento.
ABSTRACT
USES OF AGROINDUSTRIAL RESIDUES ON PROTEASE PRODUCTION BY SUBMERGED FERMENTATION: OPTIMIZATION OF THE CULTURE MEDIUM
USING AN EXPERIMENTAL DESIGN APPROACH
Thermophilic Bacillus sp. SMIA-2, produced protease when grown on apple pectin, cheese whey and corn steep liquor medium, which concentration was varied from 3 to 10 gL-1, according to the central composite design 23 with six center points plus star points. The experiments were conducted in shaker, at 50°C, 150 rpm and initial pH 6.5. The enzyme production was measured as a function of the enzymatic activity of the fermentation brutish extracts using azocasein as substrate. The results revealed that the culture medium affected both, cell growth and enzyme production. After graphical and numerical optimization procedure, the enzyme production reached its maximum value at 30 h fermentation, reaching, approximately, 70 U protein mg-1, suggesting that this process was partially
associated to the growth.
1. INTRODUÇÃO
Proteases são enzimas que catalisam a clivagem das ligações peptídicas de outras proteínas, são enzimas de grande importância do ponto de vista industrial, as quais são utilizadas em diversas atividades como no processamento de alimentos, bebidas, formulação de detergentes, processamento de couro e pele, amaciamento de carnes, formulação de medicamentos, indústria têxtil, entre outros (Ghorbel et al.,2003; Haki e Rakshit, 2003; Genckal e Tari, 2006; Reddy et al.,2008; Sellami-Kamoun et al.,2008).
O elevado custo da produção de enzimas é o principal obstáculo para sua aplicação industrial. Devido à promissora aplicabilidade das proteases, sua produção deveria ser intensificada utilizando para esse fim os meios de cultivos com baixos custos (Chauhan e Gupta, 2004). Estima-se que por volta de 30-40% do custo envolvido na produção de proteases esteja relacionado ao meio de cultura utilizado para o crescimento do microrganismo. Portanto sua otimização é de grande importância para a redução dos custos de sua produção (Kona et al.,2001; Joo e Chang, 2006; Mukherjee et al, 2008). Em escala industrial, exoenzimas como as proteases alcalinas são produzidas com meios de cultura complexos contendo glicose e outros substratos de alto custo. Para uma potencial aplicação industrial, é necessário um elevado crescimento de microrganismos em meios mais econômicos (Shikha et al.,2007).Uma vez que a aplicação industrial de proteases tende a crescer enormemente nos próximos dez anos é de grande interesse a busca por métodos economicamente mais viáveis para aumentar a produção de protease, bem como para diminuir o preço de mercado desta enzima. Para alcançar esses objetivos, durante os últimos anos, esforços têm sido direcionados para explorar os meios para reduzir os custos de produção de protease através da melhoria da produtividade, bem como utilização de substratos de baixo custo como componentes do meio de cultura para fermentação. Sendo assim, vários subprodutos da indústria agrícola têm sido estudados para uso como substrato para produção de protease (Mukherjee et al., 2008).
As proteases podem ser obtidas de diversos organismos, incluindo bactérias, fungos, leveduras, tecidos de mamíferos e de plantas, porém atualmente uma grande proporção das proteases disponíveis comercialmente é derivada de linhagens de Bacillus, por serem estes produtores de quantidade
substancial de protease extracelular (Rao et al.,2006; Reddy et al., 2008; Sellami-Kamoun et al.,2008).
No entanto, não foi definido um meio de cultura que propiciasse uma produção ótima de protease microbiana porque cada microrganismo tem condições diferentes de cultivo para uma produção máxima de protease. Sendo assim, a composição do meio de cultura e a concentração de seus componentes têm que ser otimizadas de acordo com o microrganismo utilizado (Rao et al. 2006; Oskouie et al. 2008).
A otimização é um tema de grande importância nos processos de produção biotecnológicos, sendo que até mesmo pequenas melhorias podem ser decisivas para um êxito comercial. Em fermentação, melhorias alcançadas na produtividade do metabolismo microbiano, em geral, através da manipulação dos parâmetros físico - químicos e nutricionais podem alterar significativamente o rendimento do produto de interesse. Esta otimização pode ser conseguida através de metodologias estatísticas (Reddy et al.,2008).
A metodologia de superfície de resposta (RSM) é uma eficiente ferramenta experimental, onde as condições ótimas de um sistema com muitas variáveis podem ser determinadas (Reddy et al., 2008).A RSM é uma coleção de técnicas estatísticas que são úteis para modelagem e análise onde uma resposta de interesse é influenciada por diversas variáveis, e o objetivo é otimizar essa resposta. RSM auxilia na identificação das variáveis significativas, estuda as interações, escolhe condições ótimas e quantifica as relações entre uma ou mais variáveis que interferem na resposta de interesse; contribuindo assim em limitar o número de experimentos (Oskouie et al.,2008).
Muitos pesquisadores têm usado a metodologia de Superfície de Resposta como ferramenta na otimização do processo de produção enzimática de protease (Li et al., 2007; Xiao et al., 2007; Reddy et al., 2008; Oskouie et al.,2008). Alguns desses trabalhos publicados têm focado a sua atenção sobre o papel de uma variedade de fontes de carbono e nitrogênio na produção de proteases. Melaço de cana-de-açúcar, extrato de malte, extrato de levedura, água de maceração de milho, farinhas, cascas de batata, penas de aves são fontes estudadas para utilização na produção de proteases (Rao et al.,2006; Reddy et al.,2008 ; Mukherjee et al.,2008;).
maçã, proteína de soro de queijo e água de maceração de milho como substratos para produção de protease, por uma espécie termofílica Bacillus sp. SMIA-2.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Microrganismo
O microrganismo utilizado neste estudo foi o Bacillus sp SMIA-2, uma bactéria termofílica, isolada no Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA) da Universidade Estadual Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), a partir de amostras de solo do município de Campos dos Goytacazes-RJ (Souza e Martins, 2001). Segundo estes autores, os resultados da comparação das seqüências de 16S rRNA indicaram que o isolado possui 94% de similaridade com B. caldoxylyticus e Bacillus sp. espécie AK1. O microrganismo foi conservado em meio ágar TSY (triptona 20 g.L-1; NaCl 10 g.L-1; extrato de levedura 10 g.L-1; ágar 20 g.L-1 e água 1 L), em placa de petri sob temperatura de 4°C.
2.2. Preparação do meio de cultura e condições de fermentação
O meio de cultura utilizado para a produção da protease foi (g.L-1): pectina
de maçã (variável); proteína de soro de queijo (variável), água de maceração de milho (variável), peptona (1,0); KCl (0,3); K2HPO4 (0,9); MgSO4 (0,5); CaCl2 (0,3);
ZnO (2,5×10-2); FeCl3.6H2O (2,7×10-1); MnCl2.4H2O (1,0×10-1); CuCl2.2H2O
(8,5×10-3); CoCl2.6H2O (2,4×10-2); NiCl3.6H2O (2,5×10-3); H3BO3 (3,0×10-3). O pH
final do meio foi ajustado para 6,5 e posteriormente esterilizado em autoclave a 121oC por 15 minutos. Uma vez preparado o meio de cultura, este foi inoculado com 0,5 mL de pré-inóculo preparado no dia anterior. Os experimentos foram realizados em triplicata, em frascos erlenmayers de 250 mL, contendo 25 mL do meio, usando um shaker orbital (Thermo Forma Orbital Shaker, Ohio, USA) a 150 rpm e à temperatura de 50ºC.
2.3. Planejamento experimental e análise estatística
Para avaliar os efeitos das concentrações de pectina de maçã, proteína de soro de queijo e água de maceração de milho na produção de protease (Y1) e o
crescimento celular (Y2), foi realizado um planejamento experimental central
composto 23 com seis repetições no ponto central para estimativa do erro
experimental e usando pontos estrelas (Tabela 1), durante 24 horas de fermentação à temperatura de 50°C e 150 rpm. A análise da significância dos efeitos das variáveis independentes sobre a produção de protease foi avaliada através do programa Statistic versão 7.0 (StatSoft Co., USA), enquanto que o programa Design Expert versão 5.0 foi empregado para realizar a análise da variância (ANOVA) dos resultados obtidos, assim como, para realizar os procedimentos de otimização gráfica e/ou numérica. Neste contexto, o teste F foi empregado como critério de validação da significância estatística dos modelos obtidos em nível de confiança de 95%.
Tabela 1. Matriz experimental do planejamento 23 central composto com pontos estrelas Níveis Variáveis Código -1,682 -1 0 +1 +1,682 Pectina de maçã (gL-1) X1 0,62 3,0 6,5 10,0 12,4 Proteína de soro de queijo (gL-1) X2 0,62 3,0 6,5 10,0 12,4 Água de maceração de milho (gL-1) X3 0,62 3,0 6,5 10,0 12,4 2.4. Métodos analíticos
2.4.1. Determinação do Crescimento Celular
função da densidade ótica a um comprimento de onda de 600 nm, utilizando um espectrofotômetro Shimadzu modelo UVmini -1240 (Kyoto, Japão).
2.4.2. Determinação da produção de protease através de ensaio enzimático
A produção de protease foi determinada indiretamente através da avaliação da atividade proteolítica de extratos brutos do caldo de fermentação. Desta forma, quando concluídas as fermentações, os meios de culturas foram centrifugados a 4500g por 15 min a 4oC em uma centrífuga modelo HERMLE
Z382K, e o sobrenadante livre de células utilizado para dosagem da atividade da enzima. A atividade da protease foi determinada em triplicata nos filtrados da cultura, adicionando 0,5 mL de extrato enzimático bruto em 1,0 mL de substrato contendo azocaseina a 0,2% dissolvida em tampão Tris-HCL (0,2 M; pH 8,5) a 70ºC por 10 minutos. A reação foi paralisada pela adição de 0,5 mL de ácido tricloroacético 15% (TCA) à mistura que foi centrifugada (HERMLE Z382K) a 15000g por 5 minutos a 4°C e o sobrenadante colocado em tubo de ensaio contendo 0,5 ml de uma solução de NAOH 1N. A coloração desenvolvida foi medida por meio de espectrofotômetro SHIMADZU UV-mini 1240, utilizando comprimento de onda de 420 nm. O mesmo procedimento foi realizado com o controle, exceto que o TCA foi adicionado antes do extrato enzimático. Uma unidade de protease foi definida como a quantidade de enzima necessária para produzir um aumento na absorbância, a 420 nm, igual a 0,1 em 60 minutos (Janssen et al., 1994).
2.4.3. Determinação da proteína
A dosagem de proteína nos filtrados da cultura foi determinada pelo método de Lowry, conforme modificações propostas por Peterson (1977), usando albumina de soro bovino (BSA) como padrão. Os reagentes utilizados foram os seguintes: Reagente A (carbonato de sódio 20 g.L-1; NaOH 2N 50 mL.L-1; tartarato
de sódio e potássio 0,2 g.L-1), Reagente B (CuSO
4.H2O 5 g.L-1), Reagente C (50
partes do Reagente A e uma parte do Reagente B).
A mistura de reação foi constituída de 40 µL da amostra, 360 µL de água destilada e 2000 µL da solução C. Esta mistura foi agitada vigorosamente e após
o repouso da mesma por 15 minutos, foi adicionado 200 µL do reagente de Folin. A mistura foi agitada novamente e em seguida deixada em repouso por mais 30 minutos. O mesmo procedimento foi realizado com o controle, exceto que a amostra foi substituída por água.
A coloração desenvolvida será medida através de espectrofotômetro SHIMADZU UV-mini 1240 utilizando comprimento de onda de 750nm.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Tabela 2 são apresentados os resultados referentes ao perfil de crescimento microbiano e de produção de protease de acordo com o planejamento experimental realizado em shaker.
Conforme pode ser observado, os valores de protease produzida, expressos em unidades de atividade enzimática por massa de proteína (U/mg de proteína), variaram de 0,20 a 55 U/mg de proteína (Y1). Neste caso, o melhor
resultado (ensaio 1) foi alcançado quando a cultura foi conduzida em meio com 3,0 gL-1 de pectina de maçã, 3,0 gL-1 proteína de soro de queijo e 3,0 gL-1 água de maceração de milho, durante 24 horas de fermentação.
Tabela 2. Resultados do planejamento estatístico, Central Composto Ortogonal, para a produção de protease pelo Bacillus sp. SMIA-2
N° exp. X1 X2 X3 Y1 Y2 1 -1,000 -1,000 -1,000 54,71 1,232 2 1,000 -1,000 -1,000 0,204 0,23 3 -1,000 1,000 -1,000 27,07 0,269 4 1,000 1,000 -1,000 0,736 0,222 5 -1,000 -1,000 1,000 34,59 1,014 6 1,000 -1,000 1,000 1,207 0,211 7 -1,000 1,000 1,000 25,82 0,331 8 1,000 1,000 1,000 21,92 0,523 9 -1,682 0,000 0,000 29,85 0,523 10 1,682 0,000 0,000 0,53 0,035 11 0,000 -1,682 0,000 40,23 1,017 12 0,000 1,682 0,000 21,67 0,263 13 0,000 0,000 -1,682 38,15 0,699 14 0,000 0,000 1,682 23,59 1,146 15 0,000 0,000 0,000 31,89 0,669 16 0,000 0,000 0,000 32,91 0,845 17 0,000 0,000 0,000 32,44 0,669 18 0,000 0,000 0,000 30,72 0,669 19 0,000 0,000 0,000 31,71 0,544 20 0,000 0,000 0,000 31,05 0,544
X1-Pectina de maçã; X2- Proteína de soro de queijo; X3-Água de maceração de milho
Shikha et al. (2007) relatam em seu trabalho a produção de protease utilizando uma diversidade de fontes de carbono e nitrogênio, sendo que seus melhores resultados foram quando utilizado melaço de cana-de-açúcar (245
U/ml) como fonte de carbono e farelo de trigo (155 U/ml) como fonte de nitrogênio. Apesar da relevância deste trabalho e do atrativo de terem empregado resíduos agroindústrias como meio de cultura, é difícil estabelecer critérios de comparação a respeito dos valores de protease alcançados pelos mesmos e aqueles obtidos no presente trabalho, uma vez que seus resultados não foram expressos em termos de atividade específica.
Para analisar a significância dos efeitos das variáveis independentes estudadas, inicialmente foram feitas análises visando verificar alterações no crescimento celular (Y2) e produção de enzima (Y1). Neste contexto, os
resultados ilustrados no gráfico de Pareto (Figura 1) revelaram que as condições que favoreceram o crescimento celular foram diferentes daquelas que estimularam a produção da protease. Desta forma, verificou-se uma influência negativa, porém estatisticamente significativa dos efeitos primários das três variáveis independentes em nível de 95% de confiança (Figura 1a). Um aumento nas concentrações da pectina de maçã, das proteínas do soro de leite e da água de maceração de milho, resultou em uma redução na produção de protease, sendo que a concentração de pectina foi a variável que, a princípio, apresentou comparativamente um efeito mais acentuado. Contudo, uma diversidade de trabalhos tem relatado resultados contrários em termos da significância de efeitos das fontes de carbono e nitrogênio sobre a produção de protease, usando a ferramenta de planejamento de experimentos (Chauhan e Gupta, 2004; Ramnani et al., 2005; Reddy et al., 2008), embora, isto dependa claramente da grandeza ou das faixas de concentração das variáveis estudadas e da forma de expressar ou quantificar a produção enzimática. Assim por exemplo, Chauhan e Gupta (2004) concluíram que níveis mais altos de concentração de amido e um hidrolisado de caseína (casamino acid) foram propícias para uma maior produção de protease, e semelhantemente, Reddy et al. (2008) obtiveram os melhores resultados quando utilizaram níveis mais altos de amido de milho e água de maceração de milho como substratos.
No entanto, quando a combinação entre as variáveis foi avaliada (Figura 1a) em função da análise simultânea dos efeitos das interações, foram observadas evidências significativamente positivas da produção enzimática. Por outro lado, ao analisar a influência de cada variável independente sobre o crescimento celular, observou-se que a concentração da água de maceração de
