*Orientador, Doutor RESUMO

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29 e 30 de outubro de 2019

DETERMINAÇÃO MULTIRESÍDUOS DE DROGAS VETERINÁRIAS POR

CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE

MASSAS (CG/EM) EM AMOSTRAS LEITE DA REGIÃO NOROESTE DO

PARANÁ

Nathalia Akemi Neves Kohara1_{; Caio Franco de Araújo Almeida Campos}2_{; Márcia} Aparecida Andreazzi3_{; Fabio Luiz Bim Cavalieri}3_{; José Eduardo Gonçalves}3,*

1_{Acadêmica do Curso de Farmácia, Unicesumar, Maringá-PR. Bolsista do PIBIC/UniCesumar}

2_{Acadêmico do Mestrado em Tecnologias Limpas, Unicesumar, Maringá-PR.}

3_{Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Limpas, Unicesumar, Maringá-PR}

*Orientador, Doutor

RESUMO

O leite é um alimento rico em proteína, gordura, carboidratos, sais minerais e vitaminas. Os principais fatores que contribuem para a perda da qualidade do leite são: presença de doenças no rebanho, falta de higiene durante a ordenha, limpeza e sanitização inadequadas dos equipamentos e utensílios de ordenha, má qualidade da água, acondicionamento e transporte em condições inapropriadas do ponto de vista de higiene e temperatura. No entanto, se o leite não é produzido com boas práticas de produção leiteira, pode ser uma fonte de contaminantes, como drogas veterinárias. Devido à segurança alimentar humana, organizações em todo o mundo, tem estabelecidos limites máximos de resíduos (LMR) de diferentes medicamentos veterinários no leite. No Brasil, os medicamentos veterinários têm sido monitorados pelo Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC), que define LMR’s com base em regulamentos internacionais para alimentos de origem animal. Assim, objetivo deste trabalho é detectar multiresíduos dessas drogas veterinárias no leite produzido na região noroeste do Paraná utilizando àcromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM). Espera-se que os dados que serão produzidos neste trbalho possa contribuir para a maior segurança no consumo de leite pela população através de um controle de qualidade mais efetivo.

PALAVRAS-CHAVE:Analise química; Resíduos veterinários; Controle de Qualidade.

1 INTRODUÇÃO

O leite é considerado o mais nobre dos alimentos, por sua composição rica em proteína, gordura, carboidratos, sais minerais e vitaminas, disponibiliza nutrientes e proteção imunológica para o neonato. Além de suas propriedades nutricionais, o leite oferece elementos anticarcinogênicos, presentes na gordura, como o ácido linoléico conjugado, esfingomielina, ácido butírico, betacaroteno, vitaminas A e D (MULLER, 2002). O componente que se apresenta em maior proporção é a água, sendo os demais formados principalmente por gordura, proteínas, carboidratos, todos sintetizados na glândula mamária. Existem também pequenas quantidades de substâncias minerais, substâncias hidrossolúveis transferidas diretamente do plasma sanguíneo, proteínas específicas do sangue e traços de enzimas (MULLER, 2002).

Do ponto de vista tecnológico, a qualidade da matéria prima é um dos maiores entraves ao desenvolvimento e consolidação da indústria de laticínios no Brasil. De modo geral, o controle da qualidade do leite nas últimas décadas tem se restringido à prevenção de adulterações do produto in natura baseada na determinação da acidez, índice crioscópico, densidade, percentual de gordura, extrato seco desengordurado, e testes

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específicos para detecção de substâncias ilegais (conservantes de neutralizantes de acidez (ex.: carbonato de sódio, bicarbonato de sódio), resíduos de detergentes e sanitizantes, reconstituintes de densidade (ex.: açúcar, sal de cozinha, amido), resíduos de antibióticos). A contagem global de micro-organismos aeróbios mesófilos (indicadores de qualidade microbiológica do produto) tem sido utilizada somente para leite cru do tipo A e B (MULLER, 2002; G100 - Associação Brasileira das Pequenas e Médias Cooperativas e empresas de Laticínios).

Os principais fatores que contribuem para a perda da qualidade do leite são: presença de doenças no rebanho (brucelose, tuberculose, mastite), falta de higiene durante a ordenha, limpeza e sanitização inadequadas dos equipamentos e utensílios de ordenha, má qualidade da água, acondicionamento e transporte em condições inapropriadas do ponto de vista de higiene e temperatura.

O consumo de leite tem sido associado a vários benefícios, uma vez que é composto de gordura, proteína, fósforo, cálcio e outros minerais e vitaminas. Estas características fazem do leite um alimento essencial na dieta humana. No entanto, se o leite não é produzido com boas práticas de produção leiteira, pode ser uma fonte de contaminantes, como drogas veterinárias (FURLANI et al., 2015).

Drogas veterinárias têm sido amplamente utilizadas no manejo de gado leiteiro para prevenir doenças e promover o crescimento. No entanto, se essas substâncias são aplicadas indevidamente e se o período de carência para a retirada do leite cru dos animais tratados não é observados, estes resíduos podem ser encontrados em alimentos de origem animal, como o leite (BILANDZIC et al., 2011). Portanto, os resíduos de medicamentos veterinários podem ser transferido do leite cru para produtos lácteos (Aguilera-Luizet al., 2012; SNIEGOCKI, GBYLIK-SIKORSKA & POSYNIAK, 2015), porque alguns desses produtos têm alta estabilidade sob tratamentos térmicos, como pasteurização e ultra processos de temperatura (UHT) (ROCA, ALTHAUS, & MOLINA, 2013; ROCA et al., 2010).

Devido à segurança alimentar humana, organizações em todo o mundo, tem estabelecidos limites máximos de resíduos (LMR) de diferentes medicamentos veterinários no leite(CODEX, 2012; Regulamento do Conselho, Regulamento do Conselho nº 37, 2010).No Brasil, os medicamentos veterinários têm sido monitorados pelo Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC), que define LMR’s com base em regulamentos internacionais para alimentos de origem animal (BRASIL,2012). Estes LMR exigem o desenvolvimento de métodos que sejam capazes de monitorar e determinar medicamentos veterinários com múltiplos resíduos em amostras de leite.

No Brasil a Instrução Normativa nº 513 (BRASIL, 2002) exige a pesquisa periódica de resíduos de antibióticos em leite, que não devem ser superiores aos Limites Máximos de Resíduos – LMRs (ANVISA, 2003; CODEX, 2012),previstos para cada grupo químico específico (Tabela 1). Este controle também é adotado em outros países (JONES, 1999; SHITANDI e KIHUMBU, 2004). Vários kits analíticos de detecção de resíduos de antibióticos foram aprovados e são autorizados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA – Brasil para o controle da presença dessas substâncias em leite, utilizando diferentes princípios de ação e detecção.

Desta forma, o objetivo do estudo foi desenvolver e validar um método analítico para quantificação multiresíduos de drogas veterinárias (amitraz, cipermetrina, diclorvos,

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clorpirifos, eprinomectina e fluazuron) no leite de gado, que seja confiável, sensível e que garanta a qualidade do leite e a saúde do consumidor.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

Na análise de resíduos no leite, o preparo da amostra é uma etapa essencial na eliminação de interferentes que possam comprometer a análise. Envolve a extração dos analitos, limpeza do extrato com a finalidade de isolar os compostos de interesse e remover os interferentes da matriz. O método empregado foi QuEChERS.

Para a otimização e validação do método, foram utilizadas amostras de leite de UHT adquiridas mercado local. As amostras foram identificadas, registradas e armazenadas a -18 °C até o momento da análise.

Extração do analito da matriz - método QuEChERS

As amostras foram preparadas tomando 10 g de leite em um tubo, e, posteriormente, sulfato de magnésio (4 g), sódio cloreto (1 g), citrato de tri-sódio (1 g) e hidrogênio citrato de di-sódio(0,5 g) seguido da adição de 15 ml acetonitrila. As amostras foram agitadas vigorosamente durante 1 minuto e centrifugação (6000 rpm) durante 5 min; a camada superior obtida de mistura foi transferida para cartucho QuEChERS contendo 25 mg de PSA e 50 mg de C18 para separar os analitos desejados da matriz, agitando em a 8000 rpm por 2 min. A camada superior separada foi filtrada e injetada diretamente no CG/EM. Todos os métodos de extração foram realizados em triplicata.

Condições Cromatográficas para análise no CG/EM

As análises no CG/EM foram realizadas em um cromatógrafo a gás (modelo Agilent 7890B) com injetor automático (CTC PAL Control), acoplado a um espectrômetro de massa (modelo Agilent 5977A MSD), equipado com coluna HP-5MS UI Agilent com fase de 5% de fenil metil siloxano (30,0 m x 250 μmd.i. x 0,25 μm de espessura do filme). Para a separação adequada dos analitos no sistema CG/EM, 2μL do extrato foi injetado na coluna usando o modo de injeção Split na razão 1:50, nas seguintes condições do forno: temperatura inicial de 70°C mantida por 2,5 min, em seguida rampa de 15°C min-1_até

175°C mantida por 13 min, e rampa de 20°C min-1_{até 290 °C e mantida por 15 min. As}

demais condições do método de análise foram: volume de injeção de 1,0 μL, fluxo do gás de arraste (He, pureza 99,99999%) igual a 1,2 mL min-1_{, ionização por impacto eletrônico}

de 70 eV, temperatura da fonte de ionização de 230°C, do quadrupolo de 150°C, da linha de transferência de 280°C e do injetor de 250°C. A aquisição dos dados foi realizado pelo software MassHunter e análise qualitativa dos espectros de massas pela biblioteca NIST 11.

Procedimentos de validação

Os ensaios de validação foram realizados por CG/MS seguindo os parâmetros descritos pelas normas brasileiras e internacionais.Para a linearidade (padronização externa), foram empregadas soluções de diferentes concentrações para cada droga veterinária (Tabela 1) e injetadas em triplicata.

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Em cada grupo de amostras fortificadas foi incluída uma amostra branca para confirmação da não detecção do analito. Através destes ensaios, foram avaliadas a seletividade, exatidão, precisão e robustez. Para determinar os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) do método, foram realizados ensaios com amostras fortificadas em concentrações decrescentes para cada droga veterinária.

Tabela 1: Concentração das drogas veterinárias

Drogas Veterinárias C1 µg/L C2 µg/L C3 µg/L C4 µg/L C5 µg/L C6 µg/L Diclorvos 2,25 5,75 6,75 9 11,54 22,5 Cipermetrina 0,25 0,625 0,75 1,0 1,25 2,5 Amitraz 1,56 1,875 2,5 3,125 6,25 Clorpirifos 3,125 3,75 5,0 6,25 12,5 Eprinomectina 0,05 0,125 0,15 0,2 0,25 0,5 Fluazuron 0,125 0,3125 0,375 0,5 0,625 1,25 C = concentração 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES

A etapa do preparo da amostra é essencial para eliminação de interferentes que possam comprometer a análise. O método de QuEChERS, descrito por Anastassiades et.al. foi satisfatório para extração do analito da matriz. A utilização de sais citrato de tri-sódio e hidrogênio citrato de di-sódio promovem o efeito salting out, aumentando a recuperação de analitos polares.

O sorvente PSA (do inglês, primary secondary amine) que tem efeito quelante, devido a sua estrutura com grupo amino primário e secundário. Resultando em uma retenção de ácidos graxos livres e de outros compostos polares presentes na matriz (PRESTES; ZANELLA, 2011). A adição de sílica C18 combinada com o PSA certifica que os resíduos lipídicos sejam eliminados, garantindo que não haja contaminação do sistema cromatográfico e diminuindo o efeito matriz.

Esta técnica apresenta vantagem de fácil e rápida realização, pois o principio baseia-se em extração, partição e limpeza. De acordo com os parâmetros de validação avaliados, a confiança dos resultados analíticos foi assegurada, com o objetivo de diminuir eventuais erros.

A recuperação das drogas veterinárias nas amostras foi avaliada com a comparação da concentração real de cada substância adicionada ao leite antes do processo de extração, com aquela encontrada após essa etapa.

Tabela 2: Resultados dos limites de detecção, limites de quantificação e recuperação do método para a determinação de Alatox, Triatox e Colosso em leite.

Drogas Veterinária s Substâncias Limite de Detecção μg L-1 Limite de Quantificação μg L -1 % Recuperação Alatox Diclorvos 1,79 2,25 89,7 Cipermetrina 0,10 0,25 96,3 Triatox Amitraz 1,15 1,56 86,6 Colosso Clorpirifos 1,406 3,125 91,3 Cipermetrina 0,101 0,75 96,3 Eprinomectina 0,023 0,05 85,8

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Fluazuron 0,061 0,125 96,7

De acordo com os parâmetros de validação foi assegurada a confiança dos resultados analíticos. Os coeficientes de limites de quantificação de 2,25;0,25;1,56;3,125;0,75;0,05;0,125, encontrados para diclorvos, cipermetrina, amitraz, clorpirifos, cipermetrina, eprinomectina e fluazuron, respectivamente, permitem considerar que o método gera resultados proporcionais á concentração das substancias em analise.

GRÁFICO 1: Cromatograma obtido da extração das drogas veterinárias (Diclorvos, Cipermetrina, Amitraz,

Clorpirifos,Eprinomectina e Fluazuron) presentes no leite.

GRÁFICO 2: Cromatograma das drogas veterinárias obtidos em diferentes concentrações após extração.

Diclorvos Cipermetrina Amitraz Clorpirifos Eprinomectina Fluazuron

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Os gráficos 1 e 2 representam o perfil cromatográfico de diclorvos, eprinomectina, fluazuron, clorpirifos, amitraz, e cipermetrina após extração pelo método de QuEChERS. A seletividade do método mostrou-se eficiente para a determinação multiresíduos em leite. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000

Curva de Concentração Cipermetrina - Alatox

Áre a re la ti va Concentração Cipermetrina (µg/L) Equation y = a + b*x Weight No Weighting Residual Sum of Squares 0,4778 Pearson's r 1 Adj. R-Square 1

Value Standard Error B Intercept -0,33019 0,18264 B Slope 1,73037E7 0,15413

GRÁFICO 3: Curva de linearidade de cipermetrina em leite.

Verifica-se que concentrações e áreas encontradas para cipermetrina encontram-se dentro da curva analítica, isto é, a relação entre sinal e quantidades.

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29 e 30 de outubro de 2019 0 5 10 15 20 25 0,00E+000 5,00E+007 1,00E+008 1,50E+008 2,00E+008 2,50E+008 3,00E+008

Curva de Concentração de Diclorvos - Alatox

Áre a re la ti va Concentração de Diclorvos Equation y = a + b*x Weight No Weighting Residual Sum of Squares 2,0683E14 Pearson's r 0,99805 Adj. R-Square 0,99532

Value Standard Error B Intercept -9,95686E6 3,81196E6 B Slope 1,27068E7 355664,04818

GRÁFICO 4: Curva de linearidade de diclorvos em leite.

A maioria dos pontos correspondentes aos volumes injetados estão dentro da curva de linearidade, com exceção de 30 µL e 100 µL. Porém, os resultados se mantiveram dentro do esperado. 0 1 2 3 4 5 6 7 -2,00E+007 0,00E+000 2,00E+007 4,00E+007 6,00E+007 8,00E+007 1,00E+008 1,20E+008 1,40E+008

Curva de Concentração Amitraz - Triatox

Áre a re la ti va Concentração Amitraz (µg/L) Equation y = a + b*x Weight No Weighting Residual Sum of Squares 1,90221E13 Pearson's r 0,99899 Adj. R-Square 0,99747

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Os quocientes entre as áreas medidas e correspondentes concentrações são constantes. Os volumes 40µL e 50µL não são significativos para a alteração de “r”.

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000

Curva de Concentração Cipermetrina - Colosso

Áre a re la ti va Concentração Cipermetrina (µg/L) Equation y = a + b*x Weight No Weighting Residual Sum of Squares 6,33935E11 Pearson's r 0,99974 Adj. R-Square 0,99937

Value Standard Error B Intercept 162984,49757 209120,35655 B Slope 5,75338E6 59046,82185

GRÁFICO 6: Curva de linearidade de Cipermetrina em leite.

A maioria dos dados estão dentro da curva de linearidade, com exceção do volume 30µL, porém não é considerado discrepante em relação a curva analítica.

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29 e 30 de outubro de 2019 0 2 4 6 8 10 12 14 0,00E+000 5,00E+007 1,00E+008 1,50E+008 2,00E+008 2,50E+008

Curva de Concentração Clorpirifos - Colosso

Áre a re la ti va Concentração Clorpirifos (µg/L) Equation y = a + b*x Weight No Weighting Residual Sum of Squares 2,27516E14 Pearson's r 0,99636 Adj. R-Square 0,99091

GRÁFICO 7: Curva de linearidade de Clorpirifos em leite.

A maioria dos dados encontrados estão dentro da curva analítica, com exceção dos volumes 50µL e 100µL. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,00E+000 2,00E+007 4,00E+007 6,00E+007 8,00E+007 1,00E+008 1,20E+008 1,40E+008

Curva de Concentração Eprinomectina

B Concentração de Eprinomectina (µg/L) Equation y = a + b*x Weight No Weighting Residual Sum of Squares 4,05126E13 Pearson's r 0,99781 Adj. R-Square 0,99453

Value Standard Error B Intercept -1,10277E7 2,33046E6 B Slope 2,74673E8 9,10441E6

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Os dados encontrados para eprinomectina de 30µL e 100µL foram satisfatórios na construção da curva analítica, e os desvios em 25µL, 40µL e 50µL não são considerados discrepantes em relação a linearidade.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 0,00E+000 2,00E+007 4,00E+007 6,00E+007 8,00E+007 1,00E+008

Curva de Concentração Fluazuron

à re a re la ti va Concentração de Fluazuron (µg/L) Equation y = a + b*x Weight No Weighting Residual Sum of Squares 5,32271E13 Pearson's r 0,99554 Adj. R-Square 0,98931

Value Standard Error B Intercept -1,799E6 1,92765E6 B Slope 7,6755E7 3,25367E6

GRÁFICO 9: Curva de linearidade de Fluazuron em leite.

Os valores obtidos ajustam-se a equação da reta, e não foram identificados valores anômalos em 25µL, 30µL e 50µL.

O estudo da linearidade foi realizado com a construção de curvas analíticas. As figuras 3,4,5,6,7,8, e 9 ilustram as curvas obtidas, respectivamente, de adicionados de cipermetrina, diclorvos, amitraz, cipermetrina, clorpirivos, eprinomectina e fluazuron, nas concentrações de 100 µL, 50 µL, 40 µL, 30 µL, 25 µL e 10 µL. Cada ponto corresponde a média dos valores encontrados nas análises realizadas em triplicatas. Não foram observados valores discrepantes em nenhuma situação apresentada.

Os dados relativos a linearidade demonstram que há correlação entre as concentrações das drogas veterinárias e as respectivas áreas. A linearidade para o método de ensaio foi verificada através da leitura da curva analítica, de acordo com a relação linear expressa pela equação:y= bx + a

De acordo com Cardoso et.al. 2010, a correlação apresentada entre os valores de “x” e “y” é representada pelo coeficiente de Pearson – “r”. O quadrado desse coeficiente é chamado de coeficiente de determinação R 2. Tais coeficientes apontam o ajuste dos dados á curva, os resíduos decorrentes dos ajustes da curva analítica demonstram se há valores discrepantes e se há desvio da linearidade.

O método validado no presente trabalho demonstrou ser qualificado para a verificação da presença de resíduos de drogas veterinárias em leite, tendo fácil execução e curto tempo

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de análise. Foi possível observar que a regressão foi significante, não expressando desvio da linearidade na curva avaliada para as seis substâncias alvo do estudo.

4 CONCLUSÃO

A metodologia QuEChERS, combinada com cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas, proporciona uma extração e análise qualitativa e quantitativa das drogas veterinários estudados com alta eficiência e baixa detecção, sendo um método simples e de fácil aplicação para o desenvolvimento de análises de rotina no controle da qualidade de alimentos.

Visto que a presença de resíduos de drogas veterinárias pode resultar em prejuízos econômicos e a saúde do consumidor, torna-se fundamental o monitoramento destes analitos em leite. O método validado no presente trabalho demonstrou eficiência na determinação destes resíduos.

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