Citotoxicidade in vitro das membranas de hidrogel reticuladas por radiação ionizante

Rev. Inst. A dolfo L u tz,

5 9 (l/2):l-5,2000 A R T I G O O R I G I N A L /O R I G I N A L ARTICLE

Citotoxicidade in vitro das membranas de hidrogel reticuladas

por radiação ionizante

In vitro cytotoxicity o f hydrogel membranes reticulate by ionizing radiations

Sizue O. ROGERO1 Áurea de SOUZA-BAZZI1 Tamiko I. IKEDA2 Áurea S. CRUZ2’ Katia C. FERNANDES2 O laaZ .H IG A 1 RIALA6/875

Rogero, S.O. et al. Citotoxicidade in vitro das membranas de hidrogel reticuladas por radiação ionizante. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 59(1/2): 1-5,2000.

R E SU M O . Hidrogéis constituídos de poli N-vinil-2-pirrolidona (PVP), ágar e polietilenoglicol (PEG) são utilizados como m em branas para uso tópico, no tratam ento de lesões de pele. Com o objetivo de m elhorar algum as das propriedades m ecânicas da m em brana, com o tensão de ruptura e elongação, substituiu-se o PEG pelo copolím ero poli (dim etilsiloxano)-co-poli (óxido de etileno). (SEO). A biocom patibilidade “in vitro” das m em branas de PVP-SEO com diferentes concentrações de SEO foi testada em cultura de células. O teste de citotoxicidade foi realizado pelo estudo com parativo de dois m étodos: 1) difusão em ágar, utilizando-se as linhagens celulares RC-IA L e NCTC Clone L-929 e 2) inibição da form ação de colônias utilizando-se a linhagem celular C H O -K r Os resultados obtidos nos dois m étodos foram análogos e dem onstraram que as m em branas do PVP-SEO apresentam toxicidade nas concentrações testadas e nas linhagens celulares utilizadas. Foi possível tam bém concluir que a adição de SEO ocasiona caráter citotóxico às m em branas de PVP.

P A L A V R A S -C H A V E . H id ro g e l; c u ltu ra de c é lu la s ; c ito to x ic id a d e ; b io c o m p a tib ilid a d e ; polivinilpirrolidona.

INTRO D U ÇÃ O

M embranas de hidrogel constituídas por poli N-vinil-2- pirrolidona (PVP), ágar e polietilenoglicol (PEG), reticuladas por radiação ionizante vêm sendo utilizadas como dispositivos médicos para uso tó p ico 8 ". A principal vantagem desta

metodologia está na capacidade da radiação promover a reticu- lação em condições razoavelm ente brandas, sem qualquer aditivo, além da esterilização sim ultânea4. Souza et a l.13 m ostraram que a substituição do PEG nas m em branas de hidrogel pelo copolímero poli (dimetilsiloxano)-co-poli (óxido de etileno) (SEO) aumenta o grau de reticulação tomando-as

Instituto dc Pe sq ui sa s En er gé tic as e N u c le a re s - S u p e rv is ã o de Ra d io b io lo gi a Instituto A d o lf o Lu tz - Se ç ão d c C ul tu ra s C el ula res

* Endere ço para co rre s p on d ên c ia : Av. Dr. A m a l d o , 3 5 5 - 0 1 2 4 6 - 9 0 2 - Sã o Paulo - SP E-Mail: au rcruz@ial.sp.gov.br

R ogero, S.O. e ta l. C ito to x icid ad e//; vítro das m em branas de hidrogel reticuladas po r radiação ionizante. Rev. Inst. A d olfo Lutz, 59(1/2): 1-5,2 0 0 0

mais resistentes à ruptura quando subm etidas a uma força externa. O SEO foi selecionado por ser utilizado na indústria de cosméticos e na fabricação de lentes de contato12.

As membranas de hidrogel, como todos os biomateriais, devem ser submetidas a avaliação de biocompatibilidade que incluem ensaios “in vitro” e “in vivo” u.

Vários métodos “in vitro”, para avaliação da toxicidade de biom ateriais, foram padronizados utilizando-se culturas celulares. Os testes de citotoxicidade consistem em colocar o material direta ou indiretamente em contato com uma cultura de células de mamíferos, verificando-se a viabilidade celular por diferentes mecanismos, entre os quais a incorporação de corantes vitais ou a inibição da formação de colônias2-3,5,7’9.

O o b je tiv o do p re s e n te tra b a lh o foi a v a lia r a citotoxicidade dos filmes de PVP, com diferentes concentra­ ções de SEO, em sistem as celulares “in vitro”, bem como comparar a sensibilidade dos dois métodos utilizados: difusão em ágar e inibição da formação de colônias.

M A T E R IA L E M É T O D O S 1. Preparo das membranas

Os reagentes utilizados no preparo das m em branas foram: PVP K-90 proveniente da GAF Corporation com massa molar 3,6 x 105 g/mol, o copolímero SEO L7604 gentilmente cedido pela Osi Specialties, com massa molar 4x103 g/mol e o ágar técnico n° 03 Oxóid L I 3.

Os 5 tipos de membranas foram preparados com PVP a 6%, ágar a 0,4% e SEO nas concentrações de 0; 0,5; 1,5; 3,5 e 4,5% (P/P), nas membranas numeradas de 1 a 5, respectiva­ m ente. As soluções aquosas de PVP, SEO e ágar foram preparadas separadamente, incorporadas a uma temperatura aproximada de 60°C e distribuídas em placas de Petri. Após a gelificação, as placas cobertas com filmes de PVC foram irradiadas com uma dose de 25kGy no acelerador de elétrons D ynam itron, com energia de l,5 M eV e taxa de dose de 22,4kGy/s. Ao término da irradiação, as amostras ficaram em repouso por 24h para atingir o equilíbrio.

2. Teste de citotoxicidade

A avaliação da citotoxicidade das membranas de hidrogel foi realizada utilizando-se dois métodos:

2.1. Método de difusão em ágar

As linhagens celulares utilizadas foram: células de tecido conectivo de camundongo, NCTC Clone L-929 (C C L 1- ATCC)1 e células fibroblásticas de rim de coelho RC-IAL, isoladas no Instituto Adolfo Lutz6.

A s c é lu la s fo ra m se m e a d a s em p la c a de P etri (15x60mm), na concentração de 3,0 x 105 células/mL em Meio Mínimo de Eagle (MEM) com 10% de soro fetal bovino (SFB), sem antibióticos, no volume de 5mL e incubadas durante 48h a 37°C em atm osfera úm ida com 5% de CO,. A pós esse período, com a monocamada de células já formada, o meio de

cultura foi desprezado e adicionado 5mL do meio “overlay” em cada placa de Petri. Este meio é composto de partes iguais de MEM duas vezes concentrado e ágar (Difco) a 1,8% contendo 0,01% de vermelho neutro como corante vital. No momento do uso, o ágar foi fundido e misturado na mesma proporção com o MEM duas vezes concentrado, ambos a uma temperatura de 44°Ç. As m em branas a serem testadas foram cortadas em fragmentos de 5inm de diâmetro e colocadas sobre o ágar antes de sua solidificação com pleta. As placas de Petri foram incubadas novam ente em estufa com 5% CO, a 37°C por 24h; ' |

Foram utilizados como controles positivos fragmentos de látex e como controles negativos discos de papel de filtro de natureza comprovadamente atóxica, respeitando a dimensão de 5mm de diâmetro. As amostras foram avaliadas em duplicata para cada linhagem celular.

As placas foram analisadas macroscópica e microscopi­ camente e a característica de citotoxicidade constatada por halo claro ao redor do material testado.

2.2. Método inibição da formação de colônias2,9

Para a preparação dos extratos das amostras, utilizou- se a proporção de l,4cm 2de área superficial das membranas para cada mL do meio de cultura RPM1-SFB (RPMI 1640 com 10% de SFB e 1% de solução de penicilina e estreptomicina) em frascos de vidro com tam pa rosq u ead a incubados a 37°C/24h. Após este período foram feitas diluições seriadas de 50; 25; 12,5 e 6,25% dos extratos das m em branas. Os controles negativo, extrato de polietileno de alta densidade (HDPE), e positivo, solução de fenol 0,02%, foram igualmente diluídos.

Utilizou-se a linhagem celular de ovário de hamster c h in ês C H O -K j ( C C L -6 1 -A T C C )1, m an tid a em g arrafas plásticas com o meio RPMI SFB. No momento do ensaio, volum e de 2mL de uma suspensão celular contendo 100 células/mL, foi distribuído em placas de Petri de 15X60mm, as quais foram incubadas por 5h para permitir adesão celular, em incubadora úm ida a 37°C com 5% de CO,. Após este período, o meio de cultura foi removido e substituído por 5mL dos extratos puros e das diferentes diluições. As placas foram novamente colocadas em estufa úmida com 5% de CO, a 37°C, por 7 dias. Para cada diluição do extrato utilizou-se placas em triplicata.

A pós o p e río d o de in c u b a ç ã o , os m eio s foram rem ovidos e as colônias form adas fixadas em solução de formol 10% em solução salina 0,9% e coradas com Giemsa. As colônias visíveis foram contadas e com paradas com o número de colônias formadas na placa controle da linhagem celular CHO-Kj, previamente incubada com o meio RPMI- SFB.

O potencial citotóxico foi avaliado e expresso pelo índice de citotoxicidade IC50(%), correspondente à concentração do extrato que suprime em 50% a formação de colônias em relação ao controle.

Rogero, S.O. et ai. C itotoxicidade in vitro das m em branas d eh id ro g e l reticuladas p o r radiação ionizante. Rev. Inst. A d olfo L utz, 59(1/2): 1-5, 2000

RESULTADOS

No teste de citotoxicidade, pelo método de difusão em ágar. a intensidade de morte celular foi avaliada pelo dimensio- namento do halo claro formado ao redor da membrana em teste. O diâmetro do halo foi medido com uma régua milimétrica, e os resultados estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1

.

Am ostras

M ed ia d os di â m e tr o s d os halos*

Linhagem celular N C T C L929 Li nhagem celular RC-1AL

Contr. N c g at . 0 , 0 0 , 0 Contr. Po si t. 3 5 , 0 3 5 , 0 1 0 , 0 0 . 0 2 5 , 0 5 . 0 3 9 . 0 9 , 0 4 1 5 , 0 2 5 , 0 5 2 1 , 0 3 5 . 0 * Valores ex pressos c m m m

Figura 2. Placas de Petri do teste de citotoxicidade pelo método de inibição de formação de colônias

A presença do halo claro ao redor da membrana de PVP- SEO, contendo 1,5% de SEO, corresponde as células mortas (Figura 1).

Tabela 2. Percentual da média do número de colônias forma­ das, em diferentes concentrações dos extratos, em relação à placa controle, nas am ostras de PV P-SEO e nos controles negativo e positivo

Figura 1. Teste de citotoxicidade pelo método de difusão em ágar: a- Controle negativo, b- M embrana de PVP-SEO com 1,5% de SEO

Na Figura 2 são apresentadas as placas de Petri do controle de células C H O -K (; do controle negativo; do controle positivo e da membrana de PVP contendo 0% de SEO, do ensaio de citotoxicidade pelo método de inibição de formação de colônias. A porcentagem da média do número de colônias em cada diluição foi calculada em relação à placa controle de células CHO-K, (Tabela 2).

Lançando-se os dados da Tabela 2 num gráfico pode-se calcular quantitativamente o índice de citotoxicidade, que é representado pelo IC.0(%), como mostra a Figura 3.

% da M é d i a d o N ú m e r o de Co lô ni a s A m o s t r a s _{C o n c e n tr a ç ã o d o E xtrato} 6 . 2 5 % 1 2 , 5 % 25 % 5 0 % 1 0 0 % C o n t r . N e g a t . 8 4 10 3 7 8 9 3 8 7 C o n t r . P os it. 7 6 6 9 5 2 1 9 1 1 8 8 9 3 9 4 101 9 7 2 8 3 8 8 8 6 6 0 3 3 7 9 6 5 1 9 0 0 4 1 5 3 0 3 0 5 1 7 9 0 3 3 Figura SEO; 3-Concentração do Extrato (%)

3. Curva de supressão de colônias. 1-0% SEO; 2- 0,5% 1,5% SEO; 4-3,5% SEO e 5- 4,5% SEO

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D ISC U SSÃ O E C O N C L U S Õ E S

Os ensaios “in vitro” são habitualmente efetuados como testes de triagem no início da avaliação de biocompatibilidade de m ateriais. A ISO 10993-5 (1992) refere-se ao teste de citotoxicidade como um teste “ in vitro” de aplicabilidade geral, usado largamente com o objetivo de sugerir, a partir de seus resultados, um plano de ensaios aplicáveis ao material. Uma das vantagens deste teste é sua alta sensibilidade, e os resultados obtidos tanto pela inibição de crescimento celular, formação de colônias, morte celular, e outros, indicam que este tipo de avaliação fornece informação integrada da ação dos componen­ tes do material no meio biológico.

O copolím ero SEO, constituído de cadeias de poli dimetil siloxana com cadeias enxertadas de poli óxido de etileno, foi adicionado às membranas de hidrogel de PVP por increm entara resistência mecânica das mesmas. Ranby e Rabek (1977) verificaram que quando o poli óxido de etileno é subme­ tido à radiação ionizante, há formação de radicais que podem ser decorrentes da cisão da cadeia.

Como a obtenção das membranas é feita via radiação ionizante, este fato pode levar à formação de algum componen­ te tóxico, conforme verificado nos ensaios de citotoxicidade apresentados.

No teste de difusão em ágar (Tabela 1), a presença de halo foi observada em todas as m embranas exceto naquela

identificada como 1, PVP com 0% de SEO, evidenciando liberação de componente tóxico pelas membranas de PVP com diferentes concentrações de SEO. A presença de halo nas placas indica morte celular, ou seja, citotoxicidade como se verifica no controle positivo, que apresentou um halo de 35mm.

Na Figura 3 observa-se que a membrana de PVP sem a presença de SEO apresenta IC50% superior a 100, portanto não citotóxica, assim como o controle negativo. A medida em que a concentração de SEO foi aumentada na formulação, houve aumento da citotoxicidade da membrana. O controle positivo apresentou IC 50% de 28, isto é, a solução de fenol numa diluição de 28%, provoca a morte de 50% da população celular.

Os métodos de difusão em ágar e de inibição de forma­ ção de colônias podem ser utilizados para avaliar a citotoxici­ dade “in v itro ”, das m em branas de hidrogel, pois ambos dem onstraram sensibilidade equivalente. Por estes testes concluiu-se que a adição de SEO na form ulação torna as membranas de PVP citotóxicas e que o aumento da toxicidade é proporcional à concentração de SEO na formulação.

A G R A D E C IM E N T O S • CNPq pela bolsa de estudos;

• Osi Specialties pelo fornecimento do SEO;

• Ao estudante Luciano Vieira da Costa pela assistência técnica no método de inibição da formação de colônias.

RIALA6/875 Rogero, S.O. et al. - In vitro cytotoxicity o f hydrogel membranes reticulate by ionizing radiations. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 59(1/2),1-5,2000

A BSTRA CT. Hydrogels composed by PVP, agar and PEG are used as wound dressings in the treatment o f skin ulcers. In order to im prove the m echanical properties o f the mem brane, such as tensile strength and elongation, PEG was replaced by copolym er poly (dim ethilsiloxane)-co-polyoxiethylene (SEO). The “in vitro” biocompatibility evaluation o f PVP-SEO membranes with different concentrations o f SEO was carried out in cell culture. A com parative study o f cytotoxicity assays was perform ed by two methods: 1) diffusion agar assay, using RC-IAL and NCTC Clone L-929 cells and 2) colony suppression assay, using CHO-Kj cells. In the cytotoxic evaluation o f PV P-SEO m embranes by both methods, analogous results were obtained. It was also possible to conclude that the addition o f SEO promotes cytotoxicity in PVP membranes.

KEY W ORDS. Hydrogel, cell culture, cytotoxicity, biocompatibility, polyvynilpirrolidone.

REFERÊN CIA S

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