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FACULDADE DE MEDICINA DE LISBOA
Mestrado Integrado em Medicina
2012/2013
Biologia Molecular da Célula
Módulo I.I – Biologia Molecular, Celular e do
Desenvolvi-mento Humano e Genética
João Coutinho de Almeida Milhano
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ÍNDICE
INTRODUÇÃO... 4
BLOCO 1: INTRODUÇÃO À CÉLULA ... 5
BLOCO 2: GENES, GENOMA E ENGENHARIA GENÉTICA ... 5
DNA E CROMOSSOMAS... 6 TRANSCRIÇÃO ... 8 CONTROLO DA TRANSCRIÇÃO ... 11 TRADUÇÃO ... 11 CONTROLO DA TRADUÇÃO ... 13 ENGENHARIA GENÉTICA ... 13
BLOCO 3: MEMBRANAS E COMPARTIMENTOS INTRACELULARES ... 14
PROTEÍNAS MEMBRANARES ... 14
ORGANELOS MEMBRANARES ... 15
TRANSPORTE VESICULAR ... 20
VIAS DE SECREÇÃO ... 23
BLOCO 4: A ORIGEM DA VARIAÇÃO GENÉTICA... 28
BLOCO 5: RELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO ... 28
REPLICAÇÃO DO DNA ... 28
REPARAÇÃO DO DNA ... 31
RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA ... 34
ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVEIS E VÍRUS... 35
BLOCO 6: IMUNOLOGIA ... 37
DIVERSIDADE DE VRM ... 37
DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS B ... 38
DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS T... 39
DOENÇAS ... 40
BLOCO 7: DIFERENÇAS GENÉTICAS ENTRE O HOMEM E A MULHER ... 42
MEIOSE ... 42
DIFERENÇAS GENÉTICAS ... 44
DNA MITOCONDRIAL ... 45
BLOCO 8: DOS GENES AO ORGANISMO ... 48
CONTROLO DA TRANSCRIÇÃO ... 49
PROCESSAMENTO DE MRNA TRANSCRITO ... 52
CONTROLO DA DEGRADAÇÃO DE MRNA ... 52
CONTROLO DA TRADUÇÃO ... 53
ACTIVAÇÃO DE PROTEÍNAS... 54
BLOCO 9: PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR... 55
SISTEMAS DE CONTROLO DO CICLO CELULAR... 56
FASE S ... 58
FASE M ... 60
CONTROLO DO NÚMERO E TAMANHO DAS CÉLULAS... 61
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BLOCO 10: CITOESQUELETO ... 68
MICROTÚBULOS ... 68
FILAMENTOS INTERMÉDIOS ... 71
FILAMENTOS DE ACTINA OU MICROFILAMENTOS ... 73
ANEXO A: AULAS TEÓRICO-PRÁTICAS ... 77
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 1:MOLÉCULA DE DNA E CLONAGEM MOLECULAR... 77
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 2:TECNOLOGIA DE DNARECOMBINANTE ... 77
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 3:TÉCNICA DE PCR ... 78
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 4:SEQUENCIAÇÃO DE DNA ... 79
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 5:TÉCNICAS DE DETECÇÃO DE PROTEÍNAS E ÁCIDOS NUCLEICOS... 79
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 6:ANEMIA DE FANCONI ... 79
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 7:TESTES GENÉTICOS ... 80
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 8:DIAGNÓSTICO E MONITORIZAÇÃO DO DOENTE COM HIV ... 81
ANEXO B: TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR E CELULAR ... 82
MICROSCOPIA ... 82
DIFRACÇÃO POR RAIOS-X ... 83
ELECTROFORESE ... 83
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ... 84
DETECÇÃO DE PROTEÍNAS E ÁCIDOS NUCLEICOS ... 86
TÉCNICA DO DNARECOMBINANTE (RDNA) ... 88
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INTRODUÇÃO
Antes de mais: muitos parabéns. Se estás a ler esta sebenta, é porque conseguiste entrar na melhor faculdade: a FMUL. O curso de Medicina, no primeiro ano (pelo menos, é o único do qual tenho experiência para falar), consegue ser bastante árduo. Prepara-te para o que aí vem! No entanto, posso garantir que as cadeiras difíceis, aquelas que te desafiam, aquelas cujas notas finais até querias que fossem melhores porque te esforçaste, são as mais interessantes. E, talvez por isso, eleves tanto as tuas expectativas. Primeiro conselho: dedica-te a aprender. Sim, as notas são importantes e deves tentar lutar pela melhor possível mas se no fim não te lembrares das bases, de que te serviu?
Bem, mas falemos de Biologia Molecular da Célula (vulgo BMC). Se gostaste de Biologia no 12.º ano e ao longo do secundário, fantástico. Se não, bem, prepara-te para o maior banho celular que vais apanhar… Agora a sério, BMC é das cadeiras que parecem mais fáceis ao início porque já falas-te de DNA e cromossomas. Mas não é. É muito in falas-teressan falas-te mas puxa por ti. Especialmen falas-te a Car-mo. Sim, a pessoa que vos aparecer à frente é “A” Carmo e não “O” Carmo (depois perceberás a razão deste esclarecimento). As aulas dela são muito muito boas. São, por experiência (e arrepen-dimento), das poucas teóricas às quais vale a pena assistir. Até porque (segundo conselho!) as per-guntas do exame final andam muito à volta dos pormenores que ela vai debitando nas aulas. Vão. Os slides são normalmente disponibilizados antes da aula por isso até os podem levar e apontar ao lado os pormenores dela. Ora, era aqui mesmo que queria chegar.
Esta “sebenta” não é bem uma sebenta. Ela é a transcrição de uns resumos que fiz ao estudar para o exame de BMC de 2.ª fase e que achei que poderiam dar um bom apanhado geral da maté-ria. Por isso, ela foi feita para vocês, caloiros, a levarem para as teóricas (e também teórico-práticas, já que um dos anexos é um resumo do que têm de saber das teórico-práticas) e aponta-rem ao lado os pormenores dela. Sigam este conselho. Há coisas que mudam todos os anos, nomeadamente os exemplos que a Carmo usa para explicar alguma parte da matéria e que ela depois aproveita para o exame. A sebenta está organizada por Blocos, já que é assim que a Carmo organiza as aulas dela.
Se detectarem algum erro, científico ou ortográfico, ou se tiverem alguma sugestão a fazer, contactem-me por email (joaomilhano@campus.ul.pt). Atenção, o Acordo Ortográfico não conta (sou da ‘velha guarda’).
Em termos de agradecimentos, tenho alguns a fazer. Ao Ricardo, à Cat e à Teresa: obrigado por me terem aturado neste ano de stress (meu e vosso). Vos adoro como pessoas. Ao padrinho mais nervoso, inseguro e hilariante: obrigado, João. À bibliografia que mais consultei enquanto eu pró-prio estudava: obrigado, Rafael e Raminhos (não sei se isto vos irá alguma vez chegar mas ficam aqui feitos). À principal autora do anexo sobre Técnicas de Biologia Molecular e Celular: obrigado, Catarina (minha outra metade da unidade funcional de RP). À fornecedora de apontamentos das teóricas: obrigado, Mafalda. À minha revisora científica: obrigado pela tua paciência e disponibili-dade, Catarina. Aos Mega! Estejam onde estiverem, foram a melhor turma que podia ter no primei-ro ano. Ao melhor tutor desta faculdade (sim, está ocupado e não, ele não aceita mais ninguém): obrigado por tudo, David. À melhor pessoa com quem fritar: obrigado, Rambo.
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BLOCO 1: INTRODUÇÃO À CÉLULA
BLOCO 2: GENES, GENOMA E ENGENHARIA GENÉTICA
Microscopia: surge no século XVII, com Robert Hooke. Teoria celular: postulada por Schleiden e Schwann, em 1839.
→ A célula é a unidade básica, estrutural e funcional dos seres vivos; → Todas as células provêm de células pré-existentes;
→ A célula é a unidade de hereditariedade, reprodução e desenvolvimento dos seres vivos.
Seres procariontes: seres muito simples, unicelulares, desprovidos de organelos e de membrana nuclear (não têm núcleo! É o que os identifica como procariontes!). Poderão ter uma cápsula, semelhante à parede celular, que envolve a membrana celular.
Seres eucariontes: seres cujas células apresentam núcleo individualizado, delimita-do por uma membrana nuclear. Podem ser unicelulares (como as leveduras) ou plu-ricelulares. Existem organelos que desempenham uma acção especializada.
→ Núcleo: fechado pela membrana nuclear, ou envelope nuclear, ou invólucro nuclear (bicamada lipídica que invagina sobre si própria, permitindo a forma-ção de uma membrana nuclear interna e de uma membrana nuclear externa) e contém moléculas de DNA (informação genética do indivíduo). São visíveis cromossomas durante a mitose ao MOC (microscópio óptico composto).
→ Mitocôndria: revestida por duas membranas, uma interna e uma externa, que delimitam um espaço intermembranar. A interna invagina para o interior do organelo, formando cristas mitocondriais. Contém DNA próprio (mtDNA) e con-segue replicar-se independentemente. Terá sido uma bactéria aeróbia que não sofreu heterofagia, vivendo assim em endossimbiose. É responsável pela obtenção de energia celular (produção de ATP através do catabolismo glicídico e também lipídico). Consome oxigénio e liberta dióxido de carbono.
→ Retículo endoplasmático: conjunto de cisternas achatadas, túbulos e vesículas que forma um sistema contínuo entre o invólucro nuclear e a membrana plas-mática. Existem duas formas: o rugoso (maior região de síntese de proteínas, possuindo ribossomas ligados à sua face externa/citoplasmática) e o liso (sínte-se de fosfolípidos e, sobretudo, elaboração de novas membranas).
→ Aparelho de Golgi: conjunto de todos os dictiossomas (sáculos ou cisternas achatadas na periferia das quais partem vesículas). Tem uma face convexa – Golgi cis (fase de formação), virada para o retículo, e uma face côncava – Golgi
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trans (fase de maturação), virada para a membrana plasmática. Está envolvido na síntese e secreção de diversas substâncias, como glicoproteínas e polissaca-rídeos. Importante local de modificações pós-traducionais, tornando funcionais certas proteínas, como enzimas.
→ Lisossoma: vesícula que contém vários tipos de enzimas, como as hidrolases e a β-glucocerebrosidase. Formam-se no Golgi trans e podem unir-se a vesículas endocíticas (formando um vacúolo digestivo), onde ocorre digestão (heterofa-gia). São também responsáveis pela digestão dos próprios organelos (autofa-gia).
→ Peroxissoma: vesícula com um ambiente interno propício a reacções de sínte-se/degradação de peróxido de hidrogénio (H2O2).
→ Citosol: espaço entre os organelos, preenchido por água, iões, aminoácidos, precursores de ácidos nucleicos, enzimas e proteínas.
→ Membrana plasmática: ver BLOCO 3. → Citoesqueleto: ver BLOCO 10.
DNA e Cromossomas
Reconhecimento do DNA como portador da informação genética, sendo a sua estrutura determinada por James Watson e Francis Crick (1953), pelo método da difracção por raios-X (ver ANEXO B).
DNA: macromolécula com duas longas cadeias polinucleotídicas dispostas em hélice e ligadas por pontes de hidrogénio.
Os nucleótidos são compostos azotados de oses: açúcar com cinco carbonos – pen-tose, sendo que no DNA é a desoxirribose e no RNA é a ribose; um grupo fosfato (PO43-); uma base azotada, que permite distinguir quatro tipos de dNTPs:
→ Adenina (A) → Guanina (G) → Timina (T) → Citosina (C)
A adenina e a guanina são bases púricas/purínicas/de anel duplo e a timina e a citosina são bases pirimídicas/de anel simples. Existe complementaridade de bases: emparelhamento de nucleótidos de Adenina com os de Timina (A=T) e dos nucleó-tidos de Guanina com os de Citosina (G≡C). Daí se retira a Regra de Chargaff:
A + G T + C≈ 1
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Os nucleótidos de uma mesma cadeia ligam-se entre si através de ligações fosfo-diéster, sendo estas estabelecidas entre o grupo fosfato (carbono 5’) e a pentose (grupo hidroxilo do carbono 3’), formando o sugar-phosphate backbone. Estas liga-ções conferem polaridade ao DNA, permitindo a distinção de duas extremidades: extremidade 5’ (fosfato) e extremidade 3’ (grupo hidroxilo). As cadeias são anti-paralelas (orientam-se com polaridades inversas), permitindo a formação da dupla hélice. Esta conformação é favorável visto que as bases azotadas, hidrófobas, são protegidas do contacto com a água, encontrando-se no núcleo da dupla hélice.
Gene: unidade fundamental da hereditariedade. É um segmento de DNA que codifi-ca informação que leva à produção de uma proteína (ou polipéptido ou péptido) ou RNA não codificante. Inclui regiões que antecedem e que sucedem a região codifi-cante, bem como sequência que não são traduzidas (intrões) que estão intercaladas com segmentos codificantes (exões), que se mantêm na sequência de RNA maduro e poderão ser traduzidos. Existem, no ser humano, cerca de 25.000 genes.
Genoma: sequência nucleotídica completa presente nos 24 cromossomas humanos (22 autossomas e 2 heterossomas/cromossomas sexuais). É constituído por cerca de 3,2x109 nucleótidos (cromatina), sendo que apenas 2% é composta por exões e sequências reguladoras.
Cariótipo: disposição de todos os 46 cromossomas humanos.
Cromossoma: estrutura condensada do DNA encontrando-se este associado a pro-teínas: histonas e proteínas não-histonas. O complexo de histonas (H2A, H2B, H3 e H4) é responsável pela formação dos nucleossomas, devido à sua carga positiva. As regiões que contêm genes expressos estão menos compactadas.
→ Heterocromatina: forma mais condensada da cromatina, geralmente associada aos telómeros e centrossomas. Resulta de uma modificação sobretudo na cau-da cau-da histona H3 que compacta genes que não são ou são menos expressos. A condensação é promovida, por exemplo, por histona-deacetilases (HDAC ou HD).
→ Eucromatina: forma descondensada da cromatina. Permite uma maior acessibi-lidade a proteínas e a factores de transcrição. A descondensação é promovida, por exemplo, por histona-acetiltransferases (HAT), que adicionam grupos acetil a resíduos de lisina.
No genoma humano, distinguem-se dois tipos de elementos genéticos: → Sequências únicas
Genes (intrões e exões); Sequências reguladoras.
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→ Sequências repetidas Genes duplicados; Repetições simples;
Elementos genéticos móveis (LINEs – Long-interspersed nuclear elements, SINEs – Short-interspersed nuclear elements, transposões e retro-transposões);
Elementos retrovirais.
Polimorfismo: alteração genética presente em mais de 1% da população. Distingue-se da mutação por esta Distingue-se verificar em menos de 1% da população.
SNP (single-nucleotide polymorphism): polimorfismos mais frequentes no DNA que envolvem a modificação de apenas um nucleótido. Tratam-se de substituições, sen-do que também podem tratar-se de inserções ou delecções em casos mais raros. Possuem dois alelos, sendo que podem causar alterações nas sequências de restri-ção enzimática (sequências que podem ser reconhecidas por determinadas enzimas de restrição), originando fragmentos de restrição de comprimento variável (RFLP). Alguns SNPs relacionam-se com sequências associadas a metabolismos, podendo causar respostas diferentes de pessoa para pessoa à mesma dose do mesmo fárma-co.
Transcrição
Dogma central da Biologia Molecular: quando é necessária uma proteína, a sequência de nucleótidos do DNA é copiada para sequências de RNA que irão pro-duzir, através dos ribossomas, cadeias polipeptídicas que irão originar proteínas. Isto acontece em todas as células.
Transcrição: copiar a sequência de DNA em RNA.
→ Abertura e desenrolar de uma pequena porção de DNA. → Uma das cadeias actua como molde para síntese de RNA.
→ Adição de ribonucleótidos à cadeia de RNA (RNA não se liga por pontes de hidrogénio ao DNA; à medida que os ribonucleótidos são adicionados, o RNA desliga-se e o DNA volta a enrolar).
RNA polimerase: catalisa a formação de ligações fosfodiéster que unem os ribonu-cleótidos. Move-se ao longo da cadeia de DNA, desenrolando a hélice. A união dos nucleótidos faz-se no sentido 5’→3’, utilizando energia de ribonucleótidos trifosfa-tados. Em eucariotas, existem três tipos, responsáveis pela transcrição de diferentes classes de RNA:
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→ RNA polimerase I e III: tRNA, rRNA e RNA de importância estrutural e catalítica. → RNA polimerase II: maioria dos genes da célula.
A forma como as RNA polimerase procariota e eucariota actuam é diferente: → Procariotas
Adesão pouco intensa ao DNA;
Desliza até encontrar o promotor (sequência de reconhecimento para o qual tem afinidade e que indica o ponto de partida);
Ligação do factor σ, abrindo a dupla hélice;
Escolha da cadeia-molde (liga-se às duas cadeias, sendo que fica bloqueada aquela com quem estabelece uma ligação mais forte);
Solta-se o factor σ e dá-se elongação da cadeia de RNA, por complementari-dade;
Encontra o sinal terminador: solta-se o complexo (liga-se um factor σ e pro-cura novo promotor).
→ Eucariotas
Dependente de factores de transcrição: proteínas acessórias que se reúnem ao nível do promotor (TATA box, é uma sequência constituída sobretudo por T e A, estando a montante do local de início da transcrição), posicionam a polimerase, abrem a dupla hélice, expõem a cadeia molde e activam a RNA polimerase. Ligam-se a uma proteína mediadora.
Ligação do factor TFIID: causa uma distorção no DNA que serve como local de referência para outras proteínas. Fosforila o complexo enzimático, acti-vando-o (tem actividade de cinase).
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Sequências reguladoras dispersas ao longo do DNA, separadas por mais de 100.000 nucleótidos: gene é controlado por várias sequências reguladoras. Transcrição no núcleo: maturação do pré-mRNA.
Capping – adição de uma guanina metilada à extremidade 5’ (quando a cadeia formada já tem 25 nucleótidos);
Poliadenilação – clivagem da extremidade 3’, adicionando-lhe uma cau-da poli-A;
Splicing – remoção dos intrões e aglutinação dos exões. Identificação de sequências de consenso de splicing perto dos intrões, sobretudo nas extremidades, e que são iguais em todos os intrões. Clivagem da sequência não-codificante através da reacção entre uma adenina e a extremidade 5’ do intrão, formando-se um anel que é removido e ligan-do-se as extremidades dos exões. catalisado pelo spliceossoma, consti-tuído por proteínas e snRNA (small nuclear RNA). O splicing alternativo permite produção de proteínas diferentes a partir do mesmo gene, a partir da junção de exões de várias maneiras (vários mRNA a partir do mesmo pré-mRNA). Faz-se por ligação de um repressor a sequências de consenso de splicing, que bloqueia a ligação de factores do spliceosso-ma.
Migração para o citoplasma:
Ligação de um receptor de transporte nuclear (factor de exportação); Troca do 5’ cap por um factor de iniciação da síntese proteica.
Depois de usado, o mRNA é degradado: encurtamento da cauda poli-A, remoção do 5’ cap e degradação através de nucleases.
Página 11 de 89 Controlo da Transcrição
Tradução
Tradução: descodificação da linguagem nucleica em linguagem proteica. Baseia-se no código genético, que é:
→ Universal: todos os organismos o respeitam;
→ Redundante: mesmo aminoácido é codificado por codões diferentes; → Não ambíguo: um codão codifica um e um só aminoácido.
Codão: tripleto de mRNA.
Anticodão: tripleto de tRNA, complementar ao codão. Codogene: tripleto de DNA, complementar ao codão.
tRNA: RNA de transferência. Tem uma forma de trevo tridimensional, adquirindo duas porções específicas:
→ Anticodão: três nucleótidos complementares aos do mRNA.
→ Extremidade 3’-OH: local de ligação do aminoácido ao tRNA. A reacção é catali-sada pela aminoacil-tRNA sintetase, existindo uma isoforma para cada aminoá-cido. Estabelece-se uma ligação forte, através da hidrólise de ATP.
Ribossoma: complexo proteico associado a rRNA (RNA ribossomal). É constituído por duas subunidades proteicas: menor (correspondência entre tRNA e codões de mRNA) e maior (ligações peptídicas entre os aminoácidos na cadeia polipeptídica). Cada ribossoma, responsável pela captura e posicionamento de tRNA e ligação entre aminoácidos, contém um local de ligação à molécula de mRNA e três para monitorização de tRNA:
→ Local A: ligação ao tRNA; → Local P: ligação ao aminoácido;
→ Local E: ejecção do tRNA, após ligação do aminoácido à cadeia em formação. → Ver BLOCO 8
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Etapas da tradução
→ Ligação do tRNA de iniciação (transporta metionina) à pequena subunidade do ribossoma, com factores de iniciação da tradução, no local P.
→ Ligação da pequena subunidade ao 5’ cap do mRNA. → Movimentação ao longo do mRNA, à procura do
primeiro codão AUG.
→ Dissociação dos factores de iniciação, ligando-se as duas subunidades do ribossoma.
→ Elongação: ligação de um novo tRNA ao local A; formação da ligação peptídica; avanço de três nucleótidos, à conta da hidrólise de GTP.
→ Alcança-se um codão stop (UAA, UAG, UGA) que é reconhecido por um tRNA não ligado a aminoácido. → Ligação de factores de libertação ao codão stop que
alteram a peptidil-transferase (adição de água – é necessária água!).
→ Dissociação de todo o complexo, libertando-se a cadeia polipeptídica no citosol.
Em eucariotas, dão-se alterações pós-traducionais: → Estruturais: folding das proteínas na sua estrutura
nativa, através de chaperones.
→ Modificações covalentes: fosforilações. → Ligação a co-factores
→ Associação a outras proteínas
Por cada molécula de mRNA traduzida, existem duas regiões não-traduzidas, as UTR:
→ 5’ UTR: nucleótido +1 → codão de iniciação; → 3’ UTR: codão stop → cadeia poli-A.
Diferenças para os PROCARIOTAS
→ mRNA sem 5’ cap: os ribossomas ligam-se a sequências de Shine-Dalgarno (sequências de seis nucleótidos que antecedem o codão AUG, podendo ligar-se directamente ao codão de iniciação).
→ Não necessitam de factores de iniciação.
→ mRNA policistrónico: mesma molécula de mRNA codifica vários tipos diferen-tes de proteínas.
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Polirribossoma: amplificação e economização da tradução através da leitura do mesmo mRNA por vários ribossomas.
Controlo da Tradução Engenharia Genética
→ Ver BLOCO 8
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BLOCO 3: MEMBRANAS E COMPARTIMENTOS INTRACELULARES
Membrana plasmática: bicamada fosfolipídica associada a proteínas, assumindo a sua importância como barreira fomentadora de consistência celular. Impede o extravasamento da célula e fornece-lhe forma. Em eucariontes, existem várias membranas internas que delimitam e constituem organelos celulares.
Os lípidos nas membranas (fosfolípidos) são moléculas anfipáticas visto que na mesma molécula combinam uma porção hidrofílica (contém grupos polares; estabe-lecem atracções electrostáticas ou pontes de hidrogénio com a água, dissolvendo-se nela) e uma porção hidrofóbica (grupos apolares, não estabelecendo interacções favoráveis com água). O conflito entre forças hidrofílicas e hidrofóbicas é resolvido pelo efeito entrópico, através da formação de uma dupla camada, na qual as por-ções hidrofílicas estão em contacto com a água e as hidrofóbicas estão em contacto umas com as outras (face interna da dupla camada). Na membrana, os fosfolípidos ainda se encontram ligados entre eles por forças de Van der Waals.
A membrana não é estável: as moléculas trocam de lugar na própria camada (difu-são lateral) e entre as duas camadas (flip-flop), podendo ainda ocorrer movimentos de rotação no próprio fosfolípido.
A fluidez da membrana depende de factores como temperatura, pH e composição da membrana (teor em colesterol - ↑[colesterol] = ↑ rigidez e ↓ permeabilidade).
As duas faces da bicamada apresentam conjuntos diferentes de fosfolípidos. Os novos fosfolípidos que são introduzidos na face citosólica da membrana têm de ser transferidos para a face extracelular. Esse processo é catalisado por flipases.
Proteínas membranares
As proteínas membranares desempenham importantes funções, tais como transporte de moléculas, ancoragem de moléculas à membrana, reconhecimento de sinais químicos do meio e actividade enzimática. Dependendo do tipo de membrana e função celular, o conjunto de proteínas membranares é diferente e reflecte a especialização funcional da membrana.
→ Proteínas transmembranares: atravessam a membrana de um lado ao outro (porção hidrofóbica em contacto com as porções hidrofóbicas da membrana). Podem ser α-hélices ou barris-β.
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→ Proteínas associadas a monocamada: ancoradas à superfície citosólica por uma α-hélice anfipática.
→ Proteínas ligadas a lípidos: ligadas a um dos lados da membrana através de ligações covalentes a moléculas lipídicas.
→ Proteínas associadas a proteínas: ligadas por ligações relativamente fracas (não covalentes) a outras proteínas de membrana.
Porinas: proteínas responsáveis pela formação de poros na membrana (especialmente na mitocôndria), permitindo a passagem de pequenos iões e nutrientes e prevenindo a entrada de moléculas maiores, como antibióticos e toxinas. A sua estrutura nativa é barril- β.
Córtex celular: rede de proteínas associadas a proteínas transmembranares, encontrando-se na superfície citosólica da membrana. Tem como principais funções: manutenção da forma da célula, resistência mecânica da célula, locomoção celular e impedimento da saída de determinadas proteínas através da membrana. No caso específico dos eritrócitos, o seu córtex é constituído maioritariamente por espectrinas, estando ligadas à membrana através de proteínas de ancoragem intracelulares. Uma deficiência nas espectrinas faz com que os eritrócitos apresentem forma esférica (esferocitose), sejam frágeis e surjam em pequenas quantidades (anemia, pela diminuição consequente da concentração de hemoglobina no sangue, por haver menor número de eritrócitos).
A superfície celular está revestida por glícidos, nomeadamente por glicoproteínas (proteínas associadas a oligossacarídeos), proteoglicanos (polissacarídeos associados a oligopéptidos) e glicolípidos, localizando-se na monocamada não citosólica, formando a camada glicídica. Esta camada protege a membrana de danos (mecânicos e químicos), lubrifica a célula e permite o reconhecimento e adesão por outras células. As lectinas são proteínas especializadas no reconhecimento de cadeias específicas de oligossacarídeos. São extremamente importantes em caso de resposta a infecções: os glícidos da membrana dos neutrófilos são reconhecidos por lectinas das células endoteliais próximas da infecção. O reconhecimento conduz à adesão dos neutrófilos aos vasos e à migração para o local de infecção (diapedese).
Organelos membranares
Organelos: estruturas membranares que contêm moléculas únicas e específicas para determinada função celular. A existência de uma membrana que os delimita permite a ocorrência de reacções que envolvem determinadas enzimas sem que haja interferência de outras reacções que ocorrem noutros compartimentos
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res. São eles a membrana nuclear, o retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi, a mitocôndria, os lisossomas, os peroxissomas e os endossomas.
Aquando da divisão celular, os organelos têm de ser duplicados, sendo para isso necessárias novas moléculas, como proteínas. Essas proteínas têm de ser transpor-tadas para o organelo correspondente. O sistema endomembranar recebe as pro-teínas via retículo endoplasmático, nomeadamente do rugoso. O invólucro nuclear e a mitocôndria recebem as proteínas produzidas no citosol, por importação.
À excepção de proteínas produzidas na mitocôndria (via mtDNA), a síntese proteica inicia-se no citosol, sendo depois importadas para o organelo correspondente. O local para onde a proteína se vai dirigir depende de um sorting signal na sequência de aminoácidos.
1. Transporte por Poros Nucleares
Poro nuclear: estrutura proteica larga e complexa, altamente selectiva, que trans-porta activamente macromoléculas específicas e contém locais hidrofílicos que permitem a difusão livre de água e de pequenas moléculas.
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Sinal de localização nuclear: sequência de aminoácidos que sinaliza a direcção da proteína do citosol para o núcleo. Consiste numa sequência curta de aminoácidos carregados positivamente (lisinas e argininas). A estes sinais liga-se uma proteína citosólica específica, o receptor de transporte nuclear, que ajuda a proteína a atra-vessar o poro nuclear. O transportador liga-se a sequências de aminoácidos do poro, puxando até atingir o núcleo. Aí, dissocia-se da proteína e volta a atravessar o poro em direcção ao citoplasma. Este transporte é energeticamente alimentado pela hidrólise de GTP. Uma característica importante deste tipo de transporte é o facto de a proteína ser transportada dobrada (folded) na sua conformação final.
2. Transporte para a Mitocôndria
As proteínas importadas para a mitocôndria têm a sequência sinalizadora no seu N-terminal, sendo transportadas através das duas membranas simultaneamente, em locais específicos nos quais as duas membranas estão em contacto.
Cada proteína tem de ser desdobrada (unfolded) à medida que é transportada e o seu sinal é removido depois do transporte.
Mecanismo de transporte: a sequência sinalizadora é reconhecida por um receptor na membrana externa da mitocôndria. O complexo receptor-proteína difunde-se lateralmente na membrana até um local de contacto, onde a proteína é transporta-da simultaneamente através transporta-das membranas externa e interna, por meio de um translocador. Uma peptidase cliva o sinal. As chaperones ajudam no transporte e no rearranjo da conformação tridimensional da proteína após o transporte.
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Os fosfolípidos necessários ao crescimento e homeostasia mitocondriais são trans-portados individualmente por proteínas transportadoras de lípidos, que extraem fosfolípidos da membrana do retículo endoplasmático para a membrana mitocon-drial.
3. Transporte para o Retículo Endoplasmático
Retículo endoplasmático (RE): local de entrada para proteínas destinadas a outros compartimentos celulares, exceptuando as do núcleo e as da mitocôndria, ou para a membrana plasmática e para o exterior da célula. Uma vez no lúmen do RE ou incorporadas na sua membrana, as proteínas já não saem para o citosol durante o seu percurso: são transportadas por vesículas de organelo em organelo.
Existem dois tipos de proteínas que passam do citosol para o RE:
→ Proteínas hidrossolúveis: atravessam facilmente a membrana do RE, alcançan-do o seu lúmen. Podem ser posteriormente excretadas ou integradas no inte-rior de outro organelo.
→ Futuras proteínas transmembranares: atravessam parcialmente a membrana do RE, ficando incorporadas na sua membrana. Farão parte da membrana do RE, da membrana plasmática ou da membrana de outro organelo.
A sequência sinalizadora do RE é um pequeno segmento de aminoácidos hidrofóbi-cos que também está envolvido na translocação através da membrana.
A maioria das proteínas que atravessam a membrana do RE não estão completa-mente sintetizadas, o que implica que o ribossoma se associe à membrana do RE (retículo endoplasmático rugoso). Existem, assim, dois tipos de ribossomas: asso-ciados ao lado citoplasmático do RE e livres no citoplasma.
Figura 6 – Ribossomas associados à membrana do RE e livres no citoplasma.
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SRP (signal-recognition particle): liga-se ao sinal da proteína quando esta é exposta no ribossoma e impede a continuidade da tradução. Na membrana do RE existe um receptor de SRP que irá reconhecer o SRP, o qual se desliga da sequência sinalizado-ra e abre um canal de tsinalizado-ranslocação.
Proteínas solúveis no lúmen do RE:
→ Ligação do SRP ao sinal, interrompendo a síntese proteica; → Ligação do SRP ao seu receptor;
→ Libertação do SRP, recomeçando a síntese proteica (proteína atravessa o canal de translocação rumo ao lúmen do RE);
→ Clivagem do sinal (peptidase de sinal), sendo este prontamente degradado e fechando-se o canal de translocação;
→ Assim que o C-terminal do polipéptido atravessa a membrana do RE, a proteína é libertada e dissemina-se no lúmen.
Proteínas transmembranares
→ Em proteínas transmembranares, existe uma porção que se fixa na membrana. O início da translocação destas proteínas é igual ao início das proteínas hidros-solúveis. Todavia, estas proteínas possuem uma sequência de aminoácidos hidrofóbicos, designada por stop-transfer sequence. Quando esta sequência alcança o canal de translocação, no plano da bicamada lipídica, forma uma α-hélice que ancora a proteína na membrana. Assim, o C-terminal localiza-se no lado citosólico da membrana do RE, enquanto o N-terminal fica no lado do lúmen.
→ Em proteínas cujos domínios atravessam mais do que uma vez a bicamada lipídica, existe um sinal interno, a start-transfer sequence, que é usado como
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início da translocação proteica, nunca sendo removido do polipéptido. Assim, a
start-transfer sequence inicia a translocação que continua até se atingir a
próxima stop-transfer sequence, ficando estas integradas na bicamada, onde estabelecem ligações com os lípidos (α-hélice).
Transporte vesicular
Para as proteínas atingirem os organelos, utilizam a translocação para o RE e, daí, partem para o aparelho de Golgi. Como? Por vesículas de transporte.
Via secretória principal para fora da célula: membrana do RE → lúmen do RE → aparelho de Golgi → superfície celular.
Via secretória principal para dentro da célula: membrana plasmática → endosso-mas → lisossoendosso-mas.
Cada vesícula tem de conter apenas as proteínas apropriadas ao seu destino e tem de fundir apenas com a membrana-alvo. Estes processos dependem de proteínas associadas à membrana da vesícula.
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Coated vesicles: vesículas que nascem de membranas com uma camada proteica na sua superfície citosólica. Esta camada é formada por coating proteins, como a cla-trina. Após emergirem da membrana, perdem a sua camada proteica, permitindo a interacção directa com a membrana com a qual se vão fundir.
Clatrinas: proteínas que se ligam a receptores de membrana, contribuindo para a formação de vesículas. As moléculas de clatrina associam-se em redor da superfície do organelo ou da superfície interna da célula, ligando-se aos receptores, e formam uma rede. Induzem a formação de uma curvatura que se vai afastando da membra-na. A dinamina é uma proteína que hidrolisa GTP e que, juntamente com outras proteínas, corta a ligação entre a vesícula e a membrana de origem. A vesícula per-de a sua capa per-de clatrinas e forma-se a vesícula per-de transporte. As clatrinas estão envolvidas no transporte do aparelho de Golgi para o meio extracelular e da mem-brana plasmática, numa via endocítica. No entanto, as clatrinas não têm capacidade de capturar moléculas a transportar. As adaptinas são outra classe de coating
pro-teins, que mantêm as clatrinas unidas à membrana da vesícula e que ajudam na
selecção de moléculas cargo para transporte, através da fixação do receptor. As adaptinas são específicas para cada organelo, reconhecendo apenas os receptores do organelo em que actuam.
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Depois da libertação da vesícula, esta é transportada activamente por proteínas motoras que se movimentam ao longo do citoesqueleto. Quando chega ao alvo, a vesícula tem de ser reconhecida pelo organelo. O processo de identificação depen-de das proteínas Rab, que se encontram na superfície da vesícula e que são reco-nhecidas por tethering proteins na superfície citosólica da membrana-alvo. As Rab e as tethering proteins são também únicas e específicas de cada organelo e vesícula.
SNAREs: família de proteínas transmembranares que conferem reconhecimento adicional. Assim que as tethering proteins capturam uma vesícula (através da liga-ção à Rab), as SNAREs da vesícula (v-SNARE) interagem com as SNAREs da membra-na-alvo (t-SNARE), ancorando a vesícula na membrana. Após o docking, a vesícula tem de se fundir à membrana para exportar a sua carga. As SNAREs desempenham um papel importante nesse processo: depois de emparelharem, as v-SNAREs e as t-SNARES enrolam-se uma na outra, exercendo uma força que obriga as moléculas de água a saírem do espaço de fusão (se a água ficasse no espaço, a reacção seria energeticamente desfavorável, visto haver porções hidrofóbicas envolvidas), o que favorece a fusão lipídica.
Página 23 de 89 Vias de secreção
1. Modificação covalente de proteínas no RE
Ligações dissulfito: oxidação dos pares de cisteínas das cadeias laterais. São impor-tantes para a estabilização das estruturas proteicas que vão entrar em contacto com pH baixo ou enzimas hidrolíticas quer ao abandonarem a célula quer ficando na membrana da mesma. Têm poder redutor, pelo que não podem ser formadas no citoplasma.
Glicosilação: ligação de proteínas a cadeias de oligassacarídeos, por ligação cova-lente, sendo convertidas a glicoproteínas. Este processo confere à glicoproteína várias funções, como protecção contra degradação, ancoragem ao RE para recupe-rar a sus estrutura ou transporte até ao organelo apropriado (vesícula de transpor-te). Quando estão na superfície celular, os oligossacarídeos fazem parte da camada glicídica, permitindo a distinção entre células. É um processo de maturação protei-ca.
→ Etapas da glicosilação
Proteína está a ser translocada para o lúmen do RE;
Oligossacarídeo ligado a um dolicol (lípido na membrana do RE);
Liga-se ao grupo amina de uma asparagina da proteína do lúmen
(oligosac-charide protein transferase);
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O processo termina no aparelho de Golgi, para onde a proteína migra (vesí-cula de transporte).
A acumulação de proteínas no RE induz a activação de um programa de transcrição, o UPR (unfolded protein response) que actua sobretudo quando os níveis de proteí-nas danificadas aumentam, impelindo a célula a produzir mais RE, recrutando toda a maquinaria molecular necessária para recuperar o folding apropriado e o proces-samento das proteínas.
No aparelho de Golgi, os sinais glicídicos são alterados consoante o seu destino. Por exemplo, se uma proteína tem de ir para o lisossoma, o seu sinal glicídico é alterado de forma a que, no final, seja um sinal de manose 6-fosfato.
Figura 12 – Glicosilação de proteínas no lúmen do RE.
Figura 13 – Alterações dos sinais glicídicos no aparelho de Golgi.
Página 25 de 89 2. Exocitose
Exocitose: as proteínas abandonam o Golgi trans em vesículas de transporte para a membrana plasmática, onde se fundem, permitindo o crescimento desta (essen-cialmente quando está prestes a dividir-se) e levando lípidos e proteínas essenciais à membrana.
→ Secreção constitutiva: secreção contínua em todas as células de muitas proteí-nas solúveis. Esta via fornece continuamente à membrana lípidos e proteíproteí-nas recém-sintetizados.
→ Secreção regulada: ocorre apenas em células especializadas. Proteínas específi-cas (hormonas, enzimas, muco, entre outras) produzidas no Golgi trans são acumuladas e armazenadas em vesículas. São libertadas após um estímulo pro-vocado por um sinal extracelular, que estimula a fusão à membrana.
É importante referir que o tamanho da célula não aumenta apesar do constante fornecimento de lípidos à membrana, provenientes das vesículas exocíticas. A manutenção do tamanho da membrana deve-se à remoção de porções equivalen-tes de membrana pela endocitose.
3. Endocitose
Endocitose: internalização de matéria por parte da célula, havendo formação de vesículas endocíticas.
→ Pinocitose: ingestão de fluidos e partículas pequenas, formando uma vesícula. A formação das vesículas é feita através das clatrinas, por invaginações da
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membrana celular. Depois da libertação das clatrinas, as vesículas fundem-se com endossomas. A pinocitose é realizada por todas as células.
→ Fagocitose: internalização de partículas de maiores dimensões (como micror-ganismos), formando-se fagossomas. Não existe intervenção de clatrinas, sendo um processo realizado por apenas algumas células (fagócitos ou células fagoci-tárias). O fagócito reconhece, com a ajuda de receptores, a partícula estranha, estando esta coberta por anticorpos ou proteínas do sistema de complemento1 (opsonização). Através da emissão de prolongamentos citoplasmáticos (pseu-dópodes), o fagócito engloba a partícula a partícula, formando-se uma fagos-soma que se funde com lisosfagos-somas, ocorrendo digestão intracelular.
→ Endocitose mediada por receptores: consiste numa pinocitose via vesículas revestidas por clatrinas; no entanto, é um processo com uma elevada especifi-cidade. As macromoléculas a captar ligam-se a receptores de membrana e entram na célula como complexos receptor-macromolécula. Um exemplo deste tipo de endocitose é a captura de LDL. O LDL liga-se a receptores de membrana e é internalizado em vesículas de clatrina. As vesículas perdem o seu revesti-mento e fundem-se com endossomas. No ambiente ácido do endossoma, o LDL dissocia-se do receptor. Enquanto que o LDL permanece no endossoma e avan-ça para o lisossoma (onde é degradado, libertando colesterol livre), os recepto-res são devolvidos à membrana, via vesículas de transporte, onde são recicla-dos.
Hipercolesterolémia familiar: doença autossómica dominante, caracterizada por níveis de colesterol séricos elevados (hipercolesterolémia), devido a deficiências nos receptores de LDL. Se o receptor de LDL não é normal, o colesterol acumula-se no
1 Sistema de complemento: o sistema complemento ajuda ou "complementa" a capacidade de
anticor-pos e células fagocíticas eliminarem agentes patogénicos. Faz parte do sistema imunitário inato. Consis-te num conjunto proConsis-teínas encontradas no sangue, sobretudos sinConsis-tetizadas no fígado, que normalmenConsis-te circulam sob a forma de precursores inactivos.
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sangue (por não ser internalizado), o que aumenta a colesterolémia. Assim, por não entrar colesterol, a enzima HMG-CoA redutase, envolvida na síntese de colesterol, não é inibida, continuando a síntese. Aumenta ainda mais a colesterolémia, aumen-tando o risco para aterosclerose e, consequentemente, para enfarte do miocárdio e AVC. As estatinas são fármacos anti-dislipidémicos que se ligam aos centros-activos da HMG-CoA redutase, inibindo a síntese endógena de colesterol.
Endossoma: principal local da via endocítica. Revela-se como um complexo conjun-to de tubos membranares e vesículas interligadas. O seu interior é um meio ácido, sendo este mantido por uma bomba de protões ATPase que importa H+ para o lúmen do endossoma. A acidez faz uma triagem, decidindo qual o trajecto dos receptores após a sua entrada no endossoma: voltam ao mesmo domínio da mem-brana (reciclagem), fundem noutros locais da memmem-brana (transcitose) ou dirigem-se para o lisossoma (degradação).
Lisossomas: vesículas originadas no aparelho de Golgi, contendo várias hidrolases. As enzimas hidrolíticas do lisossoma só actuam a baixo pH, o que protege a célula caso haja uma ruptura da membrana lisossomal. Apresentam transportadores na membrana para permitir a passagem do resultado da digestão. O meio ácido é man-tido, de igual forma, por uma ATPase que bombeia H+. As enzimas e proteínas importadas pelo lisossoma são marcadas com manose 6-fosfato no RE e no Golgi cis. Os sinais de manose 6-fosfato são reconhecidos à saída do Golgi trans por receptores que vão induzir a formação de vesículas que originam/se fundem com lisossomas.
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BLOCO 4: A ORIGEM DA VARIAÇÃO GENÉTICA
BLOCO 5: RELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO
Existem, no organismo humano, 1012
células humanas sendo que, em cada uma delas, existe uma cópia do genoma, constituído por 109 pB. Devido a este tamanho, é bastante provável que ocorram erros e alterações que conferem variabilidade genética às populações.
Replicação do DNA
Replicação semi-conservativa: produção de duas duplas hélices completas a partir da molécula de DNA original, sendo cada nova hélice idêntica à dupla hélice original na sequência nucleotídica (excepto em casos de erro). Cada cadeia da hélice original serve de molde a uma nova cadeia, fazendo com que cada nova dupla hélice fique com uma cadeia original e uma cadeia recém-sintetizada.
A molécula de DNA é muito estável, visto as bases azotadas das duas cadeias esta-rem unidas por pontes de hidrogénio. Para essas ligações se quebraesta-rem, seria necessário atingirem-se a elevadas temperaturas, o que seria inconcebível para a célula. O processo de replicação inicia-se então através de DNA helicases, proteínas de iniciação que quebram ligações de hidrogénio, separando as duas cadeias.
Origem de replicação: zona de separação inicial das cadeias, sendo marcada por sequências específicas de nucleótidos de adenina e timina, visto a ruptura de pon-tes de hidrogénio entre espon-tes nucleótidos ser menos dispendiosa energeticamente (mais fácil quebrar A=T do que
G≡C). Ao nível das origens de replicação, existem duas junções em forma de Y onde se dá a repli-cação propriamente dita: as for-quilhas de replicação. As forqui-lhas movem-se nos dois sentidos da origem (processo bidireccional).
Figura 17 – Origem de replicação e abertura inicial das cadeias da dupla hélice.
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DNA polimerase: enzima preponderante e central do processo de replicação do DNA, sintetizando novas cadeias utilizando uma pré-existente como molde. Catalisa a adição de nucleótidos na extremidade 3’ da nova cadeia, através da formação de ligações fosfodiéster entre o grupo OH do carbono 3’ do antigo nucleótido e o gru-po fosfato do carbono 5’ do novo (sintetiza no sentido 5’ → 3’). Impõe-se uma questão: não existindo enzima que adicione nucleótidos no sentido 3’ → 5’, o que acontece à outra cadeia?
Fragmentos de Okasaki: pequenos primers de RNA são adicionados à outra cadeia, por uma primase. A DNA polimerase liga-se a estes primers de RNA e catalisa frag-mentos de DNA (Okasaki) até atingir o primer anterior, no sentido 5’ → 3’. Uma nuclease retira depois os primers de RNA, a sequência é lida para a detecção de erros e, caso não os haja, os fragmentos de Okasaki são unidos por uma ligase.
A cadeia sintetizada continuamente é designada leading strand e necessita de ape-nas um primer. A cadeia sintetizada descontinuamente, por meio de fragmentos de Okasaki, é designada lagging strand, precisando de um primer por cada fragmento de Okasaki.
Figura 18 – Replicação do DNA. A cadeia sintetizada continuamente é a leading
strand e a sintetizada descontinuamente (por fragmentos de Okasaki) designa-se de lagging strand.
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A DNA polimerase é extremamente precisa, cometendo apenas um erro a cada 107
nucleótidos que copia. No entanto, podem ocorrer erros de ligação (como G-T e C-A) que, não sendo tão frequentes, têm de ser reparados. A DNA polimerase possui duas características que aumentam a exactidão na replicação do DNA:
→ Monitorização do emparelhamento de bases: apenas quando a complementa-ridade é bem estabelecida é que é catalisada a adição de um novo nucleótido. → Proofreading: mecanismo de correcção que ocorre ao mesmo tempo que a
sín-tese de DNA. Antes de ser adicionado um novo nucleótido, a enzima confirma se o nucleótido anterior está correcta e apropriadamente colocado. Caso não esteja, a polimerase sofre uma alteração conformacional e, através de um domínio com função de nuclease, retira o nucleótido e tenta substituí-lo por outro.
A DNA polimerase α comete muitos erros. No entanto, as DNA polimerases δ
(lag-ging strand) e ε (leading strand) realizam proofreading por comparação com
nucleótidos existentes.
Na síntese da lagging strand, o DNA necessita de vários primers de RNA que não se ligam à cadeia-molde de forma contínua (existem intervalos entre eles). À extremi-dade 3’ do primer a DNA polimerase adiciona um desoxirribonucleótido (dNTP), continuando a elongação até ao primer seguinte. Posteriormente, a nuclease que-bra as ligações entre o primer e a cadeia de DNA recém-sintetizada. O RNA é substi-tuído por DNA (polimerase de reparação) e, finalmente, a DNA ligase une o fosfato 5’ do novo fragmento de DNA ao grupo hidroxilo 3’ do fragmento seguinte.
Single-strand binding proteins: após a acção da DNA helicase, mantêm a cadeia polinucleotídica simples alongada.
Sliding clamp: mantém a cadeia molde ligada à DNA polimerase e permite o desli-zamento da polimerase, como o próprio nome indica. Na leading strand é necessá-ria apenas uma; na lagging strand é necessánecessá-ria uma por fragmento de Okasaki. A
clamp loader hidrolisa ATP cada vez que a sliding clamp se associa ao DNA..
Na lagging strand, quando a forquilha de replicação se aproxima do fim do cromos-soma, não há espaço para que se forme o primer de RNA, de modo a que se forme o último fragmento de Okasaki. Desta forma, seria de esperar a perda de uma porção do cromossoma cada vez que ocorresse replicação. Este problema é resolvido, nos eucariotas, pela existência de uma sequência específica de nucleótidos incorporada na extremidade dos cromossomas, as sequências teloméricas2. Estas sequências
2
Sequências teloméricas e não telómeros, visto que os telómeros não são apenas as sequências mas incluem também várias proteinas que lhes estão associadas.
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atraem a telomerase. Usando um molde de RNA que faz parte da própria enzima, a telomerase repõe os nucleótidos que são perdidos cada vez que o cromossoma se replica, adicionando múltiplas cópias da mesma curta sequência de DNA às extre-midades do cromossoma. Esta multi-sequência actua como molde que permite que a replicação da lagging strand fique completa. Para além disso, os telómeros são reconhecidos como as extremidades reais dos cromossomas, permitindo a distinção entre estas e as quebras da dupla cadeia acidentais a meio dos cromossomas e que devem ser reparadas. A sequência dos telómeros humanos são 2.000 repetições da sequência TTAGGG.
Reparação do DNA
Mutação: alteração permanente no DNA, podendo ter consequências severas. Uma mutação que afecte apenas um par de nucleótidos pode comprometer gravemente a homeostasia de um organismo se essa alteração ocorrer numa posição vital da sequência de DNA.
Drepanocitose/Anemia falciforme: doença que resulta de uma modificação genéti-ca no gene da beta-globina, num único nucleótido, alterando a sequência de ami-noácidos da proteína. Os eritrócitos adquirem forma de foice, sendo a hemoglobina menos solúvel e formando precipitados fibrosos, o que confere aos eritrócitos a sua forma característica. Os eritrócitos falciformes têm dificuldades na difusão de oxi-génio e são mais frágeis, lisando na corrente sanguínea. Estes pacientes terão
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tropenia, o que causa fraqueza, tonturas, cefaleias, dor e falência orgânica. A muta-ção encontra-se nas células da linha germinativa, sendo por isso hereditária, sendo uma doença autossómica recessiva.
Há assim uma necessidade de proteger as células da linha germinativa. Também as células somáticas têm de ser protegidas durante toda a vida do organismo (existe o risco de desenvolvimento de cancro).
Apesar de a maioria dos erros ser prevenida pela maquinaria de replicação durante a replicação do DNA, a célula não está totalmente isenta de erros. Esses erros têm de ser reparados antes que se tornem permanentes. É esse o papel do complexo de reparação (DNA mismatch repair), que consegue reparar 99% dos erros. Detecta os erros e remove a porção afectada, sintetizando-a de novo. É importante referir que a reparação recai sobre a cadeia recém-sintetizada; caso contrário, a alteração pro-pagar-se-ia nas replicações seguintes.
Quando se forma um erro, a geometria da dupla hélice é distorcida, sendo esta distorção reco-nhecida pelas proteínas do complexo de repa-ração, que removem parte da cadeia recém-sintetizada. O espaço (gap) formado é substituí-do pela DNA polimerase que faz proofreading à medida que sintetiza uma nova cadeia e é fechado pela DNA ligase. Os nicks, mais fre-quentes na lagging strand, são usados como sinais que permitem a distinção entre a cadeia recém-sintetizada e a antiga, por parte das
pro-Figura 20 – Reparação do DNA. Na primeira situação, não há reparação e, por isso, a mutação é transmitida á
descendência; na segunda situação, a reparação faz-se na cadeia-molde, o que também propaga a mutação; na terceira situação, a reparação faz-se na cadeia recém-sintetizada, o que repara o erro e evita a transmissão da
mutação à descendência.
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teínas do complexo. Os nicks permanecem num curto espaço de tempo após a pas-sagem da forquilha, pelo que o complexo tem de actuar rapidamente.
O mecanismo do complexo de reparação envolve três etapas: → Reconhecimento e remoção do DNA danificado (nucleases);
→ Preenchimento do gap através da complementaridade de bases (polimerase); → União dos nucleótidos (ligase).
Um tipo perigoso de dano no DNA ocorre quando ambas as cadeias da dupla hélice são afectadas, não deixando qualquer template intacto para guiar uma reparação apropriada. Estas modificações podem ser causadas por radiação ionizante, erros nas forquilhas de replicação, agentes oxidativos e metabolitos produzidos pelas células. Se estes danos não forem prontamente reparados, podem levar à fragmen-tação do cromossoma e à perda de genes quando a célula se dividir.
Nonhomologous end joining: uma nuclease provoca uma delecção de uma curta sequência de nucleótidos nas extremidades originadas pela quebra das cadeias, sendo essas posteriormente unidas por uma ligase. A delecção poderá ser aceitável porque o genoma do ser humano contém apenas uma pequena parte de genes codificantes de proteínas. No entanto, também poderá ter consequências negati-vas, dependendo do que seja afectado.
Xeroderma pigmentosum: doença causada por mutações em qualquer um dos nove genes que codificam proteínas de reparação. Assim, os organismos afectados são menos eficazes na reparação de danos provocados pela radiação UV, como os dímeros de timina. Consequentemente, desenvolvem-se lesões graves, sobretudo na pele, nomeadamente cancro devido à acumulação de mutações. Os indivíduos com Xeroderma pigmentosum têm um risco mil vezes maior de desenvolver cancro.
Página 34 de 89 Recombinação homóloga
Recombinação homóloga: pode ser usado como processo de reparação do DNA quando este se encontra quebrado, não havendo perda de material genético, usan-do o cromossoma homólogo como molde.. Este mecanismo recorre à troca de informação genética entre um par de moléculas de DNA homólogas (contêm sequências de DNA similares entre si), constituindo também uma fonte de variabili-dade genética. O processo é iniciado quando ambas as cadeias são quebradas logo após a replicação do DNA (nessa altura, as duas hélices ainda estão próximas). Para começar, a nuclease digere as extremidades 5’ a partir da região quebrada. Com a ajuda de enzimas especializadas, uma das cadeias “invade” a cadeia complementar, formando ligações entre as bases azotadas. Se houver emparelhamento extenso, forma-se um branch point onde as cadeias homólogas se cruzam. Neste ponto, a DNA polimerase promove a elongação, usando a cadeia complementar como mol-de. O branch point migra ao longo da cadeia-molmol-de. A reparação completa-se atra-vés da síntese de DNA, seguida pela ligação das cadeias reparadas. O resultado final são duas hélices de DNA intactas, onde a informação genética de uma cadeia é usa-da como molde para reparar a outra. Durante a meiose, pode ocorrer um processo de recombinação homóloga semelhante, aumentando a variabilidade genética dos gâmetas originados.
Página 35 de 89 Elementos genéticos móveis e Vírus
Transposões: elementos genéticos móveis (pequenos segmentos de DNA que se conseguem mover de uma região do genoma para outra). No genoma humano, existem dois tipos de transposões:
→ Os transposões propriamente ditos, que se movimentam através de mecanis-mos de “corte-e-costura”;
→ Retro-tranposões: movimentam-se através de um intermediário de RNA, atra-vés da transcriptase reversa.
LINE-1: família de retro-transposão mais comum no genoma humano. É convertido a RNA pela RNA polimerase, sendo o RNA transformado em cDNA pela transcriptase reversa (esta enzima é codificada pelo próprio LINE-1). Estes elementos constituem cerca de 15% de todo o genoma humano, embora muitas destas cópias sejam imó-veis devido a mutações (uma pequena parte mantém a sua capacidade de se deslo-car). O seu movimento pode resultar em doença: mudança de elementos L1 para o gene que codifica o factor VIII (factor de coagulação) causou hemofilia num indiví-duo sem história familiar nem antecedentes desta doença hereditária.
Sequência Alu: tipo de retro-transposão com cerca de um milhão de cópias no nos-so genoma. Não produzem a sua própria transcriptase reversa, estando dependen-tes da existente na célula para as ajudar a deslocarem-se.
Retrovírus: vírus de RNA que, através da transcriptase reversa contida no próprio vírus, consegue sintetizar DNA, que se pode integrar no genoma do hospedeiro. O HIV é um retrovírus.
→ Síntese de cDNA a partir de RNA viral, através da transcriptase reversa;
→ Remoção do RNA e síntese da cadeia complementar à sintetizada anteriormen-te;
→ Integração do cDNA no genoma do hospedeiro (integrase);
→ O vírus pode ficar latente durante muito tempo, passando uma cópia do geno-ma viral a células-filhas da original;
→ A transcrição activa do genoma viral, dependente do recrutamento da maqui-naria da célula hospedeira, permite a produção das proteínas virais (cápsula, transcriptase reversa e outras proteínas) e do RNA viral. Assim, é possível a replicação do retrovírus.
Quando dois elementos genéticos móveis se inserem numa molécula de DNA em locais separados, limitando, por exemplo, um exão, caso estes elementos sejam muito semelhantes entre si, o mecanismo de transposição usa as suas terminações
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que delimitam o exão para remover o transposão (em vez de usar as terminações de cada um dos elementos). Assim, é removida uma sequência de DNA que contém um exão. Esta sequência é depois inserida noutro local do genoma, alterando, pelo menos, um gene.
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BLOCO 6: IMUNOLOGIA
Origem das células do sistema imunitário num indivíduo adulto: células hemato-poiéticas da medula óssea.
→ Linfócitos B: permitem o reconhecimento do meio extracelular e são responsá-veis pela imunidade humoral, mediada por anticorpos, sendo estes secretados para a circulação quando os linfócitos B se diferenciam em plasmócitos.
→ Linfócitos T: responsáveis pela imunidade celular (reconhecem o meio intrace-lular ao reconhecer moléculas expressas por células – tumorais, infectadas por vírus, etc.).
Estas células têm o seu genoma modificado quando comparado com o do resto das células somáticas, o que afecta a sua produção de proteínas. Expressam receptores nas suas membranas plasmáticas:
→ BCR (B-cell receptor): heterodímeros constituídos por quatro cadeias (duas leves e duas pesadas). Apresentam dois locais de ligação a proteínas.
→ TCR (T-cell receptor): heterodímeros (αβ ou γδ) constituídos por duas cadeias. apresentam apenas um local de ligação a proteínas. Os linfócitos T-αβ podem ser CD4+ (células T-helper) ou CD8+ (células T-cytotoxic). Associam-se a proteí-nas CD3.
Os receptores são VRMs (Variable Region Molecules), visto possuírem um domínio variável para além de um domínio constante. É o domínio variável que confere especificidade a cada antigénio.
Paradoxo de Landsteiner: “como é que um organismo finito (ser humano tem 105
genes no genoma) consegue reconhecer uma infinidade de moléculas (existem 1012 isoformas de VRM)?”. A resposta: existe um conjunto de células que são seleciona-das por serem as mais aptas (teoria evolucionista de Darwin).
Diversidade de VRM
Recombinação somática/Rearranjo VDJ
→ A geração de proteínas VRM do sistema imunitário não corresponde à simples transcrição e tradução de genes.
→ Não herdamos dos progenitores a sequência nucleotídica que codifica os recep-tores: herdamos então o mecanismo enzimático que permite a produção de proteínas e enzimas funcionais.
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→ Três fragmentos génicos:
V: variável. Tem acoplado o promotor. D: diversidade.
J: junção. Tem acoplado o enhancer.
→ Os fragmentos localizam-se num locus específico, sendo que existem 7 loci. → Mecanismo: justaposição dos fragmentos, formando uma sequência (gene
fun-cional). Excisão de uma molécula circular de DNA com o material que não inte-ressa, sendo os fragmentos unidos por uma ligase. Dá-se apenas em células B e T, acontecendo apenas uma vez por célula. A activação da recombinação é feita por duas enzimas RAG (Recombination Activation Gene):
RAG-1: junção dos fragmentos D e J. RAG-2: junção dos fragmentos V e DJ.
→ VDJ recombinase: endonuclease que reconhece sequências de restrição especí-ficas, as RSS (Recombination Signal Sequences).
→ Obtenção de 106 isoformas diferentes de VRM.
→ Ausência de RAG funcional/ausência total de RAG: Doença de Omenn.
Inserção aleatória de nucleótidos
→ Inserção aleatória de nucleótidos nos locais de junção dos fragmentos génicos. → TdT (terminal deoxinucleotidyl transferase): introduz sequências ao acaso
entre os blocos V e J, contribuindo para a diversidade juncional. → Obtenção de 1012
isoformas diferentes de VRM.
Desenvolvimento de células B
Derivam de células hematopoiéticas estaminais, sendo diferenciadas na medula óssea.
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Hipermutação somática: alteração de nucleótidos individuais no locus da região variável. Permite a maturação e afinidade de cada imunoglobulina. Catalisada pela AID (activation-induced deaminase).
Mudança de classe: IgM é o primeiro anticorpo a ser produzido. Para se obterem as outras classes, é necessária a alteração da região constante (o efector). Catalisada também pela AID.
Desenvolvimento de células T
Células hematopoiéticas estaminais que sofrem diferenciação no timo (fígado, no feto).
Células-mãe apresentam o receptor c-Kit e IL-7 para factores de crescimento.
Figura 26 – Desenvolvimento de células B.
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Foxn1: regulador de transcrição importante para diferenciação de epitélios, nomeadamente o epitélio tímico.
Doenças
Síndrome de Omenn
→ Imunodeficiência primária, caracterizada pela ausência de RAG funcional ou ausência total de RAG.
→ Doença autossómica recessiva associada a mutações nos genes activadores da recombinação (RAGs).
→ Ausência de células B e T, devido à impossibilidade/disfunção ao nível dos rear-ranjos VDJ. Logo após o nascimento, os níveis séricos de IgG são normais visto que estes são transmitidos pela mãe (cordão umbilical e colostro).
→ Tratamento: transplante de medula óssea. Agammaglobulinémia
→ Total ausência de anticorpos com presença de células T.
→ Doença heterossómica recessiva (ligada ao X – homens têm maior prevalência) associada a mutações no gene que codifica a BTK (tirosina cinase de Bruton). A BTK é responsável por sinalizações para o interior da célula a partir do pré-BCR; assim, não se formam células B maduras (desenvolvimento estagnado em pré-B).
→ Tratamento: transfusão de anticorpos; transplante de medula com imunossu-pressão de células T já existentes (visto que reagem ao transplante, rejeitando-o).
Síndrome de híper-IgM
→ Níveis séricos de IgM acima dos normais, combinados com níveis anormalmen-te baixos ou ausenanormalmen-tes de outras classes de imunoglobulinas (IgA, IgD, IgE e IgG). → Mutação no cromossoma 12, afectando a enzima AID, tornando-a disfuncional. → A AID não consegue alterar a região constante da IgM, não havendo mudança
de classes de imunoglobulinas.
Síndrome de DiGeorge/Nude-SCID
→ Ausência de células T diferenciadas e epitélios desdiferenciados (ausência de pelos na pele – nude).
→ Mutação nonsense no nucleótido 792 no cromossoma 22, afectando o gene foxn1, que codifica um factor de transcrição essencial à diferenciação de células epiteliais, nomeadamente de células do epitélio tímico.
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→ As células do epitélio tímico (juntamente com células dendríticas e macrófagos existentes no timo) providenciam a diferenciação das células T. Ao não estar diferenciado o epitélio tímico, as células pré-T não sofrem maturação (não há apresentação de moléculas estranhas e do próprio organismo – antigénios – por parte da MHC às células pré-T).
→ Tratamento: transplante de timo (sendo este previamente colocado num meio de cultura que elimina linfócitos T existentes).
X-linked SCID
→ Ausência de células T e contagem normal de células B.
→ Mutações no cromossoma X que afectam a cadeia gama do receptor da inter-leucina-7 (IL-7).
