Utilizado quando se quer ver a composição de moléculas isoladas, de resolução superior à da microscopia electrónica. Consiste em três passos:
1) Formação de cristais da molécula em questão (por exemplo, proteínas). 2) Difracção do feixe de raio-X pela molécula.
3) Determinação da localização exacta de cada átomo, a partir do padrão de difracção.
Electroforese
Técnica com várias aplicações, que permite separar e identificar moléculas (proteí- nas, RNA e DNA).
NOTA: para realizar electroforese, é necessário um “substrato” para pôr a correr no gel. Para isso, recorre-se à preparação de homogenatos de células (“batidos de célu- las”) em que todos os constituintes se encontram em solução. Para os separar e retirar os constituintes celulares a analisar, procede-se a lises e centrifugações a velocidades diferentes consoante o material que se quer aproveitar.
Electroforese propriamente dita: colocam-se as amostras a “correr” num gel, isto é, colocam-se as amostras num gel, em poços, e, de seguida, faz-se uma corrente eléc- trica atravessar o gel. Desta forma, os vários componentes das amostras vão migrar a diferentes velocidades, dispondo-se em várias bandas, sendo que cada uma delas é constituída pelo mesmo tipo de moléculas, com o mesmo tamanho e/ou carga. Quando se analisa uma pista/lane, está a analisar-se todas as proteínas/DNA pre- sentes na amostra colocada no poço correspondente.
Factores que influenciam a velocidade da migração: → Tamanho da molécula;
→ Carga eléctrica da molécula;
→ Viscosidade do meio ([agarose] ou [poliacrilamida]); → pH;
→ Temperatura;
→ Intensidade da corrente eléctrica.
A electroforese pode ser em gel de agarose ou gel de poliacrilamida ou, ainda elec- troforese capilar. A diferença entre estes dois géis é a precisão (poliacrilamida é muito mais preciso, detectando varições de um único nucleótido).
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Na electroforese de DNA em gel de agarose é necessário corá-lo. Para tal, recorre- se a corantes fluorescentes, como o brometo de etídio (tem grupos químicos que se intercalam entre as bases de DNA, fluorescendo com mais intensidade que o coran- te livre quando iluminado com radiação UV).
Na electroforese de proteínas, podemos ter electroforese com base no ponto isoe- létrico da proteína (pH no qual a proteína não apresenta carga). Neste isoelectric
focusing, as amostras sofrem electroforese em gel de poliacrilamida, no qual está
estabelecido um gradiente de pH (conseguido com recurso a vários buffers), de tal forma que, quando se dá a passagem de corrente eléctrica, as proteínas vão migrar até alcançarem o seu ponto isoeléctrico. Podemos ter ainda o SDS-PAGE, isto é, o
SDS-polyacrilamide gel eletroforesis, em que as proteínas são sujeitas à acção de um
detergente com carga negativa (o SDS), formando complexos negativamente carre- gados entre cadeias polipeptídicas e as moléculas de SDS. De seguida, são submeti- das a uma electroforese em gel de poliacrilamida normal. Desta forma, a migração das proteínas vai traduzir o seu peso molecular.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Objectivo: obtenção de inúmeras cópias de um segmento de DNA/gene com carac- terísticas de interesse.
Baseia-se na utilização de uma DNA polimerase termoestável que irá formar uma nova cadeia, tendo como molde uma cadeia existente. O início da síntese é definido pela ligação a um primer (segmento de DNA com cerca de 23 nucleótidos, preferen- cialmente único no genoma, que se liga à extremidade 3’ de cada uma das cadeias; o forward tem a mesma sequência que a porção inicial da cadeia dada e o reverse é complementar dos nucleótidos do final da cadeia, sendo lido no sentido 5’ → 3’). Esta técnica assume particular importância visto que todas as técnicas que se baseiam na análise de DNA utilizam, numa primeira fase, a reacção de PCR visto ser necessária grande quantidade de DNA para serem obtidos resultados mais verosí- meis.
Etapas de uma PCR
1) Isolamento da sequência a copiar (por electroforese, por exemplo);
2) Colocação na preparação da sequência isolada, DNA polimerase, dNTP (nucleó- tidos livres) e dois primers (forward e reverse);
3) Elevação da temperatura a 90ºC, desnaturando a dupla cadeia de DNA em duas cadeias simples;
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4) Redução da temperatura, permitindo a hibridização/annealing dos primers por complementaridade em extremidades opostas da sequência;
5) Elevação leve da temperatura, permitindo a ligação da polimerase e o início da síntese de DNA, a partir dos primers por extensão, no sentido 5’ → 3’;
6) Promoção de ciclos sucessivos dos passos 3, 4 e 5, resultando numa amplifica- ção exponencial da sequência inicial.
Fases de uma PCR
→ 1.ª fase (crescimento exponencial): crescimento exponencial do produto amplificado (cada ciclo duplica a quantidade de produto);
→ 2.ª fase: diminuição da velocidade de reação, deixando de se poder correlacio- nar o aumento de produto com a quantidade inicial de amostra;
→ 3.ª fase (plateau): esgotamento dos reagentes, deixando de haver amplifica- ção.
Variantes de PCR
→ RT-PCR (reverse transcription PCR): análise e ampliação de fragmentos de mRNA. Os passos são iguais aos descritos para a técnica normal, havendo ape- nas uma etapa prévia: o molde é uma molécula de mRNA, tendo por isso de ser transcrito em cDNA (transcriptase reversa). Esta técnica é utilizada para dete- ção da expressão génica de células (o mRNA indica quais os genes que estão activos nessa célula).
→ Real-time PCR: produto da reacção é marcado com fluorescência, sendo anali- sado durante a fase de crescimento exponencial. Torna a quantificação da amostra inicial mais fácil uma vez que a quantidade de produto obtido é direc- tamente proporcional à quantidade de moléculas na amostra inicial.
→ PCR-RFLP (PCR restriction fragment length polymorphism): tratamento do produto com nucleases de restrição, obtendo-se fragmentos (ou não, se a sequência não tiver uma sequência de reconhecimento) mais pequenos de DNA que, por exemplo, podem ser submetidos a electroforese em gel de agarose (determinação de uma certa sequência associada a patologia).
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