Estudo imunofenotípico dos linfócitos T TCR
αβ+
CD3+ CD4- CD8- para diagnóstico de síndrome
linfoproliferativa autoimune
Fernanda Freire Coutinho
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2019
MESTRADO
ONCOLOGIA – ESPECIALIZAÇÃO EM ONCOLOGIA CLÍNICA
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ESTUDO IMUNOFENOTÍPICO DOS LINFÓCITOS T TCRαβ+ CD3+
CD4- CD8- PARA DIAGNÓSTICO DE SÍNDROME
LINFOPROLIFERATIVA AUTOIMUNE
Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Oncologia – Especialização em Oncologia Clínica submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto
Orientadora
Professora Doutora Margarida Maria de Carvalho Lima Professora Associada do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto.
Médica especialista em Imunohemoterapia, Consultora, Assistente Graduada, responsável pela Unidade de Diagnóstico Hematológico (Laboratório de Citometria e Laboratório de Genética), Serviço de Hematologia Clínica, Centro Hospitalar Universitário do Porto.
Coorientadoras
Dra. Júlia Maria Andrade Mendes de Vasconcelos
Médica especialista em Patologia Clínica, Consultora, Assistente Graduada, Serviço de Imunologia, Centro Hospitalar Universitário do Porto.
Dra. Maria Catarina Panelas Nunes Lau
Médica especialista em Imunohemoterapia, Consultora, Assistente Graduada, Laboratório de Citometria, Serviço de Hematologia Clínica, Centro Hospitalar Universitário do Porto.
“If you can’t fly, then run, if you can’t run, then walk, if you can’t walk, then crawl, but whatever you do, you have to keep moving forward.”
I
Dedicatória
II
Agradecimentos
Este trabalho foi um divisor de águas na minha vida ao adentrar um campo de atuação totalmente diferente do que eu estava habituada. Retirou-me da zona de conforto, promoveu grande amadurecimento pessoal e profissional, e não teria sido possível sem o esforço, apoio e colaboração de muitas pessoas. À todos, meu mais sincero agradecimento.
À Dra. Margarida Lima, que é imbuída do real significado da palavra “orientador”. Acolheu-me desde o início, mostrou-me o caminho a trilhar, ajudou com bibliografia, participou ativamente de cada etapa, presente e apoiadora, ao fazer, corrigir e motivar a seguir em frente. Apesar de todas as minhas dificuldades, que ainda geraram trabalho adicional, não desistiu. Nenhum agradecimento será suficiente.
Às minhas coorientadoras Dra. Júlia Vasconcelos e Dra. Catarina Lau, também presentes e apoiadoras, sempre prontas a explicar, tirar dúvidas, dar opiniões, motivar e conversar, assuntos sérios e amenidades. Principalmente no momento de maior dificuldade pessoal, a Dra. Júlia veio ao socorro. E às vezes ainda conseguia mais um artigo importante. Obrigada por poder contar convosco.
À Dra. Júlia Vasconcelos pela ajuda na identificação dos casos de ALPS com potencial para inclusão neste estudo previamente estudados no Serviço de Imunologia, e ainda pelos contatos com colegas de outros hospitais, fundamentais para a colaboração entre instituições de saúde.
À Dra. Magdalena Leander, colaboradora do Laboratório de Citometria do Serviço de Hematologia Clínica do Centro Hospitalar Universitário do Porto, que me introduziu à vida e prática no laboratório, e cujas explicações foram cruciais para que eu também pudesse executar as análises.
Aos restantes profissionais do Laboratório de Citometria do Serviço de Hematologia Clínica do Centro Hospitalar Universitário do Porto, Dra. Maria dos Anjos Teixeira, médica, e Dras. Maria Luís Queirós (farmacêutica), Marta Gonçalves (técnica superior de saúde), Marlene Santos, Sônia Fonseca, Ana Helena Santos e Lurdes Oliveira (técnicas superiores de diagnóstico e terapêutica), cujo apoio diário, auxílio e orientações também contribuíram para a execução do trabalho. Sempre me senti acolhida, bem recebida, com bom ambiente para trabalhar, além de vários agradáveis momentos de convívio.
À Dra Esmeralda Neves, diretora do Laboratório de Imunologia, e ao Dr. Jorge Coutinho, diretor do Serviço de Hematologia Clínica do Centro Hospitalar Universitário do Porto, por terem permitido a execução deste estudo nos respetivos serviços, facultando a utilização
III
das instalações e equipamentos, assim como a disponibilização das amostras excedentárias de análises clínicas de rotina de pacientes com doenças autoimunes e com doenças linfoproliferativas malignas. Agradeço também à Dra Esmeralda Neves pelo apoio e conselhos em momentos importantes.
Aos clínicos, Dr. António Marinho, Dra. Maria Esmeralda Cleto, Dra. Isabel Guerra, Dra. Emília Costa (Centro Hospitalar Universitário do Porto), Dra. Sónia Lemos (Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra - Hospital Pediátrico de Coimbra), Dra. Roswitha Bauerle (Unidade Local de Saúde do Alto Minho - Hospital de Santa Luzia, Viana do Castelo), Dr. António Figueiredo (Hospital Professor Doutor Fernando Fonseca) e Dra. Emília Faria (Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra), peças-chave para a identificação e recrutamento de doentes com ALPS, e recolha dos dados clínicos.
Aos enfermeiros que colaboraram com as colheitas de sangue, e a todos os demais que contribuíram direta ou indiretamente.
Por fim, agradeço ao meu alicerce, à minha família. Meus pais, Dora e Augusto, meus irmãos, Adriana e Lauro, que acompanharam de longe todo este caminho, dividindo as angústias, apoiando, incentivando, procurando ajudar; Luiz Paulo, meu namorado, amigo e companheiro, que esteve sempre ao meu lado, também dividindo as angústias, incentivando, consolando, ajudando e apoiando, desde acolher desabafos a dividir madrugadas insones. Amo vocês.
Muitos outros familiares e amigos também acompanharam essa trajetória, em especial minhas amigas-irmãs Fernanda e Nandi, tia Helena, tio Ailton e tia Marcia, e o apoio de cada um me deu mais força para seguir em frente.
IV
Preâmbulo
Este trabalho tem em vista a caraterização fenotípica dos linfócitos T que expressam o recetor da célula T de tipo αβ e que não expressam CD4 nem CD8, isto é, são duplamente negativos (CD4- CD8-) para auxílio no diagnóstico da Síndrome Linfoproliferativa Autoimune.
É fruto de um projeto de investigação executado no Laboratório de Citometria do Serviço de Hematologia Clínica e no Serviço de Imunologia do Centro Hospitalar Universitário do Porto, pela estudante, com a supervisão das orientadoras, entre agosto de 2017 e junho de 2018.
A sua estrutura é composta de uma introdução ao tema, seguida de breve revisão da literatura sobre a doença em causa. Logo após, apresentam-se os materiais e métodos usados no estudo e os resultados obtidos, complementados por um resumo clínico dos casos avaliados. No final, os resultados são discutidos e confrontados com os dos estudos previamente publicados, com ênfase na relevância e contributo da presente investigação para o diagnóstico desta patologia.
V
Resumo
Introdução e Objetivos: A Síndrome Linfoproliferativa Autoimune (ALPS) é uma patologia rara ligada a defeitos na apoptose pela via do FAS. Consiste em “linfoproliferação” crónica, aumento do número de células T duplamente negativas (TDN), isto é, CD4- CD8-, que expressam o recetor da célula T de tipo αβ (TCRαβ), de agora em diante designadas células TDNαβ, mutação somática no gene FAS na maioria dos doentes, associação com doenças autoimunes, principalmente citopenias, e maior risco de desenvolvimento de doença linfoproliferativa neoplásica. A etiopatogenia da doença e o mecanismo exato que conduz à acumulação das células TDNαβ nos doentes com ALPS não são ainda completamente conhecidos, no entanto há evidência de hiperatividade da via de sinalização da mTOR (mammalian target of rapamycin). O diagnóstico é estabelecido de acordo com critérios clínico-laboratoriais, sendo um critério major o aumento da fração de células TDNαβ. Este trabalho foi concebido e executado no Laboratório de Citometria do Serviço de Hematologia Clínica e no Serviço de Imunologia do Centro Hospitalar Universitário do Porto (um hospital de ensino universitário) e teve em vista uma melhor caraterização fenotípica dos linfócitos TDNαβ para auxílio no diagnóstico da ALPS.
Material e Métodos: Foram desenhadas combinações a 8 cores de anticorpos monoclonais conjugados com diferentes fluorocromos (FITC, PE, PC5.5, PC7, APC, APC-Fire750, V450, and KO or OC515), com diversas especificidades (CD3, CD4, CD8, TCRγδ, CD27, CD28, CD45R / B220, CD57, HLA-DR), com base em caraterísticas fenotípicas das células TDNαβ de doentes com ALPS descritas na literatura. Procedeu-se ao estudo, por citometria de fluxo multiparamétrica com marcação por imunofluorescência direta, de linfócitos de sangue periférico de 11 doentes com ALPS ou suspeita de ALPS (2 a 35 anos de idade), 16 indivíduos adultos saudáveis (dadores benévolos de sangue, 18 a 50 anos de idade), 16 crianças saudáveis (1 a 17 anos de idade), 15 doentes com patologias autoimunes (4 a 72 anos de idade) e 14 doentes com doença linfoproliferativa maligna (42 a 93 anos de idade).
Resultados: As proporções de células CD28+, CD45R(B220)+, CD28+ CD45R(B220)+ e CD28++CD27++ nos linfócitos TDNαβ dos doentes com diagnóstico definitivo de ALPS foram significativamente superiores às encontrada nos restantes grupos, inclusivamente no grupo com diagnóstico provável de ALPS. As proporções de células CD57+ e HLA-DR+ nos linfócitos TDNαβ+ e nos linfócitos TDNαβ+CD28+ nos doentes com diagnóstico definitivo de ALPS foram significativamente superiores às observadas nos grupos controlo saudáveis (adultos e crianças) e no grupo de doentes com patologias
VI
autoimunes, mas não diferiam significativamente das observadas nos doentes com doenças linfoproliferativas neoplásicas.
Conclusões: Apesar do tamanho pequeno da amostra, os anticorpos monoclonais selecionados permitiram não só a quantificação das células TDNαβ (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, e anti-TCRγδ), como lograram êxito em distinguir claramente o fenótipo destas células no sangue periférico dos doentes com ALPS (CD27, CD28, anti-CD45R/B220, anti-CD57 e anti-HLA-DR), especialmente os que tinham diagnóstico definitivo, dos grupos controlo. Seria interessante, posteriormente, validar estes resultados com estudos realizados em outras instituições e com maior número de indivíduos nos grupos de doentes e nos grupos controlo. Deveria também ser ponderado, no futuro, o acréscimo do perfil fenotípico dos linfócitos TDNαβ aos critérios atuais de diagnóstico de ALPS, para aumento da sensibilidade e especificidade da citometria de fluxo como exame complementar para diagnóstico desta patologia.
Palavras-chave: Citometria de fluxo, ALPS, células T alfa/beta duplamente negativas, CD27, CD28, CD45R (B220), CD57, HLA-DR.
VII
Abstract
Introduction and Objectives: Lymphoproliferative Autoimmune Syndrome (ALPS) is a rare condition related to apoptosis defect on the FAS signaling pathway. It comprises chronic “lymphoproliferation”, increased proportions of double-negative T cells (TDN) (which do not have CD4 nor CD8 molecules) that express the αβ T cell receptor (TCRαβ), hereafter designated by the abbreviation TDNαβ, somatic mutations of the FAS gene in most cases, autoimmune diseases, especially cytopenias, and increased risk of development of malignant lymphoproliferative diseases. ALPS physiopathology and the exact mechanism by which TDNαβ cells accumulate in ALPS patients are still unknown. However, there is evidence of hyperactivation of the mTOR (mammalian target of rapamycin) signaling pathway. Diagnosis is made through established clinical and laboratorial criteria, one of which is an increased proportion of TDNαβ cells in the peripheral blood. This investigation was conceived and executed at the Cytometry Laboratory of the Clinical Hematology and Immunology Services of Centro Hospitalar Universitário do Porto (a teaching university hospital in Porto, Portugal) and aimed a more precise phenotypic characterization of the TDNαβ cells to improve ALPS diagnosis. Materials and Methods: Eight color panels of monoclonal antibodies conjugated with different fluorochromes (FITC, PE, PC5.5, PC7, APC, APC-Fire750, V450, and KO or OC515) and specificities (CD3, CD4, CD8, TCRγδ, CD27, CD28, CD45R/B220, CD57, HLA-DR) were designed based on the phenotypic characteristics of the TDNαβ cells from ALPS patients that were previously described in the literature. Peripheral blood lymphocytes of 11 definitive or probable ALPS patients (2 to 35 years old), 16 healthy adults (blood donors, 18 to 50 years old), 16 healthy children (1 to 17 years old), 15 patients with autoimmune diseases (4 to 72 years old) and 14 patients with malignant lymphoproliferative diseases (42 to 93 years old) were stained using a direct immunofluorescence technique, and analyzed by multiparametric flow cytometry.
Results: The proportion of CD28+, CD45R(B220)+, CD28+CD45R(B220)+ and CD28++CD27++ in TDNαβ cells of patients with definitive diagnosis of ALPS was significantly higher than on the remaining groups, including patients with a probable diagnosis of ALPS. The proportion of CD57+ and HLA-DR+ in TDNαβ cells and in TDNαβ+CD28+ cells of patients with definitive diagnosis of ALPS was significantly higher comparatively to healthy controls (adults and children) and to patients with autoimmune diseases, but did not differ significantly from that observed in patients with malignant lymphoproliferative diseases.
VIII
Conclusions: Despite the small sample size, the selected monoclonal antibody panel allowed not only to quantify the TDNαβ cells (CD3, CD4, CD8 and anti-TCRγδ), but also to clearly distinguish the immunophenotype from the TDNαβ cells that were present in the peripheral blood from ALPS patients (CD27, CD28, anti-CD45R/B220, anti-CD57, and anti-HLA-DR), especially those with a definitive diagnosis, from the TDNαβ cells that were present in the peripheral blood from the control groups. It will be important to validate these results with studies using a larger number of patients and controls, conducted at other institutions. In the future, it would also be important to consider the phenotypic profile of the TDNαβ+ cells as an additional diagnostic criterion, complementary to the percentage of TDNαβ+ cells, in order to improve flow cytometry sensitivity and specificity as tool for ALPS diagnosis.
Key words: Flow cytometry, ALPS, double-negative alfa/beta T cells, CD27, CD28, CD45R (B220), CD57, HLA-DR.
IX LISTA DE ABREVIATURAS
αβ – alfa/beta
AIJ – Artrite idiopática juvenil
ALPS – Síndrome Linfoproliferativa Autoimune (Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome)
ALPS-FAS – ALPS com mutação do gene FAS
ALPS-sFAS – ALPS com mutação somática do gene FAS ALPS-FASL – ALPS com mutação do gene FASLG ALPS-CASP10 – ALPS com mutação do gene CASP10
ALPS-U – ALPS sem mutação documentada nos genes FAS, FASLG e CASP10 (unknown)
APC – Aloficocianina (allophycocyanin)
APC-H7 – Aloficocianina H7 (allophycocyanin H7) APO-1 – Apoptosis antigen 1
AR – Artrite reumatóide BC – Beckman Coulter
BDB – Becton Dickinson Biosciences BDH – Becton Dickinson Horizon BIOL – Biolegend
CA – Controlo adulto CASP – Caspase
CD – Unidade de diferenciação (cluster of differentiation) CHUC – Centro Hospitalar Universitário de Coimbra CHUP – Centro Hospitalar Universitário do Porto
CHVNG/E – Centro Hospitalar de Vila Nova de Gaia/Espinho CMV – Citomegalovírus
X CYT - Cytognos
DAI – Doenças autoimunes
DD – Domínio de morte (death domain) DISC – Death inducing signaling complex DK – Dako
DLP – Doenças linfoproliferativas
DMTC – Doença mista do tecido conjuntivo EBV – Vírus de Epstein-Barr (Epstein-Barr vírus)
FACS – Separação celular ativada por fluorescência (fluorescence-activated cell sorting) FADD – Domínio associado ao domínio da morte do FAS (FAS-associated death domain) FAS – Fibroblast-associated (associado ao fibroblasto), também conhecido por APO-1 ou CD95, membro 6 da superfamília dos recetores do TNF (TNFRSF6)
FASL – Ligando do FAS (FAS ligand), também conhecido por ligando do APO-1 ou CD95L, membro 6 da superfamília do TNF (TNFSF6)
FASLG – gene que codifica para o ligando do FAS
FITC – Isotiocianato de fluoresceína (fluorescein isothiocyanate) FSPM – Familiar saudável portador de mutação
γδ – gama/delta
HAS – Hospital Amadora-Sintra HLA – Human leukocyte antigen
HIV – Vírus da imunodeficiência humana (human immunodeficiency vírus) HPC – Hospital Pediátrico de Coimbra
IBM – International Business Machines IDCV – Imunodeficiência comum variável IL – Interleucina
IOT – Immunotech IST – Immunostep
XI KO – Krome Orange
LES – Lúpus eritematoso sistémico LB – Linfócitos B
LT – Linfócitos T
mFAS – FAS membranar MMF – Micofenolato de mofetil
mTOR – Alvo da rapamicina nos mamíferos (Mammalian target of rapamycin) NF-κβ – Nuclear factor kappa/beta
NK – Natural killer
OC515 – Orange cytognos 515 p75 – percentil 75
p90 – percentil 90 PC5.5 – PE-cianina 5.5 PC7 – PE-cianina 7
PE – Ficoeritrina (phycoerythrin)
PBS-BSA – Solução salina de fosfatos tamponada, com albumina sérica bovina (Phosphate Buffered Saline-Bovine Serum Albumin)
PI3κ – Phosphoinositide 3-kinase PLAD – Pre-ligand assembly domain PTI – Púrpura trombocitopénica imune SAF – Síndrome do anticorpo antifosfolipídeo sFAS – FAS solúvel
sFASL – Ligando do FAS solúvel (no plasma) (Soluble FASL) sIL-10 – Interleucina 10 solúvel (no plasma)
sIL-18 – Interleucina 18 solúvel (no plasma) SS – Síndrome de Sjögren
XII ST – Tubo de rastreio (Screening Tube) TCR – Recetor da célula T (T cell receptor) TDN – Células T duplamente negativas
TNF – Fator de necrose tumoral (tumor necrosis factor) U – Unknown
ULSAM-HVC – Unidade local de saúde do Alto Minho – Hospital de Viana do Castelo USA – United States of America (Estados Unidos da América)
V450 – Violeta 450 VB12 – Vitamina B12
XIII
SUMÁRIO
Dedicatória ... I Agradecimentos ... II Preâmbulo ... IV Resumo ... V Abstract ... VII LISTA DE ABREVIATURAS ... IX LISTA DE QUADROS, TABELAS E FIGURAS ... XVIINTRODUÇÃO ... 1
REVISÃO DA LITERATURA ... 4
Fisiopatologia ... 5
Genética ... 8
Clínica e alterações laboratoriais ...10
Células T duplamente negativas e outras populações linfocitárias ...13
Biomarcadores solúveis ...17
Histopatologia ...18
Risco de desenvolvimento de linfoma ...18
Tratamento ...19 OBJETIVOS ...21 Objetivos primários ...21 Objetivos secundários...21 MATERIAL E MÉTODOS ...22 População em estudo ...22
XIV
Recolha de dados ...24
Amostras ...25
Reagentes ...25
Painel de imunofenotipagem...25
Processamento das amostras ...27
Análise estatística ...28
RESULTADOS ...29
Caraterização sociodemográfica e clínico-laboratorial da população em estudo...29
Caraterização dos doentes com ALPS avaliados neste estudo ...32
Casos clínicos ...33 Populações linfocitárias ...38 Linfócitos totais ...38 Linfócitos T (CD3+) ...38 Linfócitos B (CD19+CD20+) ...38 Células NK (CD3-CD56+) ...39 Subpopulações de linfócitos T ...42 Linfócitos T CD4+ ...42 Linfócitos T CD8+ ...42 Razão CD4/CD8 ...43
Células T duplamente negativas (TDN) ...43
Avaliação da clonalidade dos linfócitos B ...45
Linfócitos B com expressão de cadeias leves ...45
XV
Razão kappa/lambda ...46
Caraterização das células T duplamente negativas ...47
Linfócitos T CD4-CD8- (DN) TCR-gama/delta (γδ)+ ...47
Linfócitos T CD4-CD8- (DN) TCR-alfa/beta (αβ)+ ...47
Perfil fenotípico das células T alfa/beta duplamente negativas (TDNαβ)...49
CD28 ...49
CD27 ...49
B220 ...50
CD57 ...50
HLA-DR ...52
Familiar saudável portador de mutação ...57
DISCUSSÃO ...58
CONCLUSÕES ...62
XVI LISTA DE QUADROS, TABELAS E FIGURAS
Quadro 1 Critérios para o diagnóstico de ALPS. 12 Quadro 2 Anticorpos utilizados no presente estudo para a quantificação e caraterização
imunofenotípica dos linfócitos do sangue periférico por citometria de fluxo multiparamétrica, com indicação das respetivas especificidades, fluorocromos,
clones e isotipos, assim como dos fabricantes e números de catálogo. 26 Quadro 3 Painel de imunofenotipagem utilizado no presente estudo para a quantificação
e caraterização imunofenotípica dos linfócitos do sangue periférico por citometria de fluxo multiparamétrica, com indicação dos anticorpos, fluorocromos, e combinações utilizadas nos tubos de imunofenotipagem (ST, ALPS-1 e ALPS-2) 27
Tabela 1 Caraterização sumária dos grupos ALPS 29 Tabela 2 Caraterização sumária dos grupos controlo 30 Tabela 3 Informações clínicas e laboratoriais dos casos ALPS avaliados no presente
estudo 32
Tabela 4 Linfócitos e populações linfocitárias T, B e NK nos diferentes grupos avaliados
neste estudo 41
Tabela 5 Subpopulações de linfócitos T (CD4+, CD8+ e TDN) nos diferentes grupos
avaliados neste estudo 45
Tabela 6 Populações de células T duplamente negativas, TDNαβ e TDNγδ, nos
diferentes grupos 48
Tabela 7 Perfil fenotípico das células TDNαβ+ nos diferentes grupos 56
Figura 1 Via FAS de apoptose ... 6 Figura 2 Manifestações clínicas da ALPS ...10
1 INTRODUÇÃO
A Síndrome Linfoproliferativa Autoimune (ALPS, do inglês Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome) é uma patologia rara, com incidência e prevalência desconhecidas, que tem vindo a ser diagnosticada com maior frequência devido ao aumento do seu conhecimento entre os profissionais de saúde e a uma maior disponibilidade dos meios complementares de diagnóstico (Bride & Teachey, 2017). Está relacionada com defeitos da apoptose, com consequente distúrbio na homeostasia linfocitária. O seu quadro clínico consiste em “linfoproliferação”1 crónica (duração superior
a 6 meses, por definição) em órgãos linfóides secundários, habitualmente com adenomegalias, que podem ser flutuantes, esplenomegalia e/ou hepatomegalia. Há também aumento do número de linfócitos T (LT) que expressam o recetor da célula T (TCR, T cell receptor) de tipo alfa/beta (TCRαβ) e são duplamente negativos (DN, double negative), isto é, que não apresentam expressão de CD4 nem de CD8 (TDNαβ), defeitos na apoptose mediada pela via do recetor FAS (Fibroblast-associated), e doença autoimune (DAI) (principalmente citopenias de etiologia autoimune). Outra caraterística relevante é o maior risco de desenvolvimento de doença linfoproliferativa neoplásica/maligna (DLP), com origem principalmente nos linfócitos B (LB), cuja incidência aumenta com a idade (Jack J.H. Bleesing et al., 2001; Bride & Teachey, 2017; Price et al., 2014). Estudo de Price e colaboradores (2014) identificou nestes doentes um risco para DLP aumentado em 149 vezes para linfoma de Hodgkin e 61 vezes para linfoma não-Hodgkin. O diagnóstico é estabelecido de acordo com critérios clínico-laboratoriais aceites pela comunidade médica e científica, revistos pela última vez em 2009 (J. B. Oliveira et al., 2010).
A maioria dos doentes com ALPS possui mutação germinativa heterozigótica deletéria no gene FAS, que codifica para o recetor com o mesmo nome (Jack J.H. Bleesing et al., 2001; Bride & Teachey, 2017; Price et al., 2014). Estão também descritas mutações somáticas neste mesmo gene, assim como mutações nos genes que codificam para o ligando do FAS (FASL) e para a caspase 10 (CASP10), com mais de 90 mutações patogénicas conhecidas. Alguns casos podem ter mutação em ambos os alelos, frequentemente com quadro clínico grave (Jack J.H. Bleesing et al., 2001; Bride &
1Apesar de estar estabelecida a utilização do termo linfoproliferação, que faz parte do nome atribuído à doença – Síndrome Linfoproliferativa Autoimune – conceitualmente seria mais preciso descrever como acumulação linfocitária (Jack J. H. Bleesing, Janik, & Fleisher, 2003), visto que o mecanismo preponderante demonstrado para o aumento do número de linfócitos é a redução da morte celular e não a sua proliferação. Recentemente, um estudo demonstrou linfoproliferação in vitro e sugere linfoproliferação in vitro, ainda a ser validado por outros estudos (Volkl et al., 2016). Deste modo, neste trabalho, optou-se pela utilização entre aspas deste termo, até o momento consagrado na literatura.
2
Teachey, 2017). A penetrância não é completa, com estimativas de 60% (Price et al., 2014) a 70% (Bride & Teachey, 2017).
Um dos critérios laboratoriais major para diagnóstico de ALPS é o aumento de células TDNαβ no sangue periférico. Os linfócitos TDNαβ são um subtipo muito particular de LT e representam apenas uma pequena proporção dos linfócitos totais em indivíduos saudáveis, habitualmente inferior a 1% (Jack J.H. Bleesing et al., 2001, 2002; Bride & Teachey, 2017), já que nos indivíduos saudáveis a maioria dos LT duplamente negativos expressa o TCR de tipo gama/delta (TCR-γδ) (TDNγδ, LT γδ duplamente negativos) (Bride & Teachey, 2017; Tosato et al., 2015).
O aumento de células TDNαβ foi descrito pela primeira vez em modelos murinos de doença autoimune (MRL/Mp lpr/lpr e C3H/HeJ gld/gld), e logo em seguida constatado também em doentes com ALPS, tendo sido estabelecida conexão entre as duas situações devido à similaridade clínica (Jack J.H. Bleesing et al., 2002). Estes ratinhos são modelos naturais do ALPS-FAS e ALPS-FASL (respetivamente), e suas células TDNαβ apresentam fenótipo muito parecido com o das células TDNαβ dos humanos com ALPS (Jack J. H. Bleesing, Janik, & Fleisher, 2003; Jack J.H. Bleesing et al., 2001). O mecanismo exato que provoca a acumulação de células TDNαβ em doentes com ALPS ainda não é conhecido, no entanto alguns estudos evidenciam hiperatividade da via de sinalização da mTOR (mammalian target of rapamycin), uma proteína com atividade cinase específica para a serina e a treonina (Bride & Teachey, 2017). Esta proteína coordena múltiplas funções do metabolismo celular, síntese proteica, crescimento celular, e até mesmo autofagia. A sua desregulação foi implicada na progressão de neoplasias, de diabetes e na senescência (Saxton & Sabatini, 2017). Apesar das células TDNαβ serem frequentemente analisadas como um conjunto, elas são na verdade compostas por vários subtipos de LT que podem ter funções distintas (Jack J.H. Bleesing et al., 2002). Alguns trabalhos avaliaram a presença ou ausência de certos marcadores nestas subpopulações (J. J. H. Bleesing, 2001; Jack J.H. Bleesing et al., 2002), e no estudo de Völkl e colaboradores (2016) foi identificado um perfil fenotípico que parece estar associado às células TDNαβ de doentes com ALPS.
O tratamento medicamentoso da ALPS é dirigido para o controlo das condições autoimunes associadas. Já foram utilizados vários agentes imunossupressores, além dos corticosteroides. No entanto, os melhores resultados têm sido obtidos com o micofenolato de mofetil (MMF) e principalmente com o sirolimus (Price et al., 2014), que inibe a função da mTOR (Volkl et al., 2016).
3
A esplenectomia é uma abordagem utilizada em alguns casos de citopenias graves e/ou esplenomegalia maciça, porém nos doentes com ALPS o seu resultado é inferior ao do tratamento medicamentoso, além de estar associada a um grande risco de sepsis recorrente e considerável mortalidade (Price et al., 2014).
O presente estudo foi concebido com o intuito de melhor definir o perfil fenotípico das células TDNαβ, visto que: os doentes com ALPS necessitam de seguimento diferenciado devido ao alto risco de desenvolverem linfoma; o diagnóstico correto permite estabelecer a estratégia terapêutica mais adequada, com seleção dos melhores medicamentos e evicção de tratamentos com elevado risco de morbimortalidade para estes doentes (nomeadamente a esplenectomia); a identificação de novos casos possibilita a procura de outros dentro das respetivas famílias; e os critérios fenotípicos atualmente estabelecidos para o diagnóstico não são suficientemente sensíveis nem suficientemente específicos. Espera-se que a caraterização fenotípica das células TDNαβ presentes no sangue periférico de doentes com ALPS (ou com suspeita de ALPS) e a sua comparação com as encontradas em adultos e crianças saudáveis, doentes com DLP neoplásica e doentes com patologias autoimunes, possa contribuir para melhorar a sensibilidade e especificidade do protocolo de imunofenotipagem do Laboratório de Citometria do Serviço de Hematologia Clínica do Centro Hospitalar Universitário do Porto para auxílio no diagnóstico de ALPS e diagnóstico diferencial entre ALPS e linfoma.
4 REVISÃO DA LITERATURA
O quadro clínico da Síndrome Linfoproliferativa Autoimune (ALPS, do inglês Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome) foi descrito pela primeira vez em 1967 por Canale e Smith (1967), ainda nos primórdios do conhecimento sobre os linfócitos. Mais tarde, na década de 90, foi verificado que algumas estirpes de ratinhos com mutação no gene lpr ou gld em homozigotia (MRL/Mp lpr/lpr e C3H/HeJ gld/gld) apresentavam quadro clínico de “linfoproliferação”, manifestações autoimunes e aumento dos LT, particularmente de LT CD3+ TCRαβ+ CD4-CD8-, também conhecidos como células T αβ+ duplamente negativas (TDNαβ). Pouco depois, notou-se presença de alterações semelhantes nos doentes com ALPS e foi estabelecida correlação entre as duas situações. Desde então, estes ratinhos são usados como modelos murinos de ALPS e contribuíram para um melhor entendimento da fisiopatologia e da evolução clínica desta doença ao longo do tempo (Sneller et al., 1992).
A ALPS é uma condição rara, a sua epidemiologia é incerta, e a sua incidência e prevalência são ainda desconhecidas. Por ser uma doença crónica cujas manifestações clínicas se podem confundir com as de outras patologias, existe alguma probabilidade de subdiagnóstico. Recentemente, tem vindo a ser diagnosticada com maior frequência devido ao aumento do seu conhecimento entre os profissionais de saúde e a uma maior disponibilidade dos estudos laboratoriais, nomeadamente a citometria de fluxo e os testes genéticos (Bride & Teachey, 2017). A expetativa de vida destes doentes é próxima à da população geral, conforme estudo longitudinal de Price e colaboradores (2014), que incluiu doentes com episódios de sepsis e algumas mortes por sepsis após esplenectomia, procedimento atualmente desaconselhável.
No Instituto Nacional de Saúde do Estados Unidos (NIH, National Institute of Health), um centro de referência internacional para estudo da ALPS, de entre pacientes e familiares portadores de mutação relacionada ao ALPS, 92% eram caucasianos, 3% hispânicos e 5% negros. Além disso, a relação género masculino/feminino era de 1.6 para os doentes e de 0.58 para familiares portadores de mutação no gene FAS, FASL ou CASP10, sem diferenças quanto ao género no que diz respeito à gravidade da doença ou na penetrância consoante herança materna ou paterna (Price et al., 2014).
A ALPS foi a primeira doença por defeito de apoptose a ser descrita, sendo o protótipo deste tipo de doenças (João Bosco Oliveira, 2013; Worth, Thrasher, & Gaspar, 2006). Na classificação das imunodeficiências primárias estabelecida pela União Internacional de Sociedades Imunológicas (International Union of Immunological Societies – IUIS) em 2017, encontra-se no grupo dos distúrbios de desregulação imune. O seu quadro clínico
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consiste em “linfoproliferação” crónica com atingimento de órgãos linfóides secundários, aumento das células TDNαβ, compromisso da apoptose por defeitos na via do recetor FAS, e citopenias autoimunes (Bride & Teachey, 2017; Canale & Smith, 1967; Price et al., 2014; Sneller et al., 1992; Worth et al., 2006).
A apoptose é um importante mecanismo para a manutenção da homeostasia linfocitária. O desenvolvimento da ALPS está associado a prejuízo nesta função, favorecendo caraterísticas como: “linfoproliferação” crónica, com adenomegalias, esplenomegalia e/ou hepatomegalia; desregulação imunológica com surgimento de doença autoimune, principalmente citopenias; menor depuração dos linfócitos, consequentemente com maior propensão para erros genéticos e maior risco de desenvolvimento de DLP neoplásica/maligna (principalmente da linhagem B), que aumenta com a idade dos doentes (Jack J.H. Bleesing et al., 2001; Bride & Teachey, 2017; Price et al., 2014). A apoptose pela via do FAS é induzida após contato dos LT com os antigénios para os quais são específicos. Este contato provoca ativação das células e promove a expressão do recetor FAS na membrana celular (Jack J.H. Bleesing et al., 2001).
Fisiopatologia
Sabe-se que as mutações nos genes FAS, FASLG e CASP10, com alteração de função da via de sinalização para apoptose, estão relacionadas com a fisiopatologia da doença. O aumento das células TDNαβ é outro componente essencial desta fisiopatologia, sendo bastante significativo nos doentes, porém pouco aumentado ou normal nos familiares saudáveis portadores de mutação (Price et al., 2014; Volkl et al., 2016).
O recetor FAS, também conhecido como APO-1 (apoptosis antigen 1) ou CD95, é o membro número 6 da superfamília de recetores do fator de necrose tumoral (TNFRSF6, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 6). Tem estrutura homotrimérica e é ativado pela ligação com seu correspondente, o ligando do FAS (FASL, FAS Ligand), membro número 6 da superfamília do fator de necrose tumoral (TNFSF6, tumor necrosis factor superfamily, member 6), o que desencadeia uma das vias que levam à apoptose celular (Price et al., 2014; Worth et al., 2006).
O FASL possui uma forma ligada à membrana celular (m-FASL) e outra forma solúvel (s-FASL), também homotrimérica, que surge a partir da clivagem da forma membranar por diversas metaloproteinases. Parecem existir diferenças entre os compostos solúveis, provavelmente devido a clivagem em pontos distintos pelas enzimas responsáveis, o que pode ter impacto em sua atividade. Tanto a forma m-FASL quanto a forma s-FASL são capazes de ativar o recetor FAS. Entretanto, o m-FASL ativa a apoptose enquanto a
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maioria dos compostos s-FASL é capaz de ativar apenas vias não-apoptóticas, relacionadas a PI3K e NF-Kβ. Este fenómeno parece estar relacionado com a conformação e agregação dos ligandos, que condicionam funções diferentes para a mesma molécula, porém de maneira ainda pouco esclarecida. Todo o mecanismo também pode ser modulado consoante as quimiocinas presentes no meio (Le Gallo, Poissonnier, Blanco, & Legembre, 2017, p. 95).
Após ativação da via apoptótica, o domínio de morte (DD, death domain) do FAS, localizado na porção intracelular do recetor, liga-se a um complexo de proteínas adaptadoras (FADD, FAS-associated protein with death domain). Este passo ativa uma cascata de sinalização que envolve as caspases – uma família de proteases com um resíduo de cisteína, capazes de clivar outras proteínas após um resíduo de ácido aspártico –, e outras moléculas sinalizadoras, culminando com a apoptose dos LT (Price et al., 2014) (Figura 1).
Figura 1 Via FAS de apoptose
Esquema explicativo da via de sinalização para apoptose do recetor FAS (2006, Worth): O FASL (ligando do recetor FAS), solúvel ou membranar, liga-se ao recetor FAS (fibroblast-associated) na superfície da membrana celular. A ativação deste recetor acarreta modificações conformacionais que permitem o acoplamento das proteínas adaptadoras (FADD, FAS-associated death domain) ao domínio de morte celular (DD, death domain), na porção terminal do recetor FAS. Em seguida, as pró-caspases 8 e/ou 10 ligam-se às FADD e formam o complexo proteico DISC (death-inducing signalling complex), responsável pelo início da sinalização intracelular. Após a formação do DISC, as pró-caspases 8 e 10 sofrem auto-catálise e dão origem às caspases 8 e 10, que em seguida promovem catálise das pró-caspases 3 e/ou 7, com formação das caspases 3 e/ou 7. As últimas são caspases efetoras, que promovem os processos necessários para a apoptose e amplificam a resposta.
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Ao contrário da via apoptótica, as vias não-apoptóticas promovem ativação celular, migração e inflamação. A sua estimulação leva à formação de um complexo de proteínas sem FADD, com recrutamento de recetores com atividade de cinase das tirosinas, e aciona as cinases da família Src, um grupo de proteínas com importante função ativadora. Estas caraterísticas determinam funções pró-inflamatórias. Sua desregulação tem papel na fisiopatologia de outras doenças, como o Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) e diversas neoplasias. A ativação de ambas as vias de sinalização através do recetor FAS é necessária para o correto funcionamento da resposta imune (Le Gallo et al., 2017).
O mecanismo que provoca a acumulação das células TDNαβ ainda não é plenamente conhecido, no entanto alguns estudos evidenciam hiperatividade da via mTOR (Bride & Teachey, 2017). Esta enzima é uma proteína-cinase da serina/treonina relacionada à PI3K-Akt, e o centro de grande rede reguladora do crescimento celular a partir de sinais exteriores (Saxton & Sabatini, 2017). A hiperatividade desta via de sinalização como causa da proliferação anormal das células TDNαβ é corroborada por estudos em modelo animal através de terapia dirigida com inibidor do mTOR – sirolimus. Para além disso, os resultados de ensaios clínicos em humanos tratados com este medicamento são similares aos obtidos nos modelos animais, com redução da “linfoproliferação” das células TDNαβ, sem grande impacto nas linhagens normais, e com redução dos marcadores típicos da doença. Não foram observados os mesmos efeitos com o micofenolato de mofetil, outro imunossupressor utilizado com sucesso no tratamento da ALPS (Bride & Teachey, 2017; Volkl et al., 2016).
A ativação sustentada da mTOR leva à diferenciação terminal das células, com redução proliferativa e prejuízo na formação de memória, resultando no fenótipo TEMRA (célula T de memória, efetora e com diferenciação terminal). Na ALPS, a ativação sustentada da mTOR parece estar desvinculada do programa de diferenciação destas células. A redução ou ausência de sinalização de apoptose pelo FAS pode promover maior força de sinalização através do TCR, o que afeta a ativação inicial das células T, levando à sobrevivência inapropriada da célula pelo defeito de apoptose (Volkl et al., 2016).
Völkl e colaboradores (2016) demonstraram maior atividade basal e induzida por ativação da mTOR e outras proteínas-cinases da mesma via nas células TDNαβ, entretanto não se verificou o mesmo nos outros subtipos de linfócitos ou nos controlos. A atividade proliferativa das células TDNαβ foi dependente da co- estimulação através do CD28, que é um potente ativador da via PI3K-Akt-mTOR. Esta via regula a proliferação celular, entre outras ações, e sua inibição com sirolimus reduz a taxa proliferativa especificamente
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desta população. Não está claro ainda se a hiperatividade da mTOR é a condição inicial que leva ao desenvolvimento da ALPS, ou se é um fator que permite a manutenção do processo fisiopatológico. No entanto, os ensaios laboratoriais sugerem dependência de fatores externos para perpetuação deste estado de hiperatividade (Volkl et al., 2016). Price e colaboradores (2014) identificaram importante redução da apoptose linfocitária in vitro pela via do FAS nos doentes e familiares saudáveis portadores de mutação, em comparação com os familiares saudáveis sem mutação. Os familiares saudáveis portadores de mutação apresentavam alteração funcional considerável, apenas um pouco menos marcante do que a alteração vista nos doentes.
É desconhecido o mecanismo que leva ao desenvolvimento das citopenias autoimunes, mas é provável que seja devido à desregulação imune desencadeada pelas células TDNαβ, possivelmente através da produção de IL-10 e FASL (Price et al., 2014).
Além disso, Bleesing e colaboradores (2001) demonstraram redução da população de células T CD4+CD25+, provavelmente do subtipo de células T reguladoras, o que poderia acarretar redução na regulação da atividade linfocitária, resultando em maior proliferação dos linfócitos, redução da morte de células ativadas e, adicionalmente, maior risco de desenvolvimento de doença autoimune. Este mecanismo não é consensual já que Völkl e colaboradores (2016) não observaram redução de células T reguladoras FOXP3+ nos doentes com ALPS, nem aumento das mesmas após o uso de sirolimus.
Genética
Nos humanos, o gene que codifica para o recetor FAS está localizado no braço longo do cromossoma 10, região 10q24.1, e contém 9 exões, sendo que os exões 1 a 5 correspondem à porção extracelular do recetor, o exão 6 dá origem ao domínio transmembranar e os exões 7 a 9 codificam a porção intracelular, sendo o exão 9 responsável pela síntese do DD (Jack J.H. Bleesing et al., 2001; Price et al., 2014). A maioria dos doentes portadores de ALPS com alteração genética identificada tem mutações germinativas heterozigóticas deletérias no gene do FAS, observadas em cerca de 70% dos casos (Jack J.H. Bleesing et al., 2001; Bride & Teachey, 2017; Price et al., 2014), e descritas pela primeira vez em 1995 (Magerus-Chatinet et al., 2009). Há também casos de ALPS que resultam de mutações somáticas no gene do FAS (cerca de 10% dos casos), e, mais raramente, de mutações nos genes do FASLG ou da CASP10 (< 1% cada), com mais de 90 mutações patológicas distintas descritas. Habitualmente, a herança tem padrão autossómico dominante, com mutação em heterozigotia. Entretanto, alguns casos podem ter mutação em ambos os alelos, frequentemente com quadro
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clínico mais grave (Jack J.H. Bleesing et al., 2001; Bride & Teachey, 2017). A penetrância não é completa, com estimativas de 60% (Price et al., 2014) a 70% (Bride & Teachey, 2017) tanto em estudos de “coorte” apenas com doentes com mutação no gene FAS, quanto em “coortes” de doentes portadores de mutação em qualquer um dos genes relacionados ao ALPS. Há também um grupo de doentes classificados como ALPS com mutação desconhecida (U, unknown), por apresentarem o quadro clínico da doença, preencherem os critérios de diagnóstico, mas não terem mutação identificada nos genes até o momento relacionados à ALPS (J. J. H. Bleesing, 2001; Jack J.H. Bleesing et al., 2001).
Mutações no gene do FAS localizadas nas zonas que codificam para as porções transmembranar ou intracelular do recetor FAS têm maior penetrância (J. J. H. Bleesing, 2001; Price et al., 2014) e maior gravidade clínica, pois mantêm integro o PLAD (pre-ligand assembly domains – domínio de junção pré-(pre-ligando) (Figura 1). Este é o domínio responsável pela ligação entre as cadeias do FAS, que resulta na estrutura homotrimérica funcional do recetor, permitindo a ligação de cadeias defeituosas às normais. Logo, há formação de muitos recetores não-funcionais, o que provoca um efeito dominante negativo. Alterações referentes à porção extracelular da proteína levam à haploinsuficiência do gene. Têm menor penetrância e menor gravidade clínica já que, apesar da formação de um número menor de recetores, estes são funcionalmente preservados. A maioria das mutações que ocorrem do exão 6 em diante promove a perda do DD, visto que acarretam interrupção prematura ou mudança na grelha de leitura do gene (Price et al., 2014).
No estudo de Price e colaboradores (2014), 21% dos doentes apresentavam defeitos correspondentes à porção extracelular do recetor, enquanto que em 73% dos casos os defeitos eram intracelulares, e em 6% ocorriam na porção transmembranar; uma pequena percentagem correspondia a mutações germinativas de novo. Apesar do tipo de mutação interferir na penetrância da doença, esta não modifica o perfil fenotípico apresentado pelos doentes (J. J. H. Bleesing, 2001).
A presença de mutações em genes relacionados com a ALPS acarreta prejuízo funcional in vitro da apoptose FAS-dependente, com diferentes graus de comprometimento. No entanto, não há correlação entre magnitude do defeito e presença de doença, a sua gravidade ou a fração de células TDNαβ (Price et al., 2014). Familiares saudáveis portadores de mutação apresentam habitualmente um grau de comprometimento funcional in vitro similar ao encontrado nos seus familiares com ALPS (J. J. H. Bleesing, 2001; Price et al., 2014), ao contrário dos familiares saudáveis sem mutação, que
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apresentam função da via FAS semelhante aos controlos saudáveis não relacionados (J. J. H. Bleesing, 2001). Isto leva a crer que, apesar da clara relação causa-efeito entre comprometimento deste mecanismo e desenvolvimento de ALPS, o defeito isolado não é suficiente para causar a doença (J. J. H. Bleesing, 2001; Bride & Teachey, 2017; Price et al., 2014). Um facto que reforça a necessidade de um segundo fator para o desenvolvimento da doença é que apenas algumas estirpes específicas de ratinhos desenvolvem o quadro clínico quando portadoras das mutações. Além disso, a doença murina tem diferenças clínicas para a ALPS, o que também pode ser justificado pelas diferenças genéticas entre espécies (Martina, Noel, Saxena, Rabb, & Hamad, 2014; Sneller et al., 1992; Worth et al., 2006). Algumas possíveis explicações para as diferenças de penetrância e apresentação clínica são: presença de outra alteração genética ou variante do normal que propicie o desenvolvimento da doença; ausência de algum fator protetor; aquisição de mutação somática no alelo saudável; e/ou interferência de fatores ambientais.
Clínica e alterações laboratoriais
O espetro da ALPS inclui manifestações autoimunes, linfoproliferativas e alterações laboratoriais típicas (Figura 2).
Figura 2 Manifestações clínicas da ALPS
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A apresentação clínica típica da ALPS é de uma criança com “linfoproliferação”, manifestada por adenomegalias e/ou esplenomegalia, e com citopenias, que podem estar presentes no início do quadro ou surgir posteriormente, bom desenvolvimento estato-ponderal e psicomotor, sem infeções graves ou de repetição, sem infeções oportunistas, e sem outros sinais e sintomas (Bride & Teachey, 2017). A “linfoproliferação” é crónica (duração superior a 6 meses) e não tem causa conhecida (exclusão de causas infeciosas e doenças malignas), com adenomegalias, esplenomegalia e/ou hepatomegalia, que podem ser maciças, que podem flutuar ao longo do tempo, e que têm tendência a melhorar ou desaparecer na idade adulta. As citopenias autoimunes são frequentes, recorrentes, com diferentes gravidades, e podem estar presentes em mais de uma linha celular. Há aumento do número total de LT e de LB na maioria dos doentes, mas este aumento é muito mais pronunciado nas células TDNαβ (Volkl et al., 2016), marcador obrigatório da doença, e a presença de hipergamaglobulinemia policlonal é comum (J. J. H. Bleesing, 2001; Jack J.H. Bleesing et al., 2001; João Bosco Oliveira, 2013; Price et al., 2014). A apoptose dos linfócitos é deficiente pela via de sinalização do FAS, em virtude da existência de mutações patogénicas nos genes FAS, FASL ou CASP10. Os níveis séricos de alguns mediadores, como o FASL solúvel (sFASL), a IL-10 e a IL-18 estão frequentemente aumentados, assim como os níveis séricos de vitamina B12 (VB12) (Bride & Teachey, 2017; João Bosco Oliveira, 2013; Price et al., 2014). Existe, com frequência, história familiar de DLP (benigna ou maligna) e/ou de doença autoimune (João Bosco Oliveira, 2013; Worth et al., 2006).
O espetro da doença varia desde apresentação neonatal, com alterações surgidas durante o desenvolvimento intrauterino e maior gravidade, até quadros frustres de início na vida adulta, com “linfoproliferação” discreta ou alterações laboratoriais praticamente sem expressão clínica (Bride & Teachey, 2017).
O diagnóstico de ALPS é estabelecido de acordo com critérios clínico-laboratoriais, revistos em 2009, e descritos no Quadro 1. O diagnóstico definitivo estabelece-se com a presença dos critérios obrigatórios e um critério acessório primário. O diagnóstico provável baseia-se na presença dos critérios obrigatórios mais um critério acessório secundário (J. B. Oliveira et al., 2010).
12 Quadro 1 Critérios para o diagnóstico de ALPS.
Obrigatórios
1. Adenopatias e/ou esplenomegalia crónica (> 6 meses), não malignas, não infeciosas
2. Aumento da fração de células T TCRαβ+ CD4-CD8- (≥1.5% dos linfócitos totais ou 2.5% dos linfócitos T) com contagem de linfócitos normal ou elevada
Acessórios
Primários
1. Defeito de apoptose dos linfócitos pela via do FAS (demonstrado em dois ensaios independentes) 2. Mutação patogénica somática ou germinativa nos genes FAS, FASL ou CASP10
Secundários
1. Aumento de níveis plasmáticos de FASL (> 200 pg/ml) OU interleucina-10 (> 20 pg/ml) OU vitamina B12 (> 1.500 ng/L) OU interleucina-18 (> 500 pg/ml)
2. Achados histopatológicos típicos identificados por patologista experiente
3. Citopenias autoimunes (anemia hemolítica, trombocitopenia ou neutropenia) E hipergamaglobulinemia policlonal
4. História familiar de “linfoproliferação” não maligna e não infeciosa, com ou sem autoimunidade Observações: Para diagnóstico definitivo de ALPS são necessários ambos os critérios obrigatórios e pelo menos um critério acessório primário. Para diagnóstico provável de ALPS são necessários ambos os critérios obrigatórios e pelo menos um critério acessório secundário. Fonte: (J. B. Oliveira et al., 2010)
Apesar da atualização dos critérios, baseada na evolução do conhecimento sobre esta patologia, este meio de diagnóstico ainda não possui boa especificidade, pois as alterações são comuns a patologias diversas.
A “linfoproliferação” crónica pode ser causada por diversos agentes patogénicos, como o vírus da imunodeficiência humana (HIV, Human Immunodeficiency Virus), o vírus de Epstein Barr (EBV, Epstein Barr Virus), citomegalovírus (CMV) e o vírus linfotrópico para linfócito T humano (HTLV-1 e 2, Human T lymphotropic virus 1 e 2) (Sneller et al., 1992). Além disso, existem outras síndromes linfoproliferativas hereditárias já conhecidas e com o passar do tempo tem havido a descrição de novas. Algumas têm defeito de apoptose em genes e/ou vias diferentes, outras têm mecanismos fisiopatológicos totalmente distintos. Com a evolução na investigação sobre esta via de sinalização e seus componentes, e o avanço na sequenciação genómica e exómica, têm vindo a ser descobertas muitas síndromes linfoproliferativas com autoimunidade (denominadas ALPS-like) (Bride & Teachey, 2017; João Bosco Oliveira, 2013). Finalmente, a “linfoproliferação” crónica pode ser devido a doença linfoproliferativa neoplásica / maligna (João Bosco Oliveira, 2013).
Sabe-se que o aumento das células TDN pode surgir associado a outras doenças (Price et al., 2014), como doença autoimune sistémicas – Lúpus Eritematoso Sistémico (LES), Doença Mista do Tecido Conjuntivo (DMTC), Artrite Idiopática Juvenil (AIJ), entre outras
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(Bride & Teachey, 2017) –, mas o conhecimento sobre a fisiologia e patologia deste subtipo celular ainda é limitado, conforme se descreve adiante. O aumento dos marcadores bioquímicos também não é específico e pode acontecer em outras patologias, apesar de aparentemente ser um acontecimento incomum, como a VB12 e FASL na Síndrome de Evans e na Imunodeficiência Comum Variável (IDCV). Estas doenças possuem sobreposição de manifestações clínicas com ALPS, são diagnósticos
diferenciais e podem estar associadas à ALPS (Bride & Teachey, 2017). A classificação genética da ALPS baseia-se na mutação correspondente – ALPS-FAS,
ALPS-sFAS (FAS somático), ALPS-FASL, ALPS-CASP10 – e ALPS-U, para casos indeterminados, ou seja, sem identificação de mutação nos genes relacionados ao ALPS conhecidos até o momento (J. B. Oliveira et al., 2010). Muitos doentes que haviam sido classificados como ALPS-U, e que frequentemente apresentam quadros atípicos, foram posteriormente diagnosticados com síndromes ALPS-like, que possuem grande sobreposição de quadro clínico com a ALPS típica (Bride & Teachey, 2017; João Bosco Oliveira, 2013).
Células T duplamente negativas e outras populações linfocitárias
As células TDNαβ foram descobertas em modelos murinos de doença autoimune (MRL/Mp lpr/lpr e C3H/HeJ gld/gld), sendo em seguida identificadas em doentes com ALPS e estabelecida ligação entre a similaridade fisiopatológica de ambas situações (Jack J.H. Bleesing et al., 2002; Sneller et al., 1992). Inicialmente foram interpretadas como células alteradas, pois eram estudadas apenas em contexto de doença, mas hoje sabe-se que elas estão presentes no sangue periférico de pessoas saudáveis (Jack J.H. Bleesing et al., 2001).
Estas células TDNαβ são um subtipo celular muito particular e representam apenas uma pequena proporção dos linfócitos totais, habitualmente < 1% (Jack J.H. Bleesing et al., 2001, 2002; Bride & Teachey, 2017). Por muito tempo foram vistas como sem importância e sua baixa frequência dificulta o seu estudo (Sneller et al., 1992).
Apesar de habitualmente analisadas em conjunto, estudos apontam para que esta subpopulação seja na verdade composta por vários subtipos com funções distintas, alguns inclusive com ação imunorreguladora (Jack J.H. Bleesing et al., 2002; Juvet & Zhang, 2012; Martina et al., 2014).
As suas funções têm vindo a ser estudadas, sendo atribuídos a estas células a produção de grande quantidade de interleucina 17 (IL-17) (Martina et al., 2014), atividade citolítica,
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função no controlo de infeções intracelulares (Chapman, Chapman, & Michael, 2015) e ação reguladora da atividade linfocitária (Juvet & Zhang, 2012).
A ontogenia das células TDNαβ ainda é desconhecida. Algumas hipóteses em discussão são: origem tímica, antes do estadio de diferenciação em células duplamente positivas; origem tímica, após estadio de células duplamente positivas, com posterior reversão; origem extra tímica; conversão de células T maduras na periferia (Chapman et al., 2015; Juvet & Zhang, 2012; Martina et al., 2014).
As células TDNαβ e as células TDNγδ possuem ação na manutenção da gestação e os esteróides sexuais têm papel na sua liberação tímica, portanto parece existir influência hormonal na produção destas células (Chapman et al., 2015). Também é possível que exista mais de uma via ontogénica. Além disso, a acumulação patológica destas células pode permitir a descoberta de estadios de maturação linfocitária e/ou outras vias de diferenciação não identificados previamente (Jack J.H. Bleesing et al., 2002).
O compromisso na função de diferentes vias de indução da apoptose leva à acumulação de outros subtipos de linfócitos que não as células TDNαβ, embora de forma menos expressiva (Martina et al., 2014).
Bleesing e colaboradores (2001) descreveram, em várias famílias de doentes (ALPS-FAS, ALPS-CASP10 e ALPS-U), um perfil fenotípico com aumento das populações de LT (CD3+) CD8+, TDNαβ, TDNγδ, LT CD8+CD57+, LT CD8+HLA-DR+, TDNαβ HLA-DR+; aumento de LB (CD20+) e de LB CD5+; redução de LT CD4+CD25+; valores normais de LT CD4+ e de células NK. A relação LT CD25+ / LT HLA-DR+ foi inferior a 1 em todos os doentes e bastante superior a 1 nos indivíduos saudáveis. As alterações eram independentes da idade (sem grupo controlo pareado por idade) ou da evolução no tempo. Também foi observado um maior coeficiente de variação da intensidade de fluorescência de CD4+ nos doentes com ALPS, em contraste com um estreito coeficiente de variação nos controlos, correlacionado ao percentual de células TDNαβ. Em outro estudo, Bleesing e colaboradores (2001) apontaram que os marcadores expressos pelas células TDN condizem com um padrão de ativação celular.
Mesmo nos familiares sem mutação, foi identificado ligeiro aumento das populações de LT, LT CD8+, LB CD5+, TDNαβ e TDNγδ, comparando com os controlos saudáveis não relacionados, o que corrobora a hipótese da existência de fatores modificadores necessários para o desenvolvimento da doença. Estas alterações são independentes da partilha ou não do mesmo ambiente – provavelmente devido a variantes genéticas (J. J. H. Bleesing, 2001).
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Em estudo seguinte, Bleesing e colaboradores (2002) analisaram um grande painel de marcadores, em que destacamos alguns com expressão diferente nas células TDNαβ de doentes com ALPS comparativamente aos controlos: presença de CD11b, CD27, CD28, B220, CD57, HLA-DR e CD45RA, porém sem expressão de CD45RO, CTLA-4 e CD40L. É referida a presença de uma população muito maior de células TDNαβ B220+CD27+ nos doentes, porém o painel de imunofenotipagem utilizado não está explicitado.
Os estudos realizados por Bleesing e colaboradores evidenciaram que as células TDNαβ dos doentes com ALPS expressam de maneira consistente uma isoforma do CD45, designada CD45R, também conhecida por B220 (Jack J. H. Bleesing et al., 2003; Jack J.H. Bleesing et al., 2001). Este é um marcador murino de LB, fortemente expresso nas células TDNαβ dos ratinhos MRL/Mp lpr/lpr e C3H/HeJ gld/gld, modelos naturais do ALPS-FAS e ALPS-FASL, identificado com boa especificidade pelo anticorpo monoclonal RA3-6B2 (Jack J. H. Bleesing et al., 2003; Jack J.H. Bleesing et al., 2001). As células TDNαβ destes ratinhos são similares, do ponto de vista fenotípico, às dos doentes com ALPS (Jack J.H. Bleesing et al., 2001, 2002). Estudos em humanos sugerem que a expressão de B220 está relacionada com a ativação dos LT e com o processo de apoptose, sendo observada, ainda que em menor grau, também em controlos saudáveis. Alguns resultados também sugerem ligação entre a isoforma B220 e ativação de via de sinalização ligada à sobrevivência celular (Jack J. H. Bleesing et al., 2003). Na ALPS, este marcador está presente nas células TDNαβ (de maneira consistente), em subtipos de LT CD4+ e de LT CD8+, além de subtipos das células TDNαβ de controlos (Jack J.H. Bleesing et al., 2002).
Também foi demonstrado que o aumento da população de células TDNαβ dos doentes com ALPS coincidia com maior expressão do marcador B220 nesta população. A positividade compreendeu a maioria das células, ao contrário dos controlos, que tinham uma população de células TDNαβ muito inferior e com pequena parcela da mesma positiva para o B220, mostrando-se um marcador com boa sensibilidade e boa especificidade para diagnóstico de ALPS. Não houve qualquer correlação entre o nível de expressão deste marcador e o grau de comprometimento da apoptose via FAS, avaliada por estudos in vitro. É possível que haja ligandos específicos para a isoforma B220 do recetor CD45, porém estes são desconhecidos. Além disso, a expressão comum de B220 nas células TDNαβ de doentes com ALPS e de ratinhos lpr e gld sugerem que sua fisiopatologia pode ser igual ou semelhante (Jack J.H. Bleesing et al., 2001). Tanto quanto é do nosso conhecimento, o valor deste marcador para diagnóstico de ALPS não foi avaliado por outros grupos e não existem outros estudos publicados a este respeito em data posterior a 2003.
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Em estudo recente, Völkl e colaboradores (2016) identificaram um padrão fenotípico presente em grande parte das células TDNαβ de doentes com ALPS. Este fenótipo apresenta caraterísticas mistas de células T de memória efetoras com diferenciação terminal (CCR7-/CD45RA+/CD127-/CD57+) e de células de memória de longa duração (KLRG-/CD27+/CD28+). Adicionalmente, este subtipo de células apresentava maior sinalização através da proteína m TOR, possuía HLA-DR+, confirmando seu perfil de ativação, expressão de Ki67, Ciclina A e PCNA (proliferating cell nuclear antigen), consistente com alta taxa proliferativa.
As células TDNαβ mostraram-se resistentes à estimulação in vitro em diversos estudos, com baixa taxa de proliferação e produção reduzida de IL-2 e interferão-γ (IFN-γ) (Martina et al., 2014; Sneller et al., 1992), o que foi corroborado por Völkl e colaboradores (2016) utilizando a estimulação habitual (IL-2, IL-7, IL-15, anti-CD3 ou fitohemaglutinina). Entretanto, após estimulação com anti-CD3/CD28 ou com células dendríticas alogénicas, a resposta proliferativa foi intensa, sugerindo que pode haver um componente de linfoproliferação na ALPS. Este padrão fenotípico foi também observado em subtipo de LT CD4+ e de LT CD8+, o que coloca a possibilidade destas células serem precursoras das células TDNαβ dos doentes com ALPS (Volkl et al., 2016). Völkl e colaboradores (2016) demonstraram ainda que tanto as células TDNαβ dos doentes com ALPS quanto seus potenciais precursores T CD4+ e T CD8+ apresentavam redução da atividade proliferativa e aumento de apoptose à exposição ao sirolimus (inibidor da mTOR), in vitro e in vivo.
Outra caraterística das células TDNαβ é possuírem alterações de glicosilação de recetores de membrana, o que interfere com sua mobilização e organização na superfície celular, e pode ter impacto nas vias de sinalização (Jack J.H. Bleesing et al., 2002). Apresentam, ainda, um repertório restrito de famílias de regiões variáveis da cadeia beta do TCR, com expansões de caráter oligoclonal (Bristeau-Leprince et al., 2008).
A expansão de células TDNαβ raramente está presente em outras patologias (Jack J.H. Bleesing et al., 2002). Além disso, Price e colaboradores (2014) observaram que o aumento da contagem destas células nos doentes com ALPS foi substancialmente maior do que em outras condições em que este fenômeno também pode ocorrer. Valores de células TDN acima dos 3% dos linfócitos totais ou 5% dos LT são raramente identificados em outros contextos que não a ALPS (J. B. Oliveira et al., 2010).
Apesar de haver alguma descrição de marcadores presentes (ou ausentes) nas células TDNαβ, definindo várias subpopulações destas células, para efeitos de diagnóstico de ALPS, elas têm sido consideradas como uma única população. Apenas recentemente um
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fenótipo de células TDNαβ patológicas na ALPS começou a ser caraterizado e valorizado.
Biomarcadores solúveis
Alguns marcadores séricos mostraram-se úteis para o diagnóstico presuntivo. Podem ser auxiliares antes da deteção de mutação, em situações em que os estudos genéticos não estão disponíveis, ou nos casos indeterminados, onde não é identificada mutação em doente com quadro clínico sugestivo de ALPS.
Existe correlação entre o aumento da VB12 sérica e “linfoproliferação”, assim como dos níveis séricos de FASL e de IL-10, que se encontram frequente e persistentemente aumentados em doentes com ALPS (João Bosco Oliveira, 2013; Price et al., 2014). A hipergamaglobulinemia policlonal também é achado comum nestes casos. Além destas alterações, outras menos frequentemente identificadas são: monocitose, eosinofilia, teste de Coombs direto positivo, fator reumatóide positivo, baixos níveis de anticorpos antinucleares e anti-cardiolipina (Jack J.H. Bleesing et al., 2001; Price et al., 2014). Também foi identificado aumento consistente de CD27 no soro dos doentes, que parece ser outro marcador bastante sensível, no entanto ainda com especificidade desconhecida (Jack J.H. Bleesing et al., 2002).
Magerus-Chatinet e colaboradores (2009) demonstraram aumento de sFASL, IL-10 e células TDN em uma “coorte” de doentes com ALPS. Observaram ainda elevação moderada nos doentes com síndrome ALPS-like e em parte dos familiares saudáveis portadores de mutação. Price e colaboradores (2014) viram o aumento destes marcadores também nos familiares sem mutação, bem como da VB12 e das imunoglobulinas. Völkl e colaboradores (2016) demonstraram não só o elevado nível sérico de IL-10 nestes doentes, como produção de grandes quantidades de IL-10 pelas células TDNαβ, que foi revertido sob uso de sirolimus. Para além disso, o estudo de Magerus-Chatinet e colaboradores (2009) evidenciou redução evolutiva destes biomarcadores nos doentes após tratamento com outros agentes imunossupressores (sem utilização de sirolimus), no entanto, sem normalização.
A utilização combinada destes marcadores mostrou-se mais sensível do que a avaliação in vitro da apoptose via FAS – cujo procedimento é muito laborioso e não está estandardizado – e apresentou boa especificidade para doentes com ALPS (Magerus-Chatinet et al., 2009).
Apesar de auxiliarem no diagnóstico, estas alterações não são específicas de ALPS. Pode haver aumento de s-FASL em neoplasias, como cancro de mama, de pâncreas,
