Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Avaliação do Impacto do uso de um Biofertilizante, Ergofito, em
Plantas de Castanheiro (Castanea sativa Mill.) Sujeitas a Stresses
Biótico e Abiótico
Dissertação de Mestrado em Engenharia Agronómica
Ana Matilde de Andrade Mota Magalhães
Orientadora: Professora Doutora Teresa Pinto Coorientadora: Professora Doutora Maria do Rosário Anjos
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Avaliação do Impacto do uso de um Biofertilizante, Ergofito, em
Plantas de Castanheiro (Castanea sativa Mill.) Sujeitas a Stresses
Biótico e Abiótico
Dissertação de Mestrado em Engenharia Agronómica
Ana Matilde de Andrade Mota Magalhães
Orientadora: Professora Doutora Teresa Pinto Coorientadora: Professora Doutora Maria do Rosário Anjos
Composição do Júri:
_____________________________________ _____________________________________ _____________________________________
“As doutrinas apresentadas neste trabalho são da exclusiva responsabilidade do seu autor.”
“Nós somos o que fazemos. O que não se faz não existe. Portanto, só existimos nos dias em que fazemos. Nos dias em que não fazemos apenas duramos.” Padre António Vieira
v
Agradecimentos
A realização desta dissertação de mestrado contou com importantes apoios e incentivos, sem os quais não seria possível concretizar este trabalho e aos quais manifesto, deste modo, a minha eterna gratidão.
À Professora Doutora Teresa Pinto, expresso o meu profundo agradecimento, pela orientação, pelo apoio e disponibilidade incondicionais, pela partilha do saber e pelas preciosas contribuições para o trabalho. Acima de tudo, obrigada por aceitar trabalhar comigo e por me acompanhar dedicadamente ao longo desta jornada.
À Professora Doutora Rosário Anjos, o meu sincero agradecimento pela coorientação deste projeto. Pelo profissionalismo, pelo apoio e pela total disponibilidade que sempre revelou para comigo. Todos estes aspetos foram determinantes para a elaboração deste trabalho.
Ao Professor Doutor José Gomes Laranjo, pela simpatia, pela disposição na colaboração e pelo interesse neste trabalho.
Ao Professor Doutor Luís Martins, pela consideração e disponibilidade. Pelos conhecimentos que me transmitiu e pela disponibilização de materiais e meios necessários na realização de uma componente deste trabalho.
À Mestre Helena Ferreira, pela disponibilidade e pelo auxílio no laboratório, e pelos conhecimentos que me transmitiu.
À Andreia Carvalho e ao Tiago Marques, pelo companheirismo e interajuda. Aos meus amigos, pelo apoio incondicional que demonstraram ao longo de todo o processo, preenchendo o tempo com sorrisos e boa disposição, mesmo nos momentos menos bons.
E especialmente à minha família, pelo exemplo, pelo encorajamento e pela compreensão essenciais e de indiscutível importância para a minha pessoa.
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Resumo
As alterações climáticas são uma realidade comprovada, consideradas, uma das mais sérias ameaças ambientais a nível global, com fortes impactos nos ecossistemas. Previsões atuais apontam para verões cada vez mais quentes e secos. Temperaturas elevadas são apontadas como fatores abióticos desestabilizadores do normal crescimento do castanheiro, induzindo perda de vigor da planta e consequentemente elevada suscetibilidade a agentes patogénicos. A vasta área de distribuição do castanheiro quer em Portugal quer na Europa, a sua importância económica, social, cultural e paisagística, impõem encontrar respostas para esta problemática. A utilização de biofertilizantes em culturas que não a do castanheiro, no sentido de tornar as plantas mais resistentes a condições abióticas menos favoráveis, assim como a ataques de pragas e doenças, tem vindo a ser descrita como benéfica.
Este estudo integra-se no âmbito do projeto Avaliação do impacto do uso do
Ergofito® em castanheiro, que oferece a oportunidade de indagar a ação deste biofertilizante em plantas envasadas (1) na mitigação dos efeitos provocados por stresse térmico e o grau de recuperação destes quando o regime térmico se tornou adequado para o seu desenvolvimento, e (2) na resistência destas plantas à doença da tinta e cancro do castanheiro, em condições ótimas de desenvolvimento e quando sujeitas a stresse térmico, constituindo estes os objetivos do trabalho. Foram avaliados parâmetros relativos a trocas gasosas, bioquímica foliar, teste OJIP e teste de resistência às doenças da tinta e cancro do castanheiro.
O estudo revelou uma ação positiva do Ergofito® no que respeita a parâmeros fisiológicos, uma vez que a produtividade fotossintética apresenta uma maior eficiência nas plantas tratadas ao longo do ensaio, tendo-se observado maior eficiência na gestão da água por parte deste grupo de plantas. Também os resultados relativos aos pigmentos fotossintéticos, nomeadamente os teores em clorofila a, permitiram concluir que as plantas tratadas recuperam mais facilmente do período de stresse térmico. Os parâmetros bioquímicos foliares estudados revelaram maior necessidade das plantas controlo produzirem compostos metabólicos protetores contra agentes abióticos, nomeadamente compostos fenólicos, indicando maior suscetibilidade a temperaturas extremas. O estudo do índice de vitalidade permitiu verificar melhor recuperação do estado fisiológico das plantas tratadas depois de otimizada a temperatura, o que vem confirmar que os resultados encontrados quer nos parâmetros relativos às trocas gasosas, quer nos parâmetros
viii bioquímicos, refletindo igualmente os benefícios da utilização do biofertilizante
Ergofito®.
A avaliação da resistência realizada para as doenças da tinta e cancro do castanheiro revelou que o biofertilizante teve uma ação retardadora e até impeditiva da entrada dos agentes patogénicos nas plantas quando estas se encontravam numa temperatura ótima para o seu desenvolvimento, mas principalmente quando tinham sido sujeitas a temperatura extrema.
Palavras-chave: Castanea sativa, alterações climáticas, biofertilizante, Ergofito®, doença da tinta, cancro do castanheiro.
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Abstract
Climate change is a proven reality, considered one of the greatest threats the world is facing, with serious impacts on ecosystems. High temperatures are indicated as abiotic factors that destabilize the regular growth of the chestnut tree, by inducing loss of vigor of the plant and consequently high sustainability to pathogens. Due to the great area extent that the chestnut tree occupies in Portugal and in Europe, as well as the great economical, social and landscaping importance, it becomes crucial to find answers to such problem. The use of biofertilizers in crops other than the chestnut tree has been described as beneficial as it makes plants more resistant to less favorable abiotic conditions, pest and disease attacks,.
This study takes part in a project entitled evaluation of the impact of the use of
Ergofito® in chestnut trees. Through it we had the opportunity to investigate the action of
this biofertilizer on potted plants (1) in the mitigation of the effects caused by thermal stress and the degree of recovery of the plants when the thermal regime became proper for its development, and (2) in the resistance of these plants to ink disease and chestnut cancer, under the most favorable conditions for the development of its pathogen. These two points are the goals of our study. Parameters related to gas exchange, foliar biochemistry, OJIP test and resistance test to the diseases of the ink and chestnut cancer were evaluated.
The study revealed a positive action of Ergofito® in physiological parameters, since the photosynthetic productivity presents a better efficiency in the plants treated with Ergofito® during the study, as it was observed a more efficient water management by this group of plants. The results concerning the photosynthetic pigments, namely the chlorophyll a content, allowed to conclude that the treated plants recovered more easily from the thermal stress period. The study of foliar biochemical parameters showed a bigger need for control plants to produce protective metabolic compounds against abiotic agents, such as phenolic compounds, indicating higher susceptibility to extreme temperatures.
The study of the vitality index showed a better recovery of the physiological state in treated plants after the temperature being optimized, which confirms that the results found in the parameters related to the gas exchanges as well as the ones found in the biochemical parameters both reflect the benefits of using the Ergofito® biofertilizer.
x The evaluation of resistance to ink diseases and chestnut blight revealed that the biofertilizer caused a delayed and even preventive action to the entrance of pathogenic agents in the plans when they were in a optimized development temperature, especially when they had been exposed to a period of extreme temperature previously.
Key words: Castanea sativa, climate change, biofertilizer, Ergofito®, ink disease, Chestnut blight.
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Índice
Introdução ... 2 1.1 Objetivos do estudo ... 10 Material e Métodos ... 13 2.1. Material vegetal ... 13 2.2. Instalação do ensaio ... 13 2.3. Trocas gasosas ... 16 2.4. Bioquímica foliar ... 17 2.4.1. Pigmentos fotossintéticos ... 17 2.4.2. Compostos fenólicos ... 18 2.4.3. Açúcares solúveis ... 18 2.4.4. Amido ... 19 2.4.5. Proteínas solúveis ... 19 2.5. Teste OJIP ... 202.6. Testes de resistência à doença da tinta e do cancro ... 21
2.7. Análise estatística ... 22 Resultados e Discussão ... 24 3.1. Trocas gasosas ... 24 3.2. Bioquímica foliar ... 26 3.2.1. Pigmentos fotossintéticos ... 27 3.2.2. Parâmetros bioquímicos ... 29 3.3. Teste OJIP ... 32 3.4. Teste de resistência ... 34
3.4.1. Doença da tinta - Phytophthora cinnanoni Rands ... 34
3.4.2. Cancro do castanheiro - Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr ... 37
Conclusões ... 41
xii
Índice de figuras
Figura 1- Exemplo de um souto.. ... 2
Figura 2 - Distribuição geográfica da Castanea sativa Mill. em Portugal continental. ... 3
Figura 3 - Castanheiro afetado pela doença da tinta... 7
Figura 4- Castanheiro afetado pelo cancro. ... 8
Figura 5 - Banco de germoplasma do castanheiro da UTAD. ... 13
Figura 6- Resumo das ações implementadas para instalação do ensaio. ... 13
Figura 7 – Instalação do ensaio: Sementeira das castanhas. ... 14
Figura 8 - Castanheiros em vasos após quatro meses de germinação. ... 15
Figura 9 – Resumo da calendarização e das ações a implantar no estudo. ... 16
Figura 10 – Testes de resistência à doença da tinta e do cancro. ... 22
Figura 11 - Percentagem (%) de discos foliares infetados pela doença da tinta no Tempo 1 (T1). ... 34
Figura 12 - Evolução da infeção pela doença da tinta em discos de plantas tratadas com Ergofito® (A) e plantas controlo (B). ... 35
Figura 13 - Percentagem (%) de discos foliares infetados pela doença da tinta no tempo 3 (T3). ... 36
Figura 14 - Percentagem (%) de discos foliares infetados pela doença do cancro do castanheiro no Tempo 1 (T1). ... 38
Figura 15 - Percentagem (%) de discos foliares infetados pela doença do cancro do castanheiro no Tempo 3 (T3)... 39
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Índice de tabelas
Tabela 1. Composição nutricional da castanha ... 4 Tabela 2. Teores médios e respetivo erro padrão relativos às trocas gasosas foliares: taxa fotossintética (A, µmol CO2.m-2.s-1); taxa de transpiração (E, mmol H2O.m-2.s-1);
condutância estomática (gs, mmol.m-2.s-1) e eficiência do uso de água (WUE, µmol CO 2. mmolH2O-1). ... 24 Tabela 3. Teores médios e respetivo erro padrão em pigmentos clorofilinos: Clorofila a; Clorofila b (Clb mg.dm-2); Clorofila total (Cltot, mg.dm-2); Carotenoides (Car, mg.dm-2). 28 Tabela 4. Teores médios e respetivo erro padrão dos parâmetros bioquímicos: Compostos fenólicos (mg.g-1); Açúcares solúveis (mg.g-1); Amido (mg.g-1); Proteínas solúveis(mg.g-1).30
Tabela 5. Teores médios e respetivo erro padrão em fluorescência: Eficiência quântica máxima do fotossistema II (Fv/Fm); Fluorescência inicial (F0, mg.dm-2); Fluorescência
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Introdução
O género Castanea, para além do castanheiro europeu, Castanea sativa Miller, inclui treze espécies oriundas de diversos pontos do mundo. Entre elas contam-se cinco espécies asiáticas, sete espécies americanas e apenas uma espécie nativa da Europa. Esta espécie, pertencente à família das Fagaceas (Figura 1), é considerada a única espécie nativa na Europa, com uma distribuição preferencial por todo o sul mediterrânico, onde assume uma importância económica relevante (González et al., 2011). Trata-se assim de uma árvore diretamente associada à atividade humana. A facilidade de cultivo e maneio, assim como os múltiplos usos associados a esta espécie, fazem dela uma das mais importantes da história e do tempo (Dinis et al., 2011).
Figura 1- Exemplo de um souto. (Fonte:http://gazetadabeira.pt/agricultura-ed-663/).
A área de distribuição natural do castanheiro europeu estende-se desde o Cáucaso até a Turquia e à Grécia e dos Balcãs até à Itália, França, Espanha, Portugal e Sul da Inglaterra (Marinoni et al., 2003). De acordo com Costa e colaboradores (2011), esta espécie abrange atualmente uma área total de 2,53 milhões de hectares dos quais dois milhões são florestas de castanheiro, sendo os restantes 0,53 milhões de hectares dedicados à produção de frutos (20,9% da área total de castanheiro). O cultivo do
3 castanheiro foi generalizado nas zonas rurais e montanhosas até meados do século XX. A produção de castanha na Europa diminuiu consideravelmente durante o século passado para as atuais 200 000 t, quase 300 milhões de euros, (Costa et al., 2011). Este declínio surgiu principalmente devido a alterações socioeconómicas e ao despovoamento das montanhas, bem como à propagação de doenças como o cancro do castanheiro (Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr), doença da tinta (Phytophthora cambivora (Petri) Buis. e Phytophthora cinnamomi Rand.) (Boccacci et al., 2004) e mais recentemente ao inseto Dryocosmus kuriphilus Yasumatsu.
Em Portugal, o castanheiro encontra-se enraizado na cultura e história agrícola do país. A principal região portuguesa produtora de castanha situa-se em Trás-os-Montes, nordeste de Portugal, que compreende cerca de 85% da área de soutos do país (Figura 2). Nessa região, denominada de Terra Fria, os castanheiros estão instalados entre os 500 e os 1100 m acima do nível do mar. Maioritariamente os soutos mais recentes encontram-se a altitudes mais elevadas relativamente aos soutos mais antigos, encontrando-encontram-se estes em zonas de altitude inferior associadas a regiões mais quentes (Dinis et al., 2011).
Figura 2 - Distribuição geográfica da Castanea sativa Mill. em Portugal continental. (Fonte: http://flora-on.pt/index.php#/wid3092.).
4 A castanha integrava a dieta mediterrânica como alimento fundamental no sustento das populações. A introdução da batata importada, na época dos descobrimentos, no regime alimentar diminuiu a popularidade da castanha, embora algum interesse tenha prevalecido ao longo do tempo (Barreira, 2010; Soares, 2011). A castanha é assim um alimento nutracêutico que para além do amido, o componente energético principal, contém açúcares livres, proteínas com um bom perfil de aminoácidos, lípidos com ácidos gordos mono e polinsaturados, fibras, vitaminas e minerais (Borges et al., 2008) (Tabela 1). As qualidades nutritivas deste fruto, a par de uma recente e diversificada inclusão na gastronomia, têm motivado a sua procura e aliciado a exploração pela indústria alimentar.
Tabela 1. Composição nutricional da castanha (Silva et al., 2007).
Atualmente, Portugal é um importante produtor de castanha na Europa (Gomes-Laranjo et al., 2005; Dinis et al., 2011). Segundo o Instituto Nacional de Estatística (INE, 2016), 60 000 ha era a área de soutos em Portugal no início do Séc. XX, tendo-se observado um decréscimo para cerca de 15 000 ha nos anos 80. Esta situação tem vindo a ser revertida com as novas plantações, sendo atualmente a área de souto em Portugal de
Componentes Castanha Por 100g Água (g) 53 Proteína (g) 3 Aminoácidos (mg) 189 Teor em gordura (g) 1,5 Açúcares (g) 5 Amido (g) 29 Fibra (g) 6,4 K (mg) 439 Fe (mg) 1,2 Minerais totais (mg) 369 Ácidos orgânicos (mg) 760 Compostos fenólicos (mg) 165
5 cerca de 35 000 ha, que, no entanto, não se reflete na produção que tem diminuído, tendo sido em 2016 de 26 000 t.
As alterações climáticas são, atualmente, consideradas, uma das mais sérias ameaças ambientais a nível global, com fortes impactos nos ecossistemas, na qualidade da água, na saúde humana e nas atividades económicas. Esta é uma realidade a que ninguém pode ficar alheio. Diversos estudos preveem alterações na distribuição espacial e temporal de variáveis e parâmetros meteorológicos. Em particular, esperam-se condições mais severas durante a primavera e o verão, especialmente na região mediterrânica, com uma taxa de precipitação inferior e temperaturas mais elevadas (Calheiros et al., 2012).
Todos os modelos, em todos os cenários, preveem um aumento significativo da temperatura média em todas as regiões de Portugal até ao fim do século XXI. No Continente são estimados aumentos da temperatura máxima no verão entre 3 ºC na zona costeira e 7ºC no interior, acompanhados por um grande incremento da frequência e intensidade de ondas de calor. Relativamente à precipitação, a incerteza do clima futuro é substancialmente maior. No entanto, quase todos os modelos preveem uma redução da precipitação em Portugal Continental durante a primavera, verão e outono, que podem atingir valores de 20 a 40% da precipitação anual (Tomé, 2007). Deste modo, as alterações climáticas terão impacto em todos os ecossistemas e limites ecológicos integrantes. As florestas em particular são consideradas ecossistemas vulneráveis a todo este processo devido à natureza de longo prazo dos seus componentes estruturais principais (Pautasso, 2013), afetando assim o setor agroflorestal em geral, e em particular a produção de frutos e de madeira de castanheiros na Europa (Calheiros et al., 2012).
A informação é escassa relativamente à tolerância térmica do ciclo vegetativo das cultivares de castanheiros, particularmente durante o período de verão em Trás-os-Montes, onde as temperaturas atingem facilmente os 30 ºC (Gomes-Laranjo et al., 2005). Em árvores adultas, a atividade fotossintética atinge o máximo de produtividade aos 24º-28 ºC, mas exibem termo-inibição quando a temperatura do ar ultrapassa os 32 ºC, o que frequentemente acontece durante o verão (Pereira et al., 2011). As condições adversas durante este período, baixa disponibilidade de água no solo e temperaturas elevadas, são referidas como fatores abióticos desestabilizadores do normal crescimento dos castanheiros, induzindo a perda de vigor da planta e consequentemente induzindo a suscetibilidade a agentes patogénicos (Gomes-Laranjo et al., 2005).
6 A fotossíntese é a base do crescimento e da produção da planta. Segundo Pan et
al., (2017) este processo é responsável por mais de 90% da biomassa vegetal. É
influenciado por fatores abióticos (luz, temperatura, concentração de CO2, água, fertilidade do solo, etc.) e também por fatores intrínsecos à própria planta, como sejam a morfologia, a estrutura e idade da folha, entre outros (Proietti et al., 2000). É reconhecido o facto de que a fotossíntese é um dos processos da planta mais sensíveis à oscilação da temperatura (Yamori et al, 2014; Wise et al, 2004). Como sendo um processo biofísico e bioquímico, a fotossíntese é dependente da temperatura, em que temperaturas elevadas são um dos fatores mais importantes e que mais afetam a capacidade de produção dos tecidos fotossintéticos e as funções específicas dos vários intervenientes no processo fotossintético (Gomes-Laranjo et al., 2005).
Compreender e explorar o mecanismo subjacente à potenciação de um incremento da fotossíntese é essencial para aumentar o rendimento das culturas (Long et al., 2015) em geral e do castanheiro em particular. Torna-se importante, tanto para a agricultura, como para o ambiente, entender os processos fisiológicos da fotossíntese subjacentes à temperatura, a par da sua aclimatação, tendo em consideração a realidade climática com a qual nos temos vindo a deparar (Yamori et al, 2014).
As temperaturas elevadas induzem alterações na respiração e fotossíntese e isto leva à diminuição da vitalidade, longevidade e produtividade da planta (Wise et al, 2004; Barnabás et al, 2008). Os primeiros sintomas deste stresse compreendem alterações estruturais e funcionais ao nível dos cloroplastos e uma redução da atividade enzimática, além de causar lesões na membrana celular, na organização dos microtúbulos e, por último, no citoesqueleto. As altas temperaturas modificam a membrana permeável e alteram a diferenciação celular assim como o alongamento e a expansão das mesmas (Bita & Gerats, 2013).
Fatores bióticos têm sido também ameaças para o castanheiro. De facto, ao longo do século XX, a área de soutos e respetiva produção de castanha tem vindo a ser ameaçada pela invasão de organismos patogénicos responsáveis pelo surgimento de epidemias que atacam, furtivamente, a espécie (Pereira et al., 2015). Estas epidemias têm demonstrado uma ação devastadora quer em Portugal quer na Europa, causando graves problemas no setor agrícola e no sistema agroflorestal, onde é atribuída uma grande importância à cultura do castanheiro.
7 A doença da tinta, provocada pelo agente patogénico Phytophtora cinnamomi, é a responsável pela diminuição da área de soutos em Portugal na ordem dos 45 000 hectares. Este parasita radicular (Figura 3) além de invadir as raízes jovens penetrando nos tecidos condutores, floema e xilema, penetra também nas raízes mais grossas podendo progredir até à zona do colo da planta (Gouveia & Abreu, 1994; Dinis et al., 2011). Os resultados devastadores provocados pela infeção deste parasita verificam-se em todas as regiões castaneícolas de Portugal e do Mundo, sendo considerada, pela generalidade dos autores, a principal causa do declínio de soutos em Portugal (Dinis et al, 2011).
Figura 3 - Castanheiro afetado pela doença da tinta.
O cancro do castanheiro é provocado por um fungo designado Cryphonectria
parasitica (Murr) Barr, encontra-se tipicamente associado à morte dos ramos da árvore
devido a uma necrose extensiva (cancro) na casca e nos ramos do tronco (Figura 4), e ao aparecimento de estroma ou micélio fúngico (Bragança et al., 2008). Esta doença, outra das principais causas da mortalidade dos castanheiros, constitui um dos maiores desastres na história das epifítias mundiais, talvez só comparável à praga da filoxera que, há mais de um século, assolou os vinhedos da Europa (Simões, 2007).
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Figura 4- Castanheiro afetado pelo cancro.
São vários os fatores que determinam a severidade de uma doença assim como a sua taxa de propagação. A temperatura, a pluviosidade, o tipo de solo e a população microbiana são alguns exemplos desses fatores (Dinis et al., 2011). Encontrar formas de combate às doenças da tinta e do cancro e em simultâneo fortalecer o castanheiro enquanto árvore, é uma preocupação há muito sentida por produtores, transformadores, exportadores e investigadores. A utilização de biofertilizantes em culturas que não a do castanheiro, no sentido de tornar as plantas mais resistentes a condições abióticas menos favoráveis assim como a ataques de pragas e doenças, tem vindo a ser descrita como benéfica. Um dos biofertilizantes mais recentes no mercado é o Ergofito®.
O Ergofito® é um composto natural, orgânico-mineral que promove um equilíbrio entre o metabolismo da planta e a atividade microbiana do solo, desenvolvendo um conjunto de princípios que atuam na produção vegetal que favorecem o crescimento da planta, assim como a resistência da mesma a pragas e doenças (Gomes-Laranjo et al., 2017).
9 Este composto biofertilizante, segundo environmental protection authority, contém microrganismos na sua composição, tais como Acidithiobacillus ferrooxidans,
Thiobacillus radiobacter, Agrobacterium radiobacter, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Byssochlamys nivea, Eurotium rubrum, Penicillium citrinum. Trichoderma harzianum, Trichoderma Koningii e Trichoderma víride.
De um modo geral, o Ergofito® parece fornecer às plantas ótimas condições de nutrição, desde micro e macronutrientes, auxinas, enzimas, aminoácidos, entre outros, tornando-as resistentes e acelerando a sua taxa de crescimento. Para além disso, o Ergofito® pareceatuar também ao nível do estímulo do sistema imunológico das plantas, produzindo uma maior quantidade de fitoalexinas quando as plantas se encontram sob o ataque de um agente patogénico, o que melhora claramente a sua defesa.
Estes princípios levam ao crescimento saudável das plantas desprovidas de stresse, tornando-as mais fortes, resistentes, robustas e com uma densidade foliar farta, o que irá estimular diretamente a eficiência fotossintética dos cloroplastos ainda que sob condições meteorológicas adversas. Com uma maior e melhor área de superfície foliar exposta ao sol, mais energia será capturada, e esta energia além de abundante será utilizada mais eficientemente, uma vez que os principais nutrientes se encontram disponíveis e assimiláveis no solo.
Desde 1990 que o uso deste biofertilizante se tem expandido em diferentes países. Exemplos de algumas aplicações em países que têm tido experiências com sucesso nos resultados obtidos são a Itália e Espanha com a aplicação do Ergofito® em árvores de fruto, tabaco e vegetais e o Brasil com a cultura do café, banana, algodão, cana-de-açúcar, arroz, milho, tabaco e soja. Refira-se ainda o Equador com a cultura da banana e Cuba com a cana-de-açúcar e o arroz. Em Portugal o biofertilizante tem vindo a ser testado nas culturas da alface, espinafre, abóboras (Loureiro, 2013; Vicente, 2013) cerejeira e vinha (dados não publicados).
O Ergofito® apresenta um gama de produtos que exibem determinadas características que os distinguem, nomeadamente o Universal, que se trata de um produto que promove o crescimento saudável da planta, aumenta a sua produção e o calibre do fruto. Este produto tem ainda efeitos ao nível da recuperação de tecido, eventualmente, lesado, estimulando a regeneração celular. O Defense é um outro produto incluído na gama Ergofito® que, por sua vez, reforça e promove o sistema de defesa das plantas, estimulando a produção de fitoalexinas. O Algue é um produto que atua ao nível da
10 concentração de cálcio e do seu transporte, melhorando a absorção deste nutriente por
parte das plantas. Este produto aumenta, ainda, a firmeza e a homogeneidade do fruto. O
Boro, atuando ao nível dos processos reprodutivos, tem um papel importante no
desenvolvimento do tubo polínico, facilita o transporte de açúcares e aumenta a frutificação. Na gama Ergofito® pode ser ainda encontrado o Micro-ultra, que atua de forma preventiva sobre as plantas, especialmente, no que diz respeito ao ataque de pragas e doenças. Além disso, este último produto ajuda no processo de cicatrização dos tecidos lesados, estimulando-o (Ergofito, 2012).
Dados os desafios de sobrevivência que se apresentam atualmente ao castanheiro e tendo em consideração as potencialidades deste biofertilizante, um estudo da ação do Ergofito® nesta espécie no sentido de promover a mitigação dos efeitos provocados pelos stresses bióticos e abióticos, torna-se relevante.
1.1 Objetivos do estudo
Este estudo integra-se no âmbito do projeto Avaliação do impacto do uso do
Ergofito em castanheiro, PA 52428, financiado pelo Fundo Europeu Agrícola de
Desenvolvimento Rural (FEADER) e pelo Estado Português, através da Medida 4.1. Cooperação para a Inovação do programa PRODER – Programa de Desenvolvimento Rural.
Perante o conhecimento da existência deste novo biofertilizante, Ergofito®, recentemente entrado no mercado português e europeu, e das suas potencialidades noutras culturas, constituiu objetivo geral do projeto referido em supra, avaliar o impacto da sua aplicação em soutos jovem e adultos, não só sob o ponto de vista fisiológico, mas também no que respeita à produtividade e ao bem-estar fitossanitário dos castanheiros.
Com a consciência plena das alterações climáticas que se observam diariamente, este estudo pretendeu ir mais além e estabeleceu como objetivos:
Objetivo 1 | Determinar a ação do biofertilizante, Ergofito®, em castanheiros envasados quando submetidos a stresse térmico (temperaturas elevadas) e o grau de
11 recuperação destes quando o regime térmico depois se torna adequado para o seu
desenvolvimento.
Objetivo 2 | Avaliar a ação do Ergofito® na resistência das plantas às duas principais doenças desta espécie: Phytophtora cinnamomi (doença da tinta) e
Cryphonectria parasitica (cancro do castanheiro), em condições ótimas de
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Material e Métodos
2.1. Material vegetal
Neste estudo foram utilizadas sementes da espécie Castanea sativa Mill var. Demanda. Todas as sementes foram colhidas na mesma árvore, no banco de germoplasma da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal (41 ° 17 '20 "N, 7 ° 44' 0" W).
Figura 5 - Banco de germoplasma do castanheiro da UTAD.
2.2. Instalação do ensaio
O estudo decorreu no Departamento de Biologia e Ambiente da Universidade de Trás-Os-Montes e Alto Douro (UTAD), e o conjunto das ações realizadas para a instalação do ensaio, encontram-se resumidas na Figura 6.
Sementeira • Semear 56 castanhas, variedade Demanda, em dois tabuleiros. Plantação dos castanheiros em vasos • Transferência dos castanheiros para vasos de 15 cm de diâmetro. • Formação de dois blocos, Controlo e Tratadas, constituidos por 10 e 20 plantas, respetivamente. Aplicação de Ergofito nas plantas envasadas
• Aplicação do biofertilizante nas plantas do bloco Tratadas. • 80% do produto foi aplicado no solo e 20% na região aérea da planta.
14 O material vegetal recolhido foi reservado em sacos plásticos e conservado a 4°C
durante um mês, de modo a potencializar as capacidades germinativas da castanha. No final desse período, realizou-se uma sementeira. As castanhas selecionadas foram aquelas que apresentavam melhor condição germinativa e em bom estado fitossanitário. Como meio germinativo utilizou-se o extrato siro-relva juntamente com perlite, como forma de permitir condições controladas à sementeira, sem químicos e enriquecidas com macro e com microelementos de origem mineral.
Dois tabuleiros constituídos por 28 orifícios cada foram o suporte da sementeira (Figura 7). Cada um dos orifícios foi totalmente preenchido com extrato e uma castanha no interior. Para a geminação das sementes os tabuleiros foram colocados numa câmara de crescimento com um fotoperíodo de 12 h, uma radiação de 1600 μmolfotões.m2.s-1, temperatura constante e rega em intervalos de dois dias.
Figura 7 – Instalação do ensaio: Sementeira das castanhas.
Após quatro meses de germinação procedeu-se à plantação em vasos com 15 cm de diâmetro. Foram selecionadas as 30 plantas, aparentemente as mais saudáveis e vigorosas, tendo sido utilizado o mesmo extrato de siro-relva e perlite (Figura 8).
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Figura 8 - Castanheiros em vasos após quatro meses de germinação.
Com a plantação feita, o passo seguinte passou pela aplicação do biofertilizante Ergofito®. Para isso foram delineados 2 blocos:
Bloco Controlo (CT) | constituído por 10 plantas que não sofreram qualquer intervenção.
Bloco Tratado (T) | constituído por 20 plantas tratada com Ergofito®.
Para o tratamento das 20 plantas do Bloco T, foi necessário preparar 2,5 L de biofertilizante. A sua preparação passou por se misturar 2,5 g de microlite com 9,62 g de leite em pó, 6,25 g de açúcar, 5,19 mL de Ergofito® Boro, 5,19 mL de Ergofito® Defense e de Ergofito® 5,19 mL Universal.
Em cada planta foram aplicados 0,1 L de biofertilizante, do qual 80% foi aplicado diretamente no solo e 20% aplicado na região aérea da planta com a utilização de um vaporizador. A aplicação foi realizada uma vez no início do ensaio.
A partir deste ponto, as plantas permaneceram na câmara de crescimento com fotoperíodo de 12 h, radiação de 1600 μmolfotões.m2.s-1 e rega com intervalos de dois dias, tendo sido a temperatura o único fator que se fez variar. Deste modo, o ensaio decorreu em três etapas seguidas assim denominadas:
16 Tempo 1 (T1) - a câmara foi mantida a 25 ºC durante cerca de 1 mês;
Tempo 2 (T2) - a temperatura da câmara subiu para 35 ºC no mês seguinte; Tempo 3 (T3) - a temperatura da câmara voltou a ser de 25 ºC, tendo as plantas permanecido nestas condições durante mais um mês (Figura 9).
Figura 9 – Resumo da calendarização e das ações a implantar no estudo.
2.3. Trocas gasosas
Em todas as plantas (CT e T) foi utilizado um sistema portátil (IRGA, mod. LCpro +, Analytical Development Co®, Hoddesdon, RU) para avaliar as trocas gasosas foliares, incluindo a taxa de assimilação líquida (A) condutância estomática (gs) e taxa de transpiração (E). Intrigliolo et al. (2009) consideram o IRGA extremamente fiável para este fim e com a vantagem de se tratar de um método não destrutivo (Smart, 1974). Refira-se que tratando-Refira-se de medições em folhas individuais, a amostragem é Refira-sempre complexa, (Lu et al., 2003), as medições são demoradas e o equipamento não é muito “user-friendly”. A eficiência do uso de água (WUE) foi calculada através razão A/E (Polley, 2002). Estas medições foram realizadas no final dos períodos T1, T2 e T3, entre as 10:00 e as 12:00 horas. As medições foram replicadas 12 vezes por tratamento (n=12).
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2.4. Bioquímica foliar
Para a avaliação dos constituintes bioquímicos foliares dos castanheiros dos dois blocos, foram efetuadas quantificações de pigmentos fotossintéticos, compostos fenólicos totais, açúcares solúveis, amido e proteínas solúveis. Para isso começou por se recolher, no final de cada um dos tempos: T1, T2 e T3, seis folhas adultas e saudáveis, uma por castanheiro, do bloco T e do bloco CT, tendo desta forma as quantificações sido replicadas seis vezes por tratamento (n = 6).
Com um furador retiraram-se de cada folha seis amostras circulares com 8 mm de diâmetro, tendo-se evitado a nervura central. Dos seis discos recolhidos, dois foram embrulhados em papel de alumínio devidamente identificados e conservados a -80 ºC para posterior quantificação de açúcares, amido e proteínas solúveis presentes nas folhas. Os quatro restantes foram utilizados imediatamente para a determinação de pigmentos fotossintéticos.
2.4.1. Pigmentos fotossintéticos
A quantificação de clorofilas foi realizada segundo um protocolo adaptado de Arnon (1949) e Sesták et al. (1971). Assim, colocaram-se quatro discos de cada folha em 6 mL de acetona 80% (v/v) num tubo de ensaio fechado e protegido da luz. Todos os tubos foram deviamente identificados e colocados a 4 °C durante um período de 48 h até completa descoloração, agitando-se periodicamente.
Em condições de luminosidade reduzida e em gelo, no sentido de evitar a degradação dos pigmentos fotossintéticos, o extrato obtido foi diluído com acetona 80 % (v/v) numa proporção de 1 mL de extrato para 4 mL de acetona em novos tubos e agitados em vortex. De seguida, no espetrofotómetro Spectronic® 20 GenesysTM efetuaram-se
leituras da absorvância nos comprimentos de onda: 663, 645 e 470 nm. As clorofilas a, b e carotenoides foram quantificados de acordo com as equações descritas por Lichtenthaler (1987).
No final da determinação dos pigmentos fotossintéticos, o extrato foi reservado para posterior quantificação dos compostos fenólicos.
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2.4.2. Compostos fenólicos
Para quantificar os compostos fenólicos totais das folhas do castanheiro recorreu-se ao procedimento adaptado de Singleton et al (1965).
Começou por se pipetar, para um tubo de rosca, 0,2 mL do extrato utilizado na quantificação de clorofilas, adicionou-se 1 mL de reagente de Folin-Ciocalteu, e por fim 0,8 mL de carbonato de sódio (Na2CO3) a 75 % (v/v) de 30 em 30 segundos. Selaram-se os tubos com parafilm e colocaram-se em condições de luminosidade à temperatura ambiente durante 30 minutos. No final desse tempo homogeneizou-se a solução no vortéx e determinou-se a absorvância a 765 nm de comprimento de onda, segundo o procedimento adaptado de Singleton & Rossi (1965) e antecipado por um branco constituído por água. As leituras no espectrofotómetro foram feitas de 30 em 30 segundos, mantendo a ordem de adição de Na2CO3, de modo a garantir o mesmo tempo de incubação para todas as soluções.
A quantificação dos compostos fenólicos foi calculada através de uma reta padrão. Para a construção da reta-padrão, utilizou-se como padrão o ácido gálico nas concentrações de 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 e 20 μg/mL. As absorvâncias foram lidas a 765 nm com duas repetições para cada um dos padrões.
2.4.3. Açúcares solúveis
Os açúcares solúveis foram determinados a partir do desenvolvimento de um protocolo adaptado de Irigoyen et al. (1992).
Começou por se colocar, em tubos de ensaio de rosca devidamente identificados, um disco foliar de 8mm de diâmetro previamente recolhidos das plantas em estudo e conservado a -80 ºC. Pipetaram-se 10 mL de etanol 80% (v/v) para cada um dos tubos que foram deixados num banho-maria a 80 ºC, durante 60 minutos.
De seguida, num tubo de ensaio, adicionaram-se cuidadosamente 0,2 mL de extrato alcoólico a 3 mL de antrona, homogeneizando-se, de seguida, em vortex. Os tubos de ensaio foram colocados novamente em banho-maria, durante 10 minutos a 100ºC. Após o arrefecimento das amostras em gelo, procedeu-se à leitura da absorvância a 625 nm (Abs625) antecedida da leitura do branco composto por 0,2 mL de etanol e 3 mL de antrona.
19 Os valores de Abs625 foram registados e convertidos em concentrações (µg/mL),
através de uma reta-padrão obtida com concentrações de glucose crescentes (2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40 µg/mL) em etanol 80 % (v/v). As absorvâncias foram lidas a 625 nm com duas repetições para cada um dos padrões. A partir da equação da reta obtida, determinou-se o teor em açúcares solúveis.
2.4.4. Amido
A quantificação de amido foi feita segundo um protocolo adaptado de Osaki et al (1991). Para isso, foi utilizado o mesmo tecido foliar de onde se determinaram os açúcares solúveis. Assim, eliminado o extrato dos açúcares, mantiveram-se os discos foliares nos respetivos tubos de ensaio, aos quais foram adicionados 5 mL de ácido perclórico (HClO4) a 30 % (v/v) e colocados em banho-maria a 60 ºC, durante 60 minutos.
De seguida, fez-se reagir 0,3 mL de extrato com 3 mL de antrona, tendo sido a solução homogeneizada em vortex e colocada em banho-maria a 100 ºC, durante 10 minutos. Novamente as amostras sofreram um processo de arrefecimento em gelo, após o qual se procedeu à leitura das absorvâncias a 625 nm, considerando-se o branco um tubo de ensaio onde se adicionaram 0,3 mL de ácido perclórico a 30 % (v/v) e 3 mL de antrona.
À semelhança do que aconteceu na determinação do teor em açúcares solúveis, também na determinação do amido, a conversão dos valores de Abs625 em concentrações foi feita a partir de uma reta-padrão de concentrações crescentes de glucose (1,5; 3; 6; 12; 24; 30; 36; 42 e 48 µg/mL) agora em ácido perclórico 30 % (v/v). As absorvâncias foram lidas a 625 nm com duas repetições para cada um dos padrões. A partir da equação da reta obtida, determinou-se o teor em amido.
2.4.5. Proteínas solúveis
Seguindo o protocolo adaptado de Bradford (1976), quantificaram-se as proteínas solúveis. O processo foi iniciado com a maceração dos discos foliares em azoto líquido num almofariz. Seguiu-se a homogeneização do tecido foliar com 1400 µL de meio de extração constituído por uma mistura de tampão fosfato com pH 7,5 com EDTA
20 (Ethylenediamine tetraacetic acid – Sigma-Aldrich), PMSF (phenylmethylsulfonyl
fluoride - Sigma-Aldrich) e PVP (Polyvinylpyrrolidone insoluble - Sigma-Aldrich). O
EDTA presente no meio de extração vai funcionar como agente quelante, o PMSF tem como função impedir a ação das proteases, sendo o PVP um antioxidante destinado a proteger as proteínas contidas na amostra. O meio de extração contém 20 mL de tampão fosfato pH 7,5 com EDTA, 20 µL de PMSF e 0,4 g de PVP. Este homogeneizado foi retirado para eppendorfs e centrifugado a 12 000 rpm, durante 30 minutos a 4 ºC, numa centrífuga refrigerada (PrO-Research (By Centurion Scientific Ltd).
Após a centrifugação pipetaram-se 0,2 mL de extrato do eppendorf para uma célula de leitura descartável, tendo-se adicionado 2 mL do reagente de Coomassie blue, permanecendo por um período de incubação de 15 minutos, à temperatura ambiente.
No final do tempo de reação, procedeu-se à leitura das absorvâncias nas células descartáveis. A leitura foi realizada no comprimento de onda de 595 nm, antecedido por um branco composto por 2 μL de água destilada e 2 mL de Coomassie. Os dados obtidos da leitura foram registados e convertidos em µg/mL mais uma vez através de uma reta-padrão de solução-mãe de 0,01 g de BSA (Bovine serum albumin) em 50 mL de água bidestilada (200 µg/mL). Para a construção da reta-padrão foram usados sete padrões da solução-mãe (1, 10, 20, 40, 80, 100 e 200 µg/mL) com duas repetições por padrão.
2.5. Teste OJIP
Para análise da fluorescência da clorofila a, foi utilizado o Teste OJIP (Strasser et
al, 2004; Tsimilli-Michael & Strasser, 2008), que permite calcular os fluxos específicos
por centro de reação, eficiência ou rendimentos quânticos e índices de desempenho. Desta forma, este teste pode sinalizar estados de stresse nas plantas mesmo antes do aparecimento dos sintomas visíveis (Strasser et al., 2004). Para a indução da fluorescência da clorofila, foi utilizado um fluorómetro OS-30P (Opti-Sciences, Hudson, USA). As medições de fluorescência da clorofila foram realizadas no final de cada um dos três períodos (T1, T2 e T3), em folhas ligadas à planta, após 30 minutos de adaptação à escuridão. Foram avaliadas 10 plantas por tratamento (n = 10).
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2.6. Testes de resistência à doença da tinta e do cancro
No sentido de dar cumprimento ao segundo objetivo deste estudo, avaliar a ação do Ergofito® na resistência às duas principais doenças desta espécie: a doença da tinta e o cancro do castanheiro, utilizou-se o método dos discos de resistência (Nyassé et al, 1995). Este método consiste em colocar, numa placa de Petri, um disco contendo o agente patogénico sobre um disco foliar extraído de uma folha cuja planta se pretende avaliar a resistência à doença, neste caso de castanheiros do Bloco T e do Bloco CT. As placas de Petri deste modo preparadas devem ser deixadas num ambiente adequado, sob observação diária, registando-se o momento do aparecimento de necroses no disco foliar provocadas pela doença.
Assim, começou por se preparar os inócuos. O processo de inoculação dos agentes patogénicos teve início com a recolha de material vegetativo infetado, no campo, nomeadamente ramos, porções de tronco e raízes. O material foi transferido para o laboratório. No laboratório foram preparadas placas de Petri com meio agar, onde pequenos pedaços das amostras recolhidas no campo foram colocados. De modo a não contaminar as placas com bactérias e outros agentes indesejados, todo o processo foi realizado numa câmara de fluxo laminar e todo o material utilizado estava devidamente esterilizado. Os agentes patogénicos proliferaram nas placas sob condições otimizadas tendo sido feita a repicagem para novas placas para incremento e manutenção das culturas de microrganismos.
A preparação das placas de Petri onde foi realizado o ensaio, envolveu a colocação de papel de filtro humedecido com água destilada no fundo destas, de modo a proporcionar um ambiente favorável ao desenvolvimento do agente patogénico.
Depois de recolhidas duas folhas por planta, num total de 20 castanheiros do bloco T e 10 castanheiros do bloco CT, com um furador de 2 cm de diâmetro retiraram-se três amostras de cada folha, tendo o cuidado de que estas contivessem a nervura central da folha. Dos seis discos por planta assim obtidos, três destinaram-se a testar a resistência à doença da tinta e os restantes três ao cancro. Colocaram-se três discos foliares por placa de Petri, no centro destes e sobre a nervura central, foi deixado um disco com cerca de 8 mm do agente patogénico respetivo à doença da tinta ou o cancro do castanheiro (Figura 10). Cada placa foi devidamente identificada quanto à doença com que tinha sido infetada e relacionada com a planta de onde foram obtidos os discos foliares.
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Figura 10 – Testes de resistência à doença da tinta e do cancro.
As placas de Petri desta forma preparadas foram deixadas numa estufa a 25 ºC, tendo-se procedido à sua observação diária e ao registo do aparecimento de necroses.
Este teste foi realizado no final de T1 e repetido no final de T3.
2.7. Análise estatística
Para todas as variáveis em estudo foram calculadas médias e erros-padrão. Os resultados foram sujeitos à Análise de Variância (ANOVA), tendo sido usado o teste de Tukey (Tukey Multiple Comparison Test), para comparação de médias, num intervalo de confiança de 95%. Todas as análises foram realizadas utilizando o programa Microsoft Office Excel e o Software STATISTICA 2010 (StatSoft Inc., 2010).
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Resultados e Discussão
Foi construída uma matriz com todos os dados amostrados das plantas controlo e tratadas, em três períodos onde a temperatura foi o fator que se fez variar. Assim, no primeiro período, T1, as plantas foram sujeitas à temperatura de 25 °C, no segundo período, T2, a temperatura sofreu um incremento e durante um mês as plantas estiverem expostas a 35 °C, tendo no último período, T3, a temperatura sido regulada novamente para 25 °C. Todos os resultados serão apresentados em termos de média e erro padrão.
3.1. Trocas gasosas
As trocas gasosas são parâmetros importantes na avaliação da adaptação de uma planta às condições do meio onde está inserida. Estas refletem o estado hídrico em que a planta se encontra e a capacidade de resposta às condições climáticas. Neste estudo foram efetuadas, em três períodos, medições dos parâmetros fotossíntese, transpiração, condutância estomática e calculada a eficiência do uso de água (Tabela 2).
Tabela 2. Teores médios e respetivo erro padrão relativos às trocas gasosas foliares: taxa fotossintética (A,
µmol CO2.m-2.s-1); taxa de transpiração (E, mmol H2O.m-2.s-1); condutância estomática (gs, mmol.m-2.s-1)
e eficiência do uso de água (WUE, µmol CO2. mmolH2O-1). Valores que não possuem a mesma letra são
estatisticamente diferentes (p˂0,05), letras minúsculas dizem respeito a comparações entre tratamentos no mesmo tempo; letras maiúsculas comparam tratamentos entre os três tempos.
Tratamento A E gs WUE T1 Ergofito 2,50±0,20 a AB 0,90±0,05 a A 36,67±0,003 a AB 2,83±0,27 a AB Controlo 2,91±0,23 a B 1,02±0,06 a A 42,86±0,003 a AB 3,12±0,30 a B T2 Ergofito 2,14±0,23 a AB 1,01±0,06 a A 47,14±0,003 a B 2,13±0,30 a AB Controlo 1,79±0,20 a A 0,98±0,05 a A 46,68±0,003 a B 1,85±2,27 a A T3 Ergofito 2,37±0,18 a AB 0,84±0,05 a A 34,55±0,003 a A 2,84±0,24 a AB Controlo 1,83±0,27 a A 0,85±0,07 a A 32,00±0,004 a A 2,14±0,36 a AB
25 Ao observar a Tabela 2, e relativamente à produtividade fotossintética (A),
verificou-se não existirem diferenças estatisticamente significativas entre as plantas tratadas e controlo, em cada um dos Tempos: T1, T2 e T3. Ainda neste parâmetro, e comparando o comportamento das plantas tratadas ao longo do ensaio, ainda que fosse observado um ligeiro decréscimo de A em T2, correspondente a 16%, com o aumento da temperatura para 35 °C, em T3, novamente com a temperatura a 25°C, ideal para o desenvolvimento vegetativo do castanheiro, A apresenta uma recuperação na ordem dos 11%. Quando se analisa o comportamento das plantas controlo ao longo dos tempos, estas mostram diferenças estatisticamente significativas de T1 para T2 e T3, não existindo diferenças significativas entre estes dois últimos tempos. De facto, em T2, sob a influência de stresse térmico provocado pelo acréscimo da temperatura, as plantas de controlo apresentam um decréscimo significativo de produtividade fotossintética de 61%. Em T3, apesar de existir uma tendência de recuperação, 2,23 %, esse acréscimo não é significativo.
A fotossíntese está intimamente ligada às condições climáticas, quer de forma direta quer de forma indireta. Embora a absorção de luz seja independente de temperatura, os passos subsequentes na conversão de luz em energia química são sensíveis à temperatura de diversas formas (Kirschbaum, 2004). Na maioria das espécies, a taxa fotossintética diminui, com temperaturas próximas dos 35 ºC. Esta diminuição encontra-se associada a fatores como a desnaturação proteica e a perda de integridade da membrana dos tilacoides por fotoinibição (Gomes-Laranjo et al, 2005; Sharkey, 2005).
As plantas tratadas com Ergofito® mostram uma melhor capacidade fotossintética em situações de stresse térmico, assim como uma capacidade de recuperação superior (Ergofito, 2012). O Ergofito® atua proporcionando uma assimilação rápida de nutrientes disponíveis, aumentando a produção de massa vegetal, a robustez da planta e a resistência da mesma a circunstâncias adversas (Almeida et al, 2008). Todos estes aspetos interferem diretamente na fotossíntese, estimulando os cloroplastos e tornando todo o processo mais eficiente, o que resulta numa taxa fotossintética superior em termos quantitativos e qualitativos.
Ainda que não se tenham observado diferenças significativas (P<0,05) entre as plantas tratadas e controlo, nos Tempos T1, T2 e T3 para a taxa de transpiração e condutância estomática, as plantas tratadas com Ergofito® revelaram maiores taxas de
26 transpiração e gs em T2. Quando se observaram os resultados obtidos para o parâmetro
WUE, verificou-se que as plantas tratadas apresentaram maior eficiência na gestão da água. Infere-se ainda que estas mesmas plantas, em T3, foram as que revelaram valores médios destes dois parâmetros mais próximos dos apresentados em T1. Foi ainda revelador verificar que existem diferenças significativas nas plantas controlo entre os Tempos T1 e T2, valor mais baixo em T2, já as plantas tratadas não apresentaram diferenças significativas o que sugere um efeito positivo do biofertilizante.
A condutância estomática é um fator importante no que diz respeito ao balanço cíclico que ocorre nas folhas, relativo às trocas de água, CO2 e energia, entre as plantas e a atmosfera, sendo o estoma, estrutura foliar com mecanismo de abertura e encerramento, quem possibilita e regula essas trocas (Pereira, 2000). Assim, o funcionamento dos estomas possui uma grande influência na atividade vegetal (Costa & Marenco, 2007), envolvendo uma interação com a taxa fotossintética da planta aquando da abertura ou encerramento dessas estruturas. A capacidade da planta para sustentar as trocas gasosas foliares e a taxa de assimilação de CO2 sob stresse térmico encontra-se diretamente relacionado com a tolerância a temperaturas elevadas, e o castanheiro não é exceção. Segundo Hasanuzzaman et al. (2013), o calor afeta marcadamente o estado de hidratação da folha, a condutância estomática (gs) e a concentração de CO2 intracelular. Neste estudo pode observar-se que maiores taxas de condutância estomática estão relacionadas com maior taxa de transpiração e menor eficiência do uso de água. Dado que as plantas não se encontram em stresse hídrico, ou seja, a disponibilidade de água não foi um fator limitante, este resultado é expectável. De facto, segundo Bota et al. (2001), Cifre et al. (2005), Palma (2014), Lauteri et al (1997) uma das primeiras respostas das plantas à seca é a redução da condutância estomática (gs) associada a uma otimização da eficiência do uso da água, um indicador a longo prazo, da regulação da assimilação de carbono em condições de seca. Desta forma os resultados sugerem que o biofertilizante tem uma ação positiva na eficiência do uso de água.
3.2. Bioquímica foliar
A adaptação de plantas a condições adversas pode incitar alterações bioquímicas e fisiológicas (Carneiro et al, 2011). Sendo que, a maioria das plantas sofrem danos bioquímicos e fisiológicos quando expostas a temperaturas superiores às consideradas
27 ótimas para o desenvolvimento vegetal, cujo resultado é refletido na maioria dos
processos metabólicos da planta (Rivero et al, 2001).
3.2.1. Pigmentos fotossintéticos
Os resultados obtidos relativos ao teor em pigmentos fotossintéticos nas plantas tratadas com Ergofito® e às plantas controlo, no final dos tempos T1, T2 e T3, encontram- -se resumidos na Tabela 3.
28
Tabela 3. Teores médios e respetivo erro padrão em pigmentos clorofilinos: Clorofila a (Cla, mg.dm-2); Clorofila b (Clb mg.dm-2); Clorofila total (Cltot, mg.dm-2); Carotenoides
(Car, mg.dm-2). Valores que não possuem a mesma letra são estatisticamente diferentes (p˂0,05), letras minúsculas dizem respeito a comparações entre tratamentos no mesmo
tempo; letras maiúsculas comparam tratamentos entre os três tempos.
Temperatura Tratamento Cla Clb Cla/b Cltot Car Cltot/Car
T1 Ergofito 3,92±0,26 a BC 0,86±0,10 a AB 4,57±0,27 ab AB 4,78±0,33 a BC 0,83±0,08 a A 5,83±0,33a AB Controlo 4,28±0,23 a C 1,18±0,09 a B 3,65±0,29 a B 5,46±0,30 a C 0,91±0,07 a A 6,15±0,29 a B T2 Ergofito 2,40±0,30 a A 0,39±0,11 a A 6,44±0,67 a A 2,78±0,38 a A 0,66±0,09 a A 4,23±0,38 a A Controlo 3,17±0,30 a ABC 0,52±0,11 a A 6,62±1,25 a A 3,69±0,38 a AB 0,71±0,09 a A 5,18±0,38 a AB T3 Ergofito 3,00±0,23 a AB 0,67±0,09 a A 4,53±0,29 a AB 3,66±0,30 a AB 0,72±0,07 a A 5,17±0,29 a AB
29 Assim, a análise da Tabela 3 permite verificar que apesar dos teores em Cla. Clb,
Cltot, Car e razão Cltot/Car nas plantas tratadas com Ergofito® serem sempre inferiores aos das plantas controlo, em todos os tempos, essas diferenças não são significativas. Observa-se também que os teores em pigmentos fotossintéticos apresentaram uma diminuição quando as plantas foram sujeitas a stresse térmico (T2), tendo-se notado uma tendência de recuperação quando a temperatura voltou para um valor ótimo de desenvolvimento vegetativo apontado para o castanheiro (T3), ainda que estatisticamente não significativa. É importante referir que relativamente à Cla, o controlo sofreu perdas de cerca de 26,0% quando a temperatura aumentou para 35 °C (T2), tendo recuperado cerca de 8,5% do seu teor em T3. Já as plantas tratadas, ainda que apresentassem redução do teor em Cla superiores ao controlo, a sua recuperação também foi consideravelmente superior (25,0%).
A clorofila a, pigmento principal e a clorofila b, pigmento secundário, são componentes naturais das membranas fotossintéticas e ocorrem na proporção (Cl a/b) aproximada de 3 para 1, podendo, no entanto, esta razão ser alterada à custa das condições de crescimento e de fatores ambientais (Lichtenthaler, 1987), nomeadamente condições de luminosidade e severidade do stresse hídrico e/ou térmico das folhas (Pereira, 2000). Neste estudo observou-se uma proporção (Cl a/b) de cerca de 6 para 1 no T2 (Tabela 3), alterada devido muito provavelmente à severidade do stresse térmico a que as folhas foram submetidas. A razão entre a clorofila a e b de maneira geral, diminui com a redução da intensidade luminosa (Boardman, 1977), devido a uma maior proporção relativa de clorofila b em ambientes sombreados, que pode estar associada à sua degradação mais lenta em relação à clorofila a (Engel & Poggiani, 1991). Estes resultados concordam com os obtidos por Atroch (1999), Castro (2005).
3.2.2. Parâmetros bioquímicos
De modo a analisar os parâmetros bioquímicos presentes nas plantas tratadas com Ergofito® e nas plantas de controlo, ao longo dos Tempos T1, T2 e T3, elaborou-se a Tabela 4.
30
Tabela 4. Teores médios e respetivo erro padrão dos parâmetros bioquímicos: Compostos fenólicos (mg.g -1); Açúcares solúveis (mg.g-1); Amido (mg.g-1); Proteínas solúveis (mg.g-1). Valores que não possuem a
mesma letra são estatisticamente diferentes (p˂0,05), letras minúsculas dizem respeito a comparações entre tratamentos no mesmo tempo; letras maiúsculas comparam tratamentos entre os três tempos.
Temperatura Tratamento Compostos
fenólicos
Açúcares solúveis
Amido Proteínas solúveis
T1 Ergofito 0,191±0,095 a A 0,236±0,015 a CD 0,121±0,014 a A 1,115±0,135 a BC Controlo 0,179±0,106 a A 0,277±0,016 a D 0,143±0,015 a A 1,409±0,151 a C T2 Ergofito 0,068±0,095 a A 0,149±0,015 a AB 0,092±0,014 a A 0,403±0,135 a A Controlo 0,075±0,095 a A 0,113±0,015 a A 0,111±0,014 a A 0,460±0,135 a A T3 Ergofito 1,053±0,106 a B 0,187±0,016 a BC 0,141±0,015 a A 0,904±0,151 a ABC Controlo 1,697±0,106 b C 0,157±0,016 a AB 0,135±0,015 a A 0,689±0,151 a AB
A partir da Tabela 4 verifica-se que todos os compostos estudados apresentam uma diminuição da sua concentração que coincide com o tempo no qual as plantas se encontram expostas a temperaturas elevadas (35º C) induzindo as mesmas ao stresse térmico (T2). Esta situação verifica-se com as plantas tratadas com Ergofito® e com as plantas de controlo. Em T3, com a regularização da temperatura para os 25º C iniciais, é percetível, embora, por vezes, não relevante do ponto de vista estatístico, uma recuperação tendencial dos compostos bioquímicos nas plantas.
Ao nível das proteínas solúveis, alterações na sua concentração são importantes para entender o impacto do stresse na proteólise celular e na síntese proteica (Bacelar et
al, 2006). No nosso estudo, observamos um decréscimo significativo na concentração de
proteínas solúveis em T2, tanto nas plantas tratadas como nas plantas de controlo. Este decréscimo explicado de acordo com Dinis et al (2011) pode encontrar-se relacionado com um aumento da hidrólise proteica, de modo a providenciar um aumento de aminoácidos. Em T3, com a estabilização da temperatura do ar, os castanheiros, tratados e de controlo, embora não apresentem um aumento significativo na concentração de proteínas solúveis, mostram uma recuperação tendencial do seu teor como resposta biológica. Segundo Bacelar et al (2006), um aumento da concentração de proteínas solúveis pode representar uma atividade aumentada de enzimas de defesa e stresse oxidativo.
31 A par da concentração de proteínas solúveis, a concentração de açúcares solúveis
também responde com um decréscimo significativo da sua concentração a um período de stresse térmico (T2), em ambos os tratamentos (Ergofito® e controlo). Em T3, com a regularização da temperatura, não se verificam alterações significativas do ponto de vista estatístico, porém, é percetível um aumento tendencial no teor de açúcares na folha. É conhecido que condições de stresse térmico induzem na planta a acumulação de açúcares solúveis (Rosa et al,2009). Os stresses abióticos, como temperaturas elevadas, têm influência sobre a concentração de açúcares nas células devido a uma diminuição da fotossíntese, alteração no metabolismo e demanda de alta respiração de manutenção (Chinnusamy et al, 2007). Todavia, nem todos os açúcares solúveis desempenham papéis semelhantes em eventos associados ao metabolismo da planta sob condições de stresse. Estes compostos podem atuar como osmoprotetores assim como serem uma fonte de carbono para a manutenção e crescimento durante a recuperação da planta (Bacelar et al, 2006). Assim, a sacarose e a glucose atuam como substrato para a respiração celular ou como osmolitos para mantear a homeostase celular. A frutose, por sua vez, não se encontra relacionado com a osmoproteção mas sim com a síntese de metabolitos secundários, que atua como substrato para a lenhina e síntese de compostos fenólicos (Rosa et al, 2009).
É de salientar que a concentração de compostos fenólicos em T3 teve um aumento significante tanto nas plantas tratadas como nas plantas de controlo, relativamente a T2. Este aumento significativo do teor em compostos fenólicos, em T3, em conjunto com o incremento da concentração de açúcares solúveis no mesmo tempo (T3), previamente referido, podem constituir parte do mecanismo de defesa da planta ao stresse induzido (Dinis et al, 2011).
Segundo autores como Ibrahim & Jaafar (2012) e Blokhina et al. (2003), os compostos fenólicos possuem ação antioxidante, e a sua concentração aumenta, geralmente induzida por stresses ambientais na planta, que conduzem ao stresse oxidativo. Esse aumento verificou-se neste estudo, apresentando-se quase duas vezes superior nas plantas sem tratamento comparativamente às plantas com tratamento Ergofito®. Os valores investigados sugerem que os mecanismos de defesa da planta foram ativados depois de submetidos a stresse térmico, especialmente nas plantas de controlo, o que indica efeitos positivos do biofertilizante relativamente aos processos metabólicos e bioquímicos dos castanheiros.
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3.3. Teste OJIP
Este teste pode sinalizar estados de stresse nas plantas mesmo antes do aparecimento dos sintomas visíveis surgirem nas plantas (Christen et al., 2007). De facto, o índice de vitalidade é um importante indicador do estado fisiológico das plantas. A Tabela 5 contém os resultados obtidos através da aplicação deste teste.
Tabela 5. Teores médios e respetivo erro padrão em fluorescência: Eficiência quântica máxima do
fotossistema II (Fv/Fm); Fluorescência inicial (F0, mg.dm-2); Fluorescência máxima (Fm, mg.dm-2); Índice
de vitalidade. Valores que não possuem a mesma letra são estatisticamente diferentes (p˂0,05), letras minúsculas dizem respeito a comparações entre tratamentos no mesmo tempo; letras maiúsculas comparam tratamentos entre os três tempos.
Temperatura Tratamento Fv/Fm F0 Fm P.I
T1 Ergofito 0,796±0,005 a D 164,78±4,84 a A 810,06±14,678 a A 6,13±0,25 a B Controlo 0,797±0,008 a D 164,25±7,26 a A 809,12±22,02 a AB 5,89±0,37 a B T2 Ergofito 0,766±0,007 a BC 205,54±6,19 a BC 882,00±18,78 a B 3,86±0,312 a A Controlo 0,730±0,008 b A 226,00±7,76 a B 838,88±23,54 a AB 3,25±0,40 a A T3 Ergofito 0,782±0,006 a CD 184,53±5,30 a AC 850,93±16,08 a AB 5,59±0,27 b B Controlo 0,745±0,010 b AB 219,20±9,18 b B 861,40±27,85 a AB 2,54±0,47 a A
De acordo com a tabela, os resultados no T2 da razão Fv/Fm, quer das plantas tratadas com Ergofito® quer das plantas controlo, são significativamente inferiores aos verificados em T1. Em T3, com a estabilização da temperatura para a inicial de 25ºC, as plantas tratadas não apresentam diferenças significativas de Fv/Fm relativamente aos valores de T1, já as plantas controlo mostram diferenças significativas.
A maior diminuição de Fv/Fm observada nas plantas controlo (Tabela 5) indica uma redução na regulação da fotossíntese ou fotoinibição (Carvalho et al., 2001) em resposta à diminuição do suprimento de CO2 para as células do mesófilo devido ao encerramento estomático como consequência do aumento do stresse térmico nas folhas (Maxwell & Johnson, 2000; Baker & Rosenqvist, 2004). Além disso, em T2, os valores de F0 tiveram um acréscimo significativo nas plantas controlo e tratadas, tendo sido maior nas plantas controlo. O acréscimo de F0 em aparelhos fotossintéticos adaptados ao escuro
