Análise da expressão gênica e atividade enzimática antioxidante em Passiflora edulis SIMS sob diferentes concentrações de alumínio

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA VEGETAL

IRANY RODRIGUES PRETTI

“

Análise da expressão gênica e atividade enzimática antioxidante

em Passiflora edulis SIMS sob diferentes concentrações de

alumínio”

Vitória – ES 2012

IRANY RODRIGUES PRETTI

“

Análise da expressão gênica e atividade enzimática antioxidante

em Passiflora edulis SIMS sob diferentes concentrações de

alumínio”

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal (PPGBV) da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Biologia Vegetal, na área de concentração Fisiologia Vegetal, linha de pesquisa em Fisiologia Molecular de Plantas.

Orientador: DSc. Maria do Carmo Pimentel Batitucci

Vitória – ES 2012

AGRADECIMENTOS À Deus, pela vida.

Ao CNPq e à CAPES que financiaram esta pesquisa.

À minha orientadora Maria do Carmo, pela oportunidade de realizar este estudo ao seu lado, admirada por mim como exemplo de profissional e pessoa. Obrigada por todas as vezes que me ajudou a encontrar soluções para os obstáculos que encontrei, por me acalmar e por ser muito mais que uma orientadora.

À minha família pelo incentivo, especialmente à minha vó.

Ao Vau, pela paciência de sempre e por ser quem eu posso contar independente da situação. Sempre ouvindo lamentações, dúvidas, angústias e mesmo assim me encorajou a continuar, além de ter carregado alguns baldes de solução nutritiva. Você foi minha força! Muito Obrigada!

À Tati e Raquel, por todo o tempo que estivemos juntas, por tudo que aprendi com vocês e por tanto trabalho dividido. Vocês tornaram essa caminhada um pouco mais fácil e divertida. Não sei se teria chegado ao final, e bem, não fosse vocês ao meu lado. Valeu muito a pena!

À Anny, minha amiga, que me incentivou desde o começo, inclusive na inscrição do mestrado. Obrigada por todo ensinamento das técnicas e protocolos. Você é uma das responsáveis por essa conquista!

Ao Clayton e Rodolfo, por todas as vezes que nos ajudaram com os experimentos, carregando solução nutritiva, transportando nitrogênio líquido ou pela companhia, nos propiciando trabalhar até tarde no laboratório.

Aos colegas do laboratório, especialmente Ju e Luciano, pelas dicas e disponibilidade de ajuda.

Ao Sr. Rael, pela doação de sementes de P. edulis.

Ao Gleidson, pela grande ajuda na lavagem de toda aquela areia.

Aos colegas da botânica, que em vários momentos mostraram-se sempre dispostos a contribuir com este trabalho.

Aos professores responsáveis pelo NGACB por terem cedido o espaço para que os estudos moleculares fossem realizados.

À Juliana Freitas que me ajudou muito, me ensinou e tirou muitas dúvidas, sempre torcendo para que os protocolos funcionassem.

Ao Ricardo, pela agilidade e disponibilidade em ajudar nos trâmites burocráticos da secretaria.

À professora Diolina Moura Silva, pelo empréstimo do laboratório de Fisiologia Vegetal.

Ao professor Márcio Alves Ferreira, pela participação na banca examinadora como avaliador externo.

À professora Renata Venturim Fontes, pela participação na banca examinadora como avaliadora interna.

“É melhor tentar, que preocupar-se e ver a vida passar. É

melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo

nada até o final”.

Martin Luther King

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: (a) Plântulas de P. edulis com 5 cm em média e (b) vasos contendo uma planta de P. edulis acomodados na casa de

vegetação...28

Figura 2: Esquema de repetições para extração de RNA de plantas de P.

edulis...32

Figura 3: Potencial hídrico (Ψ) em plantas de P. edulis cv. FB100 submetidas a quatro tratamentos ao longo do tempo: controle, controle pH 4, 0,2mM de Al e 2mM de Al. As barras representam o erro padrão da média de três repetições. Os valores são médias (± erro padrão) de três plantas por tratamento...40

Figura 4: Potencial hídrico (Ψ) em plantas de P. edulis cv. FB200 submetidas a quatro tratamentos ao longo do tempo: controle, controle pH 4, 0,2mM de Al e 2mM de Al. As barras representam o erro padrão da média de três repetições. Os valores são médias (± erro padrão) de três plantas por tratamento...41

Figura 5: Perfis de expressão de Cat nas cultivares de P. edulis FB100 e FB200, nas três coletas: Tempo Zero, coleta 5 dias e coleta 10 dias, em PCR´s de diferentes ciclos. (a) Expressão de Cat FB100 TZ/coleta 5 dias; (b) Expressão de Cat FB200 TZ/coleta 10 dias; (c) Expressão de Cat FB100 TZ/coleta 5 dias; (d) Expressão de Cat FB200 TZ/coleta 10 dias...42

Figura 6: Perfis de expressão de Sod nas cultivares de P. edulis FB100 e FB200, nas três coletas: Tempo Zero, coleta 5 dias e coleta 10 dias, em PCR´s de diferentes ciclos. (a) Expressão de Sod FB100 TZ/coleta 5 dias; (b) Expressão de Sod FB200 TZ/coleta 10 dias; (c) Expressão de Sod

FB100 TZ/coleta 5 dias; (d) Expressão de Sod FB200 TZ/coleta 10 dias...43

Figura 7: Perfis de expressão de 18S nas cultivares de P. edulis FB100 e FB200, nas três coletas: Tempo Zero, coleta 5 dias e coleta 10 dias, em PCR´s de diferentes ciclos. (a) Expressão de 18S FB100 TZ/coleta 5 dias; (b) Expressão de 18S FB200 TZ/coleta 10 dias; (c) Expressão de 18S FB100 TZ/coleta 5 dias; (d) Expressão de 18S FB200 TZ/coleta 10 dias...44

Figura 8: Expressão relativa de Cat em P.edulis FB100, em PCR’s de diferentes ciclos. (a) Expressão relativa com 32 ciclos. (b) Expressão relativa com 25 ciclos. (c) Expressão relativa com 20 ciclos. As barras representam o erro padrão da média. Os valores são médias de 3 repetições...46

Figura 9: Expressão relativa de Cat em P.edulis FB200, em PCR’s de diferentes ciclos. (a) Expressão relativa com 32 ciclos. (b) Expressão relativa com 25 ciclos. (c) Expressão relativa com 20 ciclos. As barras representam o erro padrão da média. Os valores são médias de 3 repetições...48

Figura 10: Expressão relativa de Sod em P.edulis FB100, em PCR’s de diferentes ciclos. (a) Expressão relativa com 32 ciclos. (b) Expressão relativa com 25 ciclos. As barras representam o erro padrão da média. Os valores são médias de 3 repetições...49

Figura 11: Expressão relativa de Sod em P.edulis FB200, em PCR’s de diferentes ciclos. (a) Expressão relativa com 32 ciclos. (b) Expressão relativa com 25 ciclos. As barras representam o erro padrão da média. Os valores são médias de 3 repetições...50

Figura 12: Atividade enzimática de CAT em P. edulis. (a) Atividade de CAT na cv FB100. (b) Atividade de CAT na cv FB200. Os valores são médias de 5 repetições...52

Figura 13: Atividade da enzima SOD em de plantas de P. edulis. (a) Atividade enzimática na cv FB100. (b) Atividade enzimática na cv FB200. Os valores são médias de 5 repetições...53

Figura 14: Atividade da enzima APX em de plantas de P. edulis. (a) Atividade enzimática na cv FB100. (b) Atividade enzimática na cv FB200. Os valores são médias de 5 repetições...54

Figura 15: Quantificação de proteínas solúveis totais em plantas de P.edulis. (a) Conteúdo de proteínas na cv FB100. (b) Conteúdo de proteínas na cv FB200. Os valores são médias de 5 repetições...55

Figura 16: Perfis de expressão de P. edulis FB200 com PCR’s de diferentes ciclos.(a) Expressão de Cat após 32, 25, 20 e 15 ciclos. (b) Expressão de Sod após 32, 25 e 20 ciclos. (c) Expressão de 18S após 32, 25, 20 e 15 ciclos...57

Figura 17: Expressão relativa de P.edulis FB200 em campo. (a) Expressão relativa de Cat com 32, 25 e 20 ciclos. (b) Expressão relativa de Sod com 32 e 25 ciclos...58

Figura 18: Atividade enzimática de CAT em P. edulis FB200 cultivado em campo. Os valores são médias de 5 repetições...59

Figura 19: Atividade enzimática de SOD em P. edulis FB200 cultivado em campo. Os valores são médias de 5 repetições...59

Figura 20: Atividade enzimática de APX em P. edulis FB200 cultivado em campo. Os valores são médias de 5 repetições...60

Figura 21: Quantificação de proteínas solúveis totais em plantas de P.edulis FB200 cultivado em campo. Os valores são médias de 5 repetições...60

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1: Composição da solução nutritiva de Hoagland e Arnon (1950)...29

Tabela 2: Resultado de análise de água utilizada no preparo de solução nutritiva...30

Tabela 3: Sequências dos primers utilizados no estudo de expressão gênica...33

Tabela 4: Componentes e concentrações da reação padrão (mix) para PCR...34

Tabela 5: Sequências dos primers desenhados para o estudo da expressão gênica...35

LISTA DE ABREVIATURAS

Al Alumínio

µm Micromolar

APX Peroxidase do ascorbato

CAT Catalase

cv. Cultivar

EROs Espécies Reativas de Oxigênio FB 100 Cultivar Maguary do maracujazeiro

FB 200 Cultivar Yellow Master do maracujazeiro

Há Hectare(s)

INCAPER Instituto Capixaba de Assistência Técnica e Extensão Rural Min Minuto(s)

mM Milimolar

Pb Pares de bases

PCR Reação em cadeia da _{Polimerase, do inglês:”Polymerase Chain Reaction”}

RT-PCR Reação em cadeia de transcrição reversa da Polimerase, do _{inglês: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction”} s Segundo(s)

Seag Secretaria Estadual de Agricultura, Abastecimento, _{Aqüicultura e Pesca} SOD Superóxido dismutase

ton

Toneladas ψw Potencial hídrico

RESUMO

O maracujazeiro é cultivado em quase todo o território brasileiro. O Estado do Espírito Santo atualmente ocupa o quarto lugar em produção no país. A produção capixaba, de Passiflora edulis, está em expansão, tendo em vista que nos últimos anos houve um aumento na área plantada de maracujazeiro de 500 ha, em 1990, para 2.429 ha, em março de 2008, atingindo em dezembro de 2010, 2.800 ha plantados. Contudo, a maior parte da produção capixaba ainda se concentra na região norte do Estado, com destaque para os municípios de Jaguaré e Sooretama. Apesar dos números mostrarem avanços na produção dessa frutífera, o Espírito Santo é caracterizado por solos ácidos e alto teor de alumínio. Dentre as respostas desencadeadas pela exposição ao alumínio estão: inibição do crescimento radicular, inibição da divisão celular, deficiência de nutrientes, além da ativação de rotas de sinalização e alterações em nível de proteínas e transcritos de RNA. Dessa forma, torna-se fundamental o estudo de componentes do sistema de defesa antioxidativo do maracujazeiro cultivado sob exposição ao alumínio. As EROs podem representar grave ameaça à célula, sendo uma das respostas aos estresses ambientais, como a toxidez por alumínio. Contudo, poucos trabalhos têm relatado os efeitos do Al na parte aérea da planta. Por isso, o objetivo deste trabalho foi verificar a resposta o sistema antioxidante de P.edulis sob tais condições. O estudo do estresse oxidativo induzido por alumínio demonstrou que a expressão do gene Cat e Sod foi aumentada nas plantas em solução nutritiva, e somente na cv. FB100 esse aumento foi acompanhado pelo incremento da atividade enzimática de SOD, o que indica maior eficiência desta na remoção de EROs. As plantas cultivadas em campo demonstraram que a expressão das enzimas antioxidantes na lavoura com alto teor de alumínio não estava ativada no momento da coleta, apesar da elevada atividade de SOD e APX. Esta resposta possivelmente foi determinada pelo tempo prolongado ao qual as plantas estavam expostas ao estresse.

Palavras-chave: Maracujazeiro, alumínio, mRNA, proteômica, catalase, peroxidase do ascorbato, superóxido dismutase.

ABSTRACT

The passion fruit is cultivated in almost all the brazilian territory. The Espírito Santo State currently ranks fourth in production in the country. The production of Espírito Santo, Passiflora edulis, is expanding, given that in recent years there has been an increase in planted area of 500 ha of passion, in 1990 to 2,429 ha in March 2008, reaching 2010 in December, 2800 ha planted. However, most of the production in Espírito Santo is still concentrated in the northern region of the state, especially the municipalities of the Jaguaré and Sooretama. While the numbers show progress in the production of fruit, the Espírito Santo is characterized by acidic soils and high aluminum content. Among the responses triggered by exposure to aluminum are: inhibition of root growth, inhibition of cell division, nutrient deficiency, and the activation of signaling pathways and changes in level of protein and RNA transcripts. Thus, it becomes important to study the components of the antioxidant defense system in plants undergoing exposure to aluminum. The ROS can pose serious threat to the cell, one of the responses to environmental stresses such as toxic aluminum. However, few studies have reported the effects of Al on the plant canopy. Therefore, the objective of this study was to evaluate the response of the antioxidant system P.edulis under such conditions. The study of the oxidative stress induced by aluminum showed that the CAT and SOD gene expression of was increased in plants in the nutrient solution and only cv. FB100 this increase was accompanied by increment enzymatic activity of SOD, indicating the higher efficiency of the removal of ROS. Plants grown in the field showed that the expression of antioxidant enzymes in the crop with high aluminum content was not activated at the time of collection, despite the high activity of SOD and APX. This response was possibly determined by the extended time to which the plants were exposed to stress.

Keywords: Passion fruit, aluminium, mRNA, proteomics, catalase, ascorbate peroxidase, superoxide dismutase.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...15

1.1 Passiflora edulis SIMS...16

1.2 TOXIDEZ DE ALUMÍNIO...19

1.3 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO...22

1.4 ENZIMAS ANTIOXIDANTES...24 1.5 EXPRESSÃO GÊNICA...25 2 OBJETIVOS...27 2.1 OBJETIVO GERAL ...27 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...27 3 MATERIAL E MÉTODOS ...288

3.1 MATERIAL VEGETAL E CONDIÇÕES DE CULTIVO ...288

3.2 CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS AVALIADAS...31

3.2.1 Potencial Hídrico (ψw) ...311

3.2.2 Expressão gênica...311

3.2.2.1 Extração de RNA...31

3.2.2.2 Transcrição reversa...32

3.2.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ...33

3.2.2.4 Desenho de primers e PCR semi-quantitativa...35

3.2.2.5 Sequenciamento ...36

3.2.3 Atividade Enzimática...366

3.2.3.1 Obtenção do extrato protéico bruto ...36

3.2.3.2 Determinação do conteúdo de proteínas solúveis totais ...37

3.2.3.3 Atividade da Catalase...38

3.2.3.4 Atividade da Peroxidase do Ascorbato...38

3.2.3.5 Atividade da Superóxido Dismutase...39

3.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA ...400

4 RESULTADOS...400

4.1 EXPERIMENTO 1 - CASA DE VEGETAÇÃO ...40

4.1.1 Potencial hídrico (ψw)...40

4.1.2 Expressão gênica...41

4.1.3 Sequenciamento...51

4.1.5 Quantificação de proteínas solúveis totais...55

4.2EXPERIMENTO2-CAMPO ... 56

4.2.1 Expressão gênica... 56

4.2.2 Atividade enzimática...59

4.2.3 Quantificação de proteínas solúveis totais...60

5 DISCUSSÃO ...61 6 CONCLUSÕES ...67 7 REFERÊNCIAS...68 ANEXO I...76 ANEXO II...77

1 INTRODUÇÃO

1.1 Passiflora Edulis SIMS

O maracujazeiro é pertencente à ordem Violales e à família Passifloraceae, que compreende 18 gêneros e aproximadamente 400 espécies (CUNHA & BARBOSA, 2002), destas, pelo menos 120 tem o Brasil como centro de origem (BERNACCI et al., 2003). É uma planta trepadeira glabra. As raízes são do tipo axial, o caule é cilíndrico ou angulado, raramente quadrangular, em geral estriado longitudinalmente. As gavinhas são modificações foliares, que servem para prender a planta a suportes. As folhas são alternas, geralmente simples, inteiras ou lobadas, raramente compostas, os pecíolos podem ou não apresentar glândulas nectaríferas que variam de tamanho, número e forma. Estas glândulas ocorrem na margem da bráctea ou na parte dorsal da folha, sendo uma característica importante para a classificação taxonômica. As estípulas são variáveis quanto à forma e bordo, e também são úteis para classificar espécie. As flores reúnem-se em inflorescências e são hermafroditas, actinomorfas, geralmente isoladas ou aos pares nas axilas foliares. O fruto apresenta pericarpo carnoso, indeiscente e várias sementes que caracterizam uma baga, não dividida em lóculos. As sementes são compridas lateralmente, com testa reticulada ou verrugosa, cobertas por arilo saciforme, suculento e colorido (VANDERPLANK, 1996).

Devido à diversidade de cores da casca dos frutos de Passiflora edulis há uma variação em sua designação taxonômica. Em 1932, Otto Degener sugeriu que o maracujá-amarelo teria se originado através de melhoramento genético na Austrália, denominando-o como P. edulis forma flavicarpa. Todavia, a distinção estabelecida para o reconhecimento da forma - cor do fruto, glândulas nas sépalas e corona maior e arroxeada - não se sustenta, pois essas glândulas são comuns na espécie, e a corona tem grande variação de cores, independentemente da cor do fruto. Além disso, o fato de que a coloração externa do fruto ser um caráter de herança complexa e sem dominância, resulta na existência de várias cores intermediárias, e dificulta o reconhecimento das cores extremas. Assim, deve-se utilizar Passiflora

associando-se a elas um nome de cultivar para as seleções (BERNACCI et al., 2008).

Apesar da grande variabilidade genética, representada pela biodiversidade nativa, 95% da área plantada de maracujá no Brasil corresponde a Passiflora edulis, devido à qualidade dos frutos, vigor, suculência e produção (MELETTI & BRÜCKNER, 2001). A produção brasileira de maracujá adquiriu expressão econômica há pouco mais de 25 anos, inicialmente pelo incentivo da agroindústria e, em seguida, pela crescente demanda no mercado de frutas frescas. Atualmente, o maracujazeiro é cultivado em quase todo o território nacional (MELETTI, 2005).

A cadeia produtiva do maracujá apresenta importância crescente na economia brasileira, criando empregos no meio rural e urbano e gerando divisas por meio da exportação de sucos. O maracujá apresenta características interessantes do ponto de vista sócio-econômico, no que concerne à geração de emprego, ocupação de mão-de-obra e a estabilização do fluxo de renda, uma vez que é colhido diversas vezes e de forma continuada por safra, contribuindo para fixação da população no campo, reduzindo o êxodo rural (LEITE et al,1994).

Até o ano de 2009, o Brasil foi maior produtor e maior consumidor mundial de maracujá, sendo a produção dessa frutífera responsável pela colheita em 2009, de mais de 700 mil toneladas em uma área de aproximadamente 50 mil hectares. Entretanto, o país deixou de ser grande exportador para ser importador e, atualmente, o Brasil compra polpa para a fabricação de néctar. O estado do Espírito Santo, com 42 mil toneladas ocupa o quarto lugar em produção, sendo precedido pela Bahia, com 322 mil toneladas, Ceará com 129 mil toneladas e Sergipe com 44 mil toneladas, neste mesmo ano (ANUÁRIO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2011).

O Estado do Espírito Santo possui condições de clima e solo propícias para o plantio do maracujazeiro, o qual apresenta desenvolvimento satisfatório em regiões com temperatura média entre 23 e 25ºC, baixa umidade relativa do ar, alta luminosidade (fotoperíodo superior a 11 horas luz) e ausência de geadas e ventos fortes (COSTA et al., 2008b). Com isso, a produção capixaba, principalmente do maracujá-amarelo

ou maracujá-azedo, Passiflora edulis SIMS, está em expansão, tendo em vista que nos últimos anos houve um aumento na área plantada de maracujazeiro de 500 ha, em 1990, para 2.429 ha, em março de 2008 (IBGE, 2008), atingindo em dezembro de 2010, 2.800 ha plantados. Contudo, a maior parte da produção capixaba ainda se concentra na região norte do Estado, com destaque para os municípios de Jaguaré e Sooretama (INCAPER, 2010).

O mercado de suco e de fruta “in natura” tem crescido substancialmente nos últimos anos, apresentando, por conseqüência, uma evolução da área cultivada com elevação da produção, quando comparada com as décadas anteriores (COSTA et al., 2008a) devido à sua adaptação às condições climáticas de diferentes regiões e a sua boa rentabilidade (INCAPER, 2007).

As perspectivas de médio e longo prazo para os produtores de maracujá para fins agroindustriais no Espírito Santo são bastante positivas, em razão do parque agroindustrial instalado no Estado, a exemplo do Pólo de Passiflora edulis do Espírito Santo, instituído em 2004 pelo Governo do Estado, por meio da Secretaria Estadual de Agricultura (Seag) e do Instituto Capixaba de Pesquisa Agropecuária (Incaper), tem estimulado a expansão da área plantada e a diversificação da agricultura e também da tendência de expansão do mercado mundial da polpa e do suco. Além disso, uma nova área de abrangência de produção de maracujá foi criada no Sul do Estado, devido à localização estratégica e às condições de clima e solo propícias ao cultivo da fruta (INCAPER, 2010).

De acordo com dados do INCAPER (2010), no Brasil tem aumentado o consumo de bebidas à base de frutas, com destaque para o maracujá, um dos sabores preferidos dos consumidores. No Espírito Santo, de dezembro de 2007 a outubro de 2009, somente para indústria foram comercializadas 1,8 mil toneladas de maracujá, o que gerou uma renda de 1,2 milhão.

A correta seleção de cultivares para um determinado ambiente de cultivo e sistema de produção é de suma importância para uma boa produtividade. Contudo, a seleção de forma adequada não é suficiente para o sucesso da cultura. É

necessário, além disso, que a cultivar tenha características que atendam às exigências de comerciantes e consumidores (FREIRE FILHO et al., 2000).

É crescente a necessidade de desenvolvimento de estudos sobre a fisiologia de frutíferas visando o prolongamento da vida pós-colheita dos frutos, aumento da produtividade, bem como conhecer os níveis de sensibilidade e tolerância aos diferentes estresses ambientais, tais como toxidez de alumínio, seca, alagamento, salinidade e potencial sensibilidade às doenças. Visto que a fruticultura corresponde à importante atividade na economia do Espírito Santo, o estabelecimento de genótipos de Passiflora edulis melhor adaptados as condições de cultivo do Estado é fundamental para um aumento da produtividade desses frutos.

Duas cultivares de Passiflora edulis SIMS foram avaliadas neste trabalho: FB100 e FB200. O maracujá FB200, também conhecido como “YELLOW MASTER", tem como principal destinação o mercado de frutos “in natura”. Seus frutos apresentam tamanho e cor uniformes, além de apresentar a casca mais espessa, o que proporciona maior resistência durante o transporte. Seu rendimento de suco situa-se em torno de 36% do peso médio do fruto de 240 gramas, enquanto o brix tem média de 14,0º e o potencial produtivo é aproximadamente 50 ton/ha/ano. Por outro lado, a cultivar FB100, conhecida como ”MAGUARY”, tem a finalidade de suprir a indústria de sucos. É uma variedade resultante de 20 anos de melhoramento genético, de boa qualidade produtiva e frutos desuniformes em tamanho, forma e cor. Possui alto rendimento de suco (cerca de 42%). A polpa apresenta cor amarelo-alaranjado com brix em média de 15,0º. O potencial produtivo é, também, em torno de 50 ton/ha/ano, sendo o peso médio do fruto de 120 gramas (VIVEIRO FLORA BRASIL, 2008).

1.2 TOXIDEZ DE ALUMÍNIO

Entre os fatores do ambiente prejudiciais ao desenvolvimento das culturas, o alumínio (Al) presente na solução do solo representa um dos principais agentes responsáveis pela redução da produtividade (PANDA & MATSUMOTO, 2007; VOSS

et al., 2006; CANÇADO et al., 2001), principalmente por causar inibição do

de água (ZHENG & YANG, 2005). Ao mesmo tempo, o Al é o metal mais abundante da crosta terrestre e, em concentrações da ordem de micromolares, provoca alterações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas em plantas de diversas culturas, cujos efeitos nocivos e de severidade variam de acordo com a espécie e a cultivar (KOCHIAN et al., 2004).

Plantas afetadas pelo Al frequentemente apresentam sintomas de deficiência de nutrientes, tais com fósforo (P), cálcio (Ca), magnésio (Mg), potássio (K) e molibdênio (Mo), devido à interferência do Al nos processos de absorção, transporte e uso destes nutrientes (FREITAS et al., 2006; BASSO et al., 2003;). A disponibilidade de P para as plantas é altamente afetada em situação de pH baixo, visto que os óxidos e hidróxidos de Al têm uma capacidade de reter este elemento muito maior que as argilas (BISSINI et al., 2006). A inibição da absorção de Ca provocada pela presença do Al tóxico ocorre de forma rápida e reversível, podendo estar associada a mudanças da homeostase celular e bloqueio de canais de Ca na membrana plasmática, afetando processos como mitose, citocinese, geotropismo, crescimento polar, correntes citoplasmáticas e sinalização celular (KOCHIAN, 1995). Estudos têm indicado que interações do Al com elementos envolvidos na transdução de sinais responsáveis pela comunicação da célula com o ambiente são eventos primários da toxidez causada pelo Al, ocasionando rápidas disfunções metabólicas na planta (JONES & KOCHIAN, 1995). Além disto, o Al também possui efeitos prejudiciais sobre moléculas de ácidos nucléicos, principalmente por modificar a conformação espacial da dupla hélice devido a interações com as cargas residuais dos grupamentos fosfato, reduzindo ou inibindo a divisão celular (FOY et al., 1978). Na parede celular, o Al pode promover o aumento na síntese de lignina, resultante da injúria nas células, prejudicando o processo de elongação radicular (SASAKI et al., 1996). Este íon metálico ainda interfere na permeabilidade da membrana plasmática por provocar alterações na fluidez e na densidade do empacotamento dos fosfolipídios, resultante da ligação eletrostática de formas catiônicas de Al a regiões polares dos fosfolipídeos, ou à interação com proteínas de membrana (RENGEL, 1996).

Contudo, poucos trabalhos têm relatado os efeitos do Al na parte aérea da planta. Segundo RYAN et al. (1993), as plantas começam a apresentar os danos induzidos pelo Al, na parte aérea, após maior tempo de exposição ao estresse, sendo que estes danos parecem ser consequência dos ocorridos nas raízes.

O alumínio em níveis tóxicos está presente em 50% das áreas com potencial agrícola do mundo, além disso, a acidez nos solos tem se agravado com o extensivo uso de fertilizantes derivados de amônia (ZHANG et al., 2007). No Brasil, a expansão do plantio direto nas áreas formadas por latossolos e argissolos, nos quais a aplicação do calcário para correção da acidez é realizada superficialmente, aumenta a importância de cultivares tolerantes à toxicidade do alumínio, em razão do menor tempo de resposta para adequação do pH e consequente diminuição da toxicidade do alumínio (CAIRES et al., 2008). De modo geral, o Al em teores tóxicos pode estar localizado em todo o perfil do solo e sua neutralização é temporariamente obtida com a calagem apenas na camada arável, devido à baixa mobilidade dos corretivos aplicados (CaCO3 + MgCO3, CaO, CaOH) e ao elevado custo da correção em profundidade (CANÇADO et al., 2001).

A toxidez causada pelo alumínio é acentuada para plantas cultivadas em solos ácidos, principalmente em pH abaixo de 5,0. Em soluções ácidas (pH<5,0) o Al se

apresenta na forma Al(H2O)63+, caracteristicamente tóxica para as plantas

(BEUTLER et al., 2001). Porém, se ocorre o aumento do pH, esta molécula sofre

hidrólise, com a formação dos complexos mononucleares Al(OH)2+ _{e Al(OH)}

2+

(ROSSIELLO & JACOB NETTO, 2006). Em pH neutro é formada a gibsita, Al(OH)3,

relativamente insolúvel, e no pH comumente estabelecido no citoplasma da célula

(pH 7,4), o íon aluminato, Al(OH)4-, é a forma dominante (KOCHIAN, 1995).

Magnago et al. (2010) relataram que no município de Vila Velha/ES os solos, predominatemente latossolos, apresentam pH bastante ácido com conseqüente disponibilização de íons Al3+. Da mesma forma, Effgen et al. (2008) estudando os atributos químicos do solo do município de Jerônimo Monteiro/ES, também encontraram alto teor Al e baixo pH. Visto que o baixo pH e a alta concentração de Al são condições encontradas no solo do Espírito Santo, torna-se fundamental conhecer o comportamento de espécies cultivadas sob estas condições, afim de

estabelecer genótipos de Passiflora edulis melhor adaptados as condições de cultivo no estado do Espírito Santo e promover aumento da produtividade dessa frutífera.

1.3 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO

O oxigênio molecular (O2) é o principal aceptor biológico de elétrons e tem papel

fundamental nas funções celulares. Entretanto, junto às propriedades benéficas do O2, ocorre a formação das espécies reativas de oxigênio (EROs), como o superóxido

(O2-), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (OH-). Situações de

estresse podem intensificar a produção de EROs, aumentando a oxidação dos componentes celulares, o que pode causar danos ao organismo. Nesse caso, as EROs funcionam com sinalizadores de uma resposta aos mais diversos estresses (MITTLER et al, 2004), como a toxidez por alumínio.

Mesmo sob condições ideais, EROs são formadas em muitos processos metabólicos, incluindo os que ocorrem nos cloroplastos, nas mitocôndrias e nos sistemas de transporte de elétrons através das membranas. A imposição a estresses bióticos ou abióticos podem elevar a concentração de EROs excessivamente, causando danos oxidativos em nível celular (SHIGEOKA et al., 2002). As EROs tem efeitos desastrosos em macromoléculas celulares, como DNA, RNA, proteínas e lipídeos. Induzem a peroxidação lipídica causando danos irreversíveis na estrutura da membrana e em sua integridade funcional (SMIRNOFF, 1993).

Superóxido de Oxigênio (O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (OH-)

são produzidos por sucessivas reduções univalentes do oxigênio (SMIRNOFF, 1993):

O

+e

_O

(1)

O

_{+ e}

_{+ H}

_H

O

(2)

H

O

+ e

_{+ H}

_OH

_{+ H}

O (3)

OH

_{+ e}

_{+ H}

_H

O (4)

O

+e

_O

(1)

O

_{+ e}

_{+ H}

_H

O

(2)

H

O

+ e

_{+ H}

_OH

_{+ H}

O (3)

OH

_{+ e}

_{+ H}

_H

O (4)

Contudo, as EROs são consideradas como “subprodutos inevitáveis” do metabolismo aeróbico, sendo continuamente produzidos e removidos das células por mecanismos não enzimáticos e enzimáticos (MITLER, 2002). Estes últimos incluem: catalases, peroxidases e superóxido-dismutases, que convertem EROS em espécies menos reativas (SCANDALIOS, 2005).

A formação de oxigênio singleto (1O2) ocorre na fotossíntese durante o processo de

dissipação de energia de moléculas de clorofila excitadas associadas ao fotossistema II (MÜLLER et al., 2001). Os radicais superóxido podem ser produzidos espontaneamente durante a etapa fotoquímica da fotossíntese, através da transferência direta de um elétron de moléculas associadas ao fotossistema I para o oxigênio molecular (APEL & HIRT, 2004). Os radicais superóxido gerados podem originar o H2O2 espontaneamente ou pela reação catalisada pela SOD. O peróxido

de hidrogênio é quebrado em água e oxigênio molecular pela catalase, enzima localizada nos peroxissomos e glioxissomos. No cloroplasto essa função é da enzima peroxidase do ascorbato, que possui isoformas para agir também no citosol. O H2O2 e o O2- são comparativamente menos danosos que outras EROs, porém

podem gerar espécies extremamente reativas, como os radicais hidroxílicos (ARORA et al.,2002).

O alumínio, bem como outros fatores, induz a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), levando a oxidação de biomoléculas (YAMAMOTO et al., 2002). A peroxidação lipídica é considerada um evento secundário e posterior à ação do Al (YAMAMOTO et al., 2001). Evidências que reforçam esta hipótese estão pautadas em correlações estabelecidas entre a exposição ao Al e aumento na produção de EROs, maior atividade de algumas enzimas e, ou concentração de metabólitos. No entanto, ainda não está perfeitamente esclarecido o mecanismo pelo qual o Al intensifica a formação de EROs (DARKÓ et al., 2004).

1.4 ENZIMAS ANTIOXIDANTES

A catalase (EC 1.11.1.6) é uma enzima tetramérica que contém um grupamento heme em cada subunidade (HORVÁTH et al., 2002) e é encontrada em todos os organismos aeróbicos. A catalase (CAT) decompõe H2O2, produzido durante a

fotorrespiração (QURESHI et al, 2007) e a β-oxidação de ácidos graxos, em água e oxigênio molecular. As CATs estão localizadas predominantemente nos peroxissomos, não sendo encontradas nos cloroplastos (RESENDE et al., 2003).Por causa de sua larga distribuição, conservação evolutiva e capacidade de degradar rapidamente o peróxido de hidrogênio, a CAT foi de extrema importância nos sistemas que evoluíram para permitir que organismos pudessem habitar ambientes aeróbicos (SCANDALIOS, 2005). Devido as diferentes afinidades de CATs (baixa afinidade, mM) e APXs (alta afinidade, µM) pelo H2O2, as CATS são responsáveis

pela remoção do excesso de EROs, ao passo que as APXs atuam na modulação fina de EROs (MITLER, 2002).

Os genes Cat respondem diferencialmente a vários estresses conhecidos que geram EROS (SCANDALIOS, 2005). As plantas possuem várias isoformas de CAT presentes nos peroxissomas e glioxissomas. Podem ser dividas em três classes: catalases da classe 1 removem o H2O2 produzido durante a fotorrespiração em

tecidos fotossintéticos; catalases da classe 2 são produzidas em tecidos vasculares e podem exercer uma função de lignificação mas, sua exata função biológica permanece desconhecida; e na classe 3 estão as catalases presentes abundantemente em sementes e plantas jovens, e cuja atividade está relacionada à remoção do H2O2 produzido durante a degradação dos ácidos graxos no glioxissoma

(BREUSEGEM et al., 2001).

As peroxidases participam de alguns processos fisiológicos como lignificação, suberização, catabolismo de auxina, tolerância à salinidade, mecanismos de defesa contra patógenos e herbivoria (HIRAGA et al., 2001). As peroxidases são proteínas do grupo heme que catalisam a oxidação de grande variedade de substratos através da reação com peróxido de hidrogênio. Além de maior distribuição na célula, as peroxidases apresentam menor massa molecular que as CATs, o que contribui para sua maior mobilidade entre os compartimentos celulares (YOSHIDA et al., 2003).

Pouco se conhece a respeito da indução de peroxidases por metais, mas o aumento na atividade destas enzimas é uma resposta a maioria dos metais que podem causar danos (FANG & KAO, 2000).

A peroxidase do ascorbato (APX - EC 1.11.1.7) usa o ascorbato como doador de elétrons específico para reduzir H2O2 à água e oxigênio molecular, com

concomitante geração de monodehidroascorbato. O modehidroascorbato é espontaneamente degradado em ascorbato e dehidroascorbato. O modehidroascorbato é também diretamente reduzido à ascorbato por ação de NADPH, dependente de monodehidroascorbato redutase (ASADA, 1997).

As superóxido dismutases (SOD - EC 1.15.1.1) são metaloenzimas responsáveis pela dismutação do radical O2- em H2O2 e oxigênio molecular. As SODs

apresentam-se na forma de 3 isoenzimas, de acordo com o íon metálico constituinte do grupo prostético: Mn-SOD, Cu/Zn-SOD e Fe-SOD (ARORA et al., 2002). Essas formas isoenzimáticas são encontradas em diferentes compartimentos celulares: Mn-SOD é encontrada nas mitocôndrias e peroxissomos, Fe-SOD principalmente nos cloroplastos e Cu/Zn-SOD nos cloroplastos, citosol e possivelmente, no espaço extracelular (ALSCHER et al., 2002).

O peróxido de hidrogênio, formado pela dismutação espontânea do radical superóxido ou pela reação catalisada pelas SODs é eliminado do metabolismo celular por ação de enzimas CATs e APXs (ARORA et al., 2002). Dessa forma, a atividade balanceada das referidas enzimas torna-se crucial na manutenção dos níveis de O2- e H2O2 (MITLER, 2002).

1.5 EXPRESSÃO GÊNICA

O acúmulo de EROs como resposta a condições de estresse ocorre pela falta de capacidade de desintoxicação inata ou pela inibição de enzimas de desintoxicação, como a catalase (JONES et al., 2006). A primeira hipótese tem sido mais aceita em razão das contundentes evidências de aumento na expressão de genes que codificam proteínas do sistema de defesa antioxidante quando da exposição ao Al

(EZAKI et al., 2000). Estes genes codificam enzimas como catalase, peroxidade do ascorbato e superóxido dismutase.

Em Arabidopsis thaliana foi observado que o alumínio induz a expressão de genes ligados ao estresse oxidativo, que constitui um importante componente das respostas das plantas a níveis tóxicos de alumínio (CORRALES et al, 2008) por ocasionar a ativação de enzimas antioxidantes. A identificação de genes e proteínas regulados por H2O2 é um passo importante para os procedimentos que possam

conferir tolerância para múltiplos estresses (SCANDALIOS, 2005).

Análises quantitativas de ácido nucléico têm tido relevância em muitos campos de pesquisa, sendo as medidas de expressão gênica extensivamente monitoradas em respostas biológicas a vários estímulos (HUANG et al., 1995).

A técnica do PCR semi-quantitativo compreende importante ferramenta no estudo da expressão gênica. Essa técnica é baseada na comparação dos níveis de amplificação em PCR’s com números de ciclos diferentes, sendo uma rápida e confiável maneira de quantificar determinado mRNA presente em pequena quantidade na amostra (REY et al., 2000).

Para o estudo da expressão de genes de plantas expostas ao Al é indispensável que o RNA extraído seja íntegro, pois a Reverse Transcription Polymerase Chain

Reaction (RT-PCR) é o mais sensível método de detecção de seqüências de RNA

mensageiro (mRNA). A técnica é complexa, com problemas associados a sua sensibilidade, reprodutibilidade e especificidade, os quais podem ser consequência de uma amostra inicial de RNA limitada ou de baixa qualidade. Este estudo em plantas pode ser tecnicamente dificultado devido a grande quantidade de compostos presentes nesses organismos (MEISEL et al., 2005), Estes compostos possuem tendência de precipitarem juntamente com o RNA por propriedades físico-químicas similares, afetando a qualidade e a quantidade das amostras (ASIF et al., 2000). Além disso, as ribonucleases (RNAses) endógenas reduzem a integridade do RNA. A extração de RNA requer o rompimento das células, fazendo com que essas enzimas, retidas no interior das organelas, extravasem e reajam com ácidos nucléicos, polissacarídeos e polifenóis, formando complexos insolúveis (AZEVEDO

et al., 2003)., reduzindo a qualidade do produto final da extração. Folhas de P.

edulis são ricas em compostos secundários como flavonóides, alcalóides,

glicosídeos cianogênicos, monoterpenóides e saponinas (LORENZI & MATOS, 2002), que dificultam o processo de extração de RNA, principalmente por desencadearem processos oxidativos.

As implicações da toxicidade de Al para o estresse oxidativo têm sido bastante investigadas em raízes de diversas espécies vegetais (BOSCOLO et al. 2003). Entretanto, poucas informações estão disponíveis quanto aos danos induzidos por Al nos tecidos foliares. Nesse sentido, o presente trabalho teve por objetivo investigar possíveis mudanças na atividade enzimática e expressão de genes em folhas de maracujazeiro quando da exposição ao Al.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Verificar a resposta do sistema antioxidante do maracujazeiro (Passiflora edulis SIMS) sob diferentes concentrações de Al em solução nutritiva e em campo.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Verificar se diferentes concentrações de Al em solução por 10 dias podem afetar o potencial hídrico das cultivares FB 100 e FB 200 em solução nutritiva;

• Identificar possíveis efeitos isolados do pH ácido em P.edulis cultivado em solução nutritiva;

• Avaliar o padrão de expressão relativa dos transcritos dos genes cat, apx e sod em maracujá cultivado em solução nutritiva e em campo;

• Desenhar primers específicos para os genes em estudo, a partir de sequências obtidas com primers inespecíficos;

• Analisar o comportamento enzimático (CAT, APX E SOD) relacionado ao estresse oxidativo em resposta a exposição ao alumínio;

• Utilizar os resultados gerados como indicadores de genótipos de Passiflora

edulis melhor adaptados as condições de cultivo do Estado.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MATERIAL VEGETAL E CONDIÇÕES DE CULTIVO Experimento 1: Casa de vegetação

O experimento foi realizado em casa de vegetação com controle de temperatura, localizada no campus de Goiabeiras da Universidade Federal do Espírito Santo/UFES (20º18’52’’S e 40º19’06’’W). Foram utilizadas sementes de Passiflora

edulis SIMS cv. FB 100 (“Maguary”) e FB200 (“Yellow Master”). As sementes foram

esterilizadas com solução de ácido clorídrico 5% por 15 min, lavadas em água corrente e embebidas com água por 12h. Foi realizada a semeadura das sementes em areia lavada e esterilizada com solução de ácido clorídrico 5% por 1h. A germinação ocorreu após 15 dias (Figura 1a). Quando as plântulas atingiram 5 cm de comprimento, em média, foram transplantadas para vasos de capacidade de 4,5L preenchidos com areia de quartzo lavada. Cada unidade experimental foi definida como um vaso contendo uma planta, sendo 5 repetições por tratamento, totalizando 158 plantas (Figura 1b). Estas foram regadas, três vezes por semana, com 200 mL de solução nutritiva modificada (HOAGLAND & ARNON, 1950) ½ força (tabela 1), mantidas sob temperatura de 28 °C (±2) e fotoperíodo natural.

a) b)

FIGURA 1: (a) Plântulas de P. edulis com 5 cm em média; (b) Vasos contendo uma planta de P.

TABELA 1: Composição da solução nutritiva de Hoagland e Arnon (1950).

Componente Peso molecular Concentração na solução nutritiva KH2PO4 136,09g 4mM KNO3 101,11g 4mM MgCl2.6H2O 203,33g 1mM MgSO4.7H2O 246,49g 3mM CaCl2.2H2O 147,02g 3mM NaNO3 84,99g 2mM NH4NO3 80,04g 1mM H3BO3 61,83g 0,0092mM ZnSO4.7H2O 287,54g 0,0003mM CuSO4.5H2O 249,68g 0,00006mM MnCl2.4H2O 197,91g 0,00036mM Na2MoO4.2H2O 241,95g 0,00012mM Fe-EDTA --- 0,0038mM CaSO4 172,17g 1,2mM

A indução ao estresse iniciou quando as plantas atingiram 45 dias após o transplantio e teve a duração de 10 dias. Os tratamentos foram: controle (pH 6-6,5); controle pH 4; 0,2mM Al3+ (pH 6-6,5) e 2mM de Al3+ (pH 6-6,5). O Al foi adicionado na forma de AlCl3. Durante o tratamento, as plantas receberam 200 mL de solução

nutritiva acrescida de solução de Al-EDTA com o objetivo de disponibilizar todo o Al adicionado. Os sais AlCl3 e EDTA foram utilizados em quantidades equimolares para

a preparação da solução de Al-EDTA (MENDHAM et al., 2002). O pH das soluções nutritivas foram ajustados com solução de HCl ou NaOH.

A água utilizada na preparação da solução nutritiva aplicada nas plantas durante o experimento foi enviada para análise no Laboratório de Análise Agronômica e Ambiental - Fullin/Linhares-ES (Tabela 2).

TABELA 2: Resultado de análise de água utilizada no preparo de solução nutritiva.

Parâmetro Amostra de água

Condutividade elétrica dS/m 0,09

pH 6

Razão de Adsorção de Sódio 0,29 Ferro reduzido (mg/L) Nd Ferro oxidado (mg/L) Nd Ferro total (mg/L) 0,06 Sódio (meq/L) 0,16 Cloro (meq/L) 0,1 Carbonato (CO3-2) (MG/L) Nd Dureza (CaCO3) (mg/L) 32,47 Bicarbonato (HCO3-2) (mg/L) Nd Sulfato (SO4-2) 0,22 Fosfato (PO4-2) (mg/L) 0,09 Potássio (mg/L) 1,8 Cálcio (meq/L) 0,51 Magnésio (meq/L) 0,14 Boro (mg/L) 0,02 Manganês (mg/L) 0,01 Zinco (mg/L) 0,01 Cobre (mg/L) 0,01 Alumínio (mg/L) 0,08 Nitrogênio (mg/L) 0,38

As folhas coletadas para análise, nos tempos 0h, 2dias, 5dias e 10dias, foram instantaneamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em ultra-freezer à -80ºC.

Experimento 2: Campo

Para a determinação do teor de nutrientes presentes nas lavouras, amostras de solo de cada lavoura foram coletadas e levadas para análise em laboratório especializado Fullin/Linhares-ES (Anexo I).

O experimento foi realizado em três lavouras de em média um ano de idade localizadas no município de Jaguaré/ES, nas quais através de análise de solo, foram encontradas diferentes concentrações de Al, sendo elas 0 de Al(pH 6), 0,33 mM de Al (pH 5,6) 2,66 mM de Al (pH 4,7). Segundo o sistema UTM (WGS84) de coordenadas, as fazendas se localizam a X: 0390038 Y: 7903486 e a 52 m do nível do mar (lavouras 0 Al pH 6 e 0,33 Al pH 5,6) e a X: 0387968 Y: 7901355 a 2m do nível do mar (lavoura 2,66 mM pH 4,7).

3.2 CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS AVALIADAS 3.2.1 Potencial Hídrico (ψw)

O potencial hídrico foi medido na antemanhã, entre 5 e 6h, utilizando-se uma bomba de pressão do tipo Scholander. As medidas foram realizadas em três folhas por tratamento. Todas as análises foram realizadas na terceira ou quarta folha, a partir do ápice em direção a base, consideradas jovens e completamente expandidas. As plantas foram retiradas da casa de vegetação ao final da tarde anterior a cada coleta de dados.

3.2.2 Expressão gênica 3.2.2.1 Extração de RNA

Para o estudo da expressão gênica realizou-se extração de RNA das amostras de folhas das cultivares FB100 e FB200 de Passiflora edulis coletadas em tempo zero, 5 dias e 10 dias. O material vegetal foi pulverizado em almofariz de porcelana e pistilo com nitrogênio líquido. Aproximadamente 100mg de tecido vegetal pulverizado foi reservado em microtubo tipo eppendorf e armazenado em ultra-freezer à -80 ºC. Foi organizado um esquema de repetições em 3 pools, cada um contendo 4 amostras diferentes (Figura 2), utilizados em todos os tratamentos, com intuito de redução do erro experimental.

planta 1 planta 2 planta 3 planta 4 planta 5

1 2 3 4

1 2 4 5

2 3 4 5

3 Pools

planta 1 planta 2 planta 3 planta 4 planta 5

1 2 3 4

1 2 4 5

2 3 4 5

3 Pools

FIGURA 2: Esquema de repetições para extração de RNA de plantas de P. edulis.

Para a extração de RNA total, utilizou-se o TRIzol Reagent (Invitrogen®_{), segundo}

recomendações do fabricante. O RNA resultante foi quantificado em espectrofotômetro NanoDrop 3300 Termo Scientific (260nm e a 280nm), submetido à corrida em gel de agarose (2%) corado com GelRedTM _(BIOTIUMTM_{) e visualizado}

em transiluminador-UV. As amostras de RNA foram tratadas com DNAse I

AmpGrade (Invitrogen®), a fim degradar qualquer fragmento de DNA pré-existente.

3.2.2.2 Transcrição reversa

O RNA extraído de amostras submetidas a tratamento com TRIzol foi utilizado para a RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) tendo como controle o gene constitutivo da unidade ribossomal 18S, para teste de amplificação.

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir do poli T do RNA, com oligoDT como primer (iniciador), a enzima transcriptase reversa e desoxirribonucleotídeos provenientes do kit GoScript™ (Promega®_{), além do tratamento com RNAse para}

realizadas segundo as instruções do fabricante. As amostras de cDNA foram quantificadas em NanoDrop 3300 (Termo Scientific) (260nm e a 280nm) e diluídas em água livre de nucleases para a padronização da concentração de 500ng.µL-1.

3.2.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Para a amplificação de DNA, a partir dos fragmentos de cDNA obtidos, foram sintetizados primers para cada gene que se desejava analisar, como apresentado na tabela 3.

TABELA 3- Sequências dos primers utilizados no estudo de expressão gênica.

Primer Sequência senso Sequência antisenso Referência

18s 5’-TGACGGAAGAATTAGGGTTCG-3’ 5’-GACTTGCCCTCCAATGGATC-3’ AZEVEDO, 2008

Cat 5´-CTGCTGGAAACTATCCTGAGTG-3´ 5´-ATTGACCTCTTCATCCCTGTG-3´ BALESTRASSE et al., ₂₀₀₈

Apx 5′-GCATGGCACTCTGCTGGTAC-3′ 5′-GAGAAATATGCTGOGGATGA-3’ KAWAKAMI et al., ₂₀₀₂

Sod 5´-CTACGTCGCCAACTACAACAAG-3’ 5´-GTAGTACGCATGCTCCCAGAC-3’ BAEK & SKINNER, ₂₀₀₅

O primer 18s, correspondente ao gene da subunidade ribossomal 18s, foi utilizado como controle interno. Os primers Cat, Apx e Sod, foram utilizados a fim de amplificar fragmentos dos genes Cat, Apx e Sod, que codificam as proteínas Catalase, Peroxidase do Ascorbato e Superóxido Dismutase, respectivamente. A escolha dos primers foi realizada a partir de levantamento bibliográfico e a seleção deu-se por meio do alinhamento desses primers com sequências depositadas no

GeneBank (NCBI), através do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool

As concentrações dos componentes da Polymerase Chain Reaction (PCR) foram testadas e uma reação padrão (mix), mostrada na tabela 4, foi estabelecida e utilizada para amplificação com todos os primers.

TABELA 4: Componentes e concentrações da reação padrão (mix) para PCR.

Componentes Volume (µL) Concentração Final

Tampão PCR (10X) 2,5 1x

MgCl2 (50mM) 1,5 3 Mm

dNTP mix (10mM cada) 1,0 2,5 Mm

Água Ultrapura Autoclavada 17,7 40 µM

Primer senso 0,5 0,2 pmol/µL

Primer antisenso 0,5 0,2 pmol/µL

cDNA (500ng/µl) 1,0 20 ng/µL

Taq DNA Polymerase (5U/µl) 0,3 1,5U/reação

Volume Final 25

Foram utilizados em todas as PCR´s o tampão PCR (Invitrogen®), MgCl2

(Invitrogen®), dNTP mix (Invitrogen®) e TaqPolimerase Platinum (Invitrogen®), segundo instruções do fabricante. As condições de PCR, perfil de reação, foram diferenciadas de acordo o primer utilizado, sendo realizadas em termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Apllied BiosystemsTM).

O primer 18s foi submetido à desnaturação inicial à 95ºC por 1min e 30 s, seguida de 32 ciclos de: desnaturação à 95ºC por 1 min e 10 s, anelamento à 53ºC por 1 min e extensão à 72ºC por 1 min e 45 segundos. A etapa de extensão final foi à 72ºC por 5 minutos (AZEVEDO, 2008).

Para o primer Cat, a amplificação dos fragmentos de cDNA deu-se segundo as condições de 94ºC por 1 min para desnaturação inicial, e 32 ciclos a 94ºC por 30 s,

54ºC por 1 min e 72ºC por 1 min, com uma extensão final a 72ºC por 7 min (BALESTRASSE et al, 2008).

Para Sod foi promovida a extensão do fragmento a partir de 3 minutos de desnaturação inicial à 95ºC, 32 ciclos de 15s a 95ºC, 20s a 54ºC, e 17s a 72ºC, com extensão final a 72ºC por 7min (BAEK & SKINNER, 2005).

O fragmento produzido pelo primer Apx originou-se nas condições de 94ºC por 2 min e 32 ciclos de 94ºC por 15s, 45ºC por 30s, 72ºC por 1 min, e extensão final de 7 min a 72ºC (KAWAKAMI et al, 2002, com modificações).

3.2.2.4 Desenho de primers e PCR semi-quantitativo

A partir das sequências obtidas pela amplificação com os primers Sod e Cat foram desenhados primers específicos para esses genes. Com esse objetivo foram utilizados os programas Primer 3 e Gene Runner (Tabela 5).

TABELA 5: Sequências dos primers desenhados para o estudo da expressão gênica.

Primer específico Sequência senso Sequência antisenso

Cat 5´-GTCAACCCGCAAACCACAA-3´ 5´-ACACCCATAGGCACCGTCT-3´

Sod 5´-TCCAACCCGATAACTGTG -3’ 5´-TCTGGTGACGAAGGGAGC -3’

Com o objetivo de analisar a expressão dos genes por RT-PCR semi-quantitativo, além do número de ciclos descritos no item anterior, cada um dos primers foi submetido a perfil de reação com 25, 20 e 15 ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Os produtos amplificados foram submetidos à corrida em gel de agarose 2%, corados com GelRedTM (BIOTIUMTM) e visualizados em transiluminador UV. Os géis foram fotografados e as bandas de DNA analisadas com o programa ImageJ.

3.2.2.5 Sequenciamento

Os fragmentos de DNA obtidos dos PCR´s realizados foram sequenciados a fim de que fosse confirmada por alinhamento a identidade dos mesmos. O sequenciamento das amostras foi realizado no Núcleo de Genética Animal e Conservação da Biodiversidade – UFES, utilizando o sequenciador automático de DNA Applied

Biosystems modelo 310.

As amostras de DNA amplificado foram purificadas com a enzima Exosap

(Invitrogen), na proporção de 1µL de enzima para cada 10µL de produto de PCR. A

reação de purificação foi realizada a 37 ºC por 30min, seguida por etapa a 80 ºC por 15min. Na reação de seqüenciamento, os DNA-moldes (1µL) foram marcados utilizando-se 0,64µL de primer 5µM, sendo utilizado um por vez, 3,5µL de tampão, 0,5µL de reagente BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing RR-100 (Applied Biosystems), completando-se o volume final de 10µL com água ultrapura. As reações de purificação e sequenciamento foram realizadas em termociclador Veriti®

96-Well Thermal Cycler (Apllied BiosystemsTM). As etapas da reação de

seqüenciamento foram as seguintes: desnaturação inicial a 96 ºC por 1 min seguida de 25 ciclos de 96 ºC por 10 s, 50 ºC por 5 s e 60 ºC por 4 min. Após marcadas, as amostras foram purificadas pela precipitação com isopropanol e lavagem com etanol 70 %. Os produtos precipitados foram submetidos à secagem por 5min a 95 ºC. As sequências foram analisadas pelo Applied Biosystems DNA Sequencing Analysis

Software v. 5.1.

3.2.3 Atividade Enzimática

3.2.3.1 Obtenção do extrato protéico bruto

Para as análises da atividade das enzimas antioxidantes foram retiradas a primeira folha jovem completamente expandida de cinco plantas de cada tratamento. No momento da coleta, cada folha foi imediatamente embalada em papel alumínio, congelada em nitrogênio líquido e armazenada em ultra-freezer a -80°C. Para obtenção do extrato protéico, foram macerados em almofariz 0,2 g de tecido foliar

com 2%(p/v) de polivinilpolipirrolidona (PVPP). Em seguida, foi acrescentado 1500µL de solução de extração contendo: 750µL de tampão fosfato de potássio 100mM (pH 6,8), 15µL de EDTA 10 mM, 150µL de ácido ascórbico 100mM e 585µL de água ultra pura. Os restos celulares foram removidos por centrifugação por 15 min a 13000g a 4ºC em centrífuga refrigerada. O sobrenadante foi coletado, armazenado em um eppendorf e congelado em ultra-freezer a -80°C. Este extrato foi utilizado nas análises de atividade enzimática e quantificação de proteínas solúveis totais.

3.2.3.2 Determinação do conteúdo de proteínas solúveis totais

Para a determinação do conteúdo proteínas solúveis totais foi utilizada a metodologia proposta por Bradford (1976), utilizando-se uma curva padrão de BSA.

Para o preparo de cada 100mL do reagente de cor, 10mg de Comassie Brilliant Blue G250 foi dissolvido em 4,7mM de etanol absoluto. À mistura, foram adicionados 10mL de ácido fosfórico (H3PO4 85% p/v) e completou-se o volume para 100mL com

água deionizada. A solução obtida foi filtrada com papel de filtragem média no dia de cada leitura. O reagente de cor foi mantido em frasco escuro em geladeira.

Para a obtenção da curva padrão, foram preparados seis tubos de ensaio contendo 5 mL de reagente de cor e, nos tubos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 foram acrescentados respectivamente 100µL, 80 µL, 60 µL, 40 µL, 20µL e 0 µL de água ultra pura e 0µL, 20µL, 40µL, 60µL, 80µL, 100µL de solução de Bovine Serum Albumine (BSA) na concentração de 1mg/mL. Os tubos foram vortexados e incubados à temperatura ambiente por 5 min. As amostras foram lidas em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis) a 595 nm utilizando-se o tubo 1 como branco.

O resultado das leituras de cada amostra foram plotados em um gráfico para a obtenção de uma fórmula de regressão linear. Os valores das leituras em espectrofotômetro foram aplicados nesta fórmula para obtenção do conteúdo de proteínas em cada amostra.

3.2.3.3 Atividade da Catalase

Para a determinação da atividade bruta da catalase foram adicionados 25µL do extrato protéico bruto e 200 µL de H2O2 250 mM a um tubo de ensaio contendo

1,775 mL água ultra pura e 2mL de tampão fosfato 100mM (pH 6,8).A temperatura foi mantida constante por imersão dos tubos de ensaio em banho-maria a 28°C. As amostras tiveram a absorbância monitorada em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis) a 240 nm durante 1 min e 30 s, em intervalos 15 em 15 s (HAVIR & MCHALE, 1987). A atividade bruta da catalase foi calculada baseando-se no coeficiente de extinção molar do H2O2 (0,036 umol cm-1) e expressa em µmol H2O2

min-1mg-1 proteína (ANDERSON et al, 1995), considerando-se que 1 U de CAT é a quantidade de enzima capaz de oxidar 1 mol de H2O2 em 1 min.

A atividade específica foi determinada dividindo-se o valor da atividade bruta da catalase pelo conteúdo de proteínas solúveis totais obtido em cada amostra.

3.2.3.4 Atividade da Peroxidase do Ascorbato

Para a determinação da atividade bruta da Peroxidase do Ascorbato foi adicionado 50µL do extrato bruto, 200 µL de H2O2 2mM a um tubo de ensaio contendo 1,775

mL água ultra pura, 2mL de tampão fosfato 100mM (pH 6,8) e 200µL de ácido ascórbico 10mM, mantido em temperatura constante por imersão em banho-maria a 28°C. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis) a 290nm, durante 1 min, com intervalos de 15 em 15s. Para a determinação da atividade da enzima foi utilizado o coeficiente de extinção molar do ascorbato de 0,0028 umol cm-1 e o resultado expresso em µmol ascorbato min-1 mg-1 proteína, considerando que 1 U de APX é a quantidade de enzima capaz de oxidar 1 mol de ascorbato em 1 min (NAKANO & ASADA, 1981).

A atividade específica foi determinada dividindo-se o valor da atividade bruta da peroxidase do ascorbato pelo conteúdo de proteínas solúveis totais obtido em cada amostra.

3.2.3.5 Atividade da Superóxido Dismutase

Para a determinação da atividade bruta da SOD foi preparado meio de reação da enzima contendo 1,5mL de tampão fosfato de potássio 100mM pH 7,5; 780µL de metionina 13mM; 60 µL de riboflavina 2mM; 60 µL de EDTA 0,1mM; 320 µL de água deionizada e 225 µL de NBT 75 µM. Estes volumes correspondem a 1 tubo de ensaio, o volume final do coquetel foi obtido pela multiplicação dos volumes pelo número de amostras. A metionina, a riboflavina e o NBT foram preparados no escuro e mantidas em recipientes envolvidos em papel alumínio a fim de evitar fotorredução, sendo que o NBT foi preparado no momento da incubação. Um tubo de ensaio foi identificado como branco claro, no qual foi adicionado 50 µl de água ultra-pura ao invés da amostra. Três tubos por tratamento foram envolvidos em papel alumínio e identificados como brancos do escuro, nos quais foram adicionados 50 µl de amostra. Das três medidas foi obtida uma média para branco do escuro. Nos demais tubos, foram adicionados 50 µl de amostra. Os tubos branco claro e demais tubos do claro foram levados à uma câmara de fotorredução (uma caixa de isopor fechada revestida internamente por papel alumínio e uma lâmpada fluorescente de 15W) e foram mantidos por 30 minutos. A reação foi identificada com a mudança da coloração do branco claro de transparente para azul-arroxeado, indicando a máxima redução do NBT à formazana azul). Foi realizada leitura em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis) a 560 nm.

A atividade da SOD foi calculada segundo a fórmula: SOD = (A/(a-b))-1

Onde:

A = absorbância do tubo sem amostra (branco claro)

a = médias das absorbâncias dos tubos contendo as amostras b = média das absorbâncias dos tubos do escuro

Uma unidade de SOD é definida como a quantidade de enzima necessária para inibir em 50% a fotorredução do NBT (BEAUCHAMP & FRIDOVICH, 1971).

3.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA

O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial quatro (tratamentos) x duas (cultivares) x cinco ou três (repetições). Os resultados referentes aos dados paramétricos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade utilizando-se o programa ASSISTAT versão 7.6.

4 RESULTADOS

4.1 EXPERIMENTO 1 - CASA DE VEGETAÇÃO 4.1.1 Potencial hídrico (ψw)

O potencial hídrico não diferiu significativamente entre os tratamentos ao longo do tempo na cv. FB100, o que indica que os tratamentos impostos por 10 dias não provocaram alteração no teor de água das plantas.

-2 -1,5 -1 -0,5 0 0 2 5 10 dias E st at u s h íd ri co ( -M P a) controle pH 0,2mM Al 2mM Al

FIGURA 3: Potencial hídrico (ΨW) em plantas de P. edulis cv. FB100 submetidas a quatro tratamentos ao longo do tempo: controle, controle pH 4, 0,2mM de Al e 2mM de Al. As barras representam o erro padrão da média de três repetições por tratamento.

As plantas da cv. FB200 aos 5 dias, demonstraram que no tratamento 2mM de Al houve aumento do potencial hídrico em comparação ao controle do dia. Aos 2 e 10 dias não foram observadas diferenças.

-2 -1,5 -1 -0,5 0 0 2 5 10 dias E st at u s h íd ri co ( -M P a) controle pH 0,2mM Al 2mM Al

FIGURA 4: Potencial hídrico (ΨW) em plantas de P. edulis cv. FB200 submetidas a quatro tratamentos ao longo do tempo: controle, controle pH 4, 0,2mM de Al e 2mM de Al. As barras representam o erro padrão da média de três repetições por tratamento.

4.1.2 Expressão gênica

A partir da visualização dos perfis de expressão (géis) pode-se inferir o nível de amplificação para cada gene em determinado tratamento, no entanto, constitui uma análise subjetiva. Por esse motivo, foram realizadas análises de densitometria com base na intensidade das bandas de DNA, sendo a expressão relativa de determinada amostra igual ao número de pixels da referida banda dividido pelo número de pixels da respectiva banda controle de amplificação, neste caso, 18S. Assim, serão descritos os resultados da expressão relativa e os géis serão apenas apresentados (Figuras 5, 6 e 7).

Siglas foram definidas para a apresentação dos resultados: TZ – tempo zero; CII – controle da coleta 5 dias; CIII – controle da coleta 10 dias; CN - controle negativo; PII – tratamento pH 4 da coleta 5 dias; PIII – tratamento pH 4 da coleta 10 dias; B – tratamento 0,2mM de Al; A – tratamento 2mM de Al.

a) b)

c) d)

FIGURA 5: Perfis de expressão de Cat nas cultivares de P. edulis FB100 e FB200, nas três coletas: Tempo Zero, coleta 5 dias e coleta 10 dias, em PCR´s de diferentes ciclos. (a) Expressão de Cat FB100 TZ/coleta 5 dias; (b) Expressão de Cat FB200 TZ/coleta 10 dias; (c) Expressão de Cat FB100 TZ/coleta 5 dias; (d) Expressão de Cat FB200 TZ/coleta 10 dias.

a) b)

c) d)

FIGURA 6: Perfis de expressão de Sod nas cultivares de P. edulis FB100 e FB200, nas três coletas: Tempo Zero, coleta 5 dias e coleta 10 dias, em PCR´s de diferentes ciclos. (a) Expressão de Sod FB100 TZ/coleta 5 dias; (b) Expressão de Sod FB200 TZ/coleta 10 dias; (c) Expressão de Sod FB100 TZ/coleta 5 dias; (d) Expressão de Sod FB200 TZ/coleta 10 dias.

a) b) c) d)

FIGURA 7: Perfis de expressão de 18S nas cultivares de P. edulis FB100 e FB200, nas três coletas: Tempo Zero, coleta 5 dias e coleta 10 dias, em PCR´s de diferentes ciclos. (a) Expressão de 18S FB100 TZ/coleta 5 dias; (b) Expressão de 18S FB200 TZ/coleta 10 dias; (c) Expressão de 18S FB100 TZ/coleta 5 dias; (d) Expressão de 18S FB200 TZ/coleta 10 dias.

Na expressão relativa de Cat cv. FB100 com 32 ciclos, os tratamentos não diferem do controle na coleta de 5 e 10 dias (Figura 8a). Com 25 ciclos, a expressão de Cat nas plantas do tratamento 2mM de Al apresentou-se elevada quando comparada com o controle do dia e demais tratamentos, tanto na coleta de 5 dias quanto na coleta de 10 dias (Figura 8b). Na PCR de 20 ciclos, não existe diferença significativa entre os tratamentos e o controle na expressão relativa de Cat (Figura 8c). Na PCR de 15 ciclos a amplificação é muito reduzida, o que impossibilitou a comparação entre as amostras.