UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
RICHARD PIFFER SOARES DE CAMPOS
DISPOSITIVOS MICROFLUÍDICOS PARA MANIPULAÇÃO DE CÉLULAS E DETECÇÃO DE COMPONENTES CELULARES
CAMPINAS 2016
RICHARD PIFFER SOARES DE CAMPOS
DISPOSITIVOS MICROFLUÍDICOS PARA MANIPULAÇÃO DE CÉLULAS E DETECÇÃO DE COMPONENTES CELULARES
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor(a) em Ciências
Orientador: Prof. Dr. José Alberto Fracassi da Silva
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO RICHARD PIFFER SOARES DE CAMPOS, E ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ ALBERTO FRACASSI DA SILVA
CAMPINAS 2016
Dedico esse trabalho à Inácia Helena Lopes,
minha amiga, companheira e esposa, pelo apoio e amor incondicional em todos os momentos de nossa vida.
Dedico também aos meus pais,
Dozinetti Ap. Soares de Campos e Ivanir Piffer Soares de Campos, por serem pais maravilhosos e terem me dado condições de chegar até aqui;
Por fim, dedico esse trabalho a meu irmão e grande amigo
Rodrigo Piffer Soares de Campos, pelo companheirismo e amizade inestimáveis, pelos momentos de descontração e por ser um exemplo de profissionalismo para mim.
Agradeço primeiramente a Deus, por ter me presenteado com tantas conquistas maravilhosas ao longo dos anos. Conquistas essas que culminam na realização desse doutorado.
Gostaria de agradecer imensamente ao Dr. José Alberto Fracassi da Silva, por ter me convidado a conversar sobre um projeto de mestrado a ser realizado no ano de 2010 e ter concordado em ser meu professor por todos esses anos. Graças à sua liderança e orientação, pude desenvolver meus conhecimentos em química analítica e me interessar tanto pela microfluídica. Fico feliz e grato de poder dizer, após cerca de cinco anos trabalhando juntos, que a maior parte do meu “eu científico” foi formada com o auxílio do Dr. Fracassi. Espero que nossa amizade e colaboração continue na próxima etapa da minha vida científica.
Aos professores que direta ou indiretamente ajudaram em minha formação, meu muito obrigado. Em especial aos que tiveram a oportunidade de estarem mais próximos, Dra. Inez Valéria Pagotto Yoshida, Dr. Dosil Pereira de Jesus, Dr. Pedro O. Volpe, Dr. Alexandre Z. Carvalho e a todos os professores com quem tive o prazer de trabalhar durante meus estágios docentes.
Gostaria de estender esse agradecimento também aos colegas e ex-colegas do Grupo de Eletroforese e Microssistemas de Análise. Aline Guadalupe, Aline Mora, Grazielle, Jaqueline, Renata, Marta, Pedro, Débora, Walter, Grafite, Heloísa, Jucélio, Carlos, Marcelo, Camila, Kelly, Gabriela, Matheus, Amilton, Alieth, Nádia, Hugo e Marcos são todos parte de um grupo de cientistas que auxiliaram no meu crescimento pessoal e profissional. Em especial, gostaria de agradecer à Aline Guadalupe, Camila Campos, Hugo Loureiro e Grazielle Setti pelas valiosas discussões científicas e por dividirem os medos e anseios da vida acadêmica.
Aos membros e ex-membros do LNNano com quem trabalhei, Ângelo Luis Gobbi, Maria Helena, Caio e Nathan, por sempre estarem dispostos a me auxiliar na confecção de moldes e dispositivos.
Durante meu doutorado, tive também o prazer de ter trabalhado com a Dra. Susan Lunte, em seu grupo de pesquisa na Universidade do Kansas, EUA. Gostaria de agradecer imensamente à Dra. Lunte pela confiança depositada e pela oportunidade de
dolorosamente pela comunidade científica. Estendo meus agradecimentos aos colegas (alunos, ex-alunos e funcionários) da Universidade do Kansas com quem tive o prazer de trabalhar e conviver: Dr. Dulan Gunasekara, Dra. Jessica Creamer, Dr. Giuseppe Caruso, Dra. Leena Suntornsuk, Abdullah, Rachel, Joseph, Nathan, Manjula, Shamal, Elton, Jeff, Paige, Ryan Grygsby, Ryan Johnson, Nham, Michael, Claudia, Gary e Cady. Em especial, gostaria de agradecer a Joseph Siegel, por ter sido meu mentor nos primeiros meses no Kansas e ter me ensinado todos os protocolos de tratamento celular e operação do detector LIF; ao Dr. Giuseppe Caruso e Claudia Fresta, por terem me ajudado imensamente com a otimização de protocolo de estímulo celular e por terem se tornado grandes amigos em tão pouco tempo; e à Rachel Saylor, pela incomensurável ajuda em todos os assuntos burocráticos e as profundas discussões sobre a ciência e a vida no geral.
Dois outros grandes casais de amigos do Kansas merecem meus agradecimentos. A Gary Webber e sua esposa Phillys, responsáveis por me ajudarem no processo de mudança para os Estados Unidos e em tantas outras oportunidades enquanto por lá morei e à Kimber e Mark Richter, que acolheram a mim e minha esposa como filhos estrangeiros e foram nossos companheiros durante todo o ano.
Agradeço também a minha família e amigos fora da UNICAMP: em especial a Michell Perine pelos conselhos e amizade, e aos meus amigos Silvio, Carol, Wederson, Attilio, Michele, Giuliano, Renan, Lucas, Emily, Diego, Aline, Carol, Pedro, Camila e Henrique. Aos amigos e colegas de UNICAMP: Nicolas, Eduardo, Gabriel, João, Maurício, Mirla e Emanueli. Em especial, gostaria de agradecer a Dra. Mirla Cidade e Emanueli do Nascimento da Silva, pela amizade durante os anos de UNICAMP e pela ajuda nos estudos que nos levaram a ser contemplados com bolsas de financiamento para os nossos doutorados.
Agradeço a todos os professores e funcionários do IQ-UNICAMP e da Universidade do Kansas, e às agências de fomento CAPES, CNPq, INCTBio e FAPESP, pelo financiamento desse trabalho. Por fim, agradeço aos membros da banca avaliadora, por reservarem parte de seu tempo em prol de meu crescimento acadêmico.
O advento dos dispositivos microfluídicos é atualmente um dos fatores responsáveis pelo crescente desenvolvimento de técnicas bioanalíticas. Com aplicações desde a manipulação de líquidos em micro escala ao tratamento e análise de amostras, é difícil encontrar um protocolo analítico que não possa ser implementado em escala micro. Adicionalmente, várias etapas analíticas podem ser integradas em um único substrato com vantagens como tempo reduzido de análise, baixo custo energético, baixo consumo de reagentes e amostra, baixa geração de resíduos, entre outras. Tais caraterísticas podem ser especialmente interessantes para inúmeras aplicações em bioanalítica, como na análise de lisados de células e estudos de heterogeneidade celular por análise de células individuais.
Nesse contexto, as propriedades do substrato no qual o microchip é construído são de extrema importância, pois estas irão determinar a afinidade do analito ao microdispositivo e, consequentemente, a possibilidade ou não de aplicação em determinada análise. Métodos clássicos de microfabricação de dispositivos de vidro são robustos e bem estabelecidos, mas demandam condições atmosféricas específicas e tem alto custo. Devido a isso, os substratos poliméricos, em especial o poli(dimetilsiloxano), são mais comumente utilizados em pesquisa acadêmica. Entretanto, a característica altamente hidrofóbica do poli(dimetilsiloxano) pode limitar suas aplicações e materiais alternativos podem ser utilizados para suprir as dificuldades atribuídas ao uso desse elastômero.
Desse modo, o presente projeto foi desenvolvido em duas frentes. Na primeira,
avaliaram-se as propriedades de diferentes substratos para fabricação de
microdispositivos em relação à possibilidade de utilização em análise de compostos apolares, pois esses representam uma dificuldade intrínseca ao poli(dimetilsiloxano). A modificação de poli(dimetilsiloxano) com diviniléter de polietileno glicol foi avaliada em relação à absorção de compostos orgânicos. Adicionalmente, o substrato polimérico não estequiométrico com ligações tiol-eno teve suas propriedades caracterizadas e avaliadas em comparação ao desempenho do poli(dimetilsiloxano) nativo. Um método alternativo para a fabricação de microdispositivos de vidro também foi proposto e sua aplicabilidade avaliada em comparação ao método clássico.
detecção indireta de espécies reativas de oxigênio em sistema acoplado a um detector de fluorescência induzida a laser. Desta forma, focou-se na detecção e avaliação das concentrações de superóxido gerado em amostras de macrófagos RAW 264.7 mediante estímulo externo, com a obtenção de um acréscimo de concentração de cerca de 15 vezes em relação a células não estimuladas. O preparo das amostras celulares foi otimizado para o sistema empregado e os efeitos da incubação dos macrófagos na presença de 3-morfolino-sidnonimina como um doador de íons superóxidos foram demonstrados. Finalmente, experimentos em sistema de análise de células individuais também foram realizados com macrófagos e linfócitos adaptando-se o microdispositivo. Os resultados para detecção de superóxido nesse sistema demonstraram evidências da diferença de resposta de macrófagos de uma mesma população ao protocolo de estímulo empregado, evidenciando a capacidade de caracterizar a heterogeneidade celular em métodos de análise de células individuais utilizando dispositivos microfluídicos.
The development of microfluidic devices is currently one of the factors responsible for the increased development of bioanalytical techniques. With applications ranging from liquid manipulation to sample analysis, it is difficult to find a protocol that cannot be implemented in micro scale. Additionally, several analytical steps can be integrated on a single substrate, leading to advantages such as fast analysis, low energetic cost, low reagent and sample consumption, low residue generation, among others. Such characteristics are especially interesting for numerous bioanalytical applications, such as the analysis of cell lysates and cellular heterogeneity studies using single cell analysis.
In this context, the properties of the microchip’s substrate are extremely important because they will determine the affinity between the analyte and the microdevice and, consequently, the suitability of the device. Classic microfabrication methods for glass microdevices are robust and well established but demand specific ambient conditions and are costly. Due to that, polymeric substrates, especially poly(dimethylsiloxane), are more commonly used in academia. However, poly(dimethylsiloxane)’s highly hydrophobic characteristic can limit its applications. Thus, alternative materials and methods can be used to overcome these difficulties.
Therefore, the present work was developed in two parts. In the first, the properties of different substrates for the fabrication of microdevices were studied. The modification of poly(dimethylsiloxane) with divinylether polyethylene glycol was evaluated regarding its absorption and adsorption of organic compounds. Additionally, an off-stoichiometric thiol-ene polymer was characterized in comparison to a native poly(dimethylsiloxane) substrate. An alternative method for glass microdevice fabrication was also proposed and its applicability was evaluated.
In the second part of the project, a microdevice for cellular analysis was developed. The microchip was implemented for electrophoretic separation and detection of reactive oxygen species, using a system coupled to a laser induced fluorescence detector. Here, we focused on the indirect detection and evaluation of superoxide generated in RAW 264.7 macrophages after external stimulation. The results showed an increase of 15 fold in comparison to non-treated cells. The cellular sample preparation was optimized and the effects of cellular incubation with 3-morpholino-sydnonimine were also demonstrated.
detection levels in single cells showed evidences of the different macrophage individual response in comparison the to entire cell population and highlighted the ability to study cell heterogeneity in these systems.
Figura 1 – Esquema representativo de um instrumento de separação por eletroforese capilar. Adaptado de Siegel et al.21 com permissão da editora. ... 30 Figura 2 – Formação da dupla camada elétrica (EDL). Adaptado de Siegel et al.21
com permissão da editora. ... 32 Figura 3 – Dispositivo microfluídico com design simples T feito em PDMS com base em vidro. Adaptado de
Siegel et al.21 com permissão da editora. ... 37 Figura 4 – Esquema para os modos de injeção em MCE. Adaptado de Siegel et al.21
com permissão da editora. ... 38 Figura 5 – Circuito para C4
D. Adaptado de Coltro et al.31 com permissão da editora. ... 46 Figura 6 – Representação esquemática da medida de ângulo de contato. Reproduzido de Campos.65
com permissão da editora. ... 48 Figura 7 – Representação do cubo hiperespectral de dados. Reproduzido de Campos et al.4
com permissão da editora. ... 52 Figura 8 – Fabricação convencional de dispositivos microfluídicos em vidro. Adaptado de Siegel et al.21
com permissão da editora. ... 56 Figura 9 – Fabricação de dispositivos microfluídicos em PDMS. Adaptado de Siegel et al.21
com permissão da editora. ... 58 Figura 10 – Esquema da selagem de substratos OSTE por click reaction. ... 60 Figura 11 – Representação das reações para modificação do substrato de PDMS com a adição de
DVE-PEG. ... 63 Figura 12 – Dispositivo em PDMS modificado com DVE/PEG acoplado a detector C4
D. Adaptado de
Campos et al.76 com permissão da editora. ... 64 Figura 13 – Medidas de sorção em dispositivos de PDMS nativo e PDMS modificado com DVE-PEG. ... 66 Figura 14 – Histogramas para a contagem de pixels com fluorescência em PDMS nativo e PDMS
modificado. ... 67 Figura 15 – Medidas de sorção em substratos de PDMS modificado com DVE-PEG após exposição à
solução de rodamina B por 1 minuto. ... 68 Figura 16 – Fórmula estrutural dos polímeros precursores para o substrato OSTE. ... 70 Figura 17 – Espectros Raman normalizados para OSTE e seus precursores. ... 72
Figura 19 – Medidas de sorção em substratos OSTE e PDMS nativo. ... 75
Figura 20 – Histogramas para a contagem de pixels com fluorescência em substratos OSTE. ... 76
Figura 21 – Medidas de EOF pelo método do monitoramento da corrente. ... 77
Figura 22 – Injeção de amostras de H2O pura e suspensão de S. cerevisiae 0,1 % em dispositivo OSTE-C4D. ... 79
Figura 23 – Injeção de suspensões de S. cereviae diluídas em água em dispositivo OSTE-C4 D. ... 81
Figura 24 – Detecção C4 D de S. cerevisiae 0,01% em H2O injetada hidrodinamicamente em dispositivo PDMS-C4D. ... 81
Figura 25 – Esquema de confecção e selagem do dispositivo microfluídico vidro/vidro com detecção C4 D. 85 Figura 26 – Perfilometria com contato para as lâminas de vidro corroídas em solução 25 % v/v HF. ... 86
Figura 27 – Impressão e corrosão dos padrões dos canais em vidro. ... 88
Figura 28 – Espectro de ATR-FTIR para (I) vidro limpo e (II) vidro funcionalizado. ... 89
Figura 29 – Esquema representativo de funcionalização e selagem do vidro. ... 90
Figura 30 – Dispositivo de vidro selado pelo método proposto. ... 91
Figura 31 – Monitoramento de corrente em dispositivo de vidro/vidro. ... 92
Figura 32 – Sinal C4 D em dispositivo de vidro. ... 93
Figura 33 – Eletroferograma para a detecção de Na+ em dispositivo vidro-C4D. ... 94
Figura 34 – Diagrama das vias de reação de peróxinitrito. Adaptado de Augusto et al.115 com permissão da editora. ... 101
Figura 35 – Propriedades espectroscópicas de HE e seus produtos de oxidação. Adaptado de Zielonka et al.134 com permissão da editora. ... 103
Figura 36 – Reação de MitoHE com superóxido e outros ROS. Adaptado de Zielonka et al.139 com permissão da editora. ... 111
Figura 37 – Síntese do padrão de 2-OH-MitoE+ e obtenção de curva de calibração. ... 111
Figura 38 – Avaliação da quantidade de NDS no preparo de solução padrão de 2-OH-MitoE+ . ... 112
Figura 39 – Mecanismo de reação do sistema XA/XO. Reproduzido de Lvovich.129 com permissão da editora. ... 113
Figura 40 – Eletroferogramas para a injeção de meio de reação XA/XO + MitoHE. ... 114
Figura 43 – Otimização do protocolo de estímulo.. ... 118 Figura 44 – Lise comparativa utilizando tampão com SDS e tampão com Triton X-100. ... 120 Figura 45 – Protocolo otimizado para a produção de superóxido em macrófagos 264.7 mediante estímulo
externo com PMA. ... 121 Figura 46 – Eletroferogramas para amostras de lisado celular de macrófagos RAW 264.7. ... 121 Figura 47 – Análise de lisado celular de macrófagos RAW 264.7 estimulados por 24 h com PMA na
presença de DDC e 2-ME. ... 123 Figura 48 – Injeção de células Jurkat individuais marcadas com 6-CF em microdispositivo simples T por
modo de diferença de pressão. ... 125 Figura 49 – Eletroferograma para a detecção de células Jurkat individuais marcadas com 6-CF em modo
SCA. Detector posicionado a 10 mm da intersecção. ... 126 Figura 50 – Eletroferograma para a detecção de células Jurkat individuais marcadas com 6-CF em modo
SCA. Detector posicionado a 25 mm da interseção. ... 126 Figura 51 – Eletroferograma para a detecção de células RAW 264.7 individuais marcadas com 6-CF em
modo SCA. Detector posicionado a 15 mm da interseção. ... 127 Figura 52 – Eletroferograma para a detecção de células RAW 264.7 individuais nativas e estimuladas 12
Tabela 1 – Valores de WCA típicos para diversos materiais. Reproduzido de Campos.65
com permissão da editora. ... 49 Tabela 2 – Intensidade Média de pixels para as amostras de PDMS e PDMS modificado com DVE-PEG
após exposição à solução de rodamina B. ... 68 Tabela 3 – Resultados para amostras de lisado celular de macrófagos RAW 264.7: Contagem celular,
µTAS – microssistema de análise total (micro total analysis system) 2-ME – 2-metoxiestradiol (2-methoxyestradiol)
6-CF – 6-carboxifluoresceína (6-carboxyfluorescein)
ATR-FTIR – refletância total atenuada na região do infravermelho com
transformada de Fourier (attenuated total reflectance Fourier transform infrared) BGE – eletrólito de corrida (background electrolyte)
BSA – albumina de soro bovino (bovine serum albumin)
C4D – detecção condutométrica sem contato acoplada capacitivamente (capacitively coupled contactless conductivity detection)
CE – eletroforese capilar (capillary electrophoresis) CI – imagem química (chemical imaging)
CZE – eletroforese capilar de zona (capillary zone electrophoresis) DBZTC - 2-cloro-1,3-dibenzotiozolinacicloexeno (2-Chloro-1,3-dibenzothiazolinecyclohexene)
DDC – dietilditiolcarbamato (diethyldithiolcarbamate) ddp – diferença de potencial
DMEM – meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)
DMSO – sulfóxido dimetílico (dimethylsulfoxide)
DTPA – ácido dietilenotriaminopentaacético (diethylenetriaminepentaacetic acid) DVE-PEG – diviniléter de polietileno glicol
EC – detecção eletroquímica (electrochemical detection) EDL – dupla camada elétrica (electrical double layer) EOF – fluxo eletrosmótico (eletroosmotic flow)
HE – hidroetidina (hydroethidine) His – L-histidina (L-histidine)
HPLC – cromatografia líquida de alta performance (high performance liquid chromatography)
HV – alta voltagem (high voltage)
LIF – fluorescência induzida a laser (laser induced fluorescence)
MALDI – ionização/desorção da matriz assistida a laser (matrix-assisted laser desorption /ionization)
MCE – eletroforese em microchip (microchip electrophoresis)
MEKC – cromatografia eletrocinética micelar (micellar electrokinetic chromatography)
MES – ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) MitoHE – MitoSOX red (derivado de HE)
MS – espectrometria de massas (mass spectrometry) NDS – ânion nitrosodisulfonato (nitrosodisulfonate anion)
OSTE – polímero não estequiométrico tiol-eno (off-stoichiometric thiol-ene) PBS – solução salina tamponada de fosfato (phosphate buffer solution) PDMS – poli(dimetilsiloxano)
PMA – forbol 12-miristato 13-acetato (phorbol 12-myristate 13-acetate) PMHS – poli(metilhidrogenossiloxano)
ROS – espécies reativas de oxigênio (reactive oxygen species)
RPMI – meio de cultura do Instituto Roswell Park (Roswell Park Memorial
Institute medium)
SOD – superóxido dismutase (superoxide dismutase) UV – radiação ultravioleta
UV-Vis – absorção molecular na região do UV e visível WCA – ângulo de contato com a água (water contact angle) XA – xantina (xantine)
– capacitância de fuga
– capacitância na parede do capilar / canal – campo elétrico
– densidade de carga – constante dielétrica
– frequência do sinal de corrente alternada – comprimento do canal
– capacitância
– constante de eficácia da captura de radiação emitida – intensidade da radiação de excitação
– resistência no capilar / microcanal
– tempo de migração do eletrólito – volume irradiado de amostra
– rendimento quântico
– diferença de potencial aplicada
– velocidade do fluxo eletrosmótico
– reatância capacitiva – fração molar – tensão interfacial – tensão superficial – absortividade molar – espessura da EDL – potencial zeta
– mobilidade do fluxo eletrosmótico – mobilidade aparente
– mobilidade eletroforética – mobilidade efetiva
– raio iônico solvatado – carga do íon
CAPÍTULO 1 ... 25 1.1. INTRODUÇÃO ... 26 1.2. OBJETIVOS ... 29 1.3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 29 1.3.1. ELETROFORESE CAPILAR... 29 1.3.2. SEPARAÇÃO ELETROFORÉTICA E FORMAÇÃO DO FLUXO ELETROSMÓTICO ... 31 1.3.3. FATORES QUE INFLUENCIAM O EOF ... 34 1.3.4. INJEÇÃO DE AMOSTRA EM CE... 36 1.3.5. ELETROFORESE EM MICRODISPOSITIVOS ... 36 1.3.6. INJEÇÃO DE AMOSTRA EM MCE ... 37 1.3.7. ESTRATÉGIAS DE DETECÇÃO EM MCE ... 39
1.3.7.1. Absorção UV-Vis ... 40 1.3.7.2. Fluorescência induzida a laser ... 41 1.3.7.3. Detecção amperométrica ... 44 1.3.7.4. Detecção condutométrica sem contato ... 45
1.3.8. MEDIDAS DE ÂNGULO DE CONTATO COM A ÁGUA ... 47 1.3.9. ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO, ESPECTROSCOPIA RAMAN E RAMAN DE IMAGEM 51 CAPÍTULO 2 ... 54 2.1. SUBSTRATOS UTILIZADOS EM MICROFABRICAÇÃO ... 55 2.1.1. PDMS E VIDRO ... 55 2.1.2. POLÍMEROS NÃO ESTEQUIOMÉTRICOS COM LIGAÇÕES TIOL-ENO ... 59 2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO ... 61 2.3. MODIFICAÇÃO DE SUPERFÍCIE DE PDMS ... 61 2.3.1. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ... 62
2.3.1.1. Confecção do substrato de PDMS nativo ... 62 2.3.1.2. Adição de DVE-PEG à superfície do PDMS nativo ... 62 2.3.1.3. Dispositivo C4D para determinação do fluxo eletrosmótico ... 63 2.3.1.4. Estudo de sorção de composto orgânico ... 64
2.3.2.2. Estudo de sorção de moléculas apolares ... 65
2.4. POLÍMEROS OSTE... 69 2.4.1. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ... 69
2.4.1.1. Polimerização para OSTE ... 69 2.4.1.2. Desmoldagem, confecção dos reservatórios e selagem dos dispositivos ... 70 2.4.1.3. Caracterização dos substratos ALIL e TIOL ... 71
2.4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 71
2.4.2.1. Caracterização espectroscópica dos substratos OSTE ... 71 2.4.2.2. Ângulo de contato com a água ... 74 2.4.2.3. Estudo da sorção de compostos apolares ... 75 2.4.2.4. Avaliação do EOF ... 76 2.4.2.5. Detecção de células em dispositivo OSTE-C4D ... 78
2.5. VIDRO ... 82 2.5.1. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ... 82
2.5.1.1. Estratégias de proteção para corrosão do vidro ... 82 2.5.1.2. Procedimento de corrosão e formação de microcanais ... 83 2.5.1.3. Confecção de reservatórios e limpeza das lâminas de vidro ... 83 2.5.1.4. Funcionalização do vidro ... 84 2.5.1.5. Processo de selagem entre lâminas ... 84 2.5.1.6. Dispositivo microfluídico vidro/vidro com detector C4D ... 85
2.5.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 86
2.5.2.1. Taxa de corrosão do vidro em HF ... 86 2.5.2.2. Parâmetros para corte do filme plástico ... 87 2.5.2.3. Avaliação do protocolo de selagem do dispositivo vidro/vidro ... 88 2.5.2.4. Caracterização do dispositivo com detector C4D ... 91
2.6. CONCLUSÃO ... 95 CAPÍTULO 3 ... 98 3.1. ANÁLISE DE LISADO CELULAR E DE CÉLULAS INDIVIDUAIS ... 99 3.1.1. ESTRESSE OXIDATIVO E SUAS IMPLICAÇÕES NOS ORGANISMOS ... 100 3.1.2. PRODUÇÃO E DETECÇÃO DE SUPERÓXIDO CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE ... 101 3.1.3. HIDROETIDINA COMO FLUORÓFORO SELETIVO AO SUPERÓXIDO ... 103
3.3.1. PREPARO DE SOLUÇÕES ... 106
3.3.1.1. Solução estoque de MitoHE ... 106 3.3.1.2. Preparação do padrão de 2-OH-MitoE+ ... 106 3.3.1.3. Xantina/Xantina oxidase ... 106
3.3.2. CULTURA CELULAR ... 107 3.3.3. PROTOCOLO DE ESTÍMULO ... 107 3.3.4. PREPARADO DE AMOSTRA DE LISADO CELULAR ... 108 3.3.5. SUSPENSÃO DE CÉLULAS PARA SCA ... 108 3.3.6. VIABILIDADE CELULAR ... 109 3.3.7. FABRICAÇÃO DO MICRODISPOSITIVO E CONFIGURAÇÃO INSTRUMENTAL ... 109 3.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 110 3.4.1. ANÁLISE DE LISADO CELULAR ... 111
3.4.1.1. Solução padrão e curva de calibração ... 111 3.4.1.2. Identificação de pico utilizando sistema XA/XO ... 113 3.4.1.3. Análise de lisado celular de macrófagos incubados com SIN-1 ... 114 3.4.1.4. Detecção indireta de superóxido em macrófagos RAW 264.7 após estímulo com PMA ... 117
3.4.2. ANÁLISE DE CÉLULAS INDIVIDUAIS ... 123
3.4.2.1. Funcionamento do microdispositivo em modo SCA ... 123 3.4.2.2. Detecção de células individuais marcadas com 6-CFDA ... 124 3.4.2.3. SCA para monitoramento de superóxido ... 128
3.5. CONCLUSÕES ... 130 CAPÍTULO 4 ... 131 4.1. CONCLUSÕES GERAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS... 132 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 135
Capítulo 1
1.1. Introdução
A aplicação analítica de dispositivos microfluídicos, referidos simplesmente como microdispositivos ou microchips, tem crescido rapidamente nas últimas décadas. Seu desenvolvimento é proveniente da microfluídica, uma área da ciência e tecnologia capaz de processar e manipular quantidades pequenas de fluidos (da ordem de picolitros), utilizando sistemas com canais de dimensões da ordem de dezenas a centenas de micrometros.1 Assim, a microfluídica é uma ferramenta de miniaturização que lida principalmente com o comportamento, controle e manipulação de fluidos em escala micrométrica.
As principais características dos dispositivos microfluídicos são a miniaturização e integração de múltiplas etapas analíticas que podem não ser facilmente alcançadas utilizando tecnologias analíticas convencionais.2 O dispositivo é normalmente desenvolvido para ter dimensões totais da ordem de centímetros quadrados, contribuindo para a sua portabilidade, podendo ser utilizado fora de um laboratório convencional.1 A quantidade de fluido manipulada em um dispositivo microfluídico varia de alguns microlitros, nanolitros ou até mesmo picolitros, e isso resulta na redução de material necessário e resíduo gerado pela análise.2 A energia necessária para a operação desses dispositivos também é reduzida, devido a suas dimensões. Adicionalmente, várias etapas analíticas podem ser integradas em um único substrato, para o desenvolvimento de micro sistemas de análise total (µTAS) onde, idealmente, todas as etapas analíticas de uma análise são realizadas em um único dispositivo.3,4
Assim, com aplicações desde a manipulação de líquidos em micro escala ao tratamento e análise de amostras, é difícil encontrar um protocolo analítico que não possa ser implementado em escala micro.5,6,7 De fato, diversas aplicações da microfluídica têm sido reportadas nas mais diversas áreas, como síntese orgânica, diagnóstico clínico, triagem de drogas, monitoramento ambiental, formação e detecção de gotas, dentre outras.2,8
A bioanálise, i. e., a análise química de substâncias bióticas (naturalmente produzidas e encontradas em organismos) e xenobióticas (drogas, metabólitos e biomoléculas não produzidas no organismo) em sistemas biológicos, beneficia-se grandemente do desenvolvimento de sistemas microfluídicos. O comportamento das
células de um organismo decorrente dos processos envolvidos em seu crescimento, comunicação, diferenciação e morte é um comportamento dinâmico que, muitas vezes, é difícil de ser acompanhado e mensurado.2 Devido à capacidade de manipular volumes pequenos com precisão e de serem capazes de integrar transporte, cultivo, tratamento e aprisionamento celular com diversos sistemas de separação e detecção, os dispositivos microfluídicos podem ser utilizados para aprimorar o conhecimento adquirido com tecnologias tradicionais por meio de estudos biológicos que são conduzidos em micro-escala nos níveis celular e molecular.2,7 Adicionalmente, sistemas complexos de interação célula-célula que não são previstos por modelos in vitro convencionais podem ser estudados utilizando dispositivos microfluídicos que mimetizam o funcionamento de orgãos e tecidos, criando sistemas que podem ser replicados apenas com o auxílio da microfluídica.7
Desse modo, uma grande variedade de aplicações de sistemas microfluídicos tem sido desenvolvida no intuito de auxiliar a investigação de amostras celulares e a manipulação das células no interior do microchip. Exemplos de aplicações incluem dispositivos para investigação de crescimento, metabolismo, comunicação, separação e triagem de células.9–12
Dispositivos de monitoramento celular acoplados a técnicas de separação podem ser utilizados, por exemplo, para o monitoramento a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio que participam de processos de sinalização fisiológica e patológica.13–15 De fato, sistemas de separação por eletroforese em microdispositivos são extremamente vantajosos, pois necessitam apenas de instrumentação simples que pode ser facilmente acoplada ao dispositivo microfluídico.14 Além disso, os dispositivos podem ser acoplados a técnicas de detecção de alta detectabilidade, como fluorescência, amperometria e espectrometria de massas.7 As separações tipicamente rápidas (da ordem de segundos), auxiliam na detecção de compostos biológicos que possuem tempo de vida curto, com a possibilidade de detecção simultânea de diversos compostos em uma única amostra.13 Em um exemplo, Gunasekara et al. utilizaram a separação por eletroforese em dispositivo microfluídico para a separação de nitrito, iodeto e glutationa em macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo para produção de ácido nítrico.16 Outras aplicações para a separação por eletroforese em microdispositivos para bioanálise incluem a separação e detecção de drogas farmacêuticas, DNA, aminoácidos, peptídeos,
proteínas, anticorpos, antígenos, carbohidratos, ânions inorgânicos, neurotransmissores e componentes e lisados celulares.17,18
Embora as aplicações e vantagens para a utilização de microdispositivos com sistemas integrados em bioanálise sejam inúmeras, existe ainda a necessidade do deenvolvimento das técnicas envolvidas no acoplamento de diversas funções nesses dispositivos. Sobretudo, sistemas de detecção “label-free” de fácil miniaturização podem ser extremamente vantajosos no monitoramento da posição das células e do correto funcionamento desses dispositivos. Os dispositivos com acoplamento de diversas funções possuem mecanismos complexos de operação e a possibilidade de monitoramento celular por um método de detecção simples, que possa ser acoplado em diferentes partes do microdispositivo, pode proporcionar maior controle do sistema e, consequentemente, refinar o modo em que os experimentos são atualmente conduzidos. Recentemente, Watkins et al. demonstraram a potencialidade dessa aplicação ao desenvolver um dispositivo para a contagem de linfócitos T em amostras não tratadas de sangue utilizando detecção condutométrica sem contato.19 Por fim, a exploração de diferentes materiais para microfabricação, ou mesmo de técnicas alternativas e simplificadas para a confecção dos dispositivos, podem ser alternativas úteis para superar as dificuldades específicas a cada material e método de fabricação.
Desse modo, a estrutura do presente texto foi dividida em 4 capítulos. No primeiro momento, discutido no Capítulo 1, abordamos a fundamentação teórica necessária ao melhor entendimento do trabalho apresentado. Durante o capítulo 2, o desenvolvimento e caracterização de substratos com potencial para a análise celular foi proposto. Dispositivos feitos em poli(dimetilsiloxano) (PDMS) modificado com diviniléter de polietileno glicol (DVE-PEG) e polímero não estequiométrico tiol-eno (OSTE) foram fabricados e as suas propriedades avaliadas. Propriedades como a hidrofilicidade, a possibilidade de ancoramento de substâncias na superfície dos canais e o fluxo eletrosmótico desses dispositivos tem papel fundamental na aplicação do substrato em bioanálise. O dispositivo OSTE foi utilizado para a detecção de células de Saccharomyces cerevisiae utilizando detecção condutométrica sem contato, e os resultados comparados a um dispositivo de PDMS não modificado (nativo). Adicionalmente, em alternativa à utilização de substratos poliméricos, um método simples para a fabricação de dispositivos
em vidro foi proposto e suas vantagens e desvantagens avaliadas em comparação ao método convencional envolvendo fotolitografia.
Para a segunda etapa experimental do trabalho, relatada no capítulo 3, a aplicação de microdispositivos na análise celular foi implementada. A detecção e quantificação de superóxido gerado em macrófagos RAW 264.7 mediante a adição de um composto estimulante e após incubação com um composto doador de superóxido foi realizada. O superóxido é um importante radical produzido naturalmente pelas células mas que, quando não devidamente regulado, pode causar danos ao organismo devido ao estresse oxidativo gerado. A separação e detecção do sinal referente ao superóxido e outras espécies reativas de oxigênio foi efetuada por eletroforese em microdispositivos acoplados a um detector por fluorescência induzida a laser. As análises foram desenvolvidas nos modos de análise de lisado celular e de células individuais, e também foram discutidas no capítulo 3.
Finalmente, o capítulo 4 reserva-se às conclusões finais acerca do estudo como um todo, bem como às perspectivas futuras com relação aos métodos utilizados.
1.2. Objetivos
Tendo em vista as vantagens dos sistemas microfluídicos em bioanálise e a capacidade de acoplamento desses dispositivos em sistemas que utilizem separação por eletroforese, o desenvolvimento deste trabalho propõe dois objetivos específicos:
(1) o desenvolvimento e caracterização de substratos com potencial para a análise celular e possível aplicação em um sistema de contagem de células;
(2) a aplicação de um sistema microfluídico com separação por eletroforese para a detecção de superóxido em células do sistema imune, bem como a avaliação da resposta frente a dois métodos de análise celular: lisado celular e células individuais.
1.3. Fundamentação teórica
Eletroforese é uma técnica analítica que possibilita a separação de íons e moléculas com base na relação entre sua carga efetiva e seu raio hidrodinâmico. Utilizando a aplicação de campo elétrico, analitos podem ser separados através de um gel, capilar ou canal microfluídico. Em eletroforese em gel convencional, moléculas grandes são separadas. O gel incorporado ao sistema, normalmente feito de agar ou poliacrilamida, atua como crivo molecular e auxilia na dissipação de calor gerado pela corrente no sistema. Em eletroforese capilar (CE), o princípio de separação pode ser utilizado para a separação desde moléculas grandes até moléculas pequenas e íons inorgânicos.20 O equipamento para a separação por eletroforese capilar é bastante simples, e consiste de uma fonte de alta tensão para aplicação de potencial, reservatórios de injeção e descarte de soluções, do capilar de sílica fundida e de um sistema de detecção acoplado. Um esquema representativo é apresentado na Figura 1.
Figura 1 – Esquema representativo de um instrumento de separação por eletroforese capilar. Adaptado de Siegel et al.21
com permissão da editora.
No modo mais comum de CE, denominado de eletroforese capilar de zona (CZE), o capilar é primeiramente preenchido com um eletrólito, denominado eletrólito de corrida (BGE). A amostra é então injetada em uma das extremidades do capilar e uma diferença de potencial (ddp) é aplicada ao longo desse capilar. Na ausência de efeitos externos gerados no sistema, as espécies carregadas tendem a migrar em direção ao pólo de carga oposta. Assim, ânions migram em direção ao eletrodo positivo (ânodo) e cátions migram em direção ao eletrodo de carga negativa (cátodo). Moléculas neutras não são afetadas pelo campo elétrico e por isso não adquirem velocidade devido a aplicação de
ddp. A velocidade que os íons movem-se em direção aos pólos de carga oposta ( ) é definida por:
(1.1)
onde é o campo elétrico e a mobilidade eletroforética do íon. A mobilidade eletroforética é uma característica única de cada íon que possibilita a separação por eletroforese.22 Sua magnitude depende de , a carga do íon, de , o raio iônico solvatado e , a viscosidade do BGE:
(1.2)
Nos casos onde o analito participa de equilíbrios que possam alterar seu estado de carga, a mobilidade efetiva desse íon dependerá das condições do meio e é definida como:
∑
(1.3)
onde é a fração molar de moléculas com mobilidade (mobilidade eletroforética do íon ) e é o número total de espécies iônicas geradas pelo analito.
1.3.2. Separação eletroforética e formação do fluxo eletrosmótico
Em CE, as separações são normalmente realizadas em capilares de sílica fundida, com dimensões tipicamente de 20 a 100 cm de comprimento e diâmetro de 10 a 200 m.23
Devido às dimensões e propriedades de superfície dos capilares de sílica fundida, um fluxo de BGE é formado após a aplicação da ddp. Esse fluxo é denominado fluxo eletrosmótico (EOF) e é gerado na presença de uma dupla camada elétrica (EDL). Capilares de sílica possuem na sua superfície grupamentos silanoatos (Si-O-) negativamente carregados em pH acima de 3. Assim, a EDL se forma devido a atração de
cátions solvatados presentes no BGE para a parede do capilar. A EDL consiste de duas camadas: (1) uma camada compacta formada por cátions solvatados que fortemente ligados à parede negativamente carregada do capilar, denomidada de camada compacta; (2) uma segunda camada, a uma distância maior da parede do capilar e que, portanto, possui menor interação com as cargas negativas da superfície do capilar. Essa camada é denominada de camada difusa. A formação da EDL é representada na Figura 2. Quando a ddp é aplicada, os cátions da camada difusa migram em direção ao cátodo (pólo negativo). Como os cátions estão solvatados, o fluído move-se como um todo, arrastado pela migração dos íons, gerando assim o EOF.
Figura 2 – Formação da dupla camada elétrica (EDL). Adaptado de Siegel et al.21
com permissão da editora.
A camada compacta está fortemente ligada à parede do capilar, negativamente carregada; a camada difusa menos fortemente ligada tem a capacidade de migrar em direção ao cátodo mediante a aplicação do campo elétrico.
A magnitude do EOF é diretamente proporcional ao potencial no plano de cisalhamento (potencial zeta, ). O potencial zeta é definido como potencial no plano onde ocorre o movimento dos cátions solvatados influenciado pelo campo elétrico e é dado por:
(1.4)
onde é a espessura da dupla camada elétrica, é a densidade de carga, e é a constante dielétrica do meio.22,24
Na presença do EOF, a mobilidade aparente observada de uma dada molécula ou íon ( ) será resultado da soma vetorial da mobilidade efetiva dessa molécula / íon ( )
e da mobilidade do fluxo eletrosmótico ( ).24
→ → → (1.5)
onde é definida pela razão entre a velocidade do EOF ( ) divida e o campo elétrico aplicado. A velocidade do EOF é função desse campo elétrico e é então dada por:
(1.6)
Assim, a mobilidade do EOF pode ser escrita como:
(1.7)
Em CE de polaridade positiva, uma tensão positiva é aplicada na extremidade de injeção de amostra enquanto a extremidade de descarte é mantida em 0 V. O detector do sistema é posicionado próximo ao reservatório de descarte e ao cátodo. Nesse caso, a separação ocorre na mesma direção que o EOF. Assim, íons e moléculas positivamente carregadas irão mover-se com velocidade eletroforética resultante da somatória de sua mobilidade e da mobilidade do EOF. Analitos negativamente carregados poderão ser detectados nesse sistema se sua mobilidade eletroforética for menor que , uma vez que essas espécies alcançarão o detector somente se o EOF for capaz de carregá-las contra o seu sentido natural de movimento. Moléculas neutras serão carregadas pelo EOF
em direção ao detector com mobilidade igual a , gerando um sinal único que pode ser
utilizado para caracterizar a mobilidade e velocidade desse fluxo. A maior vantagem da presença do EOF em CE é que este proporciona separações da maioria das espécies presentes no sistema, independentemente de sua carga líquida.
1.3.3. Fatores que influenciam o EOF
Os fatores que influenciam a magnitude do EOF são: (1) a concentração ou força iônica do tampão, (2) a diferença de potencial aplicada, (3) o pH do tampão, (4) a temperatura, (5) a adição de solventes orgânicos, (6) a aplicação de potencial radial externo e (7) a modificação química da parede do capilar.22
A magnitude do EOF é diretamente dependente do potencial zeta. De fato, a força iônica do BGE utilizado para a separação (e, consequentemente, sua concentração), é um parâmetro importante, pois afeta diretamente na formação da EDL, tendo influência sobre a magnitude do EOF. Um decréscimo na força iônica causa um aumento no potencial zeta, aumentando a magnitude do EOF.22 Isso pode gerar separações mais rápidas (com menores tempo de migração), mas pode também ocasionar perdas na resolução dos picos. Adicionalmente, a utilização de BGEs com alta força iônica pode gerar aquecimento no capilar por efeito Joule, causando convecção e redução na eficiência da separação. Em casos extremos, a temperatura elevada pode gerar a formação de bolhas no BGE, causando interrupção da corrente elétrica que passa através do capilar.24
A mobilidade do EOF não deve ser afetada pela variação da aplicação de ddp, mas a velocidade desse fluxo é função direta do campo elétrico. Assim, separações mais rápidas podem ser obtidas aplicando maiores campos elétricos ao sistema. Entretanto, o aumento da ddp gera um aumento na intensidade da corrente no sistema, como previsto pela lei de Ohm. Desse modo, valores excessivos de campo elétrico podem também prejudicar a separação devido aos problemas relacionados ao aquecimento por efeito Joule, como a formação de picos largos, tempos de migração não reprodutíveis, decomposição ou desnaturação da amostra ou ainda a formação de bolhas no canal, que causam descontinuidade elétrica e impedem a utilização do sistema eletroforético.22
Para que o EOF se forme, a parede do capilar necessita estar carregada pela ionização dos grupos silanóis nela presentes. Assim, o pH é fator determinante na magnitude do EOF. Valores elevados de pH causam um aumento da densidade de carga na parede do capilar, aumentando o potencial zeta e, consequentemente, a magnitude do EOF. Entretanto, valores elevados de pH nem sempre são aconselháveis devido à instabilidade de determinados analitos nessas condições. Adicionalmente, moléculas e íons que participem de equilíbrios ácido-base terão sua mobilidade influenciada pelo pH do meio.
O aumento da temperatura do sistema causa a diminuição da viscosidade do BGE e contribui para um aumento na magnitude do EOF. Entretanto, é importante que a separação seja realizada em temperatura controlada devido aos problemas que podem ocorrer quando a dissipação de calor não é eficiente, como nos casos de aquecimento por efeito Joule discutidos anteriormente.
A incorporação de solventes orgânicos ao BGE pode afetar o potencial zeta, a viscosidade e a constante dielétrica do eletrólito de corrida, sendo difícil de prever seu efeito sobre a magnitude do EOF.24 A aplicação de um potencial radial externo pode ser utilizada para alterar o potencial zeta e controlar instrumentalmente a intensidade do EOF.22
Por fim, modificações podem ser realizadas no capilar para alteração da magnitude e também do sentido do fluxo eletrosmótico. Surfactantes podem ser adicionados ao BGE para modificação dinâmica do EOF. A adição de um surfactante catiônico, constituído de uma cabeça polar carregada positivamente e uma cauda apolar, pode ser utilizada para reverter o sentido do EOF. Esses surfactantes se adsorvem às paredes do capilar e formam uma dupla camada com carga resultante positiva. Quando aplicado a separações de polaridade reversa (tensão negativa aplicada à extremidade de injeção de amostra), a ordem de migração é invertida, com a separação inicial de ânions, seguida de moléculas neutras e cátions.25 Essa abordagem é ideal para a separação de pequenas moléculas negativamente carregadas que não seriam carregadas pelo EOF em modo positivo.
1.3.4. Injeção de amostra em CE
Em CE as amostras podem ser introduzidas ao sistema por meio de injeções hidrodinâmicas ou eletrocinéticas.24 Injeções hidrodinâmicas são baseadas na diferença de pressão entre o reservatório de amostra e o capilar. A quantidade de amostra injetada depende da diferença de pressão, do tempo de injeção e da viscosidade do BGE. Esse método necessita de bombas que gerem a pressão necessária ao sistema. Outras estratégias, como o posicionamento do reservatório de injeção a uma altura elevada por um determinado período de tempo também podem ser aplicadas.
Por outro lado, a injeção eletrocinética utiliza a aplicação de uma diferença de potencial entre o reservatório da amostra e o capilar para a injeção dos íons no sistema. Nesse modo, os diferentes analitos presentes na amostra são injetados baseado em suas mobilidades eletroforéticas, causando a injeção prioritária de íons de maior mobilidade.24 Esse método pode ser utilizado de maneira vantajosa para injetar seletivamente íons de menor tamanho enquanto minimiza-se a injeção de outras moléculas maiores. Adicionalmente, a injeção eletrocinética não necessita de bombas externas, sendo mais adequada para processos de miniaturização que a injeção hidrodinâmica.
1.3.5. Eletroforese em microdispositivos
Os princípios básicos da separação por CE se aplicam aos dispositivos microfluídicos desenvolvidos para separação eletroforética.23 Na eletroforese em microdispositivos (MCE), a mobilidade eletroforética e as propriedades do EOF também são a base para a separação de analitos carregados. Entretanto, diferentemente de CE, onde as corridas são feitas em capilares de sílica, as separações em dispositivos microfluídicos são efetuadas em um microcanal fabricado sobre um substrato planar.26,27 Devido a essa diferença, MCE possui diversas vantagens e desvantagens quando comparado a CE.
Os microcanais de separação utilizados em MCE são normalmente muito mais curtos que os capilares utilizados em CE. Comprimentos típicos de canais microfluídicos variam de 3 a 15 cm, enquanto em CE normalmente são necessários capilares de 20 a 100 cm para a separação. Entretanto, o campo elétrico aplicado ao canal de separação
ainda é de magnitude comparável aquele aplicado em CE, tornando possível separações rápidas, da ordem de segundos a poucos minutos. Essas características tornam MCE a ferramenta analítica ideal para a separação de espécies altamente instáveis ou reativas.
O design de um dispositivo para MCE rege a separação e demais etapas analíticas que podem ser integradas ao microchip. Para MCE, o design mais comumente utilizado é o formato em simples T (Figura 3). Tipicamente, os canais de separação e injeção, assim como os reservatórios presentes no dispositivo, são preenchidos com BGE e amostra, e uma ddp é aplicada para que a separação ocorra. Em MCE, a aplicação de potencial é realizada através do posicionamento de eletrodos de platina nos reservatórios localizados nas extremidades dos canais.28
Figura 3 – Dispositivo microfluídico com design simples T feito em PDMS com base em vidro. Adaptado de Siegel et
al.21 com permissão da editora.
1.3.6. Injeção de amostra em MCE
Os métodos mais comuns de injeção de amostra em dispositivos MCE são a injeção flutuante (floating injection) e injeção em modo gated (gated injection). Ambos métodos são considerados métodos de injeção eletrocinética21 e estão esquematicamente representados na Figura 4.
Para realizar a injeção em modo gated em um dispositivo em simples T, a alta voltagem é aplicada aos reservatórios de BGE (lateral, contendo apenas eletrólito de corrida) e de amostra (reservatório superior), enquanto os reservatórios de descarte são mantidos a 0 V (GRD, ground). Desse modo, cria-se um campo elétrico entre os
reservatórios superior e lateral e lateral e inferior, gerando assim a formação do “gate” na intersecção dos canais. Em seguida, a alta tensão aplicada no reservatório de BGE é momentaneamente desligada, permitindo que um pequeno volume de amostra migre para a região de interseção dos canais. Quando a alta voltagem é novamente aplicada ao reservatório de BGE, o gate se reestabelece, causando a injeção do plug de amostra no canal de separação.
Figura 4 – Esquema para os modos de injeção em MCE. Adaptado de Siegel et al.21
com permissão da editora.
(a) Injeção no modo gated. (I) Estabelecimento do gate após aplicação de potencial nos reservatórios de amostra e
BGE; (II) Desligamento da voltagem proporciona introdução da amostra na intersecção dos canais; (III) Gate reestabelecido e injeção da amostra no canal de separação. (b) injeção em modo flutuante. (I) Amostra introduzida no reservatório a ela destinado; (II) Canal de injeção é preenchido mediante aplicação de campo elétrico entre os reservatórios laterais (reservatório de amostra e de descarte de amostra); (III) Injeção do plug de amostra no canal de separação após aplicação de ddp entre os reservatórios de BGE e descarte de BGE. GRD: terra. HV: alta voltagem.
Na injeção flutuante, uma diferença de potencial é primeiramente aplicada entre o reservatório de amostra (nesse caso, o reservatório lateral), preenchendo o canal de
injeção do dispositivo. Em seguida, a diferença de potencial é aplicada perpendicularmente a esse canal, causando a injeção e separação do plug de amostra. O volume de amostra injetado é baseado no volume da intersecção entre os canais. Enquanto a injeção flutuante necessita apenas de uma fonte de alta tensão e tem controle por um software mais simples, a injeção em modo gated pode ser utilizada para melhorar automação das análises.
1.3.7. Estratégias de detecção em MCE
Ao longo dos anos uma grande gama de diferentes tipos de detectores tem sido aplicados em sistemas CE e MCE. Microdispositivos, sendo eles utilizados para separação eletroforética ou outros métodos analíticos, são especialmente interessantes por, além de proporcionarem o uso de diversos métodos de detecção, podem ainda ser utilizados para o acoplamento de mais de um detector por dispositivo. Portanto, o desenvolvimento e aprimoramentos das ténicas de detecção são fatores primordiais em análises de microfluídica, uma vez que a técnica miniaturizada somente será útil se dispor de um sistema que possa detectar os analitos de interesse em quantidades analiticamente relevantes.7
Dentre as técnicas de detecção aplicadas a MCE e sistemas microfluídicos em geral, destacam-se as técnicas ópticas e eletroquímicas. Técnicas ópticas incluem as técnicas de absorção molecular (UV-Vis), fluorescência, quimiluminescência, ressonância plasmônica de superfície, absorbância termo-óptica, infravermelho, Raman, índice de refração e emissão atômica.29 A absorção na região UV-Vis é, dentre as técnicas ópticas, a mais comumente empregada em dispositivos CE comerciais, devido à sua simplicidade instrumental. Além dela, a fluorescência destaca-se entre os métodos ópticos por proporcionar modos de detecção altamente seletivos e sensíveis que podem ser utilizados na detecção de compostos que são instáveis antes de serem submetidos às reações de derivatização.7
Os sistemas de detecção eletroquímica incluem a amperometria, voltametria, potenciometria e condutometria.29 A maior vantagem da utilização de sistemas de detecção eletroquímica é a possibilidade de miniaturização dos eletrodos e baixos requisitos energéticos, tornando-os ideais para acoplamento em MCE. Dentro os métodos
citados, amperometria é o modo mais comumente utilizado devido a seus baixos limites de detecção e protocolos de fabricação compatíveis com aqueles utilizados para a fabricação de microdispositivos. Condutometria, especialmente no modo sem contato, vem sendo aplicada a CE e MCE e pode ser utilizada para a detecção de analitos iônicos, moleculares, partículas e até mesmo células inteiras.7,30–34 A não necessidade de contato entre eletrodos e solução facilita a selagem de dispositivos para MCE e evita problemas devido a presença de microeletrodos não planares depositados sobre a superfície do substrato.7
Outros métodos de detecção com aplicações em MCE são a espectrometria de
massas (MS) e espalhamento de raios-X.7 Em especial, MS é uma excelente ferramenta
para identificação de compostos e seu acoplamento com sistemas de separação microfluídicos tem sido alvo de diversos relatos.35 As principais estratégias de acoplamento dos microssistemas com MS são métodos de ionização por electrospray (ESI), em que a borda do chip ou uma ponteira ESI auxiliar podem ser utilizadas para gerar o electrospray;36 e ionização/desorção da matriz assistida a laser (MALDI) em modo offline, em que as amostras são depositadas em um alvo ou placa MALDI e sequencialmente ionizadas e injetadas.36,37 Como exemplo de aplicação, Duarte et al. recentemente utilizaram um dispositivo microfluídico fabricado em impressora 3D para injeção de amostras de tinta de caneta em espectrômetro de massas com o auxílio do posicionamento de uma ponta de papel para ionização direta.38
Assim, devido à grande variedade de possibilidades, os próximos itens dessa sessão destinam-se à discussão dos modos de detecção mais utilizados em CE e MCE, especialmente aqueles ligados direta ou indiretamente à realização do presente trabalho de pesquisa.
1.3.7.1. Absorção UV-Vis
Uma das estratégias mais comuns de detecção em química analítica é a detecção espectrofotométrica por absorção de luz na região do visível ou ultravioleta (UV), sendo a última especialmente interessante na detecção de biomoléculas. De fato, a detecção na região do UV pode ser acoplada a sistemas de CE e existe uma variedade de equipamentos comerciais que fazem uso desse método de detecção. Para tal, é
necessário que o capilar de sílica fundida seja tratado e que uma janela de detecção seja produzida. Isso ocorre porque o capilar é normalmente recoberto com poliimida para aumentar sua resistência mecânica, impossibilitando a detecção por absorção de luz. Uma vez que a camada de poliimida é removida (por meio de aquecimento ou com o auxílio de instrumentação própria para a remoção da poliimida na área desejada), a região do capilar de sílica exposta, transparente à radiação UV, pode ser utilizada para a detecção dos analitos que por ele migrem.
Uma desvantagem do acoplamento CE-UV é o fato de que em CE o caminho óptico é muito menor quando comparado a sistemas cromatográficos com detecção UV. De acordo com a lei de Beer, a caminho óptico é diretamente proporcional à absorbância observada. Assim, em um sistema com caminho óptico reduzido (tipicamente da ordem de 25-100 µm em CE),21 a detectabilidade de analitos com baixa absortividade molar é prejudicada. Deste modo, CE-UV geralmente apresenta baixa sensibilidade e altos limites de detecção. Estes efeitos negativos são potencializados em sistemas MCE, uma vez as dificuldades encontradas com pequenos caminhos ópticos somam-se às dificuldade encontradas para acoplar-se um sistema planar, de espessura da ordem de milímetros, ao detector UV-Vis. Assim, dispositivos MCE com detecção UV-Vis encontram aplicações limitadas à determinações em que o analito de interesse encontra-se em faixas de concentração elevada.29
1.3.7.2. Fluorescência induzida a laser
O fenômeno de fluorescência pode ocorrer como parte do relaxamento de uma molécula em um estado excitado para o estado fundamental, após a interação com radiação de determinando comprimento de onda. De maneira geral, a perda de energia após a excitação pode se dar por vias radiativas ou não radiativas. Nas vias não radiativas, o excesso de energia é perdido na forma de conversões internas e relaxações vibracionais através de colisões com o ambiente e vibrações internas.39 Na via radiativa, parte da energia é perdida na forma de luz, com emissão de fótons, relaxando a molécula do estado excitado para seu estado fundamental. No processo mais comum, o spin dos elétrons envolvidos nessa relaxação permanece inalterado e o fenômeno de emissão de luz ocorre de maneira rápida, tipicamente da ordem de 10-8 a 10-4 s, sendo este
denominado fluorescência.39,40 A eficiência da fluorescência de uma determinada molécula é dada pelo rendimento quântico, definido pela razão entre o número de fótons emitidos e o número total de fótons de excitação. A espectroscopia de fluorescência molecular é a técnica analítica que se baseia na detecção da luz emitida por uma molécula no fenômeno de fluorescência.40 Para a emissão de luz que ocorre após alteração do spin eletrônico (estado singleto para estado tripleto, por exemplo), têm-se um fenômeno de duração prolongada denominado fosforescência.
A fluorescência apresenta detectabilidade intrinsicamente elevada, principalmente quando comparada às técnicas de medida de absorção da luz, uma vez que a detecção de fótons emitidos em um comprimento de onda diferente daquele da luz de excitação é favorecida quando comparada às medidas da diferença da quantidade de fótons incididos e não absorvidos por uma determinada amostra.41 Portanto, a fluorescência tem sido aplicada em diversas áreas onde baixos limites de detecção são necessários, como na análise de células individuais, 42,43 biomoléculas,44 na área de alimentos,45,46 dentre outras.
Para assegurar a alta detectabilidade em separações por eletroforese acoplada à técnicas de fluorescência, sistemas CE e MCE normalmente utilizam uma fonte de excitação com alta intensidade de radiação que pode ser focada na janela de detecção dos capilares ou microcanais sem que haja interferência significativa do meio.47 Assim, lasers de alta intensidade e radiação monocromática são empregados para a excitação por fluorescência, caracterizando a detecção por fluorescência induzida a laser (LIF).47 A relação entre o sinal de fluorescência emitido e a concentração do analito é dada
por:
(1.8)
Onde é a constante que caracteriza a eficiência da captura da radiação emitida, é a intensidade da radiação de excitação, é o volume irradiado de amostra, é o
rendimento quântico do analito e a absortividade molar desse analito.
Portanto, a radiação deve ser coletada por tubo fotomultiplicador que converte a luz emitida em sinais elétricos para obtenção do eletroferograma. Além disso, é importante garantir que a radiação emitida pela amostra seja separada das outras fontes de radiação
(radiação externa ou mesmo proviniente do laser de excitação), e isso é realizado mediante o uso de filtros ópticos, utilizando um design adequado para o detector e isolando-se o detector em um ambiente protegido da luz externa.47
É importante salientar que nem toda molécula apresenta fluorescência, pois sua estrutura pode proporcionar caminhos de perda de energia mais eficientes pela via não radiativa. Moléculas fluorescentes possuem em sua estrutura grupos denominados fluoróforos, responsáveis pela absorção e posterior emissão de radiação. Efeitos significativos de fluorescência estão normalmente ligados a estruturas rígidas e
compostos aromáticos.40 Desse modo, muitos métodos de detecção de componentes são
realizados indiretamente, via processo de derivatização, onde a molécula que não apresenta fluorescência é quimicamente ligada a um corante fluoróforo. Dentre os corantes sintéticos comuns para a derivatização de moléculas, biomoléculas e macroestruturas celulares estão a rodamina-B, cianinas, isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de tetrametilrodamina e as variações do corante Alexa flúor.44,48 O que, por um lado pode ser visto como uma desvantagem da técnica, por outro pode ser utilizado a seu favor, uma vez que o processo de derivatização pode ser feito através de ligações específicas entre moléculas, eliminando sinais provenientes de possíveis interferentes. Entretanto, amostras complexas, como conteúdos celulares, podem conter moléculas que eventualmente interagem com o grupo fluoróforo, suprimindo a intensidade do sinal de fluorescência, no processo denominado quenching.49 Essas interações podem se dar por reações de estado excitado, rearranjo molecular, transferência de energia, formação de complexos e por colisão. Assim, nos casos em que quenching afete a detecção do analito de interesse, é importante que as interações moleculares sejam controladas de modo a minimizar esse efeito.
Por fim, apesar de LIF não ser um método de detecção destrutivo, a necessidade de derivatização atua como agente modificador da amostra, alterando sua composição inicial; e a estequiometria da reação de derivatização deve ser levada em consideração na determinação final da concentração do analito de interesse.
1.3.7.3. Detecção amperométrica
A detecção eletroquímica em modo amperométrico (referida como EC) é a técnica analítica que detecta moléculas baseadas em sua oxidação ou redução na superfície de um eletrodo de trabalho. Em detecção amperométrica, o eletrodo de trabalho é normalmente produzido em metal ou carbono e é mantido a um potencial fixo em relação a um eletrodo de referência. Mudanças na corrente faradaica do sistema, que é proporcional à concentração do analito, são observadas quando ocorre uma redução ou oxidação na superfície do eletrodo de trabalho.50,51
Esse tipo de detecção pode ser realizado utilizando-se microeletrodos acoplados a sistemas CE e MCE.52 Microeletrodos fornecem alta razão sinal/ruído e são compatíveis com as dimensões dos dispositivos.50,51,53 Microeletrodos podem ser facilmente acoplados a MCE devido ao formato planar dos dispositivos. Os materiais mais comumente utilizados para EC são carbono, platina e paládio. Os eletrodos metálicos podem ser fabricados sobre substrato de vidro utilizando técnicas de sputtering e re-utilizados para a detecção em MCE, uma vez que esta pode ser realizada mediante uso de dispositivos poliméricos que são reversivelmente selados sobre o substrato contendo os eletrodos. Assim, MCE-EC tem a vantagem de necessitar apenas da fabricação de um eletrodo para dezenas de microdispositivos poliméricos.
Desvantagens desse tipo de detecção são o fato de que apenas espécies eletroativas podem ser monitoradas e amostras biológicas podem conter diversas espécies interferentes que tenham tempos de migração próximos do analito de
interesse.54 Adicionalmente, os microeletrodos são extremamente finos
(aproximadamente 100 – 200 nm) e podem ser facilmente destruídos durante a limpeza
da região do eletrodo ou remoção do dispositivo polimérico acoplado.21 Para aumentar a robustez desses eletrodos, é possível depositá-los sobre cavidades previamente corroídas na superfície do vidro, dificultando a remoção da camada metálica que neste caso pode ser depositada com maior espessura.55
1.3.7.4. Detecção condutométrica sem contato
A maneira mais popular de detecção condutométrica em CE e MCE é a utilização da detecção condutométrica sem contato capacitivamente acoplada (C4D). C4D tem sido extensivamente utilizada em CE e MCE devido à sua capacidade de fornecer informação dos analitos de interesse sem a necessidade de derivatização da amostra. Além disso, C4D é uma técnica de detecção universal e não destrutiva, em que os eletrodos não entram em contato com as soluções presentes no capilar ou microcanal. Em CE, C4D é normalmente realizada posicionando dois eletrodos tubulares ao redor do capilar de sílica, enquanto em MCE os eletrodos são construídos em geometria planar e isolados do microcanal de separação por uma camada de material dielétrico.56
A resposta em C4D é proporcional à condutividade da solução presente na região dos eletrodos.57 Quando um plug de analito passa por essa região, a condutividade nessa região irá aumentar ou diminuir baseado na diferença de condutividade do analito em relação ao eletrólito de corrida, gerando o sinal analítico.58,59 O modelo elétrico para o funcionamento do C4D pode ser exemplificado utilizando o posicionamento dos eletrodos em CE. O circuito elétrico é um circuito resistor-capacitor formado entre os eletrodos e a solução eletrolítica presente no interior do capilar (ou do microcanal, no caso de MCE). A Figura 5 apresenta uma representação esquemática desse circuito. Na Figura 5a, Cp1 e
Cp2 são as capacitâncias geradas pela presença da parede do capilar em CE ou da
camada dielétrica isolante em MCE. Rc é a resistência oferecida pela solução na região
dos eletrodos. C0 é definida como a capacitância de fuga, e ocorre devido ao acoplamento
próximo dos eletrodos. A frequência do sinal enviado ao sistema deve ser otimizada de modo a minimizar os efeitos de perda de detectabilidade devido à capacitância de fuga.58 Na Figura 5b, Cp1 e Cp2 foram substituídos pela capacitância equivalente na parede do
