UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA
ANISIO SILVESTRE PINHEIRO SANTOS FILHO
ESTABELECIMENTO DE UM MODELO EX VIVO DE FERIDA CRÔNICA EM PELE PORCINA: UMA ABORDAGEM COMPARATIVA COM MODELO IN VITRO
PARA O ESTUDO DE BIOFILMES BACTERIANOS
FORTALEZA 2019
ANISIO SILVESTRE PINHEIRO SANTOS FILHO
ESTABELECIMENTO DE UM MODELO EX VIVO DE FERIDA CRÔNICA EM PELE PORCINA: UMA ABORDAGEM COMPARATIVA COM MODELO IN VITRO
PARA O ESTUDO DE BIOFILMES BACTERIANOS
FORTALEZA 2019
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca Universitária
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S233e Santos Filho, Anisio Silvestre Pinheiro.
ESTABELECIMENTO DE UM MODELO EX VIVO DE FERIDA CRÔNICA EM PELE PORCINA: UMA ABORDAGEM COMPARATIVA COM MODELO IN VITRO PARA O ESTUDO DE BIOFILMES BACTERIANOS / Anisio Silvestre Pinheiro Santos Filho. – 2019.
54 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Médica, Fortaleza, 2019.
Orientação: Profa. Dra. Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia .
1. Biofilmes. 2. Feridas Crônicas. 3. In vitro. 4. Ex vivo. 5. Staphylococcus aureus. I. Título. CDD 616.9
ANISIO SILVESTRE PINHEIRO SANTOS FILHO
ESTABELECIMENTO DE UM MODELO EX VIVO DE FERIDA CRÔNICA EM PELE PORCINA: UMA ABORDAGEM COMPARATIVA COM MODELO IN VITRO
PARA O ESTUDO DE BIOFILMES BACTERIANOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Médica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Microbiologia Médica. Área de concentração: Microbiologia Humana e Animal
Aprovada em: 10/07/2019.
________________________________________
Professora Dra. Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia (Orientadora) Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Professora Dra.Rossana De Aguiar Cordeiro
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Professor Dr. Renato Evando Moreira Filho
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Professor Dr. Reginaldo Gonçalves De Lima Neto
A Deus.
A minha esposa, Wanessa. A minha mãe, Lúcia Guedes. Aos meus irmãos, Gilk e Mauro.
AGRADECIMENTOS
À DEUS, pelo seu infinito amor.
A minha esposa WANESSA FERNANDES MATIAS REGIS PINHEIRO, pelo apoio, auxílio diário e companheirismo.
Aos meus irmãos GILK DA SILVA SANTOS e MAURO JAYME FERNANDES MARTINS pela amizade construída ao longo dos anos.
A Professora Dra. DÉBORA CASTELO BRANCO DE SOUZA COLLARES MAIA, profissional admirável em que pude ter a honra de ser orientando. Agradeço por me conceder a chance de participar dessa equipe maravilhosa, por todas as oportunidades oferecidas, formação científica e pessoal, paciência infinita, ensinamentos, conselhos, broncas e por ser referência não só como pesquisadora, mas também como pessoa.
Aos colegas de trabalho CRISTER JOSÉ OCADAQUE e BRUNO ROCHA AMANDO, pelo auxílio diário, compartilhamento de conhecimento e apoio nas horas mais difíceis. Sem vocês este trabalho não teria sido possível.
Aos colegas de mestrado CARLIANE MELO ALVES MELGAREJO, CAROLINA PIMENTEL DE AZEVEDO, DÉBORA DAMÁSIO DE QUEIROZ PAIVA, EXPEDITO MAIA DIÓGENES e RODRIGO MACHADO PINHEIRO pelas reflexões, críticas e sugestões recebidas e momentos de risos.
A Professora Dra. SILVIANE PRACIANO BANDEIRA, pelo compartilhamento de conhecimento e auxílio para o desenvolvimento do trabalho.
A toda equipe que compõe o CENTRO ESPECIALIZADO EM MICOLOGIA MÉDICA (CEMM), pela parceria, empréstimos de materiais e incontáveis favores ao longo de todo este período.
Aos meus amores caninos BOB, PATRICK e VICK, por fazerem da minha vida um mar de alegria e me ensinarem o valor de cada dia ao lado de quem a gente ama.
À Universidade Federal do Ceará (UFC), na pessoa do reitor, Prof. Dr. HENRY DE HOLANDA CAMPOS.
Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Médica (PPGMM-UFC), pela oportunidade de fazer parte do seu corpo discente.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior – CAPES, pelo apoio financeiro concedido durante todo o período do meu mestrado.
À toda minha família Belém. Que mesmo longe sempre se fazem presente, apoiando e incentivando.
Aos professores do PPGMM-UFC que compartilharam seus conhecimentos.
Aos funcionários do PPGMM-UFC, em especial, CAROLINDA VILMA SOARES DE OLIVEIRA, pela grande ajuda e disponibilidade.
Ao técnico de laboratório do PPGMM-UFC JOSÉ OLAVO MORAES, pelo conhecimento compartilhado e pela amizade.
A todos que durante o período do meu mestrado contribuíram direta ou indiretamente na minha caminhada e que de alguma forma me ajudaram na concretização deste sonho, o meu muito obrigado.
“Nenhum trabalho de qualidade pode ser feito sem concentração e autossacrifício, esforço e dúvida” Max Beerbohm
RESUMO
A ferida crônica é uma doença incapacitante, intimamente relacionada ao envelhecimento e às doenças crônicas como diabetes, hipertensão arterial e obesidade.Estão associadas também aos biofilmes, responsáveis pela resistência aos antimicrobianos, persistência e progressão do quadro clínico, principalmente de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. Assim, desenvolver um modelo mais fidedigno com as condições in vivo é importante para a compreensão daetiopatogênese envolvida nesta interação. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo estabelecer um modelo ex vivo de feridas crônicas para o estudo de biofilmes de S. aureuse deP. aeruginosa em pele suína e compará-lo com o modelo in vitro. Para tanto, três cepas de cada espécie foram avaliadas, sendo uma cepa controle (S. aureusATCC 29213 e P. aeruginosaATCC 27853) e duas cepas clínicas. Para o modelo ex vivo, fragmentos de pele de 1,5 x 1,5 cmforam desinfetados com álcool 70% e NaOH 12% e um orifício de 0,8 cm de diâmetro foi feito removendo a epiderme, onde o inóculo bacteriano de 1,5-1,8 x 109 UFC/mL (25 µL) foi depositado. Os biofilmes in vitroforam formados em placas de poliestireno, utilizando caldo BHI-glicose 1% (175 µL) e inóculo bacteriano de 1,5-1,8 x 109 UFC/mL (25 µL). Ambos foram incubados a 37 oC, por 48, 72, 96 e 120 h. Em cada período de avaliação, foi realizada contagem de UFC, quantificação das proteínas de matriz e produção de proteases e sideróforos. Os biofilmes ex vivo foram avaliados por microscopia óptica e microscopia confocal. Observou-se que as contagens de UFC e a quantificação de matriz de biofilmes de S. aureuse P. aeruginosaex vivo foram significativamente (P<0,05) maiores que aquelas de biofilmes in vitro, especialmente às 48 e 96 h de crescimento. A microscopia confocal dos biofilmes ex vivo demonstrou uma redução significativa (P<0.05) da biomassa e da espessura, a partir das 96 h, e uma maior (P<0.05) robustez, às 72 h de crescimento, para ambas as espécies. Quanto à produção de fatores de virulência, biofilmes de S. aureusex vivo produziram menos sideróforos e proteases que os biofilmes in vitro, enquanto que os biofilmes de P. aeruginosaex vivoproduziram mais sideróforos e menos proteases que aqueles crescidos in vitro. Os resultados demonstram que biofilmes ex vivoapresentam mais células, matriz, maior biomassa e robustez que aqueles crescidos in vitro, enfatizando a importância de se trabalhar com modelos ex vivo, pois esses mimetizam melhor o ambiente do hospedeiro e criam condições mais fidedignas para o estudo de feridas crônicas.
Palavras-chave: Biofilmes. Feridas Crônicas.In vitro. Ex vivo. Staphylococcus aureus. Pseudomonas aeruginosa.
ABSTRACT
The chronic injury is a disabling disease closely related to aging and to chronic diseases, such as diabetes, arterial hypertension and obesity. They are also associated to the biofilms, responsible to antimicrobial resistance, persistence and progression of the clinical picture, specially of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Thus, it is important, in order to better comprehend the etiopathogeneses involved on this relation, to develop a more reliable to the in vivo conditions model. Therefore, the aim of this study was to establish an ex
vivo model of chronic injuries on porcine skin to the study of S. aureus and P. aeruginosa biofilms and compare them to the in vitro model. To do so, three strains of each
species were evaluated, which one of these strains was the control case (S. aureus ATCC 29213 and P. aeruginosa ATCC 27853) and the other two were clinical strains. To the ex vivo model, fragments of skin measuring 1,5 cm x 1,5 cm were disinfected with 70% alcohol and 12% NaOH. An orifice measuring 0,8 cm of diameter was made to the removal of epidermis, where the bacterial inoculum of 1,5-1,8 x 109 CFU/mL (25 µL) was placed. The in vitro biofilms were formed on polystyrene plaques, using BHI broth supplemented with 1% of the glucoses (175 µL) and bacterial inoculum of 1,5-1,8 x 109 CFU/mL (25 µL). The in vitro and
ex vivo biofilms were incubated at 37 ºC each for 48, 72, 96 and 120 hours. In each period of
evaluation, the CFU counting and the quantification of the matrix proteins and the counting of proteases and siderophore production were made. The ex vivo biofilms were evaluated via optical microscopy and confocal microscopy. It was observed that the CFU counting and the quantification of the matrix of S. aureus and P. aeruginosa ex vivo biofilms were significantly (P < 0,05) greater than those of in vitro biofilms, especially the ones of 48-96 hours of growing. The confocal microscopy of ex vivo biofilms have shown one significant (P < 0,05) reduction of the biomass and the thickness, for 96 hours, and a greater (P < 0,05) robustness at 72 hours of growing, to both the species. In matters of the production of virulence factors, S.
aureusex vivo biofilms produced fewer siderophore and proteases than in vitro biofilms,
while P. aeruginosaex vivo biofilms produced more siderophore and fewer proteases than those which have grown in vitro. The results have shown that ex vivo biofilms presented more cells and matrix and greater biomass and robustness than those which have grown in vitro, emphasizing the importance of working with ex vivo models, once it mimics better the host environment and it creates more reliable conditions to the study of chronic injuries.
Keywords: Biofilms. Chronic injuries. Ex vivo. Staphylococcus aureus. Pseudomonas aeruginosa.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Fases da cicatrização das feridas... 13
Figura 2 Resumo esquemático da evolução de uma lesão cutânea... 15
Quadro 1 Tipos de úlceras e os microrganismos mais frequentemente isolados... 16
Figura 3 Ilustração “micrococos em cachos” na parede de um abcesso... 16
Figura 4 Alexander Ogston em casa, 1896... 17
Figura 5 Carle Gessard... 19
Figura 6 (a) Biofilme em osteomielite crônica e (b) cateter intravascular, respectivamente... 21
Figura 7 Etapas de formação do biofilme... 22
Figura 8 (A) Contagem de UFC e (B) Fluorescência de matriz de S. aureus (C) Contagem de UFC e (D) Fluorescência de Matriz de P. aeruginosa... 34
Figura 9 (A)Avaliação pela microscopia confocal da espessura e (B) robustez de S. aureus, respectivamente (C)Avaliação pela microscopia confocal da espessura e (D) robustez de P. aeruginosa, respectivamente... 35
Figura 10 Imagens de microscopia confocal dos biofilmes de S. aureus e P. aeruginosa... 38
Figura 11 (A) Produção de sideróforo e (B) protease em S. aureus (C) Produção de sideróforo e (D) protease em P. aeruginosa... 39
Figura 12 Imagens de microscopia óptica (Olympus BX41) de biofilmes de S. aureus e P. aeruginosa crescido em pele porcina nos tempos 48h, 72h, 96h e 120h corados pela técnica de coloração de Gram... 41
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA... 13 2.1 Feridas crônicas... 13 2.2 Staphylococcus aureus... 16 2.3 Pseudomonas aeruginosa... 19
2.4 Biofilmes e feridas crônicas... 20
2.5 Modelo ex vivo de feridas crônicas... 23
3 HIPÓTESE... 25
4 OBJETIVOGERAL... 26
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 26
5 MATERIA E MÉTODOS... 27
5.1 Microrganismos... 27
5.2 Obtenção e armazenamento da pele porcina... 27
5.3 Desinfecção da pele e formação da ferida... 28
5.4 Formação do biofilme ex vivo e in vitro... 28
5.5 Avaliação da cinética de crescimento dos biofilmes crescidos ex vivo ein vitro... 29
5.5.1 Quantificação das Unidade Formadoras de Colônia (UFC)... 29
5.5.2 Quantificação da matriz extracelular polimérica... 29
5.6 Avaliação microscópica dos biofilmes ex vivo... 30
5.7 Ensaio da produção de sideróforos e proteases... 31
5.8 Análise estatística... 31 6 RESULTADOS... 33 7 DISCUSSÃO... 41 8 CONCLUSÃO... 44 REFERÊNCIAS... 46 ANEXO... 54
1 INTRODUÇÃO
As feridas crônicas acometem entre 70 e 140 milhões de pessoas em todo o mundo, surgindo principalmente secundárias a questões relacionadas ao envelhecimento populacional e doenças crônicas. Estima-se que sua prevalência mundial seja entre 1% e 2%, porém, em países desenvolvidos pode chegar a 6%.
Dentre as causas a úlcera vascular venosa e arterial, úlcera por pressão e úlcera do pé diabético representam 90% de todos os casos e estão associadas ao refluxo e obstrução sanguínea, levando a incompetência do vaso, inflamação, dano capilar, edema e hipóxia na pele.
Após a ruptura da integridade da pele, a ferida passará por quatro estágios: hemostasia, inflamação, proliferação celular e remodelação tecidual em 90% dos casos. Porém é possível que o processo fique estagnado na fase inflamatória, geralmente associado a biofilmes que causam persistência, progressão e falhas terapêuticas.
Os biofilmes são complexas comunidades tridimensionais envoltas por uma matriz presentesem quase todas as infecções persistentes. As bactérias frequentemente isoladas de feridas crônicas são Staphylococcus aureus(S. aureus)e Pseudomonas aeruginosa(P. aeruginosa).
O estudo in vivode feridas crônicas é o mais fidedigno, masesbarra em questões éticas complexas, já o in vitro é estático, não conseguindo reproduzir toda a complexidade do processo. O modelo ex vivo de pele suína parece ser uma alternativa eficiente, mais barata e mais real que condições de crescimento de biofilmes do que o in vitro e devido à escassez de informações que ainda não foram fornecidas pelos modelos atuais, existe espaço para a criação de novos modelos ex vivo de feridas crônicas que venham preencher estas lacunas.
Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo estabelecer um modelo ex vivo de feridas crônicas em pele suína para o estudo de biofilmes de S. aureuse deP. aeruginosa comparando-o com o modelo in vitro.
2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Feridas crônicas
A pele é o maior órgão representando 15% de um corpo adulto (MULHOLLAND, DUNE, MCCARTHY, 2017), sendo uma barreira natural eficaz que protege da desidratação e agressões externas do meio ambiente, exercendo uma defesa fundamental contra a ação de microrganismos e agressões externas (ZHAO et al., 2016; KRISHINASWAMY, MINTZ, SAGI, 2017). Quando ocorre uma descontinuidade na pele causada por um corte, uma perfuração, queimadura, fraturas ósseas ou traumatismos em geral, essa lesão recebe o nome de ferida e dependendo do tempo de evolução para a sua cicatrização poderá ser aguda ou crônica (RAHIM et al., 2016).
O processo de cicatrização da pele envolve 4 fases complexas descritas classicamente como sendo: hemostasia (0-3 dias), inflamação (0-7 dias), proliferação celular (3 dias a mais de 6 semanas) e remodelação tecidual como demonstrado na figura 1(até 2 anos) (EMING, MARTIN, TOMIC-CANIC, 2014; KRISHINASWAMY, MINTZ, SAGI, 2017; KRISTSI, NYSTRÖM, 2018).
Figura 1.Fases da cicatrização dasferidas.
Fonte: Adaptado deOpneja, Kapoor, Stavrou, 2019.Vermelho: Hemostasia; Laranja: Inflamação; Verde: Proliferação celular; Marrom: Remodelação tecidual
A ferida crônica acomete entre 1 e 2% da população em países desenvolvidos,sendo que em idosos esta taxa é de 4% o que representa 4,5 milhões de pessoas somente nos Estados
Unidos (MORI et al., 2019; STECHMILLER et al., 2019). A doença está intimamente relacionada ao aumento da expectativa de vida e países como Japão, Alemanha, Portugal e País de Gales têm até 6 % de sua população comprometida(SEN, 2019). São países com maior expectativa de vida e que atualmente encontram-se em alerta para o envelhecimento e suas consequências como as doenças crônicas como DM, as UVMMII e HAS (BOINK et al., 2016; ZHAO et al., 2016).
A Sociedade de Cuidados de Feridas classificou as feridas crônicas em quatro categorias distintas: úlcera venosa dos membros inferiores, úlcera do pé diabético e úlcera por pressão(WHS, 2006).
A úlcera venosa em membros inferiores é responsável por 70% de todos os casos de úlceras crônicas e afetam mais de 2 milhões de pessoas todos os anos (STECHMILLER et al., 2019) e tem como principais fatores de risco o tabagismo, obesidade, hipertensão arterial sistêmica e o diabetes (MORTON, PHILLIPS, 2016).
A úlcera do pé diabético representa 15-20% de 420 milhões de diabéticos em todo o mundo(PEREIRA et al., 2017) e está relacionada a uma série de fatores dentre eles cuidados locais como manter a ferida úmida, prevenção e combate as infecções, o atrito entre a roupa e a ferida, hábitos de higiene e cuidados pessoais assim como atuar nas comorbidades presentes que muitas vezes possuem difícil controle como é o caso do controle glicêmico do paciente diabético dificultando a cicatrização e perpetuando a lesão (JONES et al., 2018).
A úlcera por pressão compromete de 1% a 5% pacientes hospitalizados e estão localizadas em áreas de proeminências ósseas de pacientes acamados por períodos prolongados na mesma posição e que geralmente está associada a necrose tecidual (MORTON, PHILLIPS, 2016).
As feridas crônicas ocorrem quando a cicatrização não acontece em até 3 meses, como em 90% dos casos e o processo permanece entre as fases inflamatória e proliferativa, por uma série de fatores que incluem a desnutrição, infecções, edema local, insuficiência vascular diabetes e outras doenças crônicas próprias do envelhecimento, promovendo necrose tecidual, colonização bacteriana e gangrena (ZHAO et al., 2016; PEREIRA et al., 2017), como demonstrado no desenho esquemático abaixo (Figura 2 ):
Figura 2. Resumo esquemático da evolução de uma lesão cutânea.
Fonte: Adaptado de Pereira et al., 2017. 1- Derme e epiderme integra. 2 - fase de hemostasia. 3 – fase inflamatória. 3a – fase proliferativa. 3b – remodelação tecidual e cicatrização normal da pele. 4a – inflamação excessiva e posterior colonização microbiana na úlcera crônica.
Dentre as bactérias que promovem a colonização da úlcera as mais frequentemente encontradas são do gênero Staphylococcus, Propionibacterium,Corynebacterium, Streptococcus, e Pseudomonas(PEREIRA et al., 2017), sendo que as espécies mais frequentemente isoladas em úlceras crônicas,Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (COOPER et al., 2014; YADAV et al., 2017). Abaixo o quadro 1 com a predominância bacteriana nos tipos de úlcera mais frequentes:
Quadro 1: Tipos de úlcera e os microrganismos mais frequentemente isolados.
Úlcera venosa em membros inferiores S. aureus e P. aeruginosa
Úlcera do pé diabético Corynebacterium e Staphylococcus Úlcera por pressão Streptococcus e Corynebacterium
Fonte: Xu, Hsia, 2018.
2.2Staphylococcus aureus
O gênero Staphylococcuspertence à família Staphylococcaceae, da qual também fazem parte os gêneros Jeotgalicoccus, Macrococcus, Nosocomiicoccus e Salinicoccus, sendo bactérias Gram-positivas de formato esférico. (LORY, 2014). O gênero Staphylococcusfoi descrito pela primeira vez em 1880(Figura 3) após o médico cirurgião escocês Alexandre Ogston(Figura 4) (1844-1929),filho do professor da Jurisprudência Médica na Universidade de Aberdeen o Dr. Francis Ogston,fazer um esfregaçodo pus de abcesso de um de seus pacientes e examinar sob um microscópio(LYELL, 1989).
Figura 3.Ilustração “micrococos em cachos” na parede de um abcesso.
Fonte: Cooper, Barnsholt, Alhede, 2014. Staphilococcus presentes em secreção purulenta de abcesso pós-infecção cirurgica,feita por Sir Alexander Ogstron em 1880.
Este médico não estava disposto a aceitar a alta taxa de mortes em pós-operatórios e foi um grande defensor do valor da antissepsia defendida por Joseph Lister (1827-1912) e ao
ver os microrganismos fez a seguinte afirmação:“Meu deleite pode ser concebido quando me foram revelados belos emaranhados, tufos e correntes de organismos redondos em grande número, que se destacavam clara e distintamente entre as células de pus e detritos” (Alexander Ogston) (JONES, 1992).
Figura 4. Alexander Ogston, 1896.
Fonte: Jones, 1992. Alexander Ogstron sentado em uma cadeira na sala da sua casa.
Posteriormente este médico, testou o postulado de Robert Koch (1843-1910) e injetou pus de abcessos humanos em cobaias, observando a formação de abcessos nesses seres além da sepse evidenciada pela constatação de cocos no sangue (LICITRA, 2013). Posteriormente desenvolveu um método para cultivo de cocos em ovos de galinhas, verificando que estes ovos continham atividade piogênica semelhante ao pus original (LICITRA, 2013).
Em 1882 Ogstron nomeou o agrupamento de cocos em Staphyle (do grego cacho) e em 1884 o médico cirurgião Anton J. Rosenbach (1842-1923), isolou duas cepas e nomeou uma pela aparência da pigmentação da colônia em meio ágar sangue de S. aureus (do latim ouro) e a outra de Staphylococcusalbus (do latim branco), que depois foi renomeado para S. epidermidis(PEIXOTOet al., 2013).
Deste gênero fazem parte mais de 30 espécies sendo a mais importante o S. aureusque está intimamente relacionada a um amplo espectro de doenças no ser humano de gravidade considerável, incluindo infecções de pele, tecidos moles, ossose infecções oportunistas (LORY, 2014). O S. aureus possui um tamanho que pode variar entre 0,5 a 1,5 µm de diâmetro, sendo imóvel e capaz de crescer em variadas condições de oferta de
oxigênio, desde aeróbia até anaeróbia, em elevadas concentrações de sal e em temperaturas que podem variar entre 18 ºC e 40 ºC (SANTOS et al., 2007).
Suas colônias produzem coagulaseo que facilita para diferenciação entre os estafilococos coagulase-negativos e podem apresentar a coloração amarelo ouro resultado da produção de pigmentos carotenoides(FAGUNDES, OLIVEIRA, 2004).
S. aureus possui uma cápsula polissacarídica externa que tem a função protetora pois inibe a fagocitose dos microrganismos pelos leucócitos polimorfonucleares e é recoberto por uma matriz frouxamente ligada e hidrossolúvel que consiste em monossacarídeos, proteínas, pequenos peptídeos e que propicia a ligação à diversas superfícies não biológicas, como cateteres, stents cardíacos, próteses valvares e articulares, fixadores (CANTY et al., 2019).
Aproximadamente metade do peso da parede é composta por peptideoglicano, comum às bactérias Gram-positivas, construído com 10 a 12 subunidades alternadas com o ácido N-acetilglicosamina e unidas por ligações cruzadas de L-lisina e D-alanina o que confere rigidez a parede (VOLLMER, BORN, 2010).
As enzimas catalizadoras da construção das camadas são chamadas de proteínas ligadoras de penicilina (PBP), pois são alvos das penincilinas e de outros antimicrobianos e sua resistência está relacionada a aquisição genética mediada pelo gene mecA que altera a PBP para outra que possua baixa afinidade por meticilina, penicilinas e cefalosporinas, transformando-a em PBP-A2. O peptideoglicano tem uma atividade semelhante a endotoxina, estimulando a produção de interleucina 1 e agregação de polimorfonucleares (LENCASTRE et al., 1994).
Os ácidos teicóicos são polímeros contendo fosfato e são fracos imunógenos, mas que estimulam uma resposta específica de anticorpos, estando ligados covalentemente aos resíduos do N-acetilmurâmico da camada do PBPou aos lipídios da membrana citoplasmática, neste caso, chamados de ácidos lipoteicóicos (FISHOVITZ et al., 2014).
A expressão de fatores de virulência pelos estafilococos é controlada por complexos sistemas regulatórios sendo o mais importante o sistema regulador de genes acessórios que é responsável pela produção de QuorumSensinge este estimula a colonização de tecidos quando em baixa densidade e de enzimas hidrolíticas e toxinas quando em alta (FISHOVITZ et al., 2014). As toxinas produzidas pelo S. aureus são muitas e são dívidas em: danificadoras de membranas (alfa, beta, gama e LeucocidinaPantonValantine); esfoliativas (A e B),
enterotoxinas (A à R) e s toxina-1 responsável pela síndrome do choque toxico (NADER et al., 2007).
Indivíduos adultos saudáveis possuem S. aureussem apresentar sintomatologia, aonde fazem parte da microbiota de narinas e regiões de dobras como axila e virilha, mas quando migram dessas áreas e em condições favoráveis, podem causar um número considerável de doenças tais como: infecções cutâneas, infecções alimentares, síndrome da pele escaldada estafilocócica, abcessos, osteomielite e a infecção de feridas que ocorrem principalmente após procedimentos cirúrgicos e traumas locais(MURRAY, ROSENTHAL, PFALLER, 2014).
2.3Pseudomonas aeruginosa
O gênero Pseudomonaspertence à família Pseudomonadaceaee consiste em um grupo de bactérias Gram-negativas, baciliformes não fermentadoras do gênero Pseudomonas que apresentar o maior número de espécies, 10 adicionadas no ano 2013 e mais 6 em 2014, totalizando 144 espécies, incluindo a P. aeruginosa(GOMILLA et al., 2015; PEIX, RAMÍREZ-BAHENA, VELÁZQUEZ, 2018).
Seu primeiro isolamento com sucesso foi feito pelo químico e bacteriologista francês Carle Gessard (1850-1925) (Figura 5) em 1882 em uma publicação intitulada “Sobre a coloração azul e verde das ataduras” em que observou o crescimento de microrganismos em forma de bastões em feridas de pacientes que possuíam aspecto azul esverdeado. Um detalhamento mais completo sobre as rotas de disseminação levando a infecções agudas ou crônicas foi feito por Freeman em artigo de 1916.
Figura 5.Carle Gessard.
P. aeruginosa encontra-se dispersa no ambiente no solo, na matéria orgânica em deterioração, vegetação, água e em ambiente hospitalar em locais úmidos, como alimentos, pias, banheiros e até mesmo em produtos de limpeza(PERESI et al., 2011). De maneira geral é uma infecção oportunista que ataca pacientes imunossuprimidos, debilitados ou que receberam antibióticos por período prolongado e de amplo espectro (PERESI et al., 2011).
São bactérias Gram-negativas apresentando comprimento que varia entre 1,5 e 5 µm de comprimento, que utilizam o carboidrato por meio de respiração aeróbica e toleram temperaturas que podem variar de 4 ºC, o que justifica surtos hospitalares em ductos de ventilação e climatizadores, a até 42 ºC(MURRAY, ROSENTHAL, PFALLER, 2014).
A presença de citocromo-oxidase faz com que sejam diferenciadas das Enterobacteriaceae e Stenotrophomonas. São produtoras dos pigmentos:pioverdina (verde), piorrubina (vermelho),piocianina (azul) e piomelanina (preto). Apresenta numerosos fatores de virulência o que confere alta resistência a bactéria, através da produção de toxinas, enzimas,adesinas e bombas de efluxo em maior quantidade que as bactérias Gram-positvas.
A sua matriz extracelular é composta pelo alginato predominantemente, um polissacarídeo mucoide que forma uma cápsula proeminente (FIGUEIREDO et al., 2007).O alginato bacteriano possui propriedades quantitativas especificas o que propicia sua utilização como biopolímeroinclusive na indústria de materiais odontológicos (MULLER et al., 2011).
A infecção mais frequente da P. aeruginosa ocorre nos pulmões de pacientes acamados e também pode comprometer outros sítios como o trato urinário, conduto auditivo (otite do nadador), infecção ocular, coração e pele, sendo este último local principalmente em pacientes vítimas de queimaduras, evoluindo para uma ferida crônica (VICENTIM et al., 2009).
O intercâmbio de material genético, que ocorre de forma natural intra ou interespécies entre os bacilos Gram-negativos, é apontado como um dos responsáveis pela aquisição de determinantes de resistência,sendo assim, a capacidade que P. aeruginosa possui de tornar-se resistente durante o tratamento ao antibiótico é inerente à espécie e muitas vezes, inevitável (FERREIRA, SANTOS, 2003).
2.4Biofilmes e feridas crônicas
O estudo de biofilmes só foi possível graças inicialmente ao naturalista holandês Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) quer construí o primeiro microscópio em 1674 dotado
apenas de uma lente de vidro, mas que permitia aumentar em 300 a imagem e com uma razoável nitidez. Ele estudou glóbulos sanguíneos, espermatozoides e foi o primeiro a relatar que havia pequenos seres, que denominou de “animálculos”, quando visualizado ao microscópio o raspado da massa pardacenta incrustada em seu próprio dente (COSTERTON, GEESY, CHENG, 1978)
Somente três séculos depois, após a introdução da microscopia eletrônica em 1931, que o professor da Universidade Calgary no Canadá Dr. John Willian Costerton desenvolveu, pela primeira vez, o conceito do que seriam biofilmes em seu trabalho publicado em 1978 cujo título foi how bactéria stick: “Na natureza (mas não em culturas de laboratório) as bactérias são cobertas por um glicocálice de fibras que aderem às superfícies e a outras células” (COSTERTON, GEESEY, CHENG 1978).
Somente no ano de 1982 o Dr. Costerton e sua equipe de pesquisadores, introduziram
o termo biofilme em seu trabalho “A
scanningandtransmissionelectronmicroscopicstudyofaninfectedendocardialpacemaker lead” (MARRIE, NELLIGAN, COSTERTON, 1982).
Os biofilmes são comunidades sésseis organizada de modo tridimensional que podem ser constituídas de uma única espécie ou o que é mais frequente, composta por várias espécies e até de reinos distintos como a mescla entre o reino bacteriano e o fúngico na cavidade oral. Estão organizadas e promovem uma cooperação mútua que beneficia a todos os microrganismos envolvidos (OLIVEIRA et al., 2018).
Estão presentes de 60% a 80% das doenças infecciosas crônicas como por exemplo a fibrose cística, cárie dentaria, osteomielite (figura 6a), endocardite, infecções associadas a cateteres (figura 6b) e dispositivos biomédicos em geral e úlceras crônicas(ALHUSEIN et al., 2015).
Fonte: Del pozo, 2018. Setas indicando a estrutural baciliforme de P. aeruginosa (a) e esférica de S. aureus (b)
O biofilme irá se formar a pós cumprir etapas, que iniciam com o deslocamento até uma superfície através de flagelos, quando presentes, ou movimentos brownianos, vencendo forças repulsivas eletrostáticas entre o substrato e a superfície bacteriana ese obtiverem êxito, irão fixar-se (COOPER, BARNSHOLT, ALHEDE, 2014). Após esta etapa, vai ocorrer a formação de microcolôniase do envoltório matricial extracelular (TRENTIN, GIORDANI, MACEDO 2013) e começam a produzir substâncias que vão auxiliar na sua multiplicação de forma coordenada e maturação do biofilme, que são as moléculas de Quórum sensing (OMAR et al., 2017). Após a maturação completa,formam estruturas em forma de torre ou cogumelo e quando atingem um tamanho crítico, os biofilmes se rompem liberando bactérias planctônicas que irão colonizar novos sítios (COOPER, BARNSHOLT, ALHEDE, 2014). Estes eventos estão demonstrados na figura 7:
Figura7.Etapas de formação do biofilme
Fonte: Adaptado de Omar et al., 2017 1- bactérias planctônicas. 2- adesão, formação de microcolônias e produção de moléculas de QS. 3- Crescimento e maturação do biofilme.4- Biofilme maduro iniciando a dispersão de bactérias planctônicas. Abaixo imagens em microscopia eletrnônica da formação do biofilme: a-Adesão inicial, b-formação de microcolônias, c- biofilme maduro em 3D.
A Sociedade Europeia de Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas em 2014 afirmou categoricamente que os biofilmes são a causa primaria da cronicidade das doenças infecciosas e publicou diretrizes para coleta de amostras clínicas apropriadas, uso de métodos confiáveis de detecção do biofilme, testes de sensibilidade, avaliação das respostas de anticorpos (HØIBY et al., 2014).
A presença de bactérias na forma de biofilmes dificulta o tratamento das feridas crônicas, pois essas estruturas bacterianas apresentam menor sensibilidade aos agentes antimicrobianos. Os mecanismos envolvidos no processo de cronificação da doença ainda não estão totalmente elucidados, mas os fatores de resistência do biofilme como expressão de genes codificadores de fatores de virulência, como as moléculas de QS, a forte adesão ao substrato, a grande permuta de material genético intra e interespécies dentro do biofilme, confere uma incrível resistência entre 10 e 1000 maior do que na sua forma planctônica (APARNA et al., 2008; TRENTIN, GIORDANI, MACEDO, 2013). Dentre os mecanismos de resistência dos biofilmes, destacam-se a baixa penetração de agentes químicos, o crescimento lento de células no interior do biofilme, a transferência de genes de resistência, o efluxo de antimicrobianos e metabólitos do meio intra para o extracelular (TRENTIN, GIORDANI, MACEDO, 2013).
Os biofilmes se instalam após o processo de colonização da ferida entre as fases de inflamação e proliferação, sendo o modelo esquemático já descrito na figura 2, levando a um aumento da migração de macrófagos M1 e citocinas inflamatórias, criando um processo de hiperinflamação que destroem o tecido e retardam a cicatrização (MALONE et al., 2017;PEREIRA et al., 2017; OPNEJA, KAPOOR, STAVROU, 2019).
Para a maior compreensão sobre a dinâmica de formação da ferida crônica, diversos modelos in vitro para estudo de biofilmes foram desenvolvidos(KHARAZMI, GIWERCMAN, HØIBY, 1999; CERI et al., 1999; HARRISON et al., 2006; HILL et al., 2010; GOERES et al., 2009)merecendo destaque dentre eles o modelo de Lubbock baseado no crescimento multiespécie em um meio que simula a ferida por conter os seus principais elementos como células vermelhas do sangue, plasma e tecido danificado (SUN et al., 2008).
Embora sua importância tenha sido fundamental para a compreensão inicial dessa dinâmica, os modelos in vitro são considerados estáticos e não conseguem reproduzir de
forma satisfatória toda a complexidade que envolve o processo e por esta razão o uso de modelos animais vivos ainda é uma prática frequente (DUCKWORTH et al., 2018).
2.5 Modelo ex vivo de feridas crônicas
Os estudos até 2013 focavam na microbiota da ferida infectada e utilizavam o modelo in vitro, como o de Lubbock (SUN et al., 2008), considerado muito diferente de uma superfície biológica não sendo capaz sobretudo de representar a adesão e as forças envolvidas neste processo (YANG et al., 2013).
O surgimento de um modelo que simule uma ferida infectada deve considerar pontos fundamentais: 1- seleção de bactérias comuns em feridas crônicas; 2- seleção da superfície para a fixação do biofilme que reproduza o leito da ferida; 3- disponibilidade e custo dos principais componentes do modelo; e 4- reprodutibilidade, precisão e facilidade para testar tratamentos inibitórios ou bactericidas que possam influenciar a cicatrização da ferida, ou seja, um modelo que seja o mais próximo das condições oferecidas pela pele humana (YANG et al., 2013).
Os suínos apresentam grande similaridade estrutural, funcional, bioquímica, fisiológica, anatômica e de resposta imunológica com o ser humano (JENSEN, JOHANSEN, JENSEN, 2017; KLEIN et al., 2018), mas também apresenta diferenças que devem ser levadas em consideração como a derme do porco e seus folículos que são vascularizados, o seu endotélio não produz fosfatase alcalina, apresenta em sua pele apenas glândulasapócrinas e holócrinas, sem apresentar glândulas écrinas (SEATON, HOCKING GIBRAN, 2015).
Dificuldades de aprovação do uso de animais vivos por conselhos de ética, o custo elevado para compra e manutenção de cada cobaia, disponibilização de área suficientemente adequada para a sua acomodação, com temperatura e controle de agentes estressores e a forte opinião pública demonstrando resistência com relação ao uso de métodos cruéis em experimentos, causando dor e morte desnecessária do animal levou ao uso de métodos distintos como o modelo ex vivo de feridas crônicas, que possui como grande desvantagem a ausência de resposta inflamatória, um dos elementos fundamentais já que a ferida crônica é marcada pela estagnação entre as fase inflamatória e proliferativa do processo de cicatrização (ANDERSEN, WINTER, 2017; ALVES et al., 2018).
O modelo proposto por Qingping Yang e colaboradores em 2013 vem justamente tentar atender aos requisitos previamente citados, utilizando como microrganismos para a
formação do biofilme S. aureuseP. aeruginosa, padronizando o local de obtenção da pele, tempo e local de armazenamento, tamanho do explante e dimensões da ferida, tempo de maturação do biofilme, assim como avaliar a eficácia de diferentes métodos de desinfecção e de esterilização da pele sendo posteriormente amplamente utilizado, com adaptações, para testes dos mais variados tratamentos (WILKSON et al., 2016; YANG et al., 2017; WILKSON et al., 2018; ALVES et al., 2018; ROCHE et al., 2019)e devido à escassez de informações que ainda não foram fornecidas pelos modelos atuais, existe espaço para a criação de novos modelos ex vivo de feridas crônicas que venham preencher estas lacunas (ALVES et al., 2018).
3. HIPÓTESE
O modelo ex vivo é capaz de oferecer um substrato de adesão superior ao modelo in vitro propiciando uma formação de matriz mais bem estruturada, além de maior aporte nutricional favorecendo a formação de um biofilme mais robusto.
4. OBJETIVO
4.1 OBJETIVO GERAL
Estabelecer um modelo ex vivo de feridas crônicas em pele suína reprodutível, de baixo custo e com simplicidade em sua execução e compará-lo com o modelo in vitro de estudo de biofilmes de Staphylococcusaureus e de Pseudomonasaeruginosa.
4.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a cinética de crescimento de biofilmes de S. aureuse de P. aeruginosaex vivo e in vitro, ao longo de 120 horas;
2. Quantificar as proteínas de matriz de biofilmes de S. aureuse de P. aeruginosaex vivo e in vitro, ao longo de 120 horas;
3. Analisar por microscopia confocal e óptica o processo de maturação dos biofilmes de S. aureus e P. aeruginosaex vivo, ao longo de 120 horas;
4. Investigar a produção de sideróforos e de proteases por S. aureuse P. aeruginosa na forma de biofilmes crescidos em modelo ex vivo e in vitro ao longo de 120 h.
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Microrganismos
As bactérias utilizadas foram S. aureus e P. aeruginosa, três cepas de cada. Uma cepa de S. aureus foi obtida de um abcesso da região epidural e a outra de uma ferida crônica na perna. As duas cepas de P. aeruginosa vieram de úlceras crônicas em perna sendo que em um dos casos foi extraído de um fragmento ósseo comprometido por osteomielite. As cepas clínicas foram gentilmente cedidas pelo Hospital César Cals e Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC) e incorporadas à coleção de culturas do Laboratório de Bacteriologia (LABAC) Grupo Aplicado em Microbiologia Médica (GrAMM), da Universidade Federal do Ceará que por sua vez contribuiu disponibilizando as cepas ATCC (S. aureusATCC 29213 e P. aeruginosaATCC 27853).
5.2 Obtenção e armazenamento da pele porcina
Um retalho de pele de aproximadamente 60 X 60 cm foi retirado do dorso de suínos da raça Large White, com idade entre 6 e 8 meses, 15 minutos após o abate para consumo humano (YEUNG et al., 2016). A pele foi embalada em 3 sacos plásticos e transportada em isopor contendo uma cama de gelo e levado imediatamente para o LABAC-GrAMM, onde foi cortado em fragmentos de pele de 1,5 x 1,5 cm com faca amolada, preservando entre 1 e 2 mm da espessura da camada adiposa. Os fragmentos foram armazenados em tubos Falcon de 50 mL, a uma temperatura de – 20 °C para uso posterior (YANG et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2018). Vale ressaltar que a pele foi obtida em abatedouro regulamentado (F. de Assis Aguiar Carne), na cidade de Maracanaú, Ceará, com registro de licença de operação número 006-01/2018.
5.3 Desinfecção da pele e confecção da ferida
A metodologia utilizada foi adaptada de YANG e colaboradores 2013, com algumas modificações, que serão descritas a seguir. No dia do experimento, os fragmentos de pele foram retirados do refrigerador e deixados em temperatura ambiente para o seu completo descongelamento. Para desinfecção, os fragmentos foram submetidos à imersão em álcool 70%, por 30 minutos, seguida da imersão em hipoclorito de sódio 12%, por 30 minutos, e em
água destilada estéril por 30 minutos. Posteriormente, os fragmentos foram colocados em placas de Petri estéreis para secagem dentro da câmara de fluxo laminar.
A metodologia utilizada para a formação da ferida foi adaptada de ALVESe colaboradores 2018, com as modificações que seguem: foi substituído o dispositivo composto de 24 pinos que se aquecem por uma pinça Allis aquecida em chama, até se tornar incandescente, a qual foi colocada sobre a epiderme de forma perpendicular e em movimento de 360°, formando um óstio de 0,8 cm de diâmetro, com uma profundidade de aproximadamente 0,1 cm.
5.4 Formação do biofilme ex vivo e in vitro
A metodologia utilizada foi adaptada de CASTELO-BRANCOe colaboradores 2013 e SIDRIM e colaboradores 2017. Previamente ao experimento, as cepas de S. aureus(n=3) ede P. aeruginosa(n=3) foram semeadas em ágar Mueller Hinton e incubadas em estufa a 37 °C, por 24 h. Os inóculos foram preparados com a turbidez 6 na escala de McFarland (~1.8 × 109 UFC ml−1) em tubos de hemólise contendo caldo BHI suplementado com 1% de glicose (BHI-glicose 1%). Posteriormente, 25 μL do inóculo foram depositados sobre as feridas confeccionadas nos fragmentos de pele. Em seguida, os fragmentos de pele foram colocados em placas de Petri de tamanho médio contendo 20 mL de ágar bacteriológico [7 g/L] cada uma, para manter a umidade ao longo do período de incubação. Fragmentos de pele submetidos à confecção da ferida, mas não à inoculação bacteriana foram utilizados como controle negativo para a formação de biofilmes.
Paralelamente, foi induzida a formação de biofilmes in vitro,em placas de poliestireno de 96 poços de fundo chato. Para tanto, foram colocados 175 µL de BHI-glicose 1% em cada poço e, em seguida, foram adicionados a cada poço 25 µL do inóculo bacteriano com aturvação 6 na escala de McFarland (~1.8 × 109 UFC ml−1), preparados com água destilada estéril (CASTELO-BRANCO et al., 2017; SIDRIM et al., 2017). Poços contendo somente meio de cultura foram incluídos como controle de esterilidade e a cepa de S. aureusATCC 29213 foi utilizada como controle positivo para a formação de biofilmes.
Ambas as condições de crescimento dos biofilmes, ex vivoou in vitro, foram incubadas a 37o C, por até 120 h, sendo realizadas análises nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas (JOHANI et al., 2018). Os experimentos, em ambas as condições de crescimento, foram realizados em triplicata para cada cepa e para cada tempo de crescimento.
5.5 Avaliação da cinética de crescimento dos biofilmes crescidos ex vivoe in vitro 5.5.1 Quantificação das unidades formadoras de colônia (UFC)
A metodologia utilizada foi adaptada de PHILLIPS, YANG, SCHULTZ 2013. Resumidamente, para os biofilmes de S. aureus(n=3) e de P. aeruginosa(n=3) crescidos tanto ex vivo, quanto in vitro, o sobrenadante do biofilme foi retirado de um fragmento de pele ou de um poço da placa de poliestireno, aos quais foram adicionados 50 µL de água destilada estéril. Em seguida, um swab de algodão foi introduzido perpendicularmente em cada ferida ou em cada poço, rotacionado em 360º, duas vezes, e transferido para tubos contendo 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 5 μL/mL de TWEEN 20 (PBST). Os tubos foram agitados em vortex, por um minuto, os swabs foram desprezados e 100 μL de cada suspensão foram submetidos a uma diluição seriada, em solução salina estéril, de 1:10; 1:100; 1:1.000; 1:10.000 e 1:100.000. Posteriormente, 10 μL das diluições (1:10.000 e 1:100.000 das feridas e 1:1.000 e 1:10.000 dos poços) foram semeados, em duplicata, em ágar Muller Hinton e incubados a 37º C, por 48 h, para contagem UFC. A contagem de UFC foi realizada com uma amostra de cada condição de crescimento (pele ou poço), para cada tempo de crescimento (48, 72, 96 ou 120 horas). Os resultados foram expressos em UFC/fragmento de pele ou UFC/poço da placa de poliestireno.
5.5.2 Quantificação da matriz extracelular polimérica
A matriz extracelular polimérica de cada biofilme foi quantificada por meio da quantificação das proteínas de matriz, utilizando o fluoróforoFilmTracer SYPRO® Ruby como descrito previamente por Frank, Patel(2007) e Oleksone colaboradores(2017), com adaptações. Brevemente, para os biofilmes de S. aureus(n=3) e de P. aeruginosa(n=3) crescidos tanto ex vivo, quanto in vitro, o sobrenadante do biofilme foi retirado e foi realizada uma raspagem de um fragmento de pele ou de um poço da placa de poliestireno, com uma ponteira de 1000 μL. Em seguida, foram adicionados 100 μL de água destilada estéril, tanto nas peles, quanto nos poços, os quais foram transferidos para microtubosEppendorfcontendo 200 μL do fluoróforo, e incubados no escuro, por 30 minutos. Posteriormente os micro tubos Eppendorfforam centrifugados a 10.000 rpm, por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e
o pellet foi lavado uma vez com água destilada estéril (200 µL) e centrifugado novamente. Em seguida, o pellet foi ressuspenso em 200 μL de água destilada estéril e 30 μL foram transferidos, em quadruplicata, para uma placa de 96 poços, a qual foi lida em espectrofotômetro (Cytation 3, Biotek) para quantificação da fluorescência (450/610 nm). A quantificação da matriz foi realizada com uma amostra de cada condição de crescimento (pele ou poço), para cada tempo de crescimento (48, 72, 96 ou 120 horas). Os resultados foram expressos em intensidade de fluorescência. Os fragmentos de pele não inoculados e os poços controle de esterilidade foram utilizados como controle negativo para a presença de matriz.
5.6 Avaliação microscópica dos biofilmes ex vivo
A avaliação estrutural dos biofilmes maduros de biofilmes de S. aureus (n=3) e P. aeruginosa (n=3) foi feita por meio da microscopia óptica e microscopia confocal. Um fragmento de pele para cada cepa teve o seu óstio da ferida raspado com lâmina de bisturi número 21 Free-Bac®. O material foi transferido para uma lâmina de vidro e corado pela coloração de Gram. As lâminas foram analisadas com microscópio óptico Olympus BX41 e fotos de 10 campos/lâmina foram tiradas com a câmera Olympus DP71 e processadas com o software Olympus DP Controller, versão 3.3. Foram avaliadas a composição bacteriana e a produção de matriz extracelular (CASTELO-BRANCO et al., 2017).
Para a análise da arquitetura, composição e viabilidade dos biofilmes ex vivo, os biofilmes crescidos sobre os fragmentos de pele foram corados com FilmTracer LIVE/DEAD BiofilmViability®, contendo SYTO9 e iodeto de propídio. Os fragmentos de pele foram avaliados sob microscópio confocal Nikon C2, a 488 nm, para detecção de SYTO9, que identifica células vivas, e a 561 nm, para a detecção do iodeto de propídio, que identifica células mortas ou danificadas. Imagens tridimensionais foram adquiridas de 10 campos por pele analisada, com a câmera Nikon Eclipse Ti e processadas com o software NIS elements AR. A análise das imagens foi realizada com o softwareCOMSTAT2, associado ao ImageJ 1.5i, para quantificar biomassa (µm3/µm2), espessura total (µm), espessura da biomassa (µm), coeficiente de rugosidade e relação área-volume (µm2/µm3)(CASTELO-BRANCO et al., 2017).
5.7 Ensaio da produção de sideróforos e de proteases
O protocolo para ensaio da produção de sideróforo foi segundo WONGTRAKOONGATE, TUMAPA, TUNGPRADABKUL, 2012 e DEAN, CHUNG, VAN HOEK, 2015, com algumas modificações. Resumidamente, para os biofilmes de S. aureus(n=3) e de P. aeruginosa(n=3) crescidos tanto ex vivo, quanto in vitro, o sobrenadante do biofilme foi retirado dos fragmentos de pele ou dos poços da placa de poliestireno e transferido para micro tubos. No caso das feridas, foram adicionados 500 µL de água destilada estéril para fluidificar o sobrenadante dos biofilmes. Em seguida, os microtubos foram centrifugados a 10.000 rpm, por 5 minutos, e 100 µL do sobrenadante foram retirados e incubados com 100 µL de solução CAS (0,6 mM de hexadecil-trimetil-amônio, 0,015 mM de FeCl3.6H2O, 0,15 mM de Chrome Azural S, 50 mM de piperazina anidra, 0,75 M de HCl), a 28 oC, por 15 minutos, no escuro em placa de poliestireno de 96 poços em duplicata para leitura da absorbância a 630 nm no espectrofotômetro.
Quanto à produção de proteases, 100 µL do sobrenadante retirado dos biofilmes ex vivo e ein vitro foram incubados com 100 μL de azoalbumina, em banho maria a 37º C, por 3 horas. Após a incubação, o substrato não digerido foi precipitado em 750 μL de ácido tricloroacético a 10% e agitados em vortex por 1 minuto. A solução foi novamente centrifugada e 100 μL foram retirados e colocados em duplicata em placas de poliestireno de 96 poços juntamente com 100 μL de Hidróxido de Sódio (NaOH) para a leitura da absorbância a 450 nm no espectrofotômetro.
A solução CAS e azoalbumina foram incubadas com salina estéril e com os sobrenadantes oriundos dos fragmentos de pele e dos poços não inoculados foram utilizadas como controle negativo para a produção de sideróforos e de proteases, respectivamente.
5.8 Análise estatística
Os dados foram expressos como média e erro padrão da média e a distribuição dos dados foi avaliada quanto à homogeneidade. Aqueles dados que apresentavam distribuição normal foram avaliados por ANOVA ou teste t para amostras não pareadas, para a avaliação entre pares, enquanto que os dados com distribuição heterogênea foram avaliados pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn para comparações múltiplas, ou pelo teste de Mann-Whitney para amostras não pareadas, para a avaliação entre pares. As análises foram
realizadas com o programa GraphPad Prism 7.0, e valores de P menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
6. RESULTADOS
S. aureus e P. aeruginosaforam cultivados ex vivo e in vitro, por até 120 horas.Biofilmes de S. aureus cultivados em explantes de pele de porcína (modelos ex vivo) apresentaram contagens de Unidade Formadora de Colônia(UFC) variando de (média ± EPM) 2,9x108 ± 1,02x108 a 9,98x108 ± 4,76x107UFC / fragmento de pele, atingindo a contagem mais alta (P <0,05) de UFC em 48 e 72 h de crescimento. Quando os biofilmes foram cultivados in vitro, as contagens de UFC variaram de 4,08x107 ± 6,46x106 a 6,86x107 ± 1,18x107UFC / poço da placa, sem diferenças significativas ao longo do período de incubação testado (48-120 h). No geral, os biofilmes crescidos em modelos ex vivo tiveram uma quantidade significativamente maior (P <0,05) de células do que a sua contraparte in vitro em todos os períodos testados (Figura 8A).
Quanto à matriz, os biofilmes de S. aureus foram cultivados em modelos ex vivo, a fluorescência da matriz variou de (média ± EPM) 752,4 ± 186,8 a 5296 ± 15388 unidades de fluorescência, alcançando o maior (P <0,05) e menor (P < 0,05) valor em 96 e 120 h de crescimento, respectivamente. Quando os biofilmes foram cultivados in vitro, a fluorescência das proteínas variou de 1287 ± 129,5 a 2942 ± 272,9 unidades de fluorescência, com os valores mais altos (P <0,05) observados em 96 e 120 h de crescimento. Os biofilmes cultivados em modelos ex vivo apresentaram matriz (P <0,05) significativamente maior do que sua contraparte in vitro nas 48 e 96 h de incubação, enquanto o oposto foi observado nas 120 h de crescimento (Figura 8B).
Figura 8: (A) Contagem de UFC e (B) Fluorescência de matriz de S. aureus.
Fonte: Autor. 8A-Crescimento ex vivo atingiram maiores valores em 48 e 72 h. Crescimento in vitro não apresentou diferença significativa ao longo do tempo. 8B – Matriz mais fluorescente em 96 e menos em 120h no modelo ex vivo. Matriz mais fluorescente em 48 e 96 h e menos em 120h no modelo in vitro.
Biofilmes ex vivo de P. aeruginosa apresentaram contagem de UFC variando de (média ± EPM) 7,31x108 ± 6,5x107 a 9,72x108 ± 1,97x108 UFC / explante, mas não foram observadas diferenças significativas nas contagens de UFC ao longo do período testado (48-120 h). Quando os biofilmes foram cultivados in vitro, a contagem de UFC variou de 1,8x108 ± 4,12x107 a 5,97x108 ± 1,18x108 UFC / poço, atingindo o maior (P <0,05) número de UFC por poço às 96 h de crescimento. Em geral, as contagens de UFC de biofilmes crescidos no modelo ex vivo foram significativamente (P <0,05) maiores do que os de biofilmes cultivados in vitro, especialmente em 48, 72 e 120 h de crescimento (Figura 8C).
Quanto à matriz, quando os biofilmes de P. aeruginosa foram cultivados em modelos ex vivo, a fluorescência das proteínasda matriz variou de (média ± EPM) 965,5 ± 199,1 a 6619 ± 490 unidades de fluorescência, alcançando os maiores (P <0,05) valores aos 72 e 96 h de crescimento. No entanto, quando os biofilmes foram cultivados in vitro, a fluorescência das proteínas variou de 672,4 ± 91,28 a 896,3 ± 94,85 unidades de fluorescência, sem diferenças significativas ao longo do período de incubação (48-120 h). Em geral, os biofilmes crescidos em modelos ex vivo tiveram significativamente (P <0,05) mais matriz do que aqueles cultivados in vitro, especialmente em 72 a 120 h (Figura 8D).
Figura 8: (C) Contagem de UFC e (D) Fluorescência de Matriz de P. aeruginosa.
Fonte: Autor. 8C -Crescimento ex vivonão apresentou diferença significativa ao longo do tempo. Crescimento in vitro apresentou seu maior valor em 96h. 8D – Matriz mais fluorescente em 72 e 96 h e menos em 48 h no modelo ex vivo. A fluorescência de matriz não apresentou diferença significativa ao longo do tempo no modelo in vitro.
A microscopia confocal dos biofilmes de S. aureus em modelo ex vivo mostrou que a espessura do biofilme diminuiu com o tempo, como mostrado pela maior biomassa (P <0,05), espessura da área total e espessura da biomassa observada em 48 e 72 h, quando comparada
com aquelas observado a 96 e 120 h de incubação (Figura 9A). Além disso, os biofilmes ex vivo de S. aureus também foram mais robustos em 72 h de incubação, como demonstrado pelos valores mais baixos (P <0,05) do coeficiente de rugosidade e razão superfície-volume, quando comparados aos outros períodos de incubação (Figura 9B).
Figura 9: (A)Avaliação pela microscopia confocal da espessura e (B) robustez de S. aureus, respectivamente.
Fonte: Autor. 9A – Espessura do biofilme diminui com o tempo, sendo mais espesso em 48 e 72 h. 9B – Biofilme mais robusto em 72 h de crescimento.
Similarmente ao que foi demonstrado para biofilmes ex vivo de S. aureus, a microscopia confocal de biofilmes ex vivo de P. aeruginosa demonstrou que a espessura do biofilme diminuiu com o tempo, como mostrado pela maior biomassa (P <0,05), espessura de toda a área e espessura da biomassa observados em 48 e 72 h, quando comparados aos observados em 96 e 120 h de crescimento. Além disso, os biofilmes ex vivo foram os mais robustos em 72 h de incubação, o que foi demonstrado pelos valores mais baixos (P <0,05) do coeficiente de rugosidade e razão superfície-volume (Figuras 9C e 9D).
Figura 9: (C)Avaliação pela microscopia confocal da espessura e (D) robustez de P. aeruginosa, respectivamente.
Fonte: Autor. 9C – Espessura do biofilme diminui com o tempo, sendo mais espesso em 48 e 72 h. 9D – Biofilme mais robusto em 72 h de crescimento.
A análise das imagens de microscopia confocal mostraram uma diminuição global na quantidade de células vivas em biofilmes ex vivo em 96 e 120 h para S. aureus e em 120 h para biofilmes de P. aeruginosa (Figura 10).
igura 10: Ima ge ns de m icr oscop ia c on foc al dos b iofilm es de S. aure us e P . ae rugi nosa Fo n te: Au to r. 4 im ag en s d is p o stas em cim a: b io film e ao lo n g o d e 4 8 -1 2 0 h d e S . a u reu s co m d im in u ição g lo b al d as c élu las v iv as e m 9 6 e 1 2 0 h .4 im ag en s d is p o stas em b aix o : b io film e ao lo n g o d e 4 8 -1 2 0 h d e P . a eru g in o sa co m d im in u iç ão g lo b al d a s cé lu las v iv as e m 1 2 0 h .
Com relação à produção de fatores de virulência, os biofilmes de S. aureus cultivados em modelos ex vivo apresentaram uma constante produção de sideróforos e proteases durante todo o período testado, semelhante ao observado para biofilmes in vitro. No geral, os biofilmes ex vivo apresentaram menor produção de sideróforos (48 e 72 h) e proteases (48, 96 e 120 h) do que os cultivados in vitro (Figura 11A e 11B).
Figura 11:(A) Produção de sideróforo e (B) protease em S. aureus.
Fonte: Autor. Constante produção de sideróforos (11A) e proteases (11B) no modelo ex vivo e in vitro. O modelo ex vivo apresentou menor produção de fatores de virulência que o in vitro.
Quanto à P. aeruginosa, biofilmes cultivados em modelos ex vivo produziram mais (P <0,05) sideróforos às 72 h e proteases aos 72, 96 e 120 h de incubação, enquanto os biofilmes cultivados in vitro apresentaram uma produção constante de sideróforos e proteases ao longo do tempo. Os biofilmes ex vivo produziram mais sideróforos, às 72 e 96 h, do que sua contraparte in vitro, enquanto o oposto foi observado para a produção de protease durante todo o período analisado (Figuras 11C e 11D).
Figura 11:(C) Produção de sideróforo e (D) protease em P. aeruginosa.
Fonte: Autor.Constante produção de sideróforos (11A) e proteases (11B) no modelo in vitroe aumento de sideróforos (72 h) e proteases (72, 96 e 120 h).O modelo ex vivo apresentou maior produção
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sideróforos (72 e 96 h) do que in vitro.O modelo in vitro apresentou maior produção de proteases do que ex vivoao longo de todo período.
Quanto a formação de matriz e quantidade de células do bioflime de S. aureus eP. aeruginosa em modelo ex vivo corada pela técnica da coloração de Gram e analisadosatravés de microscopia óptica(Olympus BX41) como demonstrado na Figura 12, podemos perceber um aumento crescente de matriz extracelular e quantidade células de 24 a 72 h com o decaimento de ambos em 120 h, nas duas espécies.
Fonte: Autor. Biofilme ao longo de 48-120h com aumento crescente de matriz e células de 48 a 96 h e redução em 120 h de ambos, nas duas espécies.S. aureus(4 imagens dispostas em cima) e P. aeruginosa (4 imagens dispostas em baixo) Figura 1 2 . I m ag ens d e m ic rosc o pi a ópt ic a ( O lym p us B X 41) de b iof ilm es de S. a ure us e P. ae rug inosa cr es ci do e m pe le por ci na n os t em pos 4 8h, 72 h, 96h e 1 20h co rad os pe la téc n ica da c ol o raç ão de G ra m .
7 DISCUSSÃO
Nos últimos anos, tem havido uma crescente preocupação com o bem-estar animal e os cientistas têm tentado desenvolver alternativas para pesquisas in vivo (BRILHANTEet al., 2019; CAZARIN et al., 2004). Embora os estudos in vitrosejam reprodutíveis e tenham gerado dados essenciais para o desenvolvimento científico, eles não conseguem reproduzir várias características do ambiente hospedeiro, como a disponibilidade de nutrientes e superfícies de adesão (LEBEAUX et al., 2013). Nesse contexto, vários modelos ex vivo têm sido propostos, utilizando subprodutos de abate ou experimentação de animais, tecidos e órgãos obtidos de fetos abortados ou procedimentos cirúrgicos, dentes, biópsias de pele, cabelos, unhas, entre outros (BRILHANTEet al., 2019). , a fim de estudar a fisiopatogenia de diferentes doenças, incluindo infecções associadas a biofilme (BRILHANTEet al., 2019; YANGet al., 2013).
A manutenção de feridas crônicas é tipicamente associada ao desenvolvimento de biofilmes microbianos, especialmente por S. aureus e P. aeruginosa, na superfície da epiderme danificada, o que dificulta a eficácia da terapia antimicrobiana (PEREIRAet al., 2017; HØIBYet al., 2014). Considerando que os testes de sensibilidade antimicrobiana são realizados com bactérias no crescimento planctônico, feridas crônicas podem não responder aos antibióticos aos quais os isolados bacterianos recuperados são sensíveis devido à tolerância antimicrobiana dos biofilmes bacterianos (HANEYet al., 2018). Assim, a avaliação da sensibilidade do biofilme torna-se importante para a predição do sucesso terapêutico. No entanto, como mencionado anteriormente, os ensaios in vitro são realizados em condições artificiais e podem não levar a resultados comparáveis aos observados em estudos in vivo ou em infecções naturais (LEBEAUX et al., 2013). Assim, um modelo ex vivo para feridas crônicas, utilizando explantes suínos, tem sido proposto (YANGet al., 2013) e alguns pesquisadores utilizaram este modelo para testar abordagens alternativas para o tratamento de biofilmes bacterianos (OLIVEIRAet al., 2018; WILKINSONet al., 2018; WILKINSONet al., 2016; YANGet al., 2016).
No entanto, as metodologias utilizadas variaram entre as pesquisas e as características do biofilme do modelo ex vivo não foram minuciosamente descritas e não foram comparadas com as de biofilmes cultivados in vitro, o que é considerado a metodologia padrão para avaliação de biofilme. Com base nessas observações, o presente estudo objetivou estabelecer
