UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
CELESTE SÁNCHEZ ROMERO
IMUNOEXPRESSÃO DE HIF-1α, GLUT-1, PODOPLANINA E
DENSIDADE MICROVASCULAR EM AMELOBLASTOMAS
IMMUNOEXPRESSION OF HIF-1α, GLUT-1, PODOPLANIN
AND MICROVESSEL DENSITY IN AMELOBLASTOMA
Piracicaba 2016
CELESTE SÁNCHEZ ROMERO
IMUNOEXPRESSÃO DE HIF-1α, GLUT-1, PODOPLANINA E
DENSIDADE MICROVASCULAR EM AMELOBLASTOMAS
IMMUNOEXPRESSION OF HIF-1α, GLUT-1, PODOPLANIN
AND MICROVESSEL DENSITY IN AMELOBLASTOMA
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Estomatopatologia, na Área de Patologia.
Dissertation presented to Piracicaba Dental School of the University of Campinas in partial fulfillment of the requeriments for the degree of Master in Oral Medicine and Oral Pathology, in Pathology area.
Orientador: Prof. Dr. Oslei Paes de Almeida
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA CELESTE SÁNCHEZ ROMERO, E
ORIENTADA PELO PROF. DR. OSLEI PAES DE ALMEIDA.
Piracicaba 2016
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Jesús Francisco e Maricela, e aos meus irmãos Jesús Alberto e Oliver, pelo amor que nos manteve unidos na distância. As palavras nunca serão suficientes para refletir minha gratidão a Deus pela maior benção da minha vida, que foi ter nascido em nossa família.
Ao meu avô Jesús Sánchez Ríos, minha avó María de la Luz Cuevas Rivas e meu tio Rolando Romero Favela, meus melhores exemplos de vida, que moram na eternidade.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Oslei Paes de Almeida, pela orientação durante o mestrado. Obrigada por todos os ensinamentos que oferece a nós que temos o privilégio de trabalhar com o senhor. Esses aprendizados vão muito além do conhecimento que com muita generosidade o senhor compartilha conosco. Para mim é marcante o seu exemplo de humildade, da consciência de que sempre teremos muito para aprender, da sua preocupação pelo desenvolvimento coletivo; e de quão valioso é estender a mão ao próximo para se fortalecer mutuamente, com o fim de alcançar metas nobres para a vida.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do seu Diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques.
Ao Prof. Dr. Alan Roger dos Santos Silva coordenador do programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas. Pelo apoio infalível e a confiança que sempre brinda aos alunos do programa, com muita eficiência e amabilidade.
Aos Profs. Drs. Oslei Paes de Almeida, Edgard Graner, Ricardo Della Coletta, Márcio Ajudarte Lopes, Pablo Agustin Vargas, Jacks Jorge Júnior e Alan Roger dos Santos Silva, professores das áreas de Patologia e Semiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP, pelos valiosos ensinamentos transmitidos durante esses dois anos de mestrado.
Ao Prof. Dr. Ronell Bologna Molina agradeço por conduzir em grande parte esse trabalho e sempre estar disponível para me ajudar com dúvidas e aportar novas ideias. Sobretudo agradeço sua amizade e confiança. Obrigada por cultivar em mim o amor pela patologia e a ciência, por abrir minha mente a novas possibilidades, quando conheci seu trabalho e o do Prof. Dr. Rogelio González González, que me permitiram me aproximar dos importantes projetos que desenvolveram na Facultad de Odontología de la Universidad Juárez del Estado de
Durango (UJED), durante meu estágio no Departamento de Pesquisa em Patologia e Medicina Bucal em 2012-2013. Obrigada também pela oportunidade de conhecer sua equipe de trabalho no departamento de Patologia e Morfologia Molecular na Universidad de la República no Uruguai e por me receber em sua casa, com todo o carinho e atenção da sua esposa, a Mtra. Arleth Maria Peláez Marsiglia e os pequenos Aída e Renzo. Em eles agradeço também à Dra. Nelly Molina Frechero, que admiro muito como mulher e profissional, obrigada por nos apoiar com a análise estatística deste trabalho, e por ter sempre bons conselhos e palavras de fortaleza quando nos encontramos.
Ao Prof. Dr. Marcelo Gómez Palacio Gastélum, por ser um dos professores mais influentes na minha formação profissional e pessoal; sem dúvida o senhor fez história em nosso estado como o melhor Diretor que já teve a Facultad de Odontología da UJED. Sempre serei grata por mudar meu destino tão positivamente, desde que acreditou em mim.
Ao Prof. Dr. Adalberto Mosqueda Taylor pelo fornecimento de parte dos casos desse estudo e pelo grande exemplo de profissional a partir de seu trabalho realizado no meu país (México), que tem impacto no mundo todo.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de mestrado.
A minhas queridas amigas hispânicas que viraram minhas irmãs nesse período e sempre serão: Alicia, Marisol e Florence. Espero um dia conseguir retribuir todo o apoio, carinho e confiança que vocês me deram. Obrigada por compartilhar tantos momentos de trabalho, descontração, alegrias e dificuldades também.
Aos meus amigos brasileiros do programa, que me acolheram nesse maravilhoso país, especialmente à Débora pela fantástica ajuda com o português. Agradeço a sincera amizade de todos, por sempre me encontrar com vocês nos laboratórios, nas aulas, no corredor, na biblioteca ou na cantina, e trocar uma ideia ou um simples sorriso, iluminava meus dias: Renato, Carolina, Camilla, Karina,
Leonardo, Priscilla, Mariana, Rebeca, Gleyson, Ciro, Carine, Wagner, Vinícius, Marcondes, Diego, Felipe, Renata, Patrícia, Jéssica, Fernanda, Maurício, Raíza, Ana Carolina, Natália, Rodrigo, Isabel, Juliana; aos que conheci e já estão em outros destinos de sucesso: Marisol, Katya, Isadora, Wilfredo, Camila, Luciana, Bete, José, Rodrigo, Estevão enfim, a todos, muito obrigada pela parceria e carinho.
A Fabiana Facco Casarotti e ao Adriano Luis Martins por todo o apoio no laboratório e sobre tudo por me oferecer uma amizade sincera.
A minha madrinha Martha Simental por ser minha segunda mãe, exemplo de força, inteligência e feminidade que me inspira. Obrigada por manter todo esse carinho e apoio apesar da distância.
Ao André Marcon, ao Sr. Renato Marcon e à Sra. María Terezinha Consorte, e neles agradeço às famílias Marcon e Consorte de Laranjal Paulista por todo o carinho e as atenções, em poucas palavras, por ser minha família no Brasil.
Finalmente, minha gratidão diária a Deus envolve todas as bênçãos que me atingem sempre, mediante as pessoas e acontecimentos ao meu redor.
There is no progress toward ultimate freedom without
transformation, and this is the key issue in all lives.
B.K.S. Iyengar
ABSTRACT
Odontogenic tumors (OT) are rare entities derived from tooth germ epithelial, mesenchymal and/or ectomesenchymal elements. These tumors present a large spectrum, including hamartomatous proliferations, benign and malignant tumors. Ameloblastoma (AM) is one of the most common OTs worldwide; it is benign but locally aggressive with potential to malignant transformation. Solid ameloblastoma (SA) and unicystic (UA) are the most common subtypes, and the UA is considered less aggressive. Ameloblastic carcinoma (AC) is the malignant counterpart of AM, with approximately 120 cases reported. The better understanding of the clinical and biological characteristics of OT can be useful for diagnosis, classification and treatment. The transcription factor HIF-1α promotes expression of proteins as GLUT-1 and VEGF that enables survival of cells during hypoxia trough increasing glycolysis and angiogenesis. Co-expression of HIF-1α and GLUT-1 that has not being studied in OTs, as well as high microvascular density (MVD), has been associated with poor prognosis of several malignancies. In the other hand, D2-40 (podoplanin) has been associated with invasion and mechanisms in several tumors. Also D2-40 is a lymphatic vessel marker, used to evaluate the lymphatic microvessel density (LMVD), which in various carcinomas was related with higher potential of metastases. The aim of this study was to determine the immunohistochemical expression of HIF-1α and GLUT-1 in 13 TG, 55 AM and 3 AC; of D2-40 and LMVD in 10 TG, 57 AM and 3 AC; and the MVD (assessed by CD34 e CD105) in 56 AM and 3 AC. All cases of AM, AC and TG was positive for GLUT-1, with a significant difference (p=0.041) between SA and UA. Only one of 55 cases of AM and one of the 3 AC had nuclear positivity for HIF-1α; all TG samples were negative. All cases of TG, Am and AC were positive for D2-40; AC showed less positivity and different pattern of expression, as well as higher LMVD in comparison with TG and AM. The MVD evaluated with CD34 was similar between AC and AM, and between AS than UA (p=0.292). The MVD assessed by CD105 was higher in AC than AM (p=0.038), and lower in UA than SA (p=0.062). In conclusion GLUT-1 expression and the high MVD in AM seems to not be associated with hypoxia. In AC, hypoxia could have an influence in the expression of GLUT-1 and angiogenesis. Similar expression of D2-40 in TG and AM, as well as the loss of staining in AC, suggest that possibly D2-D2-40 does not play a crucial role in the invasion mechanisms, however, the LMVD absent in TG, mild in AM and prominent in AC (p=0.000), could have an important role in the metastatic potential of AC. Futures studies, with a major number of cases of AC are needed to prove the differences between AM and AC observed in this study.
Key Words: Ameloblastoma. Odontogenic tumors. Ameloblastic carcinoma. Immunohistochemistry. Histopathology.
RESUMO
Os tumores odontogênicos (TO) são lesões raras derivadas de elementos epiteliais, mesenquimais e ectomesenquimais do germe dentário (GD), apresentando amplo espectro: proliferações hamartomatosas, tumores benignos e malignos. O ameloblastoma (AM) é um dos TOs mais comuns; sendo localmente agressivo e com potencial de transformação maligna. O ameloblastoma sólido (AS) e o unicístico (AU) são os principais subtipos, sendo o AU considerado menos agressivo. O carcinoma ameloblástico (CA) é a contraparte maligna do ameloblastoma, com cerca de 120 casos reportados. O melhor conhecimento das características clínicas e biológicas dos TO é importante para um diagnóstico correto, e tratamento adequado. O fator de transcrição HIF-1α promove a expressão de proteínas como GLUT-1 e VEGF que permitem a sobrevivência das células durante a hipóxia mediante o aumento da glicólise e angiogênese. A co-expressão de HIF-1α e GLUT-1 que ainda não foi estudada em TOs, assim como uma densidade microvascular (DMV) aumentada, têm sido associada com pior prognóstico de várias neoplasias malignas. Por outro lado, D2-40 (podoplanina) tem sido associada com mecanismos de invasão em vários tumores, D2-40 é um marcador de células endoteliais linfáticas, usado para medir a densidade microvascular linfática (DMVL), que em diversos carcinomas foi relacionada com maior taxa de metástases. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão imuno-histoquímica de HIF-1α e GLUT-1 em 13 GD, 55 AM e 3 CA; de D2-40 e DMVL em 10 GD, 57 AM e 3 CA; e a DMV (mediante CD34 e CD105) em 56 AM e 3 CA. Todos os casos de AM, CA e GD foram positivos para GLUT-1, com diferença significativa (p = 0,041) entre AS e AU. Apenas um dos 55 casos de AM e um dos três casos de CA apresentaram positividade nuclear para HIF-1α, e todos os GDs foram negativos. Todos os casos de GD, AM e CA foram positivos para D2-40, os CAs apresentaram menor positividade e diferente padrão de expressão, assim como maior DMVL em comparação com GDs e AMs. A DMV medida com CD34 foi semelhante entre CA e AM, igualmente entre AS AU (p=0.292). A DMV medida com CD105 foi maior em CA do que em AM (p=0.038), e menor em AU do que AS (p=0.062). Em conclusão, a expressão de GLUT-1 e a alta MDV em AM não parece estar associada à hipóxia. Nos CA a hipóxia pode influenciar na expressão de GLUT-1 e a angiogênese. A expressão semelhante de D2-40 em GD e AM, assim como a perda da expressão em CA sugere que D2-40 possivelmente não tenha um papel fundamental nos mecanismos de invasão, no entanto, a DMVL ausente em GD, mínima em AM e proeminente em CA (p=0.000), poderia ter um papel importante no potencial metastático do CA. Mais estudos com maior número de CA são necessários para conferir as diferenças observadas entre AM e CA.
Palavras chave: Ameloblastoma. Tumores odontogênicos. Carcinoma ameloblástico. Imuno-histoquímica. Histopatologia.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 13
2 ARTIGOS 22
2.1 Artigo: Immunohistochemical expression of GLUT-1 and HIF-1α in tooth germ, ameloblastoma and ameloblastic carcinoma 22
2.2 Artigo: Immunohistochemical expression of podoplanin and lymphangiogenesis in tooth germ, ameloblastoma and ameloblastic carcinoma 43
2.3 Artigo: Microvessel density and neoangiogenesis in ameloblastoma and ameloblastic carcinoma evaluated by microvessel counting software 60
3 DISCUSSÃO 78
4 CONCLUSÃO 86
REFERÊNCIAS 87
ANEXO 1 Certificado de submissão do artigo 2.1 97
1 INTRODUÇÃO
Os tumores odontogênicos (TO) são lesões derivadas de elementos epiteliais, mesenquimais e ectomesenquimais relacionados com o complexo de formação dentária (Barnes et al., 2005). Tais lesões são heterogêneas e abrangem proliferações hamartomatosas (não neoplásicas) assim como neoplasias benignas e malignas, com características clínico-patológicas variáveis. Os TO são incomuns e apresentam uma variação geográfica na prevalência dos TO mais frequentes, oscilando entre tumor odontogênico queratocístico, ameloblastoma e odontoma. Anterior à classificação de tumores de cabeça e pescoço da Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2005, na qual o queratocisto odontogênico passou a ser tumor odontogênico queratocístico, o ameloblastoma era o TO de natureza neoplásica mais frequente, pois o odontoma é essencialmente um hamartoma (Mosqueda-Taylor et al., 1997; Buchner et al., 2006). A maioria das revisões de séries de TO posteriores a essa classificação consideram o tumor quertocístico odontogênico como o tumor mais prevalente (Avelar et al., 2009; El-Gehani et al., 2009; Osterne et al., 2011; da-Costa et al., 2012; Servato et al., 2013; Ramos et al., 2014), no entanto, em outras revisões o ameloblastoma continua a ser o TO mais comum (Jing et al., 2010; Avelar et al., 2011; Siriwardena et al., 2012), deixando ao odontoma em terceiro lugar de prevalência na maioria das séries.
1.1 Ameloblastoma
Ameloblastoma é um tumor epitelial odontogênico benigno dos ossos maxilares, que apresenta-se localmente invasivo e destrutivo, porém, não produz metástase. De acordo com a classificação histológica da OMS de 2005, os tipos de ameloblastomas dividem-se em sólido (AS), unicístico (AU), extra-ósseo ou periférico (AP) e desmoplásico (AD) (Buchner et al., 2005).
O AS é o tipo mais comum de ameloblastoma, aproximadamente 80% atinge a mandíbula, com predileção na região posterior (relação maxila mandíbula 1:5), e raramente surge em cavidades sinonasais. Embora apresente crescimento lento, é o subtipo mais agressivo por possuir ampla capacidade invasiva e pelo seu alto índice recorrência. É mais comumente diagnosticado entre os 30-60 anos (idade média 37) sendo raro antes da segunda década (Barnes et al., 2005; Bologna-Molina et al., 2008).
Comumente, os AS apresentam-se como um aumento de volume assintomático nos maxilares, sendo dor e parestesia infrequentes. Radiograficamente podem aparecer como uma radiolucência unilocular ou multilocular, algumas vezes associada a um dente não-erupcionado e reabsorção das raízes de dentes adjacentes (Philipsen and Reichart, 1998; Fregnani et al., 2010). Pode erodir e inclusive perfurar o osso cortical infiltrando os tecidos moles adjacentes, criando uma lesão exofítica (Stevenson et al., 1990).
Histopatologicamente existem dois padrões: folicular e plexiforme, em ambos a atividade mitótica é raramente encontrada. Ambos consistem de ilhas ou cordões de epitélio odontogênico num estroma fibroso; sendo que, no folicular, as células periféricas das ilhotas encontram-se em padrão de paliçada e as centrais possuem um arranjo frouxo que lembra o retículo estrelado, sendo este último inconspícuo no padrão plexiforme (Barnes et al., 2005; Pal et al., 2013). As células podem mostrar morfologia fusiforme, basalóide, granular, assim como diferenciação escamosa, e para esses casos já foram empregados os termos ameloblastoma de células fusiformes, basais, acantomatoso e de células granulares (Barnes et al., 2005; Fregnani et al., 2010; Pal et al., 2013). O tratamento recomendado é a excisão cirúrgica com margens amplas; geralmente são feitas resseção em bloque, curetagem e crioterapia ou somente curetagem, cada modalidade é associada a diversas taxas de recidiva (Barnes et al., 2005; Fregnani et al., 2010).
1.1.2 Ameloblastoma periférico (extra-ósseo)
O AP é a contraparte extra-óssea do AS e compreende de 2%-10% de todos os ameloblastomas, ocorre em uma idade média de 52 anos como um crescimento exofítico indolor, firme, com superfície papilar lisa que pode ser
confundido com uma hiperplasia fibrosa, e localiza-se na gengiva, predominantemente mandibular. Geralmente não é agressivo como o AS, a recidiva e o envolvimento ósseo significativo são raros, no entanto, pode causar erosão superficial da crista óssea por pressão (saucerização). Histopatologicamente, é formado por epitélio odontogênico com os mesmos padrões do AS. Células claras ou vacuolizadas podem ser encontradas no AP. O tratamento pode ser conservador (Philipsen et al., 2001).
1.1.3 Ameloblastoma desmoplásico
O AD é semelhante ao AS na distribuição por idade (média 42 anos) e na apresentação clínica, mas difere na prevalência, características radiográficas e histopatológicas. O AD representa apenas o 4%-13% dos ameloblastomas; diferentemente do AS, praticamente não têm predileção por maxila ou mandíbula (proporção 1:0.9); radiograficamente aparece como uma radiolucência com bordas não definidas, na metade dos casos áreas radiopacas admixtas estão presentes, além disso pode ocorrer reabsorção radicular e metaplasia óssea dos septos fibrosos (Savithriet al., 2013).
Histopatologicamente, o estroma é o componente predominante, que comprime as ilhotas epiteliais, as quais são irregulares e com aparência pontuada, as células na periferia são cúbicas, enquanto que abundantes células escamosas ou fusiformes e ocasionalmente microcistos preenchem o centro das ilhas. O estroma na proximidade do epitélio é mixóide, rodeado por abundantes áreas de desmoplasía. Além disso, podem estar presentes trabéculas ósseas metaplásicas. Lesões híbridas apresentando características histológicas de AD com AS já foram relatadas. O tratamento é o mesmo do AS (Philipsen et al., 2001; Barnes et al., 2005).
1.1.4 Ameloblastoma unicístico
O AU apresenta características clínicas, radiográficas e histopatológicas semelhantes a alguns cistos odontogênicos, contudo, no exame histopatológico é detectado epitélio ameloblástico delimitando a cavidade cística; o epitélio pode
proliferar dentro do lúmen cístico (intraluminal), infiltrar a parede (mural) ou permanecer simplesmente revestindo o cisto (luminal). Compõe de 5% a 15% dos ameloblastomas, no entanto, tem sido reportado por alguns autores como o subtipo mais comum na América Latina (Ledesma-Montes et al., 2007; Bologna et al., 2009; Ramesh et al., 2010; Seintou et al., 2014).
Aproximadamente 50% são diagnosticados na segunda década da vida, mais de 90% na mandíbula, apresentando-se como um aumento de volume indolor. O AU expande lentamente e pode produzir uma ampla destruição óssea e reabsorção radicular, porém, geralmente não infiltra o osso vizinho, a diferença do AS. Radiograficamente, revela-se como uma lesão unilocular, com preservação do córtex, em 80% dos casos é adjacente a um dente não-erupcionado, geralmente o terceiro molar, o que o leva frequentemente a ser tratado como um cisto dentígero. Geralmente responde favoravelmente ao tratamento conservativo, particularmente as variantes luminal e intraluminal (Barnes et al., 2005; Seintou et al., 2014).
1.2 Carcinoma ameloblástico
A contraparte maligna do ameloblastoma é o carcinoma ameloblástico (CA), o qual além de possuir a disposição histológica do ameloblastoma, mostrando características de malignidade no epitélio ameloblástico como atipia, pleomorfismo, atividade mitótica, necrose focal, invasão perineural e hipercromatismo nuclear; ainda na ausência de metástases. Menos de 120 casos foram reportados na literatura. Os CA mostram alto índice de proliferação quando comparados aos ameloblastomas e mais de um terço dos casos foram fatais devido a recorrências, invasão e metástases (Barnes et al. 2005; Bologna-Molina et al. 2009; García-Muñoz et al., 2014; Martínez-Martínez et al. 2014).
O CA pode surgir de um ameloblastoma, geralmente com histórico de recorrências múltiplas, no entanto é considerado que mais frequentemente surge de
novo (Martínez-Martínez et al., 2014). Aproximadamente 2/3 dos CA envolvem
mandíbula, contudo, na série de Yoon et al (2009), mais da metade dos CA reportados ocorreram na maxila. Radiograficamente apresenta-se como uma radiolucência mal definida ou de limites irregulares. Reabsorção óssea e expansão cortical, geralmente com perfuração, pode levar a infiltração das estruturas
adjacentes, produzindo clinicamente mobilidade dentária, e às vezes uma massa ulcerada intra-oral, além de dor, dormência e inchaço da região. O tratamento recomendado é a ressecção em bloco (Nicolotti et al., 2011; Dhir et al., 2013; Bedi et al., 2014).
1.3 Marcadores imunohistoquímicos
1.3.1 Fator de hipóxia induzível (HIF-1α)
A adaptação celular à hipóxia induz a transcrição de genes compensatórios que participam na angiogênese, metabolismo do ferro e da glicose, assim como na proliferação e sobrevivência celular, mediadas principalmente por HIF-1. Esta é uma proteína heterodimérica composta por duas subunidades: HIF-1α (regulada pelo oxigênio) e HIF-1β (constitutiva); em condições de normóxia, a primeira é rapidamente degradada pela via ubiquitina-proteossomo, no entanto, em presença de hipóxia, esse processo é inibido resultando no acúmulo de HIF-1α, que é a subunidade responsável pela estabilidade de HIF-1. Uma vez que HIF-1α encontra-se estável, é transportado do citoplasma ao núcleo para heterodimerizar com HIF-1 β e subsequentemente, o complexo HIF-1 torna-se transcricionalmente ativo, promovendo assim a expressão de várias proteínas de resposta à hipóxia, entre elas: fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e transportadores da glicose (GLUT) para manter a viabilidade das células mediante angiogênese e produção de energia mediante vias glicolíticas. Este mecanismo desempenha um papel importante nas respostas fisiológicas à hipóxia como eritropoiese, glicólise e angiogênese. Podendo também participar no desenvolvimento tumoral (Mohamed et al., 2004; Ke et al., 2006; Costa et al. 2012).
Além de ser bem conhecido que HIF-1α promove a formação de novos vasos sanguíneos pela regulação positiva de VEGF em diversos tumores como carcinoma espinocelular oral; outros achados sugerem que HIF-1α regula positivamente VEGF-C e participa na promoção da linfangiogênese, por meio da qual as células tumorais disseminam-se dentro do sistema linfático (Adams & Aitalo, 2007; Liang et al., 2008). Atualmente é bem aceito que a imunoexpressão de VEGF é regulada positivamente pelo HIF-1α, e a deleção do gene ou a irrupção da
transcrição, resulta na falta de secreção de VEGF pelas células tumorais, suprimindo angiogênese e retardando dramaticamente o crescimento do tumor (Mohamed et al., 2004).
HIF-1α é uma proteína não-secretada que geralmente é acumulada no núcleo. Essa localização é confirmada em estudos de carcinoma escamocelular oral, nos quais, a imunoexpressão de HIF-1α foi no endotélio vascular e no núcleo das células tumorais, e foi negativa no epitélio normal adjacente à lesão; além disso, expressão citoplasmática nas células tumorais tem sido documentada (Kyzas et al., 2005; Liang et al., 2008; Simonetti et al., 2012). No estudo de Kashimoto et al. (2004) a imunomarcação foi mais forte em áreas ao redor das áreas de queratinização e áreas que foram positivas para VEGF (Kishimoto et al., 2004; Mohamed et al., 2004).
Contudo, ate hoje, unicamente Costa et al. 2015, avaliaram imunoexpressão de HIF-1α em algumas lesões odontogênicas, incluindo ameloblastoma.
1.3.2 Transportador de glicose 1 (GLUT-1)
A glicose é a fonte de energia mais importante para o metabolismo oxidativo nas células dos mamíferos; o processo de entrada de glicose nas células consiste em uma difusão não dependente de energia facilitada pelas proteínas transportadoras de glicose (GLUTs), das quais o transportador de glicose 1 (GLUT-1) é o mais importante (Reisser 1999; Carvalho et al., 201(GLUT-1).
GLUT-1 está presente em células e tecidos normais como hemácias, endotélio, barreira hematoencefálica, perinéuro, e camada basal do epitélio oral e epiderme (Abdou et al., 2015; Angadi et al., 2015; Piña et al., 2015). Também é expressado em tumores malignos de mama, ovário, tireoide, cabeça e pescoço, bexiga, pulmão e outras regiões (Airley et al. 2001; Semaan et al., 2011). Em neoplasias malignas, o metabolismo da glicose é mais elevado pelo incremento na demanda de energia pelas células tumorais. A sobre-expressão de GLUT-1 tem sido associada com transformação maligna e progressão de vários tipos de câncer (Carvalho et al., 2011; da-Costa et al., 2012).
Recentemente, a expressão de GLUT-1 foi descrita em tumor odontogênico cístico calcificante, mas não em outros tumores odontogênicos, incluindo ameloblastoma (Rumayor et al., 2015).
1.3.3 CD34, CD105 (Endoglin) e densidade microvascular (MDV)
CD34 é uma glicoproteína monomérica transmembranar expressa em células progenitoras hematopoiéticas na medula óssea e em células endoteliais em diversos órgãos não hematopoiéticos. Também está presente em uma variedade de células pluripotentes e células-tronco teciduais como células satélites musculares e células-tronco do folículo piloso; CD34 encontra-se expressa em fibrócitos, eosinófilos, e fracamente em neurônios. Entre as principais funções encontra-se a indução e bloqueio da adesão do linfócito ao endotélio vascular. Também é atribuído um papel no aumento da proliferação e bloqueio da diferenciação das células tronco (Nielsen and McNagny, 2008). A imunoexpressão de CD34 é detectada no citoplasma das células endoteliais de tecidos normais e neoplásicos (Kumamoto et al., 2002).
CD105 é uma glicoproteína de membrana, expressa proeminentemente nas células endoteliais de vasos sanguíneos e linfáticos formados recentemente, e é ausente ou escassa no endotélio de vasos linfáticos e em vasos sanguíneos pré-existentes e quiescentes. CD105 está associada à angiogênese ao ser componente do complexo receptor do fator de crescimento transformante – β (TGF- β), uma citocina moduladora da angiogênese, através da sua participação em funções celulares como proliferação, diferenciação e migração. Além da positividade de CD105 em vasos neoformados e durante o processo de vasculogênese, tem sido descrita no endotélio proliferativo de vasos maduros calibrosos, os quais estariam envolvidos no processo ativo de angiogênese em neoplasias malignas (Nagatsuka et al., 2005; Jung et al., 2009; Gadbail et al., 2011).
Em diversos estudos, a expressão imunohistoquímica de CD34 e CD105, é usada para avaliar a densidade microvascular (DMV) intratumoral como parâmetro para estimar o potencial angiogênico da neoplasia (Eshghyar et al., 2011). Alguns autores reportaram uma correlação entre elevada DMV de lesões malignas com alto grau histológico, maior potencial metastático e de recorrência. Em ameloblastomas
Chen et al. (2009) acharam uma DMV em ordem crescente para ameloblastoma primário, recorrente e maligno (Weidner et al., 1991; Kumamoto et al., 2002; Chen et al., 2009).
Embora CD34 seja altamente específico e sensível para detecção de endotélio vascular, não distingue entre células endoteliais de vasos normais e as dos vasos tumorais (Glodis et al., 2015). Vários autores propõem o uso de CD105 para a identificação de células endoteliais ativadas, dos vasos tumorais, e de acordo com eles, tal marcador não estaria presente nas células endoteliais normais. Sendo assim, a DMV avaliada pela marcação de CD105, refletiria mais precisamente o estado dinâmico da atividade angiogênica tumoral (Chien et al., 2006; Mărgăritescu et al., 2008; Seon et al., 2011).
Baseado na hipótese de que CD105 é expresso mais seletivamente nos vasos sanguíneos e linfáticos tumorais do que nos normais, estudos in vitro e in vivo tem proposto CD105 como um ótimo alvo na terapia antiangiogênica para suprimir o crescimento tumoral e as metástases (Seon et al., 2011).
1.3.4 Podoplanina (D2-40)
A Podoplanina é uma mucoproteína transmembranar (38 kd) reconhecida pelo anticorpo monoclonal D2-40 e foi reportada pela primeira vez em células endoteliais linfáticas, células epiteliais do plexo coróide, células alveolares tipo I, osteoblastos, e células mesoteliais peritoneais, sob a designação antígeno E11 (Wetterwald et al., 1996). Subsequentemente foi identificada na superfície de células epiteliais do glomérulo de rato (podócitos) e devido ao seu envolvimento no encurtamento dos processos podocitários na nefrose induzida por puromicina, foi nomeado podoplanina (Ordóñez, 2006).
Esta proteína é expressa em vários tipos de células humanas especializadas, como nas células endoteliais de vasos linfáticos, mas não dos vasos sanguíneos, podócitos renais, células alveolares tipo 1, células mioepiteliais da mama, brônquios e glândulas salivares; osteoblastos, osteócitos, condrócitos e periósteo; mesotélio, células reticulares estromais e células dendríticas foliculares de órgãos linfóides; assim como em áreas focais de queratinócitos basais na epiderme humana, no colo uterino e esófago (Ordóñez, 2006; Shibahara et al., 2006; González-Alva et al., 2010).
Imunopositividade para podoplanina também é encontrada em diversas neoplasias como linfangioma, sarcomas de Kaposi, tumores de células germinativas, carcinomas de células escamosas, mesotelioma, angiosarcomas, carcinoma papilar de tireoide entre outros; por tanto este marcador é considerado auxiliar no diagnóstico desses tumores (Ordóñez, 2006; Shibahara et al., 2006; Wang et al., 2007; Kono et al., 2007).
Quando observada no frente de invasão tumoral de vários carcinomas, a expressão aumentada de podoplanina tem sido relacionada com progressão tumoral, invasão e metástase (Raica et al., 2008; Li et al., 2015) mediante reorganização do citoesqueleto, mecanismos de adesão celular e transição epitelial-mesenquimal mediada por podoplanina (Martín-Villar et al., 2006; Wicki A & Christofori, 2007; Zustin et al., 2010). Pelo fato da podoplanina ser um marcador específico para vasos linfáticos, tem sido utilizada para avaliar a densidade microvascular linfática (DMVL) em áreas peritumorais e tumorais, correlacionando com o estado linfonodal e com o prognóstico (Raica et al., 2008).
Uma alta expressão de podoplanina foi reportada no germe dentário de rato e humano (Sawa et al., 2008; Imaizumi et al., 2010; Zustin et al., 2010), células humanas do folículo dental (Tjioe et al., 2012), e várias lesões odontogênicas incluindo ameloblastoma (González-Alva et al., 2010; Okamoto et al., 2010; Tijoe et al., 2012), mas não em carcinoma ameloblástico.
O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão imuno-histoquímica HIF-1α, GLUT-1 e podoplanina assim como a DMV e a DMVL em AM e compará-la com amostras de GD como controle normal e de CA como contraparte maligna.
2 ARTIGOS
2.1 Immunohistochemical expression of GLUT-1 and HIF-1α in tooth germ, ameloblastoma and ameloblastic carcinoma
Artigo publicado no periódico: International Journal of Surgical Pathology (Anexo 1) DOI: 10.1177/1066896916640359
Celeste Sánchez-Romero1, DDS, Ronell Bologna-Molina2, DDS, PhD, Adalberto Mosqueda-Taylor3 DDS, MSc, Oslei Paes de Almeida1 DDS, PhD.
1.- Oral Pathology Section, Department of Oral Diagnosis, Piracicaba Dental School, University of Campinas (UNICAMP).
2.- Molecular Pathology Area, School of Dentistry, Universidad de La República (UDELAR), Montevideo, Uruguay.
3.- Health Care Department, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, Mexico City.
Corresponding author:
Celeste Sánchez Romero. Oral Pathology Section, Department of Oral Diagnosis. Piracicaba Dental School, University of Campinas (UNICAMP). Av. Limeira 901, P.O. Box. 52, 1314-903, Piracicaba, São Paulo, Brazil. Phone: +55 1921065213 Fax: +55 1921065218.
ABSTRACT
HIF-1α promotes proteins that enable cell survival during hypoxia, as GLUT-1. Their co-expression has been associated with aggressiveness in malignancies, and has not been studied in odontogenic tumors. Immunohistochemical expression of HIF-1α and GLUT-1 was analyzed in 13 tooth germs (TG), 55 ameloblastomas (AM) and 3 ameloblastic carcinomas (AC). HIF-1α was negative in all TG and just one case of AM and one of AC had nuclear positivity. GLUT-1 expressed in ameloblastic cells of all TG, AM and AC with an increasing intensity respectively and significantly higher in solid AM than in unicystic AM (p=0.041). Conclusions: Absence of nuclear HIF-1α in TG and most AM suggest that GLUT-1 may be induced by alternative pathways to hypoxia, however, in AC HIF-1α may be activated, though, to confirm this, additional cases are needed. GLUT-1 overexpression could be related with aggressiveness in AM and AC and must represent a normal metabolite in TG.
Key Words: ameloblastoma, ameloblastic carcinoma, odontogenic tumors, GLUT-1, HIF-1α
INTRODUCTION
Ameloblastoma (AM) is one of the most common odontogenic tumors (OTs) worldwide; it is benign but locally aggressive with potential to malignant transformation. Solid ameloblastoma (SA) and unicystic ameloblastoma (UA) are the most common histologic subtypes, and the UA is considered less aggressive with clinical and biological characteristics resembling odontogenic cysts.1,2 Ameloblastic carcinoma (AC) is the malignant counterpart of AM, presenting an ameloblastic epithelium with malignant characteristics such as atypia, pleomorphism, higher mitotic activity, nuclear hyperchromatism, focal necrosis and perineural invasion, despite of the possible absence of metastasis.1 To date, less than 120 cases of AC have been described in the English-language literature.3 The better understanding of the clinical and biological characteristics of these OT can be useful for diagnosis, classification and treatment.
The hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) is a key transcription factor whose role is the induction of genes that enable adaptation and survival of cells from normoxia to hypoxia, such as facilitators of glucose transport like GLUT-1 and angiogenic factors, which maintain energy production through alternative paths, such as increased glycolytic metabolism.4 Glucose is the most important source of energy for oxidative metabolism in mammalian cells; the process of glucose entrance into cells, consists of a non-energy-dependent diffusion facilitated by specific transmembrane glucose transporter proteins (GLUTs), of which, glucose transporter 1 (GLUT-1) is the most important.5,6 In malignant neoplasms, the glucose metabolism is higher because of the increased needs for energy of tumoral cells, and overexpression of GLUT-1 has been related with malignant transformation and progression of several types of cancer.4,6
Co-expression of HIF-1α and GLUT-1 has been associated with poor prognosis for malignancies, as in squamous cell carcinomas 7, but they have not been studied in OTs. The aim of this study is to describe, quantify and compare the immunohistochemical expression of HIF-1α and GLUT-1 in AMs and AC, including human tooth germs (TGs) as normal control.
MATERIALS AND METHODS
A total of 13 TGs, 55 cases of AMs and 03 of ACs were retrieved from the archives of the Laboratory of Oral Pathology at the Universidad Autonoma Metropolitana Xochimilco (México), Dental School of Piracicaba (Brazil) and Histology department at the Universidad de la Republica (Uruguay). TGs were also used as normal ameloblastic tissues for comparison, at bud, cap, bell and late bell stages. Using H&E staining, all cases were categorized histologically, according to the classification of head and neck tumors of the World Health Organization.1 The current study was approved by the Ethical Committee of Piracicaba Dental School, State University of Campinas with the register number 133/2014.
Immunohistochemical reactions were performed in 3-μm sections of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues that were dewaxed with xylene and then hydrated in an ethanol series. Antigen retrieval was done by immersing the sections for 15 minutes in citrate buffer solution (pH 6.0) for GLUT-1 and EDTA/TRIS solution (pH 9.0) for HIF-1α, in an electric pressure cooker. Endogenous peroxidase activity was blocked using 10% hydrogen peroxide in 5 baths, each of 5 minutes. Subsequently, tissue sections were washed in phosphate buffer solution buffer (pH 7.4), and later incubated overnight with primary antibody anti-GLUT-1 (Spring Bioscience Corp., Pleasanton, CA, USA; polyclonal, diluted 1:100) and anti-HIF-1α (Abcam, Cambridge, UK; clone mgc3, diluted 1:800). After, all slides were exposed to avidin-biotin complex and horseradish peroxidase reagents (LSAB Kit; Dako Cytomation, Carpinteria, CA, USA) and diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Finally, the tissue sections were counterstained with Carazzi hematoxylin. Skin squamous cell carcinoma (SCC) was used as positive control for GLUT-1 and prostate adenocarcinoma for HIF-1α, while the negative control was obtained by omitting the specific primary antibody. Erythrocytes served as positive internal control.8,9
Digital analysis
After immunohistochemistry for GLUT-1, slides of AM, AC and TG were scanned into high-resolution images using the Aperio Scanscope CS Slide Scanner, and digitally scored, as described previously.10 Digital images were analyzed with
Pixel Count V9 algorithm (Aperio Technologies Inc, Vista, CA, USA). By using specific input parameters: (hue value, 0.1; hue width, 0.5; color saturation threshold, 0.04; and intensity threshold ranging from 110 to 230), each category received an intensity score: 1 for weak, 2 for moderate, and 3 for strong staining. The final score of each tumor was calculated as the sum of the percentage of each category multiplied by their intensity scores using the following formula: ([%weak × 1] + [%moderate×2] + [%strong×3]). The results always ranged from 100 to 300. Five areas of 22500 μm² of each case were analyzed under these parameters (Fig. 1). Considering that only positive areas were selected for counting, and that GLUT-1 has no nuclear expression, the blue and white areas related to nuclei and clefts between stellate reticulum-like cells were discarded from counting in all cases (Fig.1 A-B).
Evaluation of immunoreactivity
Also, the distribution of GLUT-1 within TGs, AMs and ACs was listed, using previously described expression patterns.4,11 First, prostromal pattern which consist in positivity of peripheral/basal (ameloblastic-like) cells and negativity of central/suprabasal (stellated reticulum-like) cells; second, antistromal pattern presenting negative basal/peripheral layer and positive suprabasal/central cells; we described a third: full pattern in which both peripheral/basal and central/suprabasal cells positive.
As most of HIF-1α positive cases presented focal expression, they were classified according to the localization of staining as nuclear or cytoplasmic; and to the extension of positivity, focal (< 50%) and extensive (>50%).
Statistical analysis
Statistical analysis was performed using testing frequencies for qualitative variables, while for quantitative variables, the comparative analysis was performed using the Chi-square test, Student t- test and ANOVA test. We have added nonparametric statistics for comparison of the three groups with Kruskal Wallis test. The results were considered significant when p≤0.05.
Thirteen tooth germs in diverse developmental stages were studied, 1 in bud stage, 7 in cap stage and 5 in bell stage. All cases were positive for GLUT-1 (Fig. 2), with a range of intensity from 152.9 to 254.8; and mean of 214.8. Focal negative areas were absent, and a there was variation in the localization of staining according to the maturation stage of ameloblastic cells: in bud stage, GLUT-1 showed intense membrane/cytoplasmic expression in both peripheral ameloblastic and central cells that would lead to stellate reticulum (Fig. 2 A); in cap stage all epithelial layers of the enamel organ (inner and outer enamel epithelium, stratum intermedium and stellated reticulum) showed intense cytoplasmic expression of GLUT-1 (Fig. 2 C, D); subsequently, in late cap stage, before odontoblastic differentiation, ameloblasts were get columnar shape, but still keeping strong cytoplasmic staining (Fig. 2 B). In early bell stage stellate reticulum and stratum intermedium cells preserve the membrane cytoplasmic expression, whereas in late bell stage, the more differentiated pre-secretory and secretory ameloblasts lose their cytoplasmic expression and shows only membrane positivity for GLUT-1 and a clear cytoplasm; also in this stage, newly differentiated odontoblasts and adjacent dental papilla shows weak cytoplasmic positivity for GLUT-1 (Fig. 2 E, F).
Fifty-five cases of ameloblastomas were studied; 39 were classified as SAs, 25 of which were plexiform (64.1%) and 14 follicular (35.9%); among follicular ameloblastomas, 5 showed evident acanthomatous areas. There were 16 cases of UAs, 4 (25%) intraluminal, 5 (31.3%) mural, and 7 (43.7%) simple/luminal type. All cases presented membrane/cytoplasmic positivity for GLUT-1 (Fig. 3), with moderate to intense staining. Score obtained from digital analysis (minimum 100 and maximum 300), ranged from 164.2 to 279.2, with a mean of 226.2.
Qualitatively, GLUT-1 was expressed in the 3 main patterns described above: antistromal, prostromal and full. Antistromal pattern was present in 10 (18.2%) ameloblastomas (Fig. 3 A, B); 27 (49.1%) cases presented a prostromal pattern of expression (Fig. 3 C); and full immunoexpression pattern occurred in 18 (32.7%) cases (Fig. 3 D). Considering the 3 Glut-1 patterns in SA, the values for prostromal, antistromal and full patterns were 38.5%, 20.5% and 41% respectively. In UA 75% were prostromal; antistromal and full patterns represented 12.5% each one. The prostromal pattern was more common considering all cases of AM.
Foci of keratinization and focal swirling areas of squamous differentiation were negative for Glut-1 (Fig. 3 D); nevertheless in acanthomatous ameloblastomas, large areas of solid squamous differentiation presented membranous expression (Fig. 3 E). In 60% of the cases few negative areas, corresponding to <10% of the tumor, were present (Fig. 3 F).
Statistical analysis of GLUT-1 expression values between SA and UA, showed significant difference with Student t- test (p=0.041). When comparing expression between plexiform and follicular variants of SA, the values were similar.
The 3 cases of ameloblastic carcinoma were positive for GLUT-1 in the cytoplasm and membrane (Fig. 4). Considering the pattern of expression, one case each presented predominantly an antistromal pattern (Fig. 4 A); a full pattern (Fig. 4 B), and a prostromal pattern, the last also showing a full pattern in some regions. As in ameloblastomas, areas of squamous differentiation showed marked membrane staining (Fig.4D). By digital analysis, the intensity of expression was 197.9, 253.9 and 271.3, with a mean of 241.05.
All cases of TG were HIF1- α negative, with only red blood cells presenting strong staining (Fig. 5 A). HIF1- α was negative in 42 cases (76.3%) of ameloblastomas, and positive in 15 (27.3%) from which 13 were SA (9 plexiform and 4 follicular) and 2 UA. Most of the positive cases (12 out of 15) presented focal staining corresponding to less than 50% of the tumor area, while in 3 cases expression included most of the tumor tissue. All cases except one showed weak/moderate cytoplasmic staining predominantly in the peripheral ameloblastic cells (Fig. 5 B), and in one case nuclear positivity was found in less than 50% of the tumor cells (Fig. 5 C). Two cases of AC were negative for HIF1- α, and one showed strong nuclear staining in focal areas of the tumor, predominantly in central areas of the tumoral nests (Fig. 5 D).
DISCUSSION
GLUT-1 is present in normal cells such as erythrocytes, endothelium, at the blood-brain barrier, perineurial cells and basal layer of the oral epithelium and epidermis.12-14 It is also expressed in malignant tumors of the breast, ovary, thyroid, head and neck, bladder, lung and other sites.15,16
Increased glucose transport via GLUT-1 can be induced by conditions in which the metabolic rate must be adjusted, such as cell division, differentiation, malignant transformation, nutrient starvation, and hypoxia.7 These stimuli first promote an “unmasking” of GLUT-1 at the membrane, which leads to a higher affinity for glucose; further stimulation induces translocation of existing GLUT-1 from cytoplasmic vesicles to the plasma membrane, and eventually an increase in the synthesis of GLUT-1 mRNA.15 Cytoplasmic GLUT-1 has also been reported to be active and necessary for endoplasmic reticulum transit on its way to the plasma membrane.17
To better understand the expression of Glut-1 in normal TG, it is important to consider that it is an embryonic tissue, whose expression of GLUT-1 could be related to a higher proliferation and maturation activity characteristic of developmental tissues. It is interesting that during maturation of the enamel organ the pattern of GLUT-1 changes from a strong cytoplasmic expression to a membranous expression in late bell stage, when cells show a clear cytoplasm rich in glycogen,18 in this stage, newly differentiated odontoblasts and adjacent dental papilla also showed a weak cytoplasmic staining (Fig 2 E, F).
We also observed that embryonic oral epithelium neighboring TG present strong membranous staining for Glut-1 in all layers, while in adult normal oral epithelium expression is restricted to the proliferating basal layer.
Therefore, either embryonic and tumoral cells could display an increased GLUT-1 expression, due to their higher energy demands; the first for growth and differentiation, and the latter induced by pathological events such as hypoxia and glucose starvation and tumoral proliferation.4 It should be also considered that Glut-1 was positive for the enamel organ of all tooth germs, suggesting that it is a normal metabolite of ameloblastic cells.
Ameloblastoma is a benign but locally aggressive neoplasm; whose biology still is poor understood including the expression of HIF-1α and GLUT-1 involved in hypoxia and glucose metabolism. Upregulation of both markers acting separately or in co-expression have been described in several types of carcinomas and have been associated to malignant transformation, poor prognosis, and aggressiveness.7,15,19 Recently GLUT-1 expression has been described in calcifying cystic odontogenic tumor but not in ameloblastomas.20
In this study, all cases of AM, TG and AC showed a cytoplasmic/membrane positivity for GLUT-1, with moderate to strong intensity. In normal oral epithelium and epidermis, GLUT-1 has a membranous expression practically restricted to the basal layer, though, when dysplasia and malignant transformation occur, GLUT-1 is also found in the suprabasal layers, switching to a membrane/cytoplasmic staining. Several studies have also described basal and suprabasal cytoplasmic of GLUT-1 in malignant tumors.8,12,13
Membranous expression of GLUT-1 in some tumors could be an indicator of lower demands of glycolysis, as occurs with lower levels of proliferation and/or hypoxia. Tumors with cytoplasmic positivity have been associated with sustained demands of energy, larger tumor size and poorer prognosis than tumors with membranous pattern.12,13 Therefore the cytoplasmic GLUT-1 expression in all cases of ameloblastoma could be related to its high growth and local invasion potential.
In the cases studied, the expression of GLUT-1 was statistically higher in SA than in UA, and this suggest a direct association of this protein with their different histological pattern or even biological behavior, as UA is considered less aggressive than the solid variant.
It is also interesting to compare the means of the quantitative expression of GLUT-1 among the studied groups. The highest expression was seen in AC, followed by AM, and the lowest was found in TG (241.05, 226.2 and 214.8, respectively) (Fig. 6). These results seem to be indicators of higher metabolic activity, potential for growth and aggressiveness in the malignant and most aggressive types of these ameloblastic tumors: AC and SA, as compared to the more benign subtype of ameloblastoma: UA, and normal ameloblastic cells of TG. However, a larger number of samples of AC would be necessary to clarify this.
In the tumoral microenvironment, hypoxia is frequently associated with fast growing cancers and increasing expression of GLUT-1, mediated by HIF-1α.16 Mechanisms of GLUT-1 induction have been associated to its immunohistoehemical expression patterns: the antistromal pattern, has been related to a hypoxia-mediated induction, frequently this expression is adjacent to necrotic zones in malignant neoplasms;11 in this study most cases of AM presented prostromal expression pattern which is considered to be induced by non-hypoxic mechanisms, since positive cells are adjacent to stroma, and consequently to capillary oxygen sources.4
Reduced staining of GLUT-1 in large areas of squamous differentiation, and a loss of staining in foci of squamous cells and keratinized areas within tumoral nests of AM (Fig. 3 D) and AC (Fig.4 D), may represent reduced metabolic activity of cells in keratinization, as have being reported in SCC of the head and neck and in calcifying cystic odontogenic tumor in areas forming ghost cells.11,20
Cell adaptation to hypoxia induces transcription of compensatory genes that participate in angiogenesis, iron metabolism, glucose metabolism, and cell proliferation/survival, mediated mainly by HIF-1. Physiologically, when HIF-1α is recently synthesized, it is located into the cytoplasm and in normoxic conditions it is rapidly degraded before becoming active in the nucleus. That could explain the lower expression of HIF-1α in normal tissues, and its accumulation in several human malignant tumors.21,22 HIF-1α is a non-secreted protein that generally accumulates in the nucleus, however, cytoplasmic expression has been documented.23
HIF pathway has been linked to normal embryonic development.24,25 Despite this, all our cases of TG were negative for HIF-1α, and positive in 15 out of 55 cases of ameloblastomas (27.3%) with only one case showing nuclear positivity. The focal and cytoplasmic staining of the positive cases suggests that HIF-1α is degraded before translocation, stabilization and activation in the nucleus.21,22 Only one case each of ameloblastoma had nuclear positivity indicating a hypoxic related expression.
With respect to AC, one of the three cases studied showed nuclear HIF-1α positivity in focal central areas of the tumoral nests (<50%), usually in association with necrosis, probably representing an active transcription factor stabilized by hypoxia. These findings should be better evaluated in other cases of AC.
In conclusion, GLUT-1 is expressed by ameloblastic cells of TG, AM and AC with an increasing intensity respectively; also, expression was significantly higher in SA than in UA (p=0.041); this suggest that possibly the overexpressed GLUT-1 plays a role in the aggressive course of AM and AC, while in TG must represent a normal metabolite in response to increased energetic requirements of development. Nuclear expression of HIF-1α in one of three cases of AC, lead us to think in the possibility that this protein may be activated in this malignant counterpart, however, to clarify this, an evaluation of additional cases is needed. Absence of nuclear accumulation of HIF-1α and then no of immunohistochemical detection in TG and
most AM, suggest that GLUT-1 may be induced by alternative pathways to hypoxia. Glut-1 expression in ameloblastomas could be related to its aggressiveness, and a comparison with other odontogenic benign tumors could be interesting.
Funding
This work was supported by the Brazilian Federal Agency for the Support and Evaluation of Graduate Education (CAPES).
Declaration of conflicting interests
The author(s) declared no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article.
Acknowledgments
We greatly appreciate the assistance of Prof. Alvaro Maglia and Prof. Gabriel Tapia (Histology Department, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay) with the tooth germs used in the study, and greatly appreciate the support of Prof. Nelly Molina-Frechero (Health Care Departmanet, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, Mexico City) for the statistical methodology assistance.
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FIGURES
Figure 1. Illustration of the quantitative digital analysis of solid and unicystic ameloblastomas, showing that expression of GLUT-1 is more intense in solid. Blue, yellow, orange and red colors represent negative, weak, moderate and strong expression respectively. A,C. A positive area of 22500 μm² selected for digital analysis in AU and SA respectively. B,D. Once pixelcount V9 digital analysis was run, the result shows in AU (B) most of pixels regarded as blue, yellow, and orange colors, while SA (D) displays higher number of orange and red pixels.
Figure 2. Immunohistochemical staining of GLUT-1 in different stages of tooth germ development. A. Bud stage. Strong cytoplasmic positivity in both peripheral/ameloblastic and in central cells that would lead to stellate reticulum
(x400). B. Strong cytoplasmic staining of columnar ameloblasts, stratum intermedium and stellated reticulum cells in early stage of tooth formation, before complete differentiation of odontoblasts (x200). C,D. Late cap stage; cells of inner and outer enamel epithelium, stratum intermedium and stellated reticulum cells presented intense cytoplasmic positivity (x200, x400). E, F. Advanced bell stage. Stellate reticulum and stratum intermedium cells preserve the membrane/cytoplasmic staining, while more differentiated pre-secretory ameloblasts loose cytoplasmic expression and shows only membrane positivity for GLUT-1; in this stage, newly differentiated odontoblasts and adjacent dental papilla showed a weak cytoplasmic staining (x200, x400).
Figure 3. Patterns of GLUT-1 immunohistochemical expression in ameloblastomas. A. Antistromal pattern in UA, with positive cells only in the upper layers (x200). B. Solid follicular ameloblastoma showing positive cells in the central areas, while the columnar peripheral cells are negative (x200). C. Plexiform SA with prostromal expression pattern, only peripheral cells are positive (x200). D. Full pattern of immunoexpression in a follicular SA, both peripheral and central cells are positive; a whirled foci of squamous differentiation within the right tumoral nest is
negative (x200). E. Stellated reticle-like cells closest to ameloblastic epithelium shows a cytoplasmic strong staining before suffering a wide solid squamous differentiation (left) that has predominantly membrane staining (x200). F. Some cases presented negative areas in less of 10% of tumor (x200).
Figure 4. GLUT-1 immunoexpression in three cases of ameloblastic carcinoma. A. Case 1 showed cytoplasmic staining, predominantly in antistromal pattern (x200). B. Case 2 was positive in a full pattern with cytoplasmic expression (x400). C. Case 3 presented cytoplasmic and membrane positivity in most areas of tumor with prostromal pattern (x200). D. areas of squamous differentiation showed membrane staining (x400).
Figure 5. HIF1-α immunoexpression in tooth germ, ameloblastoma, and ameloblastic carcinoma. A. All cases samples of the enamel organ were HIF1- α negative. B. Solid Ameloblastoma showing focal positive areas, with weak to moderate cytoplasmic staining, predominantly at the peripheral ameloblastic cells. In the mesenchyme erythrocytes display strong immunoexpression (x400). C Only one case of ameloblastoma presented nuclear positive expression in focal areas (x200). D. One out of 3 ameloblastic carcinoma presented strong nuclear positivity in focal central areas of tumoral nests, adjacent to necrotic regions (x200).
Figure 6. Means of the quantitative expression values of digital analysis of GLUT-1. AM, ameloblastoma; AC, ameloblastic carcinoma; TG, tooth germ. SD, standard deviation.
2.2 Immunohistochemical expression of podoplanin and lymphangiogenesis in tooth germ, ameloblastoma and ameloblastic carcinoma
Celeste Sánchez-Romero1, DDS, Ronell Bologna-Molina2, DDS, PhD, Adalberto Mosqueda-Taylor3 DDS, MSc, Oslei Paes de Almeida1 DDS, PhD.
1.- Oral Pathology Section, Department of Oral Diagnosis, Piracicaba Dental School, University of Campinas (UNICAMP).
2.- Molecular Pathology Area, School of Dentistry, Universidad de La República (UDELAR), Montevideo, Uruguay.
3.- Health Care Department, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, Mexico City.
Corresponding author: Celeste Sánchez Romero. Oral Pathology Section, Department of Oral Diagnosis, Piracicaba Dental School, University of Campinas (UNICAMP). Av. Limeira 901, P.O. Box. 52, 1314-903, Piracicaba, São Paulo, Brazil. E-mail: csr_90@hotmail.comFax: +55 1921065218.
Key Words: ameloblastoma, odontogenic tumors, podoplanin, D2-40, lymphangiogenesis
ABSTRACT:
Overexpressed podoplanin has been described at the invasive front of several carcinomas and related with tumor progression, invasion and metastasis. Also podoplanin is widely used to evaluate the lymphatic vessel microvascular density (LVMD) in peritumoral and tumoral areas, which has been associated to tumor spread, lymph node status and prognosis. This is the first study that evaluates podoplanin expression and evaluates LVMD in ameloblastoma (AM) and compares with the malignant counterpart: ameloblastic carcinoma (AC) and tooth germ (TG) as a normal control. Immunohistochemistry for podoplanin was performed in 10 TG, 57 AM, and 3 AC. AM and TG had similar results in extension, intensity and pattern of expression; while AC showed decreased positivity and different pattern of
