DANIELI CRISTINA GONÇALVES
“Caracterização estrutural e funcional da interação entre a
chaperona AlfaB-Cristalina e a tirosina-fosfatase Shp2”
CAMPINAS 2016
DANIELI CRISTINA GONÇALVES
“Caracterização estrutural e funcional da interação entre a
chaperona AlfaB-Cristalina e a tirosina-fosfatase Shp2”
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Funcional e Molecular, na área de Bioquímica.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE A VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA DANIELI CRISTINA GONÇALVES E ORIENTADA PELO PROFESSOR DR. KLEBER GOMES FRANCHINI
Orientador: Prof. Dr. Kleber Gomes Franchini
CAMPINAS
2016
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 13/05877-8
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Structural and functional characterization of the interaction
between the chaperone alphaB-crystallin and the tyrosine-phosphatase Shp2
Palavras-chave em inglês:
Molecular chaperones
Protein-tyrosine phosphatase Alpha-crystallin B chain
Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 Myocytes, Cardiac
Área de concentração: Bioquímica
Titulação: Doutora em Biologia Funcional e Molecular Banca examinadora:
Kleber Gomes Franchini [Orientador] Carlos Henrique Inácio Ramos Adriana Souza Torsoni
Juliana Helena Costa Smetana Márcio Chaim Bajgelman
Data de defesa: 08-04-2016
Campinas, 08 de abril de 2016
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Kleber Gomes Franchini (Orientador) Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio RamosProf. Dra. Adriana Souza Torsoni Prof. Dr. Márcio Chaim Bajgelman
Prof. Dra. Juliana Helena Costa Smetana
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico
AGRADECIMENTOS
À Deus.
À minha família: meus pais Ermelinda e Amilton, meu irmão Rodrigo e ao meu marido Kadu, muito obrigada pela compreensão, pelo respeito, paciência, amor e por sempre acreditarem em mim.
Aos meus amigos, sempre presentes nos momentos essenciais e compreensivos com minhas ausências.
Ao Prof. Dr. Kleber Franchini, por todas as oportunidades e pela orientação. Agradeço pelas valiosas discussões e por sempre acreditar em meu potencial.
Aos colegas de trabalho do laboratório de Fisiopatologia Cardiovascular: Ana Paula Costa, Talita Marin, Michelle Pereira, Silvio Consonni, Alisson Cardoso, Ana Helena Pereira, Renata Oliveira, Raphael Morales, Irene Sousa, Carlos Paier e Isabelle Cordeiro, pelas ricas discussões científicas, pela ajuda com as metodologias, pela convivência e amizade. Em especial a Michelle Pereira e Talita Marin que tiveram um papel essencial no desenvolvimento deste trabalho. À Márcia Story e a Deivany Lima pelo auxílio com prestações de contas e documentações.
Ao laboratório de espectrometria de massas do LNBio pela análise do interatoma de CryAB. Ao Prof. Dr. Fábio Gozzo e seu aluno Hugo Ramos pelas análises de cross-linking (Laboratório Dalton – IQ/Unicamp). Ao Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos por possibilitar o uso da estrutura de seu laboratório e do equipamento de SEC-MALS (Laboratório de Bioquímica de Proteínas - IQ/Unicamp). Ao Prof. Dr. Carlos Lenz Cesar pelo acesso à estrutura do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada a Biologia Celular (INFABIC – IF/Unicamp). Ao Dr. Paulo Oliveira e Dr. Rodrigo Vargas pelo auxílio com as metodologias de modelagem e dinâmica molecular.
Às instituições de fomento CNPq, CAPES e FAPESP. Em especial a FAPESP pela concessão de minha bolsa de estudos. À UNICAMP e ao LNBio pela estrutura oferecida para o desenvolvimento do trabalho.
À toda equipe do programa de pós-graduação em Biologia Funcional e Molecular, em especial ao Prof. Carlos Amilcar Parada e a Andréia Aparecida Vigilato pela estrutura oferecida pelo programa e pela atenção dedicada aos alunos.
Aos Professores que fizeram parte de minha banca de qualificação e de defesa, Carlos Ramos, Carmen Veríssima, Juliana Oliveira, Adriana Torsoni, Márcio Bagjelman e Juliana Smetana, com contribuições muito importantes para a versão final da dissertação. Muito obrigada pela atenção, disponibilidade e pelas contribuições.
“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.”
RESUMO
O estudo de circuitos de sinalização celular ativados frente a estímulos fisiopatológicos constitui uma importante fronteira na pesquisa da patogênese da hipertrofia e insuficiência cardíacas. Estudos anteriores do nosso laboratório investigaram a participação de proteínas como Shp2, uma tirosino-fosfatase que é crítica para a sinalização hipertrófica de míocitos cardíacos, e CryAB (αB-Crystalina), uma chaperona altamente expressa no coração, que protege FAK contra degradação e promove a sobrevivência celular.
O presente estudo demonstrou que a CryAB se associa com Shp2 e reduz sua atividade catalítica em miócitos cardíacos estirados. CryAB interage diretamente com Shp2 in vitro e em células vivas, como mostrado pelas técnicas de imunoprecipitação, pull-down, FLIM-FRET e cross-linking acoplado a espectrometria de massas. Técnicas de docking e modelagem molecular demonstraram que os domínios PTP e NSH2 da Shp2 fazem contatos no domínio alfa-cristalino da CryAB oligomérica, mantendo a estrutura autoinibida da Shp2. Somente o oligômero de CryAB, mas não o dímero, é capaz de reduzir a atividade fosfatase da Shp2 de maneira dose dependente, como mostrado por meio da quantificação da atividade tirosina fosfatase da Shp2 na presença destas proteínas. Miócitos ventriculares de ratos neonatos (MVRNs) em cultura apresentam, mediante estiramento, uma robusta associação CryAB/Shp2 e reduzida atividade tirosina fosfatase de Shp2. Adicionalmente, MVRNs submetidos a silenciamento de CryAB seguido de estiramento exibiram uma atividade de Shp2 aumentada. Os resultados indicam que a CryAB pode atuar como modulador da atividade da Shp2 em miócitos cardíacos submetidos a estresse mecânico.
ABSTRACT
The study of cell signaling circuits activated during pathophysiological stimuli is an important challenge in cardiac hypertrophy and failure pathogenesis research. Previous studies from our group have investigated the role of proteins such as Shp2 (SH2 domain-containing tyrosine phosphatase 2), a tyrosine phosphatase critical in cardiac myocytes hypertrophic signaling, and CryAB (αB-Crystallin), a molecular chaperone highly expressed in heart, which interacts with and protects FAK (Focal Adhesion Kinase) from degradation, promoting cell survival.
Here we show that CryAB interacts with and regulates the tyrosine-phosphatase Shp2 catalytic activity in stretched cardiomyocytes. We used a combination of pull-down, immunoprecipitation, FLIM-FRET and chemical cross-linking coupled to mass spectrometry to show that CryAB and Shp2 directly bind in vitro and in living cells. Docking and molecular modeling showed that the PTP and NSH2 domains of Shp2 bind ACD (alpha-crystallin domain) of oligomeric CryAB, which holds Shp2 in closed and inhibited conformation. Protein tyrosine-phosphatase assays showed that the binding of CryAB oligomer, but not the dimer, is important for Shp2 stability and function, and in addition, it attenuates Shp2 activity in a dose dependent mode. Stretched Neonate Rat Ventricular Myocytes (NRVMs) show a robust CryAB/Shp2 association and reduced Shp2 phosphatase activity. In addition, NRVMs subjected to CryAB knockdown followed by mechanical stress exhibited enhanced activity of Shp2. These results indicates that CryAB might act as a modulator of Shp2 phosphatase activity in cardiomyocytes under mechanical stress.
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática do sistema chaperona. 21
Figura 2: Representação do número de membros da família smHsp em diferentes organismos. 22
Figura 3: Alinhamento das sequências de CryAA e CryAB. 24
Figura 4: Esrtutura e dimerização em smHsps. 25
Figura 5: Efeito da concentração de proteína nos perfis de eluição de CryAB. 28
Figura 6: Oligomerização da CryAB. 30
Figura 7: Representação esquemática dos domínios da Shp2. 34
Figura 8: Sequência de aminoácidos das proteínas Shp2 e CryAB. 39
Figura 9: Detecção do fenômeno de FRET e quantificação do tempo de vida de fluorescência (FLIM).47
Figura 10: Sequência de CryAB e Shp2 com cauda. 49
Figura 11: Termoforese em microescala (MST). 52
Figura 12: Estabelecimento da linhagem HEK293-Flag-CryAB. 62
Figura 13: Western blotting de extratos e eluatos de HEK293-Flag-CryAB. 63
Figura 14: Última etapa da purificação da CryABfull. 67
Figura 15: Clonagem da construção CryABACD. 68
Figura 16: Purificação da CryABACD. 69
Figura 17: Remoção da cauda de poli histidina da CryABACD com a protease TEV. 70
Figura 18: Última etapa da purificação da Shp2full. 72
Figura 19: CryAB e Shp2 interagem fisicamente. 73
Figura 20: Caracterização da estrutura quaternária da CryABfull por SEC-MALS 76
Figura 21: Caracterização da estrutura quaternária da CryABfull por UCA. 78
Figura 22: Caracterização da estrutura secundária da CryABACD e da CryABfull. 79
Figura 23: Caracterização da estrutura quaternária da CryABACD. 81
Figura 24: Caracterização da estrutura quaternária da CryAB10.3 pelo método de SEC-MALS. 82
Figura 25: Caracterização da estrutura secundária da Shp2full. 83
Figura 26: Caracterização da estrutura quaternária da Shp2full. 84
Figura 27: Caracterização da estrutura quaternária da Shp2full pelo método de SEC-MALS. 85
Figura 29: Afinidade da interação entre Shp2full e CryABfull. 90
Figura 30: Ligações cruzadas entre CryABfull e Shp2full. 92
Figura 31: Etapas de geração dos modelos de interação Shp2/CryAB oligomérica. 96
Figura 32: Clonagem da Shp2 em vetor pZs-Yellow-C1. 97
Figura 33: Associação entre CryAB e Shp2 detectada por FLIM-FRET. 99
Figura 34: Associação entre CryAB e Shp2 em MVRNs. 100
Figura 35: Associação entre CryAB e Shp2 em MVRNs mediante estiramento cíclico. 101
Figura 36: Atividade chaperona da CryAB e manutenção do estado nativo da Shp2. 103
Figura 37: CryAB reduz a atividade da Shp2. 106
Figura 38: A ativação da Shp2 induzida pelo domínio FERM da FAK é reduzida por CryAB. 107
Figura 39: O estresse mecânico reduz a atividade da Shp2. 108
Figura 40: O silenciamento da CryAB reduz a atividade da Shp2 na ausência de estresse mecânico. 110
Figura 41: O silenciamento da CryAB aumenta a atividade da Shp2 sob estresse mecânico. 111
Figura 42: As estruturas oligoméricas propostas para CryAB. 117
Figura 43: Modelo de ação da CryAB na inibição da ativação da Shp2. 123
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: As smHsps em humanos. 23
Tabela 2: Oligonucleotídeos utilizados. 40
Tabela 3: Proteínas associadas aos imunoprecipitados de Flag-CryAB. 64
Tabela 4: Resumo dos dados de caracterização biofísica. 86
ABREVIAÇÕES
ACD - Domínio alfa-cristalino (do inglês Alpha-Cristallin domain)
BSA - Albumina de soro bovino (do inglês Bovine Serum Albumin)
CD - Dicroísmo circular (do inglês Circular Dichroism)
CFP - do inglês Cyan Fluorescent Protein
CryAB - AlfaB-Cristalina
CT - Controle
DAPI - do inglês 4'-6-Diamidino-2-Phenylindole
DLS - Espalhamento dinâmico de luz (do inglês Dinamic Light Scattering)
DMEM - do inglês Dulbecco Modified Eagle Medium
DMF - Dimetilformamida
DSS - Dissuccinimidil suberato
DTT - do inglês 1,4-Dithiothreitol
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
EMR - Elipsidade molar residual
ERK - do inglês Extracellular Signal-regulated Kinase
FAK - do inglês Focal Adhesion Kinase
FERM - 4.1, Ezrina, Radixina e Moesina
FGF-2 - do inglês Fibroblast Growth Factor
FITC - Isotiocianato de fluoresceína
FLIM - do inglês Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
FPLC - do inglês Fast Protein Liquid Chromatography
FRET - do inglês Förster Resonance Energy Tranfer
GAPDH - Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase
GM-CSF - do inglês Granulocyte-macrophage colony stimulating factor
HSP - do inglês Heat Shock Protein
IPTG - Isopropil-3-D-Tiogalactopiranosídeo
MAPKAPK2 - Proteína Quinase 2 Ativada por MAP Quinase MOPS - do inglês N-Morpholino Propanesulfonic Acid
mRNA - RNA mensageiro
MS - Espectrometria de massas (do inglês Mass Spectrometry)
MST - Termoforese em microescala (do inglês Microscale Termophoresis)
MVRNs - Miócitos Ventriculares de Ratos Neonatos
NGF - do inglês Nerve growth factor
PBS - do inglês Phosphate Buffer Saline
PCR - Reação em cadeia da Polimerase (do inglês Polimerase Chain Reaction)
PDB - do inglês Protein Bank Data
PI3K - do inglês Phosphoinositide 3-Kinase
PKA - Proteina quinase A (do inglês Protein Kinase A)
PKC - Proteina quinase C (do inglês Protein Kinase C)
PMSF - do inglês Phenylmethylsulphonyl Fluoride
pNPP - p-Nitrofenil fosfato
PTP - Proteína tirosino-fosfatase
PTPN11 - do inglês Protein tyrosine phosphatase, nonreceptor type 11
RMN - Ressonância Magnética Nuclear
ROCK - do inglês Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase
SAXS - do inglês Small Angle X-Ray Scattering
SEC-MALS - do inglês Size Exclusion Chromatography – Multi Angle Laser Scattering
SHP2 - do inglês Src homology 2-containing Tyrosine Phosphatase
smHSP - do inglês small Heat Shock Protein
siRNA - do inglês small Interference RNA
TBS - do inglês Tris-buffered saline
TEV - do inglês Tobacco etch vírus
Tyr - Tirosina
UA - Unidades Arbitrárias
UCA - Ultracentrifugação Analítica
VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor
WT - do inglês Wild Type
XL - Ligação cruzada (do inglês cross-linking)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 18
1.1. Proteínas, enovelamento e homeostase ... 18
1.1.1. small Heat Shock Proteins ... 21
1.1.2. CryAB ... 23
1.1.2.1.Propriedades estruturais do monômero ... 24
1.1.2.2.Funções e oligomerização de CryAB ... 26
1.2. Fosfatases e Shp2 ... 32
1.2.1. A tirosina fosfatase Shp2: estrutura e mecanismos de ação... 32
1.2. Hipótese ... 37 2. OBJETIVOS ... 37 2.1. Objetivo Geral ... 37 2.2. Objetivos Específicos ... 37 3. MATERIAIS ... 39 3.1. Sequências ... 39 3.2. Oligonucleotídeos e enzimas ... 39
3.3. Vetores para clonagem e expressão ... 40
3.4. Anticorpos ... 40
3.5. Linhagens de E. coli... 40
3.6. Células de mamíferos ... 41
3.7. Meios de cultura e outros reagentes ... 42
4. MÉTODOS... 44
4.1. Cultura de miócitos ventriculares de ratos neonatos (MVRNs). ... 44
4.1.1. Estiramento Pulsátil Contínuo em MVRNs ... 45
4.2. Extratos proteicos e Imunoprecipitação ... 45
4.3. Identificação das proteínas imunoprecipitadas com Flag. ... 46
4.4. Western Blotting ... 46
4.5. FLIM-FRET ... 47
4.6. Proteínas recombinantes ... 48
4.7. Purificação de proteínas ... 49
4.8. Medida da concentração de proteínas ... 50
4.9. Pull-down ... 51
4.10. Termoforese. ... 51
4.11. Reação de ligação cruzada (cross-linking) e espectrometria de massas ... 53
4.12. Medida da atividade tirosina fosfatase da Shp2 ... 54
4.13. Hidrodinâmica de proteínas – Espalhamento dinâmico de luz (DLS) e Ultracentrifugação analítica (UCA).. 55
4.14. Cromatografia de exclusão molecular acoplada a detector multi-ângulo de espalhamento de luz (SEC-MALS). ... 57
4.15. Espectropolarimetria de dicroísmo circular ... 58
4.16. Monitoramento da agregação proteica ... 58
4.17. Docking e dinâmica molecular ... 59
5. RESULTADOS ... 61
5.1. CAPÍTULO I - Shp2 é um novo interator de CryAB ... 61
5.1.1. Identificação de novos parceiros de interação da CryAB ... 61
5.1.2. Expressão e purificação da CryAB e da Shp2 ... 65
5.1.2.1.CryABfull ... 66
5.1.2.2.CryABACD (domínio alfa-cristalino) ... 67
5.1.2.3.Shp2full... 71
5.1.3. Confirmação da interação por ensaio de Pull-down... 72
5.1.4. Caracterização biofísica das proteínas purificadas ... 73
5.1.4.1.Caracterização biofísica da CryABfull ... 74
5.1.4.1.1.Estrutura secundária ... 74
5.1.4.1.2.Estrutura quaternária ... 75
5.1.4.2.Caracterização biofísica da CryABACD ... 78
5.1.4.2.1.Estrutura secundária ... 79
5.1.4.3.Caracterização biofísica da Shp2full ... 82
5.1.4.3.1.Estrutura secundária ... 82
5.1.4.3.2.Estrutura quaternária ... 83
5.1.5. Propriedades do complexo formado entre CryAB e Shp2 ... 86
5.1.5.1.Ultracentrifugação analítica ... 86
5.1.5.2.Termoforese ... 89
5.1.5.3.Reações de ligação cruzada (cross-linking) ... 91
5.1.5.4.Modelo de interação in silico ... 93
5.2. CAPÍTULO II – A interação com CryAB na forma oligomérica regula a atividade de Shp2. ... 97
5.2.1. CryAB e Shp2 interagem em células vivas ... 97
5.2.2. O estresse mecânico aumenta a associação entre CryAB e Shp2 em miócitos cardíacos ... 99
5.2.3. A CryAB oligomérica preserva a estrutura nativa da Shp2 mediante estresse ... 101
5.2.4. CryAB regula negativamente a atividade da Shp2 ... 104
5.2.4.1.A presença de CryAB oligomérica reduz a atividade da Shp2 de maneira dose dependente ... 104
5.2.4.2.CryAB regula a atividade de Shp2 em miócitos cardíacos submetidos a estresse ... 108
5.3. Resumo dos resultados ... 112
5.4. Perspectivas ... 128
6. DISCUSSÃO ... 114
6.1. Identificação de novos interatores de CryAB e confirmação da interação com Shp2 ... 114
6.2. Caracterização das proteínas purificadas ... 115
6.3. Caracterização do complexo formado por CryAB e Shp2 ... 117
6.4. Modelo in silico da interação CryAB/Shp2 ... 119
6.5. Importância da CryAB para a manutenção da estabilidade e função da Shp2 ... 120
6.6. Importância da CryAB na modulação da atividade de Shp2 ... 121
7. CONCLUSÃO ... 127
8. REFERÊNCIAS ... 129
1.
INTRODUÇÃO
As cardiopatias mais prevalentes geralmente são acompanhadas por hipertrofia miocárdica, que está associada com o desenvolvimento de insuficiência cardíaca, arritmias e morte súbita. E apesar do progresso na prevenção e tratamento da maioria das cardiopatias, a incidência e prevalência da insuficiência cardíaca têm aumentado significativamente nos últimos anos.
Neste contexto, o estudo das redes de sinalização celular envolvidas na resposta de miócitos cardíacos a estímulos fisiopatológicos configura um importante desafio na pesquisa da patogênese da hipertrofia e insuficiência cardíacas. O entendimento da atuação conjunta de proteínas de diferentes classes funcionais no fino controle da transdução de sinais é um elemento-chave para o estudo da hipertrofia miocárdica. Neste quesito, a chaperona CryAB tem sido apontada como um importante fator para a arquitetura e funcionalidade de células musculares, principalmente miócitos cardíacos.
Estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que a chaperona CryAB, a tirosino-fosfatase Shp2 e a tirosino-quinase FAK, executam importantes funções no remodelamento e sobrevivência de miócitos cardíacos. Entretanto, pouco se conhece sobre os mecanismos e maquinaria de regulação destas proteínas, principalmente com respeito a influência de parceiros de interação em complexos de sinalização ou na modulação da atividade e função enzimática.
1.1.
Proteínas, enovelamento e homeostase
As proteínas são constituintes essenciais de todos os organismos e participam de variados processos biológicos. Acompanhada de sua diversidade funcional, uma vasta complexidade estrutural foi originada ao longo da evolução. Desta forma, para cumprir
suas funcionalidades na célula, cada proteína precisa adotar sua conformação tridimensional característica, por meio do processo de enovelamento proteico (Dobson & Karplus, 1999), apesar de algumas proteínas apresentarem estrutura intrinsecamente desenovelada (Dunker et al, 2001).
Os trabalhos de Christian Anfinsen no início da década de 60 mostraram evidências de que o enovelamento proteico é um processo reversível e que as proteínas são capazes de adotar sua estrutura nativa espontaneamente (Anfinsen, 1973; Anfinsen et al., 1961). Entretanto, o alto número de conformações possíveis que uma cadeia polipeptídica pode adotar torna o enovelamento um processo altamente complexo, que depende da correta e coordenada formação de interações fracas e não covalentes.
Nas células, o enovelamento de proteínas difere consideravelmente do in vitro. O citosol é bastante viscoso e com uma alta concentração de macromoléculas, sendo a concentração de proteínas estimada em cerca de 300 mg/ml (Zimmerman & Trach, 1991). Nestas condições, interações inespecíficas e improdutivas tornam se favoráveis, e competem com o processo de enovelamento (Ellis, 2001; Ellis & Minton, 2006). Ainda, vários tipos de estresse podem levar a um incorreto enovelamento de proteínas e possivelmente agregação, impondo uma ameaça a sobrevivência das células e organismos (Richter et al., 2010; Tyedmers et al., 2010).
Entretanto, tipos celulares de todos os reinos desenvolveram um sofisticado sistema de controle de qualidade de proteínas a fim de manter a integridade e homeostase do proteoma. A proteostase é alcançada por meio de uma complexa rede proveniente da integração de diversas proteínas, que promovem desde a assistência ao enovelamento e re enovelamento – as chaperonas moleculares -, até a proteólise – sistema ubiquitina-proteassomo e autofagia (Balch et al., 2008; Hartl et al., 2011).
As chaperonas moleculares são definidas como uma classe funcional de proteínas capazes de interagir com polipeptídeos parcialmente enovelados, a fim de prevenir agregação inespecífica e assistir o enovelamento, transporte e montagem, sem fazer parte da estrutura final (Ellis, 1987; Ellis et al., 1989). Muitas chaperonas moleculares foram inicialmente identificadas como parte da resposta a estresse térmico, uma vez que sua expressão é aumentada mediante flutuações na temperatura. Tal fato levou ao termo Heat-Shock Proteins (HSP) (Ellis, 1987; Georgopoulos and Welch, 1993), o que implica que além de atuarem durante e após o enovelamento, as chaperonas também são essenciais na promoção da tolerância a diversas condições de estresse.
As chaperonas também têm emergido como importantes componentes para a transdução de sinal, uma vez que podem atuar na maturação e regulação da transição entre estados inativos e ativos de moléculas de sinalização tais como receptores, reguladores transcricionais e proteínas quinases (Gaestel, 2006). São classificadas em famílias, de acordo com a sua massa molecular, sendo as cinco principais: smHsp (small
molecular Hsp), Hsp60, Hsp70, Hsp90 e Hsp100 (Tiroli & Ramos, 2007). Chaperonas da mesma classe geralmente apresentam uma alta similaridade de sequências e são funcional e estruturalmente relacionadas.
De acordo com as principais funções, as chaperonas podem ser divididas em duas classes: “enovelases” e “holders”. As enovelases usualmente dependem da hidrólise de ATP, como o sistema Hsp70/40 e Hsp90, por exemplo. São moléculas que transitam entre estados de diferentes afinidades aos substratos desenovelados ao longo do ciclo
ATPásico (Hartl et al., 2011). As holders ligam proteínas propensas a agregação e as protegem frente a distintas condições de estresse, incluem proteínas como smHsps por exemplo (Basha et al., 2012; Haslbeck et al., 2005; Jakob et al., 1999). As chaperonas
exercem sua função de maneira integrada, de modo a compor um sistema no qual um substrato pode sofrer a ação de uma ou mais chaperonas, como mostrado pela Figura 1.
Figura 1: Representação esquemática do sistema chaperona. Adaptada de Heat Shock Protein Information Resource (HSPIR), disponível em http://pdslab.biochem.iisc.ernet.in/hspir/chaperone.php.
1.1.1.
small Heat Shock Proteins
As chaperonas de baixa massa molecular (small heat shock proteins – smHsps ou HspB) representam uma família ubíqua de proteínas, que são moderadamente conservadas. Apesar da ampla diversidade, os membros desta classe apresentam características em comum, as quais as distinguem como uma classe de chaperonas. Dentre estas características estão a presença de um motivo conservado, o domínio α-cristalino, e capacidade de formar oligômeros.
Como a designação “small Hsps” indica, são chaperonas de baixa massa molecular com monômeros de massa entre 12 a 43 kDa. Entretanto, a maioria das
smHsps formam oligômeros altamente dinâmicos e de elevada massa molecular, resultantes da associação de 9 a 50 monômeros. São proteínas que não necessitam da clivagem de ATP para sua atividade, e possuem a capacidade de associar-se a porções hidrofóbicas de proteínas parcialmente enoveladas e prevenir a agregação e desnaturação irreversíveis. As smHsps respondem a uma grande variedade de estresses incluindo térmico, salino e oxidativo (Vierling & Kimpel, 1992). São abundantes em plantas, porém todos os organismos possuem uma ou mais smHsps (Waters, 1995), como mostrado na Figura 2. Em humanos estão presentes 10 membros (tabela 1) sendo que as mais estudadas são HSPB1 (Hsp27), HSPB4 (CryAA) e HSPB5 (CryAB), as quais são comumente encontradas em complexos envolvendo membros de uma ou mais famílias (Kampinga et al., 2009; Seal et al., 2011).
Figura 2: Representação esquemática do número de representantes da família smHsp em diferentes organismos. Adaptada de Haslbeck, 2005.
Tabela 1: As smHsps em humanos. Estão representados os 10 membros de smHsps juntamente com as denominações sinônimas, localização e hortólogos. Adaptado de Seal et al., 2011 e Kampinga et al., 2009.
Gene Proteína Outros nomes Expressão Gene ID
(humanos) Hortólogos (camundongo) 1 HSPB1 HSPB1 CMT2F; HMN2B; HSP27; HSP28; HSP25; HS.76067; DKFZp586P1322 Ubíqua 3315 15507 2 HSPB2 HSPB2 MKBP; HSP27; Hs.78846; LOH11CR1K; MGC133245 Músculo cardíaco 3316 69253 3 HSPB3 HSPB3 HSPL27 Músculo cardíaco 8988 56534 4 HSPB4 HSPB4 αA-Cristalina, CryAA, CryA1 Lentes oculares 1409 12954 5 HSPB5 HSPB5 CryAB, CryAB, CryA2 Ubíqua 1410 12955
6 HSPB6 HSPB6 HSP20; FLJ32389 Ubíqua 126393 243912 7 HSPB7 HSPB7 cvHSP; FLJ32733; DKFZp779D0968 Músculo cardíaco 27129 29818 8 HSPB8 HSPB8 H11; HMN2; CMT2L; DHMN2;
E2IG1; HMN2A; HSP22 Ubíqua 26353 80888
9 HSPB9 HSPB9 FLJ27437 Testículos 94086 75482
10 HSPB10 HSPB10
ODF1; ODF; RT7; ODF2; ODFP; SODF; ODF27; ODFPG;
ODFPGA; ODFPGB;
MGC129928; MGC129929
Testículos 4956 18285
1.1.2.
CryAB
Dentre as smHsps, a CryAB tem se destacado por sua relevância em diferentes doenças humanas como miopatias cardíacas, neoplasmas malignos e doenças neurodegenerativas (Goldstein et al., 2003; Kato et al., 2001; Vicart et al., 1998; Watanabe et al., 2009).
A chaperona CryAB juntamente com a CryAA são abundantes em lentes oculares, com papéis importantes na manutenção da transparência e índice de refração das lentes. CryAB e CryAA possuem homologia de 57% (Figura 3), entretanto, a CryAB também pode ser encontrada em tecidos não lenticulares, como nervoso, renal, fibras do músculo esquelético e coração (Horwitz, 1992). Confere às células a habilidade de resistir a estresses, prevenir agregação (Andley et al., 1998; Andley et al., 2000), além de remodelar e proteger microfilamentos, microtúbulos e filamentos intermediários do citoesqueleto (Andley et al., 1998; Head & Goldman, 2000; Nicholl & Quinlan, 1994).
Figura 3: Alinhamento das sequências de CryAA e CryAB. CryAA e CryAB apresentam homologia de 57%, sendo que a região compreendida pelo domínio α-Cristalino é a mais conservada (dos aminoácidos 70 a 154).
1.1.2.1.
Propriedades estruturais do monômero
Cada monômero de CryAB apresenta 22 kDa e é subdividido em 3 domínios (Figura 4B):
- Central: altamente conservado entre as smHsps, conhecido como domínio α-Cristalino (ACD - Alpha Crystallin Domain), responsável pela formação de dímeros, que são as unidades formadoras dos oligômeros (Arrigo et al., 2007). A presença deste domínio é o critério mais importante para a composição da família smHsp (Kappe et al., 2010), sendo que no ACD das smHsps há uma alta ocorrência de aminoácidos carregados e uma menor quantidade de resíduos aromáticos;
- N-terminal (60 resíduos de aminoácidos), bastante diverso entre as smHsp. Apresenta uma alta ocorrência de aminoácidos aromáticos, como triptofano e fenilalanina (Kriehuber et al., 2010). É uma importante região de modificações pós-traducionais, sendo que a CryAB apresenta 3 resíduos de serina (Ser19, Ser45 e Ser59) fosforilados por diferentes quinases. As serinas 45 e 59 são substratos de ERK e de p38, respectivamente (Webster et al, 2003), ao passo que o mecanismo de desfosforilação é desconhecido, embora algumas evidências indicam que as proteínas α-cristalinas são desfosforiladas de maneira dependente de cálcio (Chiesa et al, 1989). A quinase responsável pela fosforilação da Serina 19 ainda não é conhecida;
- C-terminal (25 resíduos de aminoácidos) que contém o motivo I-X-I/V (Isoleucina-X-Isoleucina ou Valina) que é altamente conservado nas smHsps, e importante para os contatos inter dímeros (Basha et al., 2012; Haslbeck et al., 2005a; Hilton et al., 2012). Aminoácidos carregados e polares apresentam alta ocorrência neste domínio, ao passo que resíduos alifáticos e aromáticos estão subrepresentados (Kriehuber et al., 2010).
A conservação dos ACDs é ainda maior do ponto de vista estrutural, pois todos apresentam enovelamento do tipo β-sanduíche (chave grega ou imunoglobulin-like) com até 9 folhas β antiparalelas. Porém, duas diferentes interfaces de dimerização são possíveis: em plantas, Archea e bactérias ocorre via permuta das folhas β6 entre os monômeros (Kim et al., 1998; van Montfort & Slingsby, 2002). Em metazoários, porém, as folhas β6 e β7 formam uma única e alongada folha (β6+7) que compõe a interface de dimerização em uma orientação antiparalela (Bagnéris et al., 2009; Jehle et al., 2009; Laganowsky et al., 2010), como mostrado na Figura 4.
Figura 4: Estrutura e dimerização em smHsps. A) À esquerda encontra-se a estrutura cristalográfica do dímero Mj Hsp16.5 de Methanocaldococcus jannaschii (PDB 1SHS), e à direita a estrutura do dímero da CryAB humana (PDB 2KLR). É possível observar a permuta das folhas β6 entre os dímeros na estrutura de M. jannaschii, diferente da interface de dimerização da CryAB mediada pelas folhas β6+7. Os monômeros estão coloridos em azul e vermelho, e as denominações das folhas β estão indicadas na estrutura. B) Representação esquemática dos domínios da CryAB. Domínio N-terminal à esquerda (laranja), destacando os sítios de fosforilação. No centro (lilás) o domínio α-Cristalino (ACD), responsável pela dimerização e altamente conservado entre as smHsps, e domínio C-terminal a direita (verde) (Adaptado de Arrigo et al, 2007).
N-terminal C-terminal C-terminal N-terminal A B
1.1.2.2.
Funções e oligomerização de CryAB
A CryAB, além de apresentar habilidade de interagir com peptídeos parcialmente enovelados, mantendo a homeostase proteica sob condições adversas, também tem um importante papel na sinalização da sobrevivência celular. A CryAB interage com moléculas pró-apoptóticas como Bax, Bcl-Xs e com pró-caspase 3, e no último caso inibe sua proteólise em caspase 3 (Watanabe et al., 2009).
Adicionalmente, CryAB interage com proteínas de sinalização de diversas vias (Derham & Harding, 1999; Hess & FitzGerald, 1998; Marini, et al., 2000; Santhoshkumar & Sharma, 2002). Porções específicas da CryAB interagem com filamentos de tubulina, actina e proteínas regulatórias, tais como FGF-2, NGF, VEGF, insulina, e β-catenina. Ainda, a interação da CryAB com proteínas regulatórias não se limita a condições de estresse, com uma importante atuação no crescimento, desenvolvimento celular e manutenção da integridade e atividade de proteínas (Ghosh et al., 2005; Ghosh et al., 2007), e tem importante atuação na modulação da atividade de quinases (Guay et al., 1997; Lavoie et al., 1995; Suzuki et al., 1998).
No cérebro, a superexpressão de CryAB está associada com numerosas patologias como Alzheimer, Alexander, Parkinson e Creutzfeudt-Jakob (Iwaki et al., 1993; Iwaki et al., 1989; Renkawek et al., 1992; Renkawek et al., 1994). Os transcritos gênicos de CryAB são também os mais abundantes em lesões de esclerose múltipla no tecido cerebral (Chabas et al., 2001).
Em miócitos cardíacos, a CryAB é a smHsp mais abundante, representando cerca de 3-5% do total de proteínas solúveis (Parcellier et al., 2005). Nestas células, a CryAB encontra-se primariamente associada à porção N2B da titina sarcomérica, aumentando a estabilidade mecânica da titina, o que por sua vez é importante para função cardíaca (Krüger & Linke, 2011). Adicionalmente, CryAB se associa ao
citoesqueleto e ao aparato contrátil em miócitos cardíacos, modulando a resposta hipertrófica decorrente da sobrecarga hemodinâmica (Golenhofen et al., 2002; Kumarapeli et al., 2008). Após episódio de isquemia, CryAB é translocada da fração citosólica para a fração miofibrilar em miócitos cardíacos de ratos (Golenhofen et al., 1998). Esse quadro de isquemia aumenta a presença da chaperona no complexo proteico da linha Z, indicando que a CryAB pode ser importante para a proteção desta estrutura ou na sinalização celular em resposta à isquemia miocárdica. Ainda, mutações pontuais nesta chaperona, como a R120G, por exemplo, culminam em cardiomiopatias o que ressalta a importância funcional da CryAB no contexto cardíaco (Andley, 2011; Sanbe et al., 2004).
Tais constatações indicam um papel adicional da CryAB em interações específicas com componentes do citoesqueleto e moléculas de sinalização importantes para diversos processos celulares, e não somente os processos que envolvem a ligação de substratos desenovelados mediante estresses. Um estudo recente de nosso laboratório mostrou que a CryAB interage com a quinase de adesão focal (FAK) e a protege contra proteólise, promovendo a sobrevivência de miócitos cardíacos mediante estresse. A interação entre FAK e CryAB ocorre com os dímeros de CryAB, em uma estequiometria de 2:2 (Pereira et al, 2014). Entretanto, dados que descrevam com detalhes as interações de CryAB com outros parceiros ou clientes ainda não estão disponíveis, e portanto não são conhecidas quais espécies de CryAB participam das interações (oligômeros, suboligômeros, dímeros) e se isso depende da proteína interatora envolvida.
Como característico das smHsps, os monômeros de CryAB apresentam baixa massa molecular (22 kDa) e se associam em grandes oligômeros polidispersos, que variam entre 420 e 830 kDa (18 e 36 subunidades) (Braun et al., 2011; Jehle et al., 2010). Diferente de outras smHsp, a CryAB não exibe mudanças conformacionais e de
oligomerização drásticas mediante variação de temperatura ou concentração. Vanhoudt e colaboradores (1998, 2000) mostraram que as mudanças na estrutura quaternária da CryAB mediante aumento de temperatura são muito lentas, podendo levar algumas horas para a detecção de alterações na massa molecular média. Mudanças na concentração da CryAB também exercem um efeito mínimo na oligomerização. A Figura 5 mostra os perfis de eluição de amostras com concentrações de 0,5 a 0,0025 mg/ml injetadas em cromatografia de exclusão molecular. Em todos os casos o volume de eluição permaneceu o mesmo (12,87 ± 0,02 ml), sem evidências de dissociação do complexo em espécies menores. Ainda, Horwitz e colaboradores (2009) monitoraram os efeitos de uma diluição de 2000 vezes (amostras de 2,5 a 0,00125 mg/ml) por cromatografia de exclusão molecular, sem evidências de dissociação. É importante salientar que apesar dos perfis encontrados na Figura 5 aparentarem relativa simetria, a CryAB é sempre polidispersa quando monitorada por sistema de espalhamento de luz.
Figura 5: Efeito da concentração de proteína nos perfis de eluição de CryAB. Os perfis são mostrados a 0,5 mg/ml (linha azul), 0,005 mg/ml (linha vermelha) e 0,0025 mg/ml (linha verde). Geralmente para concentrações maiores de 0,1 mg/ml, a detecção foi ajustada em 280 nm, e para baixas concentrações a absorção foi ajustada para 215 nm. Todas as amostras foram aplicadas em coluna GE Superose HR6 conectada a sistema Akta com sistema de detecção UV-900. Foi utilizado fluxo de 0,5 ml/min, em tampão
50 mM de fosfato de sódio (pH 7,0) e 100 mM de NaCl, com volume de injeção de 100 µl (Retirado de Horwitz et al, 2009).
A oligomerização de CryAB ocorre via associação dos dímeros principalmente por meio de interações da porção C-terminal (I-X-I/V) com as folhas β4 e β8 do monômero adjacente, porções que também estão envolvidas na interação com proteínas substrato (Delbecq et al., 2012; Jehle et al., 2010). Acessar informações estruturais da CryAB inteira bem como de outras smHsps isoladas ou em complexo com seus substratos tem sido extremamente desafiador, em função da polidispersão e da dinâmica dos arranjos oligoméricos. Entretanto, o crescente número de estruturas do ACD isolado tem auxiliado a desvendar com detalhes a organização estrutural, uma vez que formam dímeros estáveis, e são as unidades básicas para a construção dos oligômeros de todas as smHsps (Bagnéris et al., 2009; Basha et al., 2012; Hilton et al., 2013). Até o momento apenas duas estruturas oligoméricas de smHsp foram determinadas em alta resolução por meio de cristalografia, a Hsp16.5 de Methanococcus
jannaschii (Archea) e Hsp16.9 de Triticum aestivum (trigo), ambas monodispersas. A Hsp16.5 forma oligômeros esféricos de 24 subunidades com simetria octaédrica (Kim et al, 1998), e a Hsp16.9 apresenta uma estrutura quaternária distinta, composta de dois discos hexaméricos (van Montfort et al, 2001).
Ainda, a combinação de diferentes metodologias tem contribuído para a modelagem das estruturas oligoméricas polidispersas, até o momento não cristalizáveis. A Figura 6 ilustra a estrutura quaternária da CryAB, obtida com a combinação de diferentes técnicas como Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (Small Angle X-Ray Scattering - SAXS) e Microscopia Eletrônica (ME), modelada para um oligômero com 24 subunidades (Jehle et al., 2011). Além do modelo de Jehle e colaboradores (2011) existem outros modelos como o de
Braun e colaboradores (2011), que propuseram uma estrutura pseudoatômica para o oligômero (PDB 2YGD) também baseado em abordagens híbridas. É importante salientar que os modelos buscam apresentar uma justificativa estrutural para propriedades conhecidas da CryAB, e nenhum deles propõe que uma única estrutura possa representar todos os estados oligoméricos possíveis (Delbecq & Klevit, 2013). De acordo com estes modelos, a CryAB apresenta uma estrutura esférica, resultante da associação de discos hexaméricos, como mostrado na Figura 6.
Figura 6: Oligomerização da CryAB. A) Acima: Representação esquemática do dímero de CryAB mostrando sua conformação curva (PDB: 2KLR), Abaixo: o arranjo triangular, formado pela associação de 3 dímeros (unidade hexamérica); B) Representação do multímero, com 24 subunidades, incluído no modelo de densidade da ME. A formação do multímero ocorre com a adição de 4 unidades hexaméricas; C) Diferentes perspectivas do mapa de densidade da CryAB, a 20 Å de resolução (Adaptado de Jehle et al, 2011).
Em células já foi descrita a habilidade de formar hetero oligômeros com subunidades de CryAB e CryAA, CryAB e Hsp27 (Bova et al, 1997; Bova et al, 2000). Ainda, HspB2 e HspB3 formam hetero oligômeros bem definidos compostos de 4, 8, 12 e 24 subunidades, em uma proporção de 3 monômeros de HspB2 para 1 de HspB3 (der Engelsman et al., 2009). A fosforilação da CryAB também é importante para a formação do oligômero: estudos com mutantes fosfomiméticos com troca das serinas por glutamatos nos sítios de fosforilação, demonstraram uma redução no tamanho do
C B
oligômero e alteração na habilidade de ligar substratos (Aquilina et al., 2003; Kato et al., 2001).
As funções celulares das smHsp permaneceram desconhecidas por um longo período depois de sua descoberta, até, no início dos anos 90 estudos in vitro demonstrarem sua função de chaperona molecular. Atualmente, é conhecido que a habilidade de ligar proteínas parcialmente enoveladas e prevenção da agregação não está limitada a um determinado estado oligomérico. Algumas smHsp como a HspB6 por exemplo, formam apenas dímeros e apresentam atividade chaperona (Bukach et al., 2004). Entretanto, tem sido mostrado verdadeiro para diferentes smHsps que mutantes sem a habilidade de oligomerizar apresentam atividade chaperona reduzida (Leroux et al., 1997; van de Klundert et al., 1998). Com respeito a importância biológica dos oligômeros, bem como da sua dinâmica e trocas de subunidades, os resultados ainda são contraditórios e ainda necessitam de uma análise mais detalhada.
Desta maneira, acerca dos substratos de CryAB, bem como dos interatores e especificidade relacionada, ainda existem muitas questões a serem respondidas: (1) Há estados específicos responsáveis pela atividade? Isso é substrato-específico? (2) Quais propriedades dos clientes são reconhecidas nestas interações? (3) Qual o tempo de vida da interação? (4) Há formas de estocagem inativas?
Dentro do escopo desta tese, foi abordada a caracterização estrutural e funcional da interação entre CryAB e um novo interator, a tirosina fosfatase Shp2, como forma de suprir respostas a algumas das questões acima mencionadas para o caso específico desta interação. Interessantemente, a Shp2 se associa com a porção N-terminal da FAK (domínio FERM) (Marin et al - dados não publicados) e regula a sua atividade da quinase, o que estabelece uma relação funcional entre CryAB e Shp2, uma vez que a CryAB também interage com FAK.
1.2.
Fosfatases e Shp2
As modificações por fosforilação influenciam a atividade, associação e localização de proteínas, e portanto apresentam um papel chave na mediação de eventos de sinalização que controlam múltiplos processos celulares, como, proliferação, sobrevivência, diferenciação, migração, e comunicação celular. Desta forma, não é estranho que alterações na fosforilação de proteínas, possam culminar em um conjunto diverso de doenças como câncer, doenças metabólicas e anomalias de desenvolvimento.
As doenças congênitas do coração (DCC) são desordens de desenvolvimento bastante frequentes, pois afetam cerca de 1:100 neonatos e são, globalmente, a causa primária de mortes relacionadas a malformações. Anormalidades em vias ou moléculas de sinalização estão relacionadas às DCC, e recentemente a proteína tirosina-fosfatase Shp2 tem sido apontada como uma importante reguladora do desenvolvimento e funcionamento cardíaco. Mutações de ganho de função (hiperativação) assim como de perda de função (hipoativação) no gene da Shp2 (PTPN11) induzem uma variedade de defeitos no desenvolvimento cardíaco, destacando a importância da fina regulação dos eventos de fosforilação durante a embriogênese.
1.2.1.
A tirosina fosfatase Shp2: estrutura e mecanismos de ação
A Shp2 (Src Homology 2 - containing Phosphotyrosine Phosphatase 2) é uma tirosina fosfatase citosólica e ubiquamente expressa, caracterizada pela presença de um sítio ativo altamente conservado (domínio PTP), flanqueado por sequências regulatórias. Recebe este nome por apresentar domínios SH2, um segundo domínio que reconhece fosfotirosinas. É responsável por regular processos de proliferação, sobrevivência, migração e diferenciação celulares durante as fases de desenvolvimento embrionário e
em células adultas (Bradshaw & Dennis, 2009). A Shp2 é codificada pelo gene PTPN11 (de “Protein Tyrosine Phosphatase, Nonreceptor type 11”) (Neel et al., 2003), e mutações germinativas neste gene são responsáveis por:
- 50% dos casos de Síndrome de Noonan (Tartaglia et al, 2001; Kosaki et al, 2002; Tartaglia et al, 2002; Yoshida et al, 2004), uma doença genética autossômica dominante, caracterizada por baixa estatura, dismorfia facial, pescoço alado, ptose, malformações esqueléticas, hipertelorismo, desequilíbrio hormonal, retardo mental, criptorquidismo e múltiplas anormalidades cardíacas, que incluem malformações nas câmaras e válvulas (Tartaglia et al, 2001; Tartaglia et al, 2002; Tartaglia et al, 2005, Lauriol et al, 2011).
- 90% dos casos de síndrome de LEOPARD (Digilio et al, 2002; Legius et al, 2002), doença genética autossômica dominante rara, semelhante clinicamente a síndrome de Noonan, e muitas vezes considerada erroneamente uma variação da mesma. A síndrome de LEOPARD caracteriza-se por ser multi-sistêmica, com sinais clínicos que incluem: Lentiginose, anormalidade de condução no Eletrocardiograma, hipertelorismo Ocular, estenose Pulmonar,
Anormalidade de genitália, Retardo no crescimento e surdez sensorial (do
inglês, sensorial Deafness) Gorlin et al, 1971 – formando o acrônimo
LEOPARD.
São atribuídos a mutações somáticas no gene da Shp2 (Bentires-Alj et al., 2004; Lohet al., 2004; Shimada et al., 2004; Tartaglia et al., 2003; Tartaglia et al., 2004):
- 35% dos casos de leucemia mielomonocítica juvenil,
- 5-10% dos casos de síndrome mielodisplásica infantil,
- 7% dos casos de leucemia mielóide aguda,
A sequência de aminoácidos, padrão de expressão e função da Shp2 são altamente conservadas ao longo da evolução. O gene PTPN11 codifica uma proteína com cerca de 68 kDa, cuja principal característica é a presença de dois domínios SH2 na região amino-terminal (N-SH2 e C-SH2) ligados em série com o domínio catalítico PTP (Figura 7) (Neel et al., 2003), sendo que pode tornar-se fosforilada em dois resíduos de tirosina (542 e 580) localizados em sua porção C-terminal, onde há uma região rica em prolina. A presença de domínios de ligação, além do catalítico permite a associação da Shp2 em resíduos de tirosina fosforilados dos substratos, o que amplia sua versatilidade e potencial de participação em diversas vias de sinalização (Feng, 1999; B. Neel et al., 2003; Stoker, 2005).
Figura 7: Representação esquemática dos domínios da Shp2. Esquema da estrutura linear (acima), da estrutura inativa (abaixo à esquerda) e estrutura cristalográfica da proteína inativa (abaixo à direita), destacando em amarelo o domínio N-SH2, em verde o domínio C-SH2 e em azul o domínio catalítico PTP. Estrutura cristalográfica 2SHP (Hof, Pluskey, Dhe-Paganon, Eck, & Shoelson, 1998).
Estudos bioquímicos e cristalográficos da Shp2 revelaram que no estado inativo o domínio N-SH2 interage com o domínio catalítico PTP, formando um “loop” auto inibitório sobre o PTP, o que bloqueia o acesso aos substratos (Hof et al., 1998). A ligação de um peptídeo fosforilado em resíduo de tirosina ao sítio alostérico do domínio
N-SH2 causa mudanças conformacionais nesse sítio (Eck et al., 1996; Hof et al., 1998), o que resulta na dissociação da interação entre os domínios N-SH2 e PTP e consequente ativação da Shp2.
Interessantemente, mutações na Shp2 encontradas em leucemias e/ou na síndrome de Noonan afetam resíduos de aminoácidos presentes na interface entre os domínios N-SH2 e PTP, cuja interação é importante para o controle da ativação da Shp2. No entanto, tais mutações não interferem na atividade catalítica, o que sugere uma conformação basal “aberta-hiperativa” (O'Reilly et al., 2000; Tartaglia et al., 2001). De forma distinta, na síndrome de LEOPARD as mutações na Shp2 estão confinadas ao domínio catalítico PTP, o que causa prejuízos à atividade catalítica e também pode interferir na interação N-SH2 – PTP, sugerindo uma conformação “aberta-inativa” (Kontaridis et al., 2006; Tartaglia & Gelb, 2005).
Pacientes com síndrome de LEOPARD (Shp2 “inativa”) desenvolvem miocardiopatia hipertrófica na ausência de alterações valvulares ou hipertensão arterial (Woywodt et al., 1998). Entretanto, indivíduos com síndrome de Noonan (Shp2
“hiperativa”) raramente desenvolvem hipertrofia cardíaca, sendo manifestações mais
comuns a estenose da válvula pulmonar e anomalias septais (Digilio et al., 2002; Yoshida et al., 2004). Tais mutações de ganho de função também induzem hipersensibilidade ao fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF -
granulocyte-macrophage colony stimulating factor) em células hematopoiéticas progenitoras (Chan et al., 2005; Schubbert et al., 2005). Fato que estimula o aparecimento de doença mieloproliferativa fatal e invasiva, com hiperativação de ERK/MAPK
(Extracellular-Regulated Kinase/Mitogen-Activated Protein Kinase) e outras vias de sinalização (Mohi et al., 2005).
A atividade da Shp2 também é regulada por meio da interação com proteínas “docking”. Como exemplo, podemos citar a Gab2, que quando fosforilada em resposta a sinais de citocinas ou fatores de crescimento, interage com os domínios N e C-SH2 da Shp2, estimulando sua atividade catalítica (Arnaud et al., 2004).
A Shp2 é a primeira tirosino-fosfatase implicada na regulação funcional do miocárdio adulto (Kontaridis et al., 2008) e também muito importante para o desenvolvimento do coração. Embriões de Xenopus portando uma mutação recorrente na síndrome de Noonan (ganho de função) exibem coração com anomalias morfológicas, decorrentes de um atraso ou permanência das células cardíacas na fase M do ciclo celular e falha dos miócitos cardíacos progenitores na incorporação das células recém-formadas ao órgão em desenvolvimento. (Langdon et al., 2012).
Estudos do nosso grupo revelaram que a atividade da Shp2 regula negativamente o crescimento e o programa hipertrófico de miócitos cardíacos em cultura, por meio da modulação do complexo de sinalização FAK/Src. A depleção de Shp2 causa um aumento no tamanho dos miócitos cardíacos, elevação dos níveis de expressão de β-MHC e aumento da fosforilação de FAK, Src, AKT, TSC2 e S6K (Marin et al., 2008). Também foi constatado que a atividade da Shp2 é importante para a modulação dos níveis de fosforilação da FAK em cultura de miócitos cardíacos e no coração: animais portadores da mutação de LEOPARD (perda de função) apresentaram redução da atividade catalítica de Shp2 no coração, hipertrofia cardíaca basal, expressão de marcadores moleculares hipertróficos e aumento da fosforilação da FAK (Marin et al., 2011). Em animais portadores da mutação de Noonan (ganho de função), observou-se redução do diâmetro dos miócitos cardíacos adultos e redução da fosforilação basal de FAK e seus efetores (dados não publicados), o que evidencia a importância da atividade da Shp2 na sinalização cardíaca e regulação do crescimento hipertrófico.
Estudos recentes de nosso grupo demonstraram uma interação, até então desconhecida, entre a chaperona CryAB (uma small HSP – Heat Shock Protein) e a FAK. Essa interação é essencial para a manutenção da sobrevivência de miócitos cardíacos submetidos ao estresse mecânico e importante para proteção da FAK contra proteólise por calpaína 2 (Pereira et al, 2014). Dada a importância de Shp2, FAK e CryAB para a fisiologia cardíaca e sua relação funcional, o estudo destes complexos envolvendo a CryAB são de grande relevância. Neste estudo, mostramos que a CryAB é um interator de Shp2, com potencial ação inibitória sobre a atividade catalítica da Shp2 in vitro e em extratos celulares.
1.3.
Hipótese
A CryAB interage com a proteína tirosino-fosfatase Shp2 e essa interação é importante para a regulação da estabilidade e atividade catalítica da Shp2.
2.
OBJETIVOS
2.1.
Objetivo Geral
Validar e avaliar a existência e natureza da interação entre Shp2 e CryAB, estudar a regulação do complexo in vitro e em células, incluindo miócitos cardíacos como modelo.
2.2.
Objetivos Específicos
(1) Verificar a existência e a natureza da interação entre Shp2 e CryAB;
(2) Caracterizar estruturalmente o complexo Shp2/CryAB e definir as superfícies de interação;
(3) Determinar as consequências da interação Shp2/CryAB para a atividade da Shp2;
3.
MATERIAIS
3.1.
Sequências
O cDNA que codifica a CryAB foi obtido por meio de amplificação da sequencia a partir de mRNAs de coração de camundongo (Mus musculus), trabalho que foi realizado pela Dra. Michelle Pereira. O domínio ACD (CryABACD) foi obtido por
subclonagem, a partir do cDNA da CryAB, do fragmento compreendido entre os aminoácidos 68 a 157.
O cDNA da proteína Shp2 humana (Homo sapiens) foi gentilmente cedido pela Profa. Dra. Maria Irene Kontaridis, do Departamento de Cardiologia da Harvard
University Medical School. As sequencias de aminoácidos das proteínas Shp2 e CryAB estão ilustradas na Figura 8, o fragmento 68-157 (ACD) está destacado em cinza.
Figura 8: Sequência de aminoácidos das proteínas Shp2 e CryAB.
3.2.
Oligonucleotídeos e enzimas
Os oligonucleotídeos iniciadores, construídos a partir da sequência do cDNA de interesse, foram adquiridos comercialmente da empresa IDT e as enzimas de restrição, para os experimentos de biologia molecular, das empresas Promega, New England Biolabs e Fermentas. Os oligonucleotídos construídos para clonagem e sequenciamento estão listados no quadro a seguir.
Tabela 2: Oligonucleotídeos utilizados
Oligonucleotídeo Sequência (5’ – 3’) Uso
Shp2_Forward GTCGCGGATCCATGACATCGCGGAGATGGTTTCAC Clonagem em
pETSUMO
Shp2_Reverse CACCACTCGAGTAATCTGAAACTTTTCTGCTGTTG
CryAB_Forward CGCAGATCTATGGACATCGCCATCCACC Clonagem em
pET28a CryAB_Reverse CGCAGATCTCTACTTCTTAGGGGCTGCG 3aB68-162_EcoRI_F CGGAATTCATGCGTTTGGAGAAAGGA Clonagem em pETSUMO 2aB68-157_XhoI_Rstop CCGCTCGAGTTAGCGCTCAGGGCCAGACA
Shp2F_BamHI CGGGATCCATGACATCGCGG Clonagem em
pAmCyan1-C1
Shp2R_BamHI CGGGATCCTCATCTGAAACTTTTCTG
FRET CryAB_ F CGCAGATCTATGGACATCGCCATCCACC Clonagem em
pZsYellow1-C1
FRET CryAB_R CGCAGATCTCTACTTCTTAGGGGCTGCG
Cryab1033_s GGGGATCTACTTCTTAGGGGCTATAGTGAGTCGTATTACC Síntese de si RNA Cryab1033_as CAGCCCCTAAGAAGTAGATCCTATAGTGAGTCGTATTACC GFP_s GTGTCTTGTAGTTCCCGTCTATAGTGAGTCGTATTACC GFP_as ATGACGGGAACTACAAGACACCTATAGTGAGTCGTATTACC
3.3.
Vetores para clonagem e expressão
Para auxiliar a clonagem das sequências foi utilizado o vetor pGEM-T Easy (Promega). Para a expressão das proteínas foram utilizados vetores da família pET (Novagen), sendo pETSUMO para a Shp2 e ACD (domínio alfa-cristalino) da CryAB, e pET28a para a CryAB inteira.
3.4.
Anticorpos
Anti-CryAB, anti-GAPDH (FL335), e anti-Shp2 policlonais (Santa Cruz Biotechnology). Anti-flag mouse (Sigma) Anti-rabbit (Amersham), anticorpo secundário anti-mouse (Amersham).
3.5.
Linhagens de E. coli
C41(DE3) - Utilizada para a expressão de proteínas. Efetiva para a produção de
proteínas tóxicas de todas as classes de organismos incluindo vírus, eubactérias, archaeas, leveduras, plantas, insetos e mamíferos. Tal característica se deve a mutações que previnem a morte celular associada a expressão de proteínas tóxicas. É derivada da cepa BL21(DE3), que possui baixos níveis de produção de proteases, que poderiam degradar a proteína de interesse, e possui ainda uma construção do fago lambda DE3, responsável pela síntese da enzima T7 RNA polimerase, importante para expressão em sistema pET.
3.6.
Células de mamíferos
HEK293 (Flp In) - As células Flp In são derivadas da linhagem HEK 293 (Human
Embryonic Kidney). O sistema Flp In permite a integração e expressão do gene de interesse em uma localização genômica específica. As linhagens estáveis têm a capacidade de superexpressar o gene inserido de forma induzida, sob o controle do promotor CMV (Citomegalovírus), regulado por tetraciclina (operador TetO2). Para a construção da linhagem o plasmídeo pcDNA 5 foi clonado para a co-transfecção com o plasmídeo pOG44, o qual contem a Flp recombinase que promove a inserção do gene de interesse no genoma por meio de recombinação. Os clones são cultivados em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina, 15 µg/mL de blasticidina e 100 µg/mL de higromicina, e a expressão é realizada com a adição de 150 µg/mL de tetraciclina.
HEK293T - A linhagem HEK293T é uma importante variante que contem a sequência
do SV40 Large T-antigen que permite uma eficiente replicação de plasmídeos transfectados que contenham a origem de replicação SV40. É rotineiramente utilizada para transfecções de mais de um plasmídeo, e adicionalmente promove uma expressão prolongada do gene de interesse (DuBridge et al., 1987). Foi utilizada para os ensaios de FRET-FLIM, cultivada em DMEM com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.
Miócitos Ventriculares de Ratos Neonatos (MVRNs) - Cultura primária realizada a
partir de corações de ratos Wistar com 1 a 3 dias de vida. Detalhes da metodologia podem ser encontrados no item 4.1.
3.7.
Meios de cultura, soluções e outros reagentes
LB – Preparado com os insumos Triptona (10 g/l), extrato de levedura (5 g/l) e NaCl (10
g/l).
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Gibco), com adição de glicose,
L-glutamina, piruvato de sódio e vermelho de fenol.
Tampão tris-borato-EDTA: TBE (10x concentrado): 890 mM de tris base –
tris(hidroximetil)aminometano, 890 mM de ácido bórico, 20 mM de EDTA pH 8,0 (ácido etileno diamino tetra acético).
Tampão de amostra para DNA (6x concentrado): 0,25% de azul de bromofenol
(Massa/Volume: m/v), 0,25% de xileno cianol FF (m/v), 40% de sacarose (m/v).
Tampão de extração de proteínas (RIPA Buffer): 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM
NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 0,25% Deoxicolato de sódio, 100 µg/ml de PMSF, 1:1000 de inibidores de protease (Sigma – sem inibidor de fosfatase).
Tampão ADS (1X): 6,8 g/l de NaCl, 4,76 g/l de HEPES (sal de sódio) (pH 7,35), 0,138
g/l de NaH4PO4, 1,0 g/l de D-glicose, 0,4 g/l de KCl, 0,195 g/l de MgSO4.7H2O.
Tampão TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 150 mM de NaCl.
Tampão de transferência (Western Blotting): 25 mM Tris-HCl, 20% metanol, 0,02%
SDS, 192 mM glicina.
Outros - estreptomicina-ampicilina (Nutricell); soro fetal bovino, soro equino e
OPTI-MEM® (Gibco); Pancreatina (Sigma); colagenase tipo II (Worthington); Proteína A (Santa Cruz Biotechnology); Lipofectamina 2000 (Invitrogen);
4.
MÉTODOS
4.1. Cultura de miócitos ventriculares de ratos neonatos (MVRNs): Detalhes da
técnica de extração e estiramento de miócitos ventriculares de ratos neonatos (MVRNs) foram descritos anteriormente (Torsoni et al., 2003). Foram utilizados ratos neonatos da linhagem Wistar provenientes do Centro de Bioterismo (CEMIB) da UNICAMP, com 1 a 3 dias de vida. O procedimento foi realizado com autorização do comitê de ética no uso de animais (CEUA) e de acordo com os princípios de cuidado e manuseio de animais de laboratório, no laboratório de Fisiopatologia Cardiovascular (FCM – UNICAMP). Os neonatos tiveram seus corações extraídos do tórax e os ventrículos foram separados dos átrios, reduzidos a pequenos tamanhos com o auxílio de pinça e tesoura estéreis e transferidos para uma placa contendo solução tampão ADS 1X estéril diluído a partir de solução estoque ADS 10x (6,8 g NaCl, 4,76 g Hepes, 0,138 g NaH4PO4, 1,0 g D-glucose, 0,4 g KCl, 0,195 g MgSO4*7H4O e água MilliQ para um
volume final de 100 ml pH 7,35±0,2). O tecido foi então submetido a múltiplas digestões enzimáticas (5 a 6 digestões de 20 minutos cada) à 37 ºC usando-se para isso uma mistura de colagenase tipo II (80 Mandl U/ml) e pancreatina (0,6 mg/ml) e tampão ADS 1X. A solução obtida em cada digestão foi transferida para um tubo contendo 1,0 ml de soro fetal bovino (SFB), centrifugada (3000 rpm, 5 minutos, 37º C) e os precipitados resultantes foram ressuspendidos em 1,0 ml de SFB, colocados em placa de petri 35mm e mantidos em uma atmosfera de 95% de O2 e 5% de CO2, à 37º C, até o
final da digestão do restante do tecido. Após digestão completa, a ressuspensão de células pré-incubada nas placas de petri foi retirada com auxílio de pipeta Pasteur, transferida para um tubo e centrifugada (3000 rpm, 5 minutos, 37º C). O pellet foi ressupenso em ADS 1x e os miócitos cardíacos foram purificados em um gradiente descontínuo de Percoll. Após centrifugação (3000 rpm, 40 minutos, 37º C), os miócitos cardíacos isolados foram ressuspensos em meio de plaqueamento contendo DMEM, 10% de soro de cavalo, 5% de soro fetal bovino, bromodeoxiuridina 0,01% e 0,5% de antibiótico (penicilina/estreptomicina - 100 U/ml). As células foram quantificadas em câmera de Neubauer e plaqueadas em placas com base de silicone recoberta com colágeno tipo I (Bioflex Flexcell International Corp.). Após 48 horas, o meio foi substituído pelo meio de manutenção contendo DMEM, 0,5% antibiótico (penicilina/estreptomicina - 100 U/ml),
