5. RESULTADOS
5.1. CAPÍTULO I Shp2 é um novo interator de CryAB
5.1.5. Propriedades do complexo formado entre CryAB e Shp2
5.1.5.4. Modelo de interação in silico
Com base nos dados funcionais e de ligações cruzadas, em colaboração com o Laboratório de Biologia Computacional (LBC) do LNBio por intermédio dos pesquisadores Paulo Sergio Lopes Oliveira e Rodrigo Vargas Honorato, foram gerados alguns modelos de interação in silico, através de métodos de docking proteína-proteína e dinâmica molecular desenvolvidos no LBC e adaptados para investigação da interação Shp2/CryAB em seu estado oligomérico, uma vez que somente esta arquitetura molecular é capaz de inibir a Shp2, como será abordado no Capitulo II desta tese.
Para a geração do modelo Shp2/CryAB oligomérica foi utilizada uma porção repetitiva, correspondente ao hexâmero do modelo pseudoatômico da CryAB oligomérica (PDB 2YGD), com a finalidade de reduzir as variáveis computacionais do modelo e consequentemente, o tempo de processamento. O modelo pseudoatômico da CryAB oligomérica foi construído com base em resultados de espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS), microscopia eletrônica e RMN em estado sólido. Desta forma, a estrutura cristalográfica do ACD foi ajustada e modelada nos dados de baixa resolução para a construção do oligômero (Braun et al, 2012).
Entretanto, os dados de ligações cruzadas não são capazes de discriminar em qual unidade do hexâmero se encontram os resíduos de lisina ligados. Mesmo optando por utilizar o hexâmero para otimização do algoritmo de docking, o número de possibilidades permanece elevado. Para cada hexâmero, há dois resíduos de lisina identificados em CryAB que interagiriam com dois outros resíduos de Shp2.
A observação estrutural desses resíduos deixou clara a presença de dois planos (Figura 31), sendo um próximo a região exterior do canal formado pelo hexâmero e outro localizado na porção interna do oligômero.
Foram desenvolvidas pelo LBC ferramentas para explorar e avaliar todas as possibilidades de interação, tendo os dados de ligações cruzadas como restrição espacial. Para tal, avaliou-se distâncias euclidianas e compatibilidade com as dimensões do agente
cross-linker DSS.
Os resultados dessa busca indicaram que dentre todas as possibilidades de interação, apenas aquelas referentes ao plano externo do oligômero são compatíveis com os dados experimentais, e possíveis dadas as restrições impostas pelo agente de cross-
linker.
O experimento de docking proteína-proteína foi realizado em um software desenvolvido pelo LBC que tem como objetivo identificar a interação entre proteínas contendo múltiplos domínios utilizando dados experimentais (Honorato e Oliveira, 2014) e dividido em três etapas: (1) Domínio PTP ↔ Hexâmero, (2) Domínio PTP+Hexâmero ↔ NSH2 e (3) colocação do domínio final de Shp2, PTP-NSH2 + Hexâmero ↔ CSH2.
A primeira etapa consiste em encontrar a interação entre o domínio PTP, portador de dois resíduos de ligação cruzada com o hexâmero de CryAB. Em seguida, sabendo que a ligação da CryAB oligomérica com Shp2 causa inibição da sua atividade,
buscou-se uma conformação entre os domínios NSH2-PTP que representasse a forma inativa de Shp2 e fosse compatível com as restrições das ligações cruzadas. Desta maneira, para mapear o posicionamento do terceiro par de ligação cruzada K103-K35 (domínio N-SH2 da Shp2), a estrutura da Shp2 foi alinhada com as possíveis poses do
docking com o PTP, e a lisina 103 da CryAB mais próxima ao domínio N-SH2 foi selecionada. Em seguida, a construção do modelo tridimensional seguiu com a inclusão do domínio C-SH2 nos ensaios de docking.
Com base nas restrições anteriormente citadas, cinco modelos finais foram selecionados e submetidos a uma dinâmica molecular de 100 nanosegundos utilizando solvente explícito e campo de força YAMBER3 (Krieger e Vriend, 2015), para avaliação de estabilidade e futuras análises da contribuição de cada resíduo para interação.
No modelo mais representativo da interação Shp2/CryAB oligomérica observamos que a Shp2 interage com uma porção do oligômero que é rica em folhas beta, com uma estrutura que se assemelha à de um canal, formada por seis subunidades de CryAB. Desta maneira, a Shp2 faz contatos com diferentes monômeros de CryAB, o que aparentemente a mantém em uma conformação inibitória, além de bloquear o acesso ao sítio catalítico bem como sítios de reconhecimento de fosfotirosinas da Shp2.
É importante salientar que o modelo ainda necessita de validação por meio de experimentos de interação (pull-down, termoforese) com mutantes tanto de CryAB quanto de Shp2.
Figura 31: Etapas de geração dos modelos de interação Shp2/CryAB oligomérica. A) Representação do modelo pseudoatômico de CryAB oligomérica PDB 2YGD, destacando (em azul) a unidade hexamérica utilizada para os ensaios de docking e dinâmica molecular. B) Unidade hexamérica isolada (esquerda), com as lisinas 103 assinaladas em vermelho (direita), evidenciando dois planos (linhas pretas) sendo um mais externo e outro mais interno em relação ao posicionamento na estrutura do oligômero. As lisinas 92 exibem uma posição central, localizada entre os dois planos. Para as rotinas de docking foram utilizadas as lisinas 103 mais externas ao oligômero. C), D) e E) Modelo representativo da interação de um oligômero de CryAB, representado pela unidade repetitiva hexamérica (em azul claro), com um monômero de Shp2 (PDB 2SHP; domínios N-SH2, CSH2 e PTP nas cores amarelo, verde e azul escuro, respectivamente). Os pares de ligação cruzada K92-K274, em laranja (A), K103-K35, em magenta (B), e K103-K322, em vermelho (C), foram utilizados para guiar a geração dos modelos in silico, baseados em docking e dinâmica molecular. F) Modelo representativo (superfície) evidenciando o posicionamento da Shp2 em uma porção rica em folhas beta, presente no oligômero de CryAB, formada pela unidade hexamérica repetitiva e em G) o sítio catalítico no domínio PTP da Shp2 e as sequencias regulatórias nos domínios NSH2 e CSH2 (destacados em vermelho) estão obstruídos pelos contatos com a CryAB oligomérica. O principal ponto de contato com a CryAB é o domínio PTP, que ocupa a maior parte do espaço disponível no “canal” formado pelas folhas beta da unidade hexamérica da CryAB. O domínio NSH2 também faz contatos com a CryAB, porém em localização mais externa, o que pode ser importante para manter a conformação fechada inativa da Shp2.