WYLLERSON EVARISTO GOMES
ESTUDO DA INTERFACE SÓLIDO/LÍQUIDO APLICANDO A
MICROBALANÇA DE CRISTAL DE QUARTZO COM ELETRODOS
FUNCIONALIZADOS
CAMPINAS 2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Física Gleb Wataghin
WYLLERSON EVARISTO GOMES
“ESTUDO DA INTERFACE SÓLIDO/LÍQUIDO APLICANDO A
MICROBALANÇA DE CRISTAL DE QUARTZO COM ELETRODOS
FUNCIONALIZADOS”
Tese apresentada ao Instituto de Física da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. David Mendez Soares ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO WYLLERSON EVARISTO GOMES; E ORIENTADA PELO PROF. DR. DAVID MENDEZ SOARES.
CAMPINAS 2015
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS/ACKNOWLEDGEMENTS
Agradeço a DEUS e a todos que me conduziram até aqui: meus professores, todos eles! Desde os tempos do primário até a universidade.
Muito obrigado família, pai Émerson, mãe Lúcia, Lica, Luci, Kika, Nit, Lova. Sem vocês esse trabalho não seria possível!
Professor David, esse é mais um dos muitos ―MUITO OBRIGADOS‖ que o senhor merece de minha parte. Mais uma etapa cumprida! Professor Omar, Roberto, senhor Luiz e Juracyr... Caramba! Com esse time só se pode aprender muito! Muito obrigado pela ajuda. Ou melhor, pela muita ajuda. É uma satisfação trabalhar com os senhores! Professores Bertran e Tenan, obrigado! Valeu senhor Edilson, obrigado professor Eduardo Granado!
Colegas do LNI, obrigado! Andreza, Sarah, Eugenio, Carla, Paula e Raí: agradeço a paciência e a dedicação. Abraço apertado e boa sorte pra todos vocês! Valeu senhor Rafael e Paula: quando mais precisei vocês muito me ajudaram! Obrigado aos funcionários da biblioteca e da secretaria do IFGW, obrigado CNPq (pelo financiamento através do processo No. . 140031/2010-3) e CAPES pelo financiamento dos estudos no exterior.
Dear colleagues and friends from abroad, I AM SO PROUD of having met you around this world. Thank you very much for all knowledge shared with me. Vielen Dank Herr Professor Kautek und Professor Trettenhahn! Thank you dear Mr. Tom, Oskar, Mr. Pacher, Tristan, Mohammad, dear Slavica, Monsieur Jérôme and the team at University of Vienna.
Thank you so much dear Allison and Lisette from Int‘l Café. Because of you I met the most wonderful people in Vienna. Grazie mille Ritinha, Hvala Dorita, Multumesc Irina and Muchas Gracias Rachel. You girls are awesome... time with you is always special: I always learn something! I truly miss you all! All the Best to you, Dl. Cristian, and Herr Patrick!
Thanks for your time and friendship, dear Jasmin and Christine. You are great! Thank you very much Frau Inge, Herr Gary, Herr Franz and all Happy Hostel Team!
Aos meus mentores espirituais nessa vida, muito obrigado! As senhoras e senhores alimentaram minha Fé em Nossa Senhora, Santa Joana D‘Arc; São Francisco de Assis e o resultado é esse trabalho.
RESUMO
Neste trabalho, pesquisamos o uso de filmes autoorganizados sobre o eletrodo de ouro da microbalança de cristal de quartzo eletroquímica, EQCM. Focamos a pesquisa na interação física da superfície sólida funcionalizada com o meio líquido. Desenvolvemos uma metodologia para compreender a dinâmica de variação dos parâmetros medidos, pela EQCM durante um experimento (perturbação) em meio líquido. Introduzimos a representação bidimensional da variação da freqüência de ressonância e da resistência de ressonância do cristal de quartzo da EQCM, ∆f e ∆R respectivamente, durante uma perturbação, usando o tempo como parâmetro. A metodologia foi utilizada para soluções aquosas de sais, álcool, líquidos apolares como ciclohexano, n-hexano, soluções de sacarose. Mostramos que líquidos reais apresentam viscoelasticidade. Também testamos a perturbação causada pela aplicação de campo elétrico nas interfaces sólido/soluções iônicas em condições em que o eletrodo é polarizável. Mostramos a possibilidade de formação de nanoestruturas gasosas, nanobolhas. Estendemos a pesquisa para a superfície do ouro funcionalizado com filmes de tiol, S-layers (proteínas de membrana de bactéria), e adsorção de lipossomos zwiteriônicos. A interface sólido/líquido também foi estudada relativamente às características hidrofóbicas da funcionalidade devido à sua microestrutura superficial (superfície superhidrofóbica). Usamos as técnicas de microscopia de força atômica, AFM, e de Raman confocal, paralelamente às nossas pesquisas com a EQCM. Para complementar o estudo de campos elétricos aplicados a interfaces, estudamos também os efeitos macroscópicos da aplicação desses campos a líquidos dielétricos como a água. Pesquisamos o fenômeno da ponte líquida usando líquidos dielétricos isolantes apróticos.
ABSTRACT
In this work, we have studied the use of self-assembling films onto gold electrode of the electrochemical quartz crystal microbalance, EQCM. The main objective is to understand the physical interaction of the functionalized solid surface with the liquid medium. We have developed a methodology to understand the dynamics of variation of the parameters measured by the EQCM in liquid medium. We also have introduced the two-dimensional representation of the variation of resonance frequency and resonance resistance of the quartz crystal of the EQCM, ∆f and ∆R respectively. The measurements were taken during a perturbation, using time as parameter. The methodology was used for aqueous salt solutions, alcohol, nonpolar liquids such as cyclohexane, n-hexane and sucrose solutions. We showed that real liquids exhibit viscoelasticity. We also tested the perturbation caused by the application of electric field at solid interfaces/ionic solutions, under conditions in which the electrode is polarizable. We showed the possibility of formation of gaseous nanostructures, nanobubbles. We extended the study to gold electrode thiol-functionalized surfaces, gold surfaces covered by S-layers films (membrane proteins of bacteria), and then adsorption of zwitterionic liposomes. The solid/liquid interface was also studied in relation to hydrophobic functionality due to its surface microstructure (superhydrophobic surface). We use the atomic force microscopy, AFM, and confocal Raman techniques, parallel to our research with EQCM. In addition to the study of electric fields applied to interfaces, we also studied the macroscopic effects of the application of these fields to the dielectric liquids like water. We researched the phenomenon of liquid bridge using insulating dielectric aprotic liquids.
EPÍGRAFE
―-Foi assim que o homem aprendeu tudo que sabe: fazendo tentativas,
experimentando. Se os nossos ancestrais tivessem desistido de tentar, talvez nós ainda estivéssemos nas cavernas.‖ – in O Segredo dos Números- Luzia Faraco Ramos.
LISTA DE SIGLAS/ABREVIATURAS
AFM Atomic Force Microscopy – Microscopia de Força Atômica
QCM Quartz Crystal Microbalance – Microbalança de Cristal de Quartzo SFG Sum Frequency Generation Spectroscopy – Espectroscopia de Geração de
Soma de Freqüência
EQCM Electrochemical Quartz Crystal Microbalance – Microbalança de Cristal de
Quartzo Eletroquímica
3-MPA Ácido 3- Mercapto Propiônico
LISTA DE SÍMBOLOS
G Energia Livre de Gibbs
f Frequência de Ressonância do Cristal de Quartzo
R Resistência de Ressonância do Cristal de Quartzo
SUMÁRIO
Prólogo...16
Capítulo 1 1.1Introdução...17
1.2Objetivos...19
1.3 Importâncias do estudo realizado...19
1.4 Organização do trabalho...20
Capítulo 2 2.1 Importância do estudo da água em interfaces sólidas...21
2.2 Meio aquoso...22
2.2.1 Estruturas líquidas significativas – modelo de Eyring para líquidos...24
2.2.2 Adição de hidrocarbonetos à água...25
2.2.3 Adição de sais à água...26
2.2.4 Adição de moléculas anfifílicas à água...27
2.2.5 Água em interfaces... ...28
Capítulo 3 3.1Auto-organização e Anfifílicos... ...29
3.2 Membranas lipídicas biológicas ...32
3.3 Membranas modelo de membranas biológicas...33
3.4 Proteínas de Superfície de Membrana (Surface Protein Layers: S-Layers)...34
Capítulo 4 4.Técnicas Experimentais...………....39
4.1.1 Teoria WLF e microbalança de cristal de quartzo...42
4.1.2 Microbalança de Cristal De Quartzo Eletroquímica: EQCM...43
4.2 Microscopia de força atômica (AFM)...43
Capítulo 5 5.1 Preparação das superfícies metálicas funcionalizadas ...45
5.2 Filmes de Octanotiol/ 3-MPA para funcionalização...47
5.3 Limpeza do substrato utilizado...48
5.4 – Preparação de lipossomos de DMPC...49
5.5– Procedimento de medida para a técnica da QCM...50
5.6 Medidas de Força versus Distância com AFM...50
Capítulo 6 6 Resultados...53
6.1 Estudo de viscoelasticidade de líquidos usando a QCM ....……...54
6.2 Estudo da influência do comprimento de Debye na interface de eletrodos imersos...67
6.2.1 Estudo da superfície de eletrodo de ouro imersa em soluções aquosas com Microscópio de Força Atômica em célula eletroquímica...67
6.2.2 Nanobolhas em superfície de ouro ………...………83
6.3 Eletrodos funcionalizados...98
6.3.1.Estudo da Influência Da Funcionalização de Superfícies Metálicas para Detecção de Lipossomos de DMPC Utilizando a QCM...98
6.3.2 Programa Doutorado Sanduíche no Exterior: ―Eletrodos Funcionalizados com Filmes de Proteínas S-Layer de Bactérias: Aplicação no Estudo da Adsorção de Lipossomos...124
6.4 Trabalho com a ponte de líquido polar ………...132
6.5 Trabalho com superfícies superhidrofóbicas………...…………..133
Capítulo 7 Conclusões gerais e perspectivas...134
Referências...135 Apêndices Apêndice A...143 Apêndice B...144 Apêndice C...148 Apêndice D...149 Anexos Anexo I...153 Anexo II...167
PRÓLOGO
Neste trabalho funcionalizamos o eletrodo de ouro da microbalança de cristal de quartzo eletroquímica, EQCM, para usá-la como sensor. Fizemos filmes de tiol hidrofóbico, hidrofílico, filmes auto-organizados de fosfolipídios e de proteínas. Porém, observamos que a interação da superfície sólida não era apenas relacionada às funcionalidades. Ela dependia também da interação da água com a superfície sólida.
Procuramos na literatura especializada informações sobre a água e interfaces. Logo aprendemos que ―ninguém entende o estado líquido e muito menos a água‖. Este trabalho tomou então uma direção diferente. Uma pesquisa básica direcionada ao estudo da interface sólido/líquido seria necessária.
Procuramos estudar e compreender o comportamento das moléculas de água em interfaces sólido/líquido e observar para diferentes superfícies, como a camada de líquido adjacente se modificava. Dessa forma, o enfoque do trabalho direcionou-se mais à interface sólido/líquido. O assunto mostrou-se extenso e multidisciplinar envolvendo áreas de Física, Química, Biologia, Ciências Farmacológicas, Engenharia Química e áreas afins.
CAPÍTULO 1
1.1 Introdução
Interface sólido/líquido. Fenômenos físicos em interfaces sólido/líquido estão envolvidos em diversos processos industriais e biológicos [1-4]. Na indústria, são exemplos os processos de fabricação ―bottom-up‖, a limpeza de superfícies empregando surfactantes, a formação de filmes através do fenômeno de auto-organização, quaisquer processos envolvendo reações eletroquímicas, catálise, etc. [5]. Em biologia, cada célula presente nos organismos reconhece o meio ao qual está inserida através estímulos captados por receptores nas suas membranas [6-8]. Em sistemas coloidais a miniaturização dos elementos evidencia a prevalência de efeitos de área sobre os de volume [8-9].
A interface sólido/líquido funciona muitas vezes como eletrocatalisador. Na região da interface de eletrodos metálicos imersos, intensos campos elétricos são produzidos (~107 V/m), capazes de quebrar, por exemplo, moléculas de água [5]. De maneira similar, em sistemas biológicos é possível constatar a presença de campos elétricos intensos controlando abertura de canais para transporte de substâncias através da membrana celular (canais iônicos), transmissão de informação (sinapses entre neurônios), etc. [10].
Biossensores. O termo biossensor é designado para se referir a um dispositivo que utiliza reações bioquímicas específicas mediadas por enzimas isoladas, tecidos, organelas ou de células intactas para a detecção de compostos químicos geralmente por meio de sinais elétricos, ópticos ou térmicos [11]. Pode combinar um dispositivo transdutor, p. ex. cristal piezelétrico, com filmes biológicos capazes de detectar analitos (compostos de interesse em solução) em um ensaio analítico. A detecção de micro-elementos presentes na corrente sanguínea, tais como anticorpos, proteínas etc. é de fundamental importância no que se refere a diagnósticos e tratamentos de doenças. Decidimos usar a microbalança de cristal de quartzo (QCM) com eletrodos funcionalizados para detectar estruturas coloidais com interesse farmacológico como p. ex. lipossomos.
Água. Apesar do grande avanço no design e fabricação dos substratos modificados para aumentar a eficiência das detecções, a interação entre a superfície sólida do sensor e a camada de líquido adjacente é pouco estudada. A água frente a superfícies apresenta estrutura e propriedades físicas como densidade, viscosidade, constante dielétrica,
etc. diferentes da águas da massa líquida [12]. Conforme trabalhos recentes, a água ainda é uma incógnita [13-16]. As variações da densidade, viscosidade e constante dielétrica, teriam efeito direto na difusão de íons e na força elétrica de atração entre partes polares de moléculas [12].
Medidas das propriedades da água volumétrica (“bulk”) como viscosidade, densidade, constante dielétrica, etc. são obtidas usualmente por viscosímetros, densímetros e estão tabeladas [7]. Todavia, a medida dessas propriedades nas primeiras camadas de líquido, não é trivial. Resultados experimentais para medidas indiretas das propriedades da água interfacial foram publicadas por Israelachvili [17], Vogler [18] e Soares [19]. Técnicas ópticas de geração de soma de freqüência (SFG) podem apenas testar moléculas na superfície. As moléculas nas camadas adjacentes não podem ser observadas. A região de transição entre moléculas de água adsorvidas, as preferencialmente orientadas, e aquelas no bulk, permanece desconhecida [20].
Entre as técnicas experimentais, capazes de fornecer informações da interface sólido/líquido, temos a microbalança de cristal de quartzo. A nosso ver, apesar de simples, essa técnica não foi aplicada em sua total potencialidade, especialmente no que se refere ao estudo de líquidos nas interfaces [19].
Neste trabalho utilizamos a técnica de microbalança para estudar interfaces sólido/líquido, com especial interesse em sistemas biofísicos de agregados anfifílicos e eletroquímicos, de eletrodos em solução. Baseamos nossos estudos, especificamente o caso de o fluido ser uma solução aquosa e o sensor ser um eletrodo metálico em diferentes condições de hidrofobicidade. Utilizamos superfícies de ouro recobertas por filmes hidrofílicos (ácido mercapto propiônico, 3 - MPA), hidrofóbicos (octanotiol) e biológicos (Surface protein
layers, S - Layers).
Utilizamos também a EQCM para estudar campos elétricos intensos frente a superfícies de eletrodos metálicos polarizáveis. Campos elétricos de intensidade de 107 V/m são facilmente produzidos nas interfaces metálicas polarizáveis. A grande vantagem é que o eletrodo polarizável é o próprio eletrodo da EQCM. A aplicação de altos potenciais elétricos à água produz fenômenos bastante singulares, como o da ponte de água [21]. Mostramos que o campo não altera a densidade da água na interface da EQCM e, portanto na ponte de água. Estudamos este fenômeno com líquido aprótico dimetilsulfóxido, DMSO, mostrando que a
configuração em ponte se deve ao caráter dipolar do líquido, com modulo de Young semelhante ao da borracha (~60kPa).
1.2 – Objetivos do trabalho
Estudar a aplicação de filmes auto-organizados sobre o eletrodo de ouro da EQCM com a finalidade de usá-la como sensor biológico.
Estudar a interface sólido/líquido usando principalmente a técnica de microbalança de cristal de quartzo, EQCM: descrever uma metodologia para compreender a dinâmica de variação dos parâmetros medidos, f e R, durante uma perturbação. Testar esta metodologia para diversos líquidos.
Funcionalizar a superfície do ouro com filmes de tiol e interpretar as medidas à luz da teoria desenvolvida.
Estudar campos elétricos intensos aplicados à interface da superfície do eletrodo de ouro polarizável em contacto com soluções de sais diluídas.
Estudo da ponte líquida causada por campos elétricos macroscópicos, da mesma ordem dos produzidos na interface.
1.3 - Importâncias do estudo realizado
•Compreender a variação das propriedades viscoelásticas do sistema eletrodo/filme/meio contactante e mudanças morfológicas que ocorrem na superfície do eletrodo;
•Desenvolvimento de sistemas biomiméticos que utilizem os filmes auto-organizados e ou substratos sólidos imersos em sua constituição, tais como biomembranas, possibilitando entender processos relacionados à interação hidrofóbica em âmbito molecular, como enovelamento protéico e interações de moléculas diversas com a membrana biológica;
•Entendimento da dinâmica de adsorção de estruturas de moléculas anfifílicas sobre substratos sólidos imersos em meio aquoso;
•Em ciências farmacológicas, inferir métodos ótimos de ação de fármacos que atuem na membrana biológica.
1.4 – Organização do trabalho
Dividimos o texto em 7 capítulos e apêndices.
No Capítulo 1 contextualizamos o trabalho e mostramos os objetivos da tese. No Capítulo 2 abordamos o meio aquoso frente a interfaces. Apresentação do modelo de Eyring para líquidos em geral e para a água.
No Capítulo 3 introduzimos alguns conceitos básicos sobre auto-organização de moléculas anfifílicas como fosfolipídios, e informação básica sobre proteínas de membrana de bactérias, S-layer.
No Capítulo 4 apresentamos as técnicas de microbalança de cristal de quartzo eletroquímica e de microscopia de força atômica.
No Capítulo 5 descrevemos a parte experimental: materiais e a metodologia de trabalho empregada, procedimentos de limpeza dos eletrodos, preparação dos lipossomos, etc. No Capítulo 6 apresentamos e discutimos os resultados obtidos para a interface sólido/líquido, incluindo o estudo da camada de Debye, as medidas da adsorção de lipossomos sobre o eletrodo da EQCM em ambiente aquoso, em diferentes superfícies. Em anexo os artigos submetidos para publicação: o estudo da configuração de ponte, para líquido polar aprótico e o estudo de superfícies superhidrofóbicas feitas com cianoacrilato.
No Capítulo 7 apresentamos conclusões gerais e apontamos para as perspectivas para pesquisas futuras.
CAPÍTULO 2
2.1 Importância do estudo da água em interfaces sólidas
A água está presente em grande parte dos processos biológicos e industriais. Matriz da vida em nosso planeta, não se trata de uma simples estrutura passiva, mas com muitos papéis ativos na biologia molecular [22-23].
A comunidade científica entende a água como sendo um líquido Newtoniano, com densidade e viscosidade homogêneas nos espaços que ocupa. Esta visão vem principalmente de medidas com viscosímetros, espalhamento de nêutrons e simulações por computador [24]. No entanto, tal visão pode não ser verdadeira, principalmente para as primeiras camadas de água junto à superfície sólida[19, 25-26]. Esta ―água interfacial‖ em contato com superfícies sólidas não seria igual à água da massa líquida volumétrica (“bulk”); poderia apresentar estrutura, ter sua densidade modificada, ter suas propriedades dielétricas alteradas, etc. As implicações em biologia são enormes: nos tecidos vivos, as superfícies de células e organelas são permeadas por água. O citoplasma contém tipicamente 400 g/L de macromoléculas que podem ocupar de 5 a 40% do volume total da célula. Desse modo a célula é extremamente ―povoada‖ com macromoléculas separadas por distâncias de apenas 1 a 2 nm. A água confinada nesses espaços teria, provavelmente, sua estrutura alterada, com implicações na difusão de moléculas, íons, na hidratação e associação de partes hidrofóbicas de proteínas (folding and unfolding of proteins), etc. [22-23,25-26]. Esses fatos mostram o quanto ainda há de incertezas a respeito do comportamento da água em uma escala molecular. A água forma duas fases líquidas sob condições extremas de temperatura e pressão? Como são rearranjadas as moléculas de água junto a superfícies, ou na acomodação de solutos? A água no interior das células é estruturalmente igual à água fora dela? Estas questões são hoje assuntos de amplo debate[28-29].
Dessa forma apresentamos neste capítulo modelos de meio aquoso volumétrico (―bulk‖) conhecidos, e influência da interface sólida no arranjo das moléculas adjacentes à mesma.
2.2 Meio aquoso volumétrico
Os líquidos em geral são caracterizados pela interação molécula-molécula via forças de van der Waals (interações intermoleculares), Figura 2.1. Essas forças são de origens variadas, como as devidas aos dipolos induzidos, variando tipicamente com 1/r6, onde r é a distância entre os dipolos (da ordem de 1 a 2 Å) [30-31]. As forças de van der Waals são muito fracas, com uma energia de ligação típica de 1 a 2 kcal/mol, quando comparadas com a energia de ligação química (interações intramoleculares), da ordem de 30 a 200 kcal/mol [31].
Figura 2.1: gráfico representando a Interação de van der Waals, o potencial atrativo em função da distância
A água apresenta ligações mais complexas entre suas moléculas do que simplesmente as forças de van der Waals. O forte caráter polar da água permite que o oxigênio de uma molécula de água interaja com dois outros hidrogênios de outras duas moléculas de água, formando as ligações de hidrogênio, Figura 2.2. A energia envolvida é da ordem de 10 kcal/mol, e podem variar o comprimento e os ângulos de ligação[32].
Figura 2.2: esquema da configuração tetraédrica das moléculas de água formando ligações de hidrogênio
A água em estado líquido distante das interfaces adquire estrutura tetraédrica dinâmica (tempo de vida de 10 ps, aproximadamente), sendo que à temperatura ambiente predomina um numero médio de 4 ligações entre as moléculas, Figura 2.3[3, 33].
Figura 2.3: esquema representando o meio aquoso [13].
Há modelos que contemplam a água como sendo constituída de domínios mais densos e outros menos densos. Cada cluster de moléculas de água passa a exibir propriedades distintas. A origem desses dois domínios no meio aquoso é vasto objeto de estudos, e uma das possibilidades é a interação molécula-molécula com dois poços de potencial, conhecido como pentâmeros de Walrafen [27,29]. Existem modelos que contemplam a água como formada por clusters de moléculas, como é o caso do modelo de Eyring, apresentado a seguir.
2.2.1 Estruturas líquidas significativas – modelo de Eyring para líquidos
Líquidos gerais. Resultados de experimentos de difração de raios-X revelam que a estrutura de moléculas vizinhas de substância em estado líquido é muito semelhante à estrutura da mesma substância quando em estado sólido, mesmo após a expansão volumétrica típica de 10% devido ao derretimento. A posição relativa das moléculas vizinhas, que permanece a mesma na estrutura cristalina, persiste no meio líquido, com exceção que a longas distâncias a ordem desaparece, caracterizando um estado amorfo. Essa constatação serviu de elemento para a proposta de Eyring: um modelo no qual o meio líquido pode ser entendido como composto de moléculas ligadas, formando estruturas tipo sólido, permeadas por lacunas móveis, e um estado menos ligado, tipo gás. Essas estruturas foram batizadas como estruturas líquidas significativas, Figura 2.4 [34-35].
Figura 2.4: foto de esquema de estruturas tipo sólido e lacunas [35].
O meio líquido apresenta as três estruturas significativas em equilíbrio: o cluster sólido, as lacunas dinâmicas e as estruturas tipo gás. Mudanças de temperatura e pressão aumentam o predomínio de uma sobre a outra, até finalmente acontecer uma mudança de fase. Por exemplo, aumentar a temperatura da água aumenta a quantidade de moléculas na configuração de lacunas fluidas, liberando os gases adsorvidos, até o processo de evaporação. Com o modelo das estruturas líquidas significativas é possível escrever funções de partição apropriadas e calcular com precisão várias propriedades dos líquidos, o que antes não era alcançado com as teorias de Mayer e Kirkwood ou de Lennard-Jones e Devonshire [34].
Modelo de Eyring aplicado à água. A água, um líquido polar, contém interações de hidrogênio que alteram o comportamento esperado, como alto ponto de fusão e ebulição, e menor densidade quando a 4 ℃. Tais comportamentos são perfeitamente calculados com a teoria das estruturas líquidas significativas [34].
Um modelo de água formada por clusters de moléculas precisa ser considerado no estudo da interface sólido/líquido, uma vez que contempla propriedades de sólido na estrutura líquida adjacente à superfície. Outro aspecto a ser considerado no estudo da interface sólido/líquido é o efeito da perturbação do meio líquido causada pela adição de hidrocarbonetos, sais e anfifílicos.
2.2.2 Adição de hidrocarbonetos à água
Quando inserimos uma molécula de hidrocarboneto (apolar) em meio aquoso, as moléculas de água terão a opção de conectar-se com esta molécula (via ligação de van der Waals) ou com outras moléculas de água (via ligação de hidrogênio). Conforme o tamanho das moléculas apolares, as moléculas de água adjacentes terão dois comportamentos:
1- Se as dimensões do hidrocarboneto são grandes comparadas ao comprimento de uma ligação de hidrogênio (2,82 Å, aproximadamente a distância da ligação entre 2 moléculas de água), há a tendência de a molécula ser expelida do meio aquoso e formar uma nova fase com outras moléculas de hidrocarboneto (efeito conhecido como hidrofobicidade). Grandes superfícies de material apolar são hidrofóbicas, independente do tamanho de suas moléculas constituintes [3,36].
2- Se a molécula de hidrocarboneto for pequena, há uma tendência de molécula ser envolvida pelas moléculas de água vizinhas, formando uma estrutura tipo gaiola. Estas moléculas são solubilizadas até uma concentração de saturação. Como exemplo, podemos citar clorofórmio e moléculas de gases oxigênio nitrogênio e argônio. Este arranjo tipo gaiola é energeticamente econômico para a água, Figura 2.5 [3,36].
Figura 2.5: esquema da solvatação de molécula apolar tetracloreto de carbono, CCl4.
2.2.3 Adição de sais à água
Quando adicionamos um sal (NaCl, por exemplo) à água as forças Coulombianas de atração dos íons são extremamente reduzidos devido à permissividade relativa da água, que é aproximadamente 80. O que sucede é a dissolução do sal em um cátion e um ânion. Como moléculas de água têm um forte dipolo elétrico, estas se orientam preferencialmente em volta de cada íon um processo chamado hidratação. A dissociação de sais em água pode ser endotérmica (NaCl) ou exotérmica (NaI). A etapa de separação iônica é sempre endotérmica, mas a hidratação é exotérmica, e o resultado final depende da competição. O fenômeno de dissolução ou não do sal dependerá também do balanço energético devido a hidratação dos íons. Há grupos de moléculas que necessitam de mais energia para se dissolverem, em função do custo energético para quebrar as ligações hidrogênio do meio líquido, ou podem apenas distorcer tais ligações. As primeiras são comumente referidas como caotrópicas, enquanto as segundas são designadas cosmotrópicas [27].
Por exemplo, consideremos o caso de um cátion com um volume menor (perdeu um ou mais elétrons) do que o ânion (recebeu um ou mais elétrons). Devido à força de atração Coulombiana mais intensa pela carga concentrada do íon (maior densidade eletrônica), haverá uma maior agregação de dipolos de água ao redor do cátion. O cátion Na+ agrega 30 moléculas de água, por exemplo [37].
Figura 2.6: representação esquemática de solvatação de cátion [37].
2.2.4 Adição de moléculas anfifílicas à água
Moléculas anfifílicas apresentam duas regiões distintas, uma porção hidrofóbica, composta por uma ou mais cadeias de hidrocarbonetos, saturadas ou insaturadas, e uma porção hidrofílica, composta por um grupo polar. Os anfifílicos podem ser classificados como: aniônicos, catiônicos, não-iônicos e zwiteriônicos. Sendo que neste último grupo se incluem muitos lipídios de origem natural, dentre eles os fosfolipídios como a fosfatidilcolina ou lecitina (PC), presente nas membranas biológicas de células animais[38-39].
A tendência a se solubilizar em um meio também pode ser entendida como ―afinidade‖. Uma molécula é ―afim‖ a um determinado meio quando as interações com o solvente são fortes o bastante para que um equilíbrio se estabeleça entre a forma associada e a dissolvida [3, 31]. A solubilidade parcial das moléculas anfifílicas em meio aquoso permite sua associação em agregados [3]. Também podem concentrar-se nas interfaces formando filmes de espessura molecular. Os agregados de anfifílicos podem então formar uma interface própria em solução, de maneira autoorganizada, constituindo um tema de grande interesse para o estudo da interface sólido/líquido. Esses sistemas são tratados neste trabalho em maiores detalhes no capítulo 03.
2.2.5 Água em interfaces
A existência de uma interface modifica o comportamento dinâmico das moléculas, relativamente às suas propriedades em solução (propriedades volumétricas). Frente a interfaces, as ligações de hidrogênio não são mantidas. Temos as seguintes possibilidades:
1. A superfície é capaz de orientar as moléculas de água
Neste caso, um efeito de cooperatividade é observado, e o alinhamento das moléculas se mantém por várias camadas sucessivas, em direção ao interior da solução. É a características de superfícies hidrofílicas e de superfícies metálicas polarizáveis [12].
2. A superfície não orienta as moléculas de água.
Frente a tal interface, as estruturas formadas pelas moléculas de água se assemelham ao tipo gaiola, diminuindo a interação entre o líquido e a interface. São as denominadas superfícies hidrofóbicas [36]. Uma superfície metálica imersa em líquido em ponto de zero carga1 também não orienta as moléculas de líquido sobre a interface.
Quando há íons dissolvidos, constituindo um eletrólito, a existência da interface gera uma configuração de dupla-camada, que será explorada na seção 6-2.
1
CAPÍTULO 3
Neste capítulo apresentamos os fundamentos de auto-organização de moléculas anfifílicas para a geração de uma interface sólida em solução aquosa e sua importância em biologia. Também descrevemos uma interface composta por proteínas de bactérias com potencial uso tecnológico, conhecidas como ―S-layers‖.
3.1 Auto-organização e Anfifílicos
A auto-organização parece ser uma das chaves para a construção de ambientes específicos para o crescimento controlado e a produção de nanoestruturas diferenciadas. Estratégias de processamento encontradas nos sistemas biológicos poderiam ser ―copiadas" para a fabricação de estruturas macroscópicas que apresentariam propriedades físicas, elétricas e mecânicas não obtidas por técnicas convencionais, com a vantagem de serem feitos com baixo consumo energético[40-41].
O papel das forças intermoleculares nos fenômenos da auto-organização de anfifílicos, na determinação de formas ou padrões de agregados e nos processos de reconhecimento entre as diferentes superfícies (polar e apolar) é fundamental [8]. As forças intermoleculares atuando na cabeça e na cauda dos anfifílicos são de curto alcance, de modo que estas partes podem ser consideradas independentemente [3]. Isso facilita a modelagem para o estudo termodinâmico dos anfifílicos.
Usualmente os modelos teóricos empregados para o estudo de sistemas anfifílicos envolvem moléculas dispersas em solução aquosa, à temperatura e pressão constantes, nos quais a situação de equilíbrio termodinâmico ocorre quando a energia livre de Gibbs G 2é mínima no sistema [8, 25, 36].
O processo de auto-organização de moléculas anfifílicas é regido por essa minimização da energia livre total do sistema, que depende da concentração, aumentando com o número de moléculas. G pode ser calculada para estruturas puramente hidrofóbicas através de simulação computacional, especificamente a aproximação de esferas, cilindros e placas paralelas hidrofóbicas imersas em meio aquoso. A cadeia carbônica envolta por moléculas de
2 Energia Livre de Gibbs G = H – TS = U + PV – TS. Energia disponível para o sistema
água num arranjo tipo gaiola implica em custo energético ao sistema. Sua configuração de equilíbrio tende a ser aquela na qual a menor quantidade possível de moléculas de água fica em contato com as superfícies hidrofóbicas [3, 36]. Esses elementos básicos permitem inferir, de forma aproximada, a tendência de auto-agregação das espécies dissolvidas em solução, pois a energia do sistema diminui quando isso ocorre [36, 42-43].
Adicionando-se moléculas anfifílicas (monômeros) no meio aquoso, verifica-se que os anfifílicos tendem a se acumular nas interfaces do recipiente no qual estão confinados, Figura 3.1. Conforme a concentração é aumentada, inicia-se um processo de formação de micelas no volume. Temos dois equilíbrios possíveis: existe um equilíbrio entre monômeros dispersos em solução e a superfície e outro entre monômeros dispersos em solução e as micelas, sendo que estas se comportam como uma nova espécie química (potencial químico e energia de solvatação próprios) [25]. Neste ponto, qualquer aumento de concentração resulta na formação de monômeros auto-associados em equilíbrio, com uma concentração constante de monômeros livres. Esta concentração é denominada concentração micelar crítica, c.m.c. [38]. No apêndice A são mostrados diferentes estruturas como micelas, estruturas do tipo bastão, bicamadas, vesículas, fases hexagonais (invertidas ou não), entre outras formas possíveis podem ser obtidas em solução, em função da estrutura peculiar das moléculas anfifílicas.
Figura 3.1: esquema de auto-organização de anfifílicos em meio aquoso. A figura mostra as possíveis configurações das moléculas anfifílicas, com adsorção nas interfaces solido/líquido e
A estrutura geral reflete o empacotamento de moléculas anfifílicas com energia mínima pelo balanço entre as forças atrativas entre moléculas de água, liberando as caudas apolares (efeito hidrofóbico) e as forças repulsivas entre as cabeças polares. A c.m.c. de lisofosfolipídios e de detergentes varia num intervalo de M a mM. Todavia, os fosfolipídios com cadeia carbônica de 14 ou mais átomos se auto-associam em concentrações menores do que 10-10 M, devido à interação hidrofóbica causada por suas duas cadeias carbônicas. Não formam micelas, organizam-se em estruturas de bicamadas, que permitem o fino empacotamento de cadeias adjacentes com a máxima exclusão da água dos domínios hidrofóbicos, ver seção 3.2. Nas células os fosfolipídios não se encontram como monômeros livres em solução, mas organizados em membranas de bicamadas lipídicas ou em complexos de proteínas [38].
Lipossomos
Quando fosfolipídios de cadeia longa diluídos em solvente orgânico são secos, solidificados e, então, hidratados, espontaneamente formam folhas multilamelares de bicamadas separadas por água. A aplicação de ultrassom dispersa essas folhas em bicamadas unilamelares ou multilamelares, satisfazendo a natureza hidrofóbica dos finais das bicamadas ao fechá-las em vesículas seladas, também conhecidas por lipossomos. Apresentam geralmente uma estrutura de bicamadas unilamelares contínua com um núcleo aquoso, semelhante às membranas envolvendo células orgânicas. Lipossomos podem ser unilamelares ou multilamelares e também podem ser feitos por extrusão física de estruturas lamelares através de um pequeno orifício ou por diluição de uma mistura detergente-lipídio abaixo da cmc do detergente [44].
Figura 3.2: representação esquemática de agregação de moléculas anfifílicas em meio
A estrutura dos lipossomos é usada no desenvolvimento de fármacos inteligentes para sistema ―drug-delivery‖, com a capacidade de armazenar moléculas de interesse em seu interior [38].
Os principais fatores que determinam a auto-organização das moléculas anfifílicas são o efeito hidrofóbico, as ligações hidrogênio, as interações eletrostáticas (mesmo para lipídios com cabeças polares zwiteriônicas, há interação entre as cargas opostas de moléculas adjacentes), e estéricas3. A variação de entalpia reflete as quebras de ligações de pontes de hidrogênio e interações elétricas. A variação de entropia reflete a mudança no ordenamento das moléculas de água, a hidratação de íons, e a repulsão estérica [45].
3.2– Membranas lipídicas biológicas
A membrana biológica constitui o limite das células e das organelas nos tecidos vivos, e é através dela as células interagem com o mundo exterior e desempenham as funções de compartimentação do interior celular. A membrana biológica é constituída essencialmente de bicamada de lipídios; fosfolipídios, glicolipídios e colesterol, associados de maneira semifluida, com moléculas de proteínas mergulhadas na bicamada lipídica, Figura 3.3 [38, 44].
A disposição de bicamada bidimensional imersa em ambiente líquido condutor confere à membrana biológica características semelhantes às de um capacitor elétrico de
3
Os efeitos estéricos advêm do fato de cada átomo dentro de uma molécula ocupar uma determinada quantidade de espaço. Se os átomos forem colocados demasiado próximos, há um custo em energia associado devido à sobreposição das nuvens eletrônicas (repulsão Pauli ou Born), e esta pode afetar a forma final da molécula (conformação) e a sua reatividade. (11)
Figura 3.3: esquema tridimensional da secção transversal de uma membrana biológica. É possível perceber a complexidade da estrutura da membrana celular [38].
aproximadamente 1 μF/cm2. O interior da célula está em geral 200 mV mais negativo do que a parte externa da célula graças às proteínas de transporte de potássio, sódio e cálcio por canais iônicos imersos na membrana biológica. Campos elétricos intensos da ordem de 4 x 107 V/m através da membrana conferem à mesma propriedade única de transporte de carga elétrica [44].
As proteínas associadas à membrana biológica possuem, geralmente, elevado peso molecular e são pouco solúveis em água, necessitando de um microambiente hidrofóbico/hidrofílico adequado para adquirir sua conformação funcional, que é oferecido pela bicamada lipídica. Essas proteínas possuem diversas funções celulares, por exemplo, facilitar a comunicação entre a célula e o ambiente, sinalização, reconhecimento celular, ligante para anticorpos etc., conferindo à membrana biológica uma grande versatilidade funcional [38].
No entanto, a complexidade das membranas biológicas e suas interações com as matrizes biológicas intra e extracelulares dificultam a investigação das mesmas. Por essa razão, modelos artificiais de membranas biológicas foram desenvolvidos e têm importante papel em revelar suas funções e características físicas e químicas [46].
3.3 – Membranas modelo de membranas biológicas.
As membranas modelo são formadas por fosfolipídios. Nos lipossomos, por exemplo, a membrana modelo constitui a casca esférica separando o ambiente líquido interior do exterior, Figura 3.2. Este modelo, porém, apresenta dificuldades experimentais na medição ou controle das concentrações do ambiente interno ou os potencias através da membrana [47]. Para superar estas dificuldades membranas suportadas por substratos sólidos foram desenvolvidas recentemente [48-49]. Em geral bicamadas de fosfolipídios depositadas sobre superfícies sólidas têm sido o modelo experimental de superfície celular mais usado, permitindo-nos aprender sobre reações imunológicas e adesão celular. Esses sistemas modelo são preparados pela deposição direta de monocamadas ou bicamadas de fosfolipídios sobre uma superfície sólida para permitir a obtenção de grandes áreas (cm2) recobertas, que mantém excelente estabilidade mecânica sem perder sua natureza fluida [50-51].
Figura 3.4: esquema de uma estrutura lamelar de fosfolipídios de DMPC. Essa estrutura constitui as paredes de lipossomos de fosfolipídios DMPC, sistema biomimético.
Vem sendo desenvolvida uma tecnologia que permite a biofuncionalização de uma superfície sólida através da fixação de biomoléculas especializadas sobre uma membrana planar de fosfolipídios auto-organizados [50]. Estas biomoléculas podem ser canais iônicos, peptídios sinalizadores, etc. [52]. Por exemplo, a membrana pode ser ligada a uma molécula do tipo polietileno glicol, um tiol, de maneira a ficar suspensa entre dois meios líquidos. Desse modo é possível fixar proteínas transmembranares como canais iônicos. Esta técnica permite experimentos e uso de métodos analíticos que são difíceis ou impossíveis de serem usados com outros modelos de membrana [50, 53].
A seguir apresentamos um tipo de membrana modelo a partir de bactérias, composta por proteínas extraídas de bactérias Lysinibacyllus sphaericus CCM2177.
3.4 Proteínas de Superfície de Membrana (Surface Protein Layers: S-Layers)
Proteínas fazem parte de cada organismo biológico, e são compostos com propriedades definidas para cuidar de todas as tarefas que são necessárias para a sobrevivência de seu produtor. São expressas a partir do DNA4 (via RNA5 transportador), num processo otimizado por bilhões de anos de evolução biológica [54].
4
ácido desoxirribonucleico (ADN, em português: ácido desoxirribonucleico; ou DNA, em inglês: deoxyribonucleic acid)
5 ácido ribonucleico (sigla em português: ARN e em inglês, RNA, ribonucleic acid), associado a síntese de
S(urface)-layers cristalinas são as estruturas mais comumente observadas nas superfícies celulares de organismos procarióticos (bactéria e archaea). Representam a mais simples membrana conhecida, composta por apenas um tipo de proteína ou glicoproteína que forma de maneira auto-organizada um padrão repetitivo que recobre a parte exterior das bactérias. Estima-se que 2/3 da biomassa total do planeta está distribuída em organismos procarióticos, e 10% desse valor está associado às S-layers. S-layers são malhas protéicas porosas, com célula unitária com dimensões entre 3 e 30 nm, e espessura de ~ 10 nm. Uma das principais características das proteínas S-layers é sua capacidade de formar mono ou dupla-camadas auto-organizadas em solução e em interfaces [54-55]. Essas proteínas se destacam nas aplicações em sensores, pois mesmo após serem depositadas sobre substratos sólidos mantém sua atividade biológica [54].
Dependendo do tipo de proteína, uma célula unitária de diferentes redes cristalinas pode ser obtida a partir de um ou mais tipos de monômeros. As periodicidades de tais células variam de 2,5 a 35 nm e apresentam de 5 a 20 nm de espessura [54].
Figura 3.5: figura com SPM de S-layer [55]. As proteínas de membrana se associam formado uma rede cristalina
As S-layers apresentam dois tipos de interfaces. A superfície externa, em relação à bactéria, é normalmente menos corrugada e mais hidrofóbica (devido a neutralização de quantidades equivalente de grupos carboxila e amina) e a parte interna é em geral carregada negativamente [55].
Extração
As S-layers podem ser removidas de seu organismo biológico parental através de destruição mecânica das células e subseqüente centrifugação diferencial. Os fragmentos de camadas liberados são finalmente desintegrados até suas subunidades com altas concentrações de agentes caotrópicos (e.g. uréia ou guanidinium hydrochloride), agentes quelantes metálicos ou mudança de pH em ambas direções. Tais agentes atuam na separação das subunidades entre si. A solução base de subunidades possui concentração de 1 molL-1 [54].
Reestruturação
A reversibilidade do processo de desintegração para a reestruturação é alcançada simplesmente pela redução da concentração do agente caotrópico. Após a diluição da solução base a reestruturação ocorre espontaneamente (auto-organização) em forma de camadas achatadas, vesículas fechadas ou cilindros de extremidades abertas. Essa variedade de formas é dependente do tipo particular de S-Layer e dos parâmetros da solução. A razão para o processo de autoorganização é a alta afinidade das subunidades que é conduzida por interações fracas diversas em âmbito supramolecular. Essas forças são muito mais fortes que aquelas que ligam a S-layer à membrana lipídica, dando uma característica bidimensional cristalina ao filme protéico. A formação de filme se inicia com uma rápida nucleação de subunidades em pequenos fragmentos, que iniciam uma interação mais demorada que dá origem ao filme extenso e compacto, depois de uma hora. As propriedades do processo de cristalização são majoritariamente dependentes da estrutura terciária das proteínas. A formação de dupla-camadas, nas quais duas monocamadas estão diante uma da outra é observada quando há a presença de cátions divalentes atuando como mediador[54]. O produto da reestruturação é geralmente uma monocamada bidimensional que pode se formar em suspensão, na interface ar-líquido, em monocamadas lipídicas suspensas, em lipossomos e em superfícies sólidas.
Figura. 3.6: desenho esquemático mostrando a trajetória de reestruturação das proteínas S-layer de L. sphaericus sobre superfícies sólidas, formando o mosaico bidimensional. Canto superior
esquerdo: imagem de AFM das S-layers de L. sphaericus [55].
Do ponto de vista tecnológico, a interface mais interessante para as S-layers é a sólido-líquido. Diversos estudos sobre diferentes substratos mostraram que um caráter hidrofóbico é a chave para o mecanismo de reestruturação. Cristalização ocorre preferencialmente se as subunidades ou fragmentos podem se ligar com sua face neutra para a camada e expor sua face carregada para a solução tampão. Entretanto, em alguns casos excepcionais as S-layers também são capazes de construir grandes arranjos monocristalinos em substratos hidrofílicos. S-layers de Lysinibacyllus sphaericus CCM2177 são relatadas se autoorganizando em substratos de silício de duas maneiras diferentes. Experimentos em scanning probe microscopy, SPM, em silício submetido a decapagem (etching) com plasma de oxigênio (deixando uma superfície hidrofílica) revelaram uma estrutura reestruturada com menos do dobro da altura de uma monocamada, enquanto que a estrutura observada em um suporte hidrofóbico mostrou características de uma monocamada. Estudos adicionais mostraram que a ligação aos substratos (tanto hidrofóbico quanto hidrofílico) é atenuada por
forças repulsivas provenientes de interações estéricas, causadas pela presença de macromoléculas que podem ser encontradas no arranjo cristalino [52].
Estudos de reestruturação em eletrodos de ouro eletrificados revelam diferentes mecanismos de adsorção sobre a mesma superfície de material, mas em diferentes potenciais [54].
A estrutura periódica altamente anisotrópica e a densidade de grupos funcionais conduziram para vários tópicos em biotecnologia, biossensores e nanoestruturação em tecnologias bottom-up. A autoorganizacão em combinação com controle de superfície eletroquímico pode ser a chave para fazer desse sistema tão atrativo para aplicações tecnológicas no que se refere à fabricação de materiais em nanoescala [54-55].
CAPÍTULO 4
4.Técnicas experimentais
Apresentamos brevemente as duas técnicas interfaciais: Microbalança de Cristal de Quartzo, QCM, e Microscopia de Força Atômica (AFM, em sua sigla em inglês). Ambas as técnicas são complementares no entendimento de interfaces, empregam o efeito piezoelétrico (conversão de energia mecânica em eletricidade, e vice-versa) como fenômeno físico básico para a aquisição de dados. Os detalhes das técnicas de QCM e AFM se encontram nos Apêndices B e D, respectivamente. A técnica da microbalança de cristal de quartzo é muito simples e bastante utilizada, porém não explorada em sua totalidade. Este trabalho destaca a técnica da QCM para o estudo da interface sólido/líquido e amplia o uso da técnica para sistemas aquosos.
4.1 Fundamentos da microbalança de cristal de quartzo, QCM
A microbalança de cristal de quartzo (QCM) é um dispositivo transdutor piezoelétrico, converte energia elétrica em energia mecânica e vice-versa, devido às propriedades piezoelétricas do cristal de quartzo. É um poderoso sensor de ondas acústicas capaz de medir mudanças em propriedades físicas do meio contactante a um de seus eletrodos constituintes. O dispositivo consiste de um disco fino de cristal de quartzo em corte AT, cujas faces planas são recobertas geralmente por um filme de ouro policristalino (espessura típica de 200 nm) [56].
Figura 4.1: esquema representando o disco de quartzo recoberto com eletrodos de ouro - eletrodo da QCM
Um circuito oscilador (―driving circuit‖) aplica um sinal elétrico senoidal E(t) aos eletrodos, estabelecendo um campo elétrico oscilante (de freqüência ajustável) entre eles. Quando o cristal está em vácuo, a tensão mecânica de cisalhamento causada pelo efeito piezoelétrico do quartzo faz com que as superfícies do cristal oscilem harmonicamente em direções opostas em relação a um plano nodal, exibindo amplitude de oscilação máxima quando o sinal externo está na freqüência de ressonância do cristal, f [57].
Figura 4.2: sistema oscilante da QCM em contato com meio líquido
Um dos eletrodos é aterrado e colocado em contato com o meio fluido. Um ―setup‖ à prova de água assegura que as faces oscilem livremente e que apenas uma face do cristal (―sensing face‖) seja exposta ao ambiente líquido quando a QCM é imersa, Figura 4.2. A superfície deste eletrodo se comporta como um plano ideal de cisalhamento (rugosidade de superfície desprezível). Uma onda acústica transversal evanescente se propaga na direção perpendicular à superfície a uma máxima distância de penetração d = 200 nm. Os pequenos movimentos oscilatórios do eletrodo (amplitudes de aproximadamente 1 nm permitem medidas de forças inerciais e dissipativas atuantes no líquido contactante assegurando ao mesmo tempo mínima interferência nos movimentos moleculares da região [58].
Figura 4.3: esquema da interface metal-líquido para diversos meios: a) filme rígido, em que moléculas estão fortemente ligadas entre si b) fluido viscoso, em que as moléculas podem trocar a
posição em relação a interface, alterando o momentum transferido às camadas adjacentes de líquido e c) meio elástico, no qual as moléculas estão ligadas entre si.
Devido ao acoplamento eletromecânico do quartzo, ver Apêndice B, as propriedades mecânicas do meio de contato se refletem nas propriedades elétricas do ressonador [56]. Desse modo, a balança permite monitorar variações de massa em filmes finos, assim como variações das propriedades viscoelásticas dos mesmos (módulo de cisalhamento complexo, ou complex shear modulus, G), in-situ e em ―tempo real‖ (~ 0.1 s), Figura 4.3 [57, 59-60]. Empregando-se o mesmo eletrodo sensor de massa da QCM como eletrodo de trabalho numa célula eletroquímica, podem-se efetuar simultaneamente medidas de transferência de carga elétrica e análise de impedância eletroquímica [56].
Os parâmetros obtidos são freqüência de oscilação, f, e resistência, R, ambos na ressonância, em função do tempo. É possível também construir um gráfico de f vs. R, no qual ficam evidentes processos elásticos, newtonianos (nos quais variam densidade e viscosidade do meio adjacente) e formação de filmes rígidos sobre o eletrodo, Figura 4.4 [19].
Figura 4.4: representação do plano freqüência vs. resistência com as possíveis inclinações f/ R correspondentes a perturbações elásticas, inclinação -aN ( ZG‘), Newtonianas, inclinação aN
( Z ) e rígidas ( Zm).
4.1.1 Teoria WLF e microbalança de cristal de quartzo
Uma onda acústica viajando pelo material causa deformações que nos informam sobre as propriedades mecânicas do mesmo. Um meio perfeitamente elástico caracteriza-se por exibir uma relação linear entre a tensão mecânica aplicada e a correspondente deformação resultante (lei de Hook). Um meio perfeitamente viscoso caracteriza-se pela tensão mecânica ser diretamente proporcional à taxa de variação de deformação, independente do valor de deformação em si. Um meio viscoelástico apresenta um misto dos dois comportamentos: não mantém uma deformação constante quando sob tensão mecânica constante e recupera parte de sua estrutura quando a tensão cessa.
A microbalança de cristal de quartzo atua como uma fonte de ondas acústicas, causando uma tensão mecânica no meio adjacente, que responde com a respectiva deformação. A resposta do sistema não está necessariamente em fase com o sinal aplicado.
Segundo a teoria WLF (Williams-Landel-Ferry), quanto maior a temperatura de um meio, menor a viscoelasticidade desse meio, e vice-versa. O mesmo fenômeno pode ser correlacionado ao movimento do eletrodo em relação ao meio líquido, de maneira inversa: quanto mais rápido o eletrodo oscila, mais rígido o meio contactante parece ser. Não se trata de uma transição de fase termodinâmica, apenas não há tempo suficiente para que ocorra relaxação das moléculas antes da próxima onda mecânica. No caso da QCM os períodos de oscilação são da ordem de décimos de microssegundos, muito maiores que os tempos de relaxação para água, que são da ordem de femtossegundos. A água então se comporta como um líquido ([61], cap.12).
4.1.2 Microbalança de Cristal De Quartzo Eletroquímica: EQCM
A microbalança de cristal de quartzo é uma poderosa ferramenta analítica, capaz de fornecer informações a respeito da dinâmica de formação de estruturas sobre sua superfície metálica, em interfaces sólido-gás e sólido-líquido. Quando esta superfície metálica atua como eletrodo de trabalho em uma célula eletroquímica, acoplada a um potenciostato/galvanostato pode-se medir também o potencial de superfície e a quantidade de carga que a superfície troca com o meio no qual o sistema está inserido. A esta ferramenta chamamos microbalança de cristal de quartzo eletroquímica, EQCM [56]. Esse instrumento é capaz de medir variações de massa sobre o eletrodo da ordem de nanogramas, equivalentes a monocamadas moleculares, e também medir correntes da ordem de nano-Ampères.
Com tal sensibilidade elevada torna-se imprescindível uma metodologia de limpeza eficaz, capaz de eliminar eventuais impurezas e contaminações que possam comprometer as medidas realizadas (ver seção 5.2). Os fundamentos de uma célula eletroquímica se encontram no apêndice D.
4.2 Microscopia de força atômica (AFM)
A técnica de microscopia de força atômica, AFM, é eficaz na visualização de superfícies em nível molecular. Ela permite a investigação da morfologia das superfícies de frágeis como filmes de anfifílicos depositadas sobre um substrato sólido em meio aquoso [62].
A capacidade da AFM de medir a ―dureza de superfícies à força de penetração da ponta da haste de medida (―tip‖) em soluções aquosas já está bem documentada [63-64]. Ela permite determinar propriedades mecânicas e estruturais do filme adsorvido sobre um substrato plano conhecido, p. ex. mica, silício, etc. A separação qualitativa dos fatores que governam a interação global entre o tip e uma superfície pode ser útil na obtenção não-destrutiva de imagens em sistemas biológicos e químicos em meio aquoso [65]. Os efeitos temporais de forças de repulsão/atração elétricas no espaço confinado entre o tip e uma superfície plana, também podem ser estudados utilizando-se diferentes velocidades de aproximação tip/superfície [66-69].
Por meio desta técnica é possível determinar também a existência ou não de cargas elétricas sobre a membrana assim como sua espessura. No apêndice B encontra-se detalhada a descrição da AFM.
CAPÍTULO 5
Iniciamos o capítulo com a seção 5.1 descrevendo a deposição dos eletrodos sobre os cristais de quartzo da QCM. Nas seções seguintes descrevemos as técnicas de limpeza e procedimentos empregados, assim como a metodologia de trabalho usada. Tais técnicas e procedimentos foram retirados da literatura e são citadas no texto. Informações adicionais (como material utilizado) estão nos resultados.
5.1 Preparação das superfícies metálicas funcionalizadas
Os filmes de ouro policristalino foram depositados em nosso laboratório, empregando o sistema de sputteering modelo AJA. O substrato é um cristal de quartzo cortado em um ângulo de 35°, o que mantém a freqüência de ressonância estável termicamente (corte AT), sobre o qual foi depositado um filme de cromo e sobre este o filme de ouro. O cromo serve como promotor de aderência ao ouro sobre o quartzo. Sobre cristais de quartzo depositamos filmes de cromo de espessura de 20 nm, e sobre estes o filme de ouro de 200 nm. A limpeza para deposição é realizada a alto vácuo (~10-4 Torr), seguida no processo de pulverização catódica (―sputtering‖) com atmosfera rarefeita de argônio ultra puro (99,99%).
Figura 5.1: representação esquemática de uma câmara para deposição de filmes finos. O alvo é o metal escolhido a ser depositado sobre o substrato.
O ―alvo‖ utilizado constitui-se de um disco de cromo, sendo ligado ao terminal negativo (ou catodo) de uma fonte de alta tensão. O substrato (uma máscara de latão projetada para abrigar os cristais de quartzo) onde se realiza a deposição é colocado em um suporte que é ligado ao outro terminal da fonte de tensão (ânodo). Esse terminal está aterrado. Para iniciar e manter a descarga foi introduzido um gás a baixa pressão, neste caso o argônio. Uma limpeza do substrato é realizada com um pulso de rádio freqüência de curta duração (~3 min). Quando a descarga luminescente é iniciada, íons positivos incidem no alvo, removendo principalmente átomos neutros por transferência de momentum, e estes átomos condensam no anodo formando o filme fino desejado. O processo é repetido, mudando-se o alvo, para a deposição do filme de ouro.
Ao final, isola-se a câmara do sistema de vácuo e permite-se a entrada de nitrogênio na campânula até atingir a pressão atmosférica.
Figura 5.2: foto do Sistema de Sputtering modelo AJA utilizado para a deposição de filmes metálicos sobre cristal de quartzo da QCM.
5.2 Filmes de Octanotiol/ 3-MPA para funcionalização
Moléculas de octanethiol e ácido mercapto propiônico, 3 - MPA, (pureza 99%) foram compradas dos laboratórios SIGMA, solubilizadas em soluções de etanol concentradas (ver abaixo), preparadas em pequenas quantidades (5 mL) concentração de 0,1mM. Os eletrodos foram imersos por 24 horas em cada solução, para que ocorresse a deposição uniforme das moléculas. Após a deposição os eletrodos foram enxaguados com água milli-Q [70-71].
Deste modo temos 3 configurações de eletrodo:
i) ouro policristalino recém depositado, limpo, sem qualquer funcionalização, designado como BARE;
ii) ouro policristalino recoberto com monocamada de octanotiol, filme hidrofóbico, designado como THIOL;
iii) ouro policristalino recoberto com moléculas de 3 MPA, hidrofílico, designado como MERCAPTO;
5.3 Limpeza do substrato utilizado
O procedimento de limpeza do eletrodo de ouro para medidas eletroquímicas, sem funcionalização obedece aos seguintes critérios [72]:
-A superfície do eletrodo deve ficar livre de gorduras e demais sujeiras orgânicas; -A rugosidade intrínseca da superfície do eletrodo não deve ser aumentada com o processo de limpeza;
-A integridade do filme de ouro deve ser preservada.
Para atender estes requisitos foi utilizada a seguinte metodologia:
i) imersão do eletrodo de ouro dentro de solução contendo ácido nítrico 5%; ii) enxágüe com álcool isopropílico;
iii )enxágüe com água milli-Q.
Após a limpeza, o eletrodo foi montado na QCM. Utilizamos o sistema QCM200 da Stanford (Figura 5.3). Este aparelho mede continuamente f e R (amostragem a cada 0,1 s) e faz a compensação de Cp. A freqüência natural de ressonância f0 é de 5 MHz, e a área do
eletrodo é de 0,30 cm2.
Figura 5.3: foto do equipamento QCM 200, Stanford Applied Research, utilizado nos experimentos
O potenciostato utilizado foi um PAR Model 263A;EG&G Princeton Applied Research. O eletrodo de trabalho é o eletrodo de ouro da QCM. Para nossas medidas o eletrodo de pseudo-referência utilizado foi um fio de prata recoberto com AgCl (potencial do eletrodo Ag/AgCl). O contra-eletrodo constituiu-se de um fio de ouro.
5.4 – Preparação de lipossomos de DMPC
Técnica de ressuspensão. Um filme foi formado de uma solução de fosfolipídio, DMPC (C36H72NO8P, cmc 6 nM), em clorofórmio, pois essa molécula é insolúvel em água. A
primeira etapa foi dissolver o fosfolipídio em clorofórmio que foi seco sob fluxo de nitrogênio (N2) e mantido a uma pressão reduzida por um tempo não inferior a 2 h, para remover todos
os traços do solvente orgânico. Em seguida, adicionou-se 100 mL de água Milli-Q (prospectada antes de cada experimento de um aparelho millipore) e obteve-se uma solução de lipossomos com concentração final de 10-4 M. Então, a amostra foi sonicada usando
Ultrasonic cleaner 1440D por aproximadamente 2 h e temperatura de 40 ◦C para obter uma solução mais homogênea possível de lipossomos, Figura 5.4 [38].
5.5– Procedimento de medida para a técnica da QCM
Uma vez feito a voltametria para limpeza e caracterização da superfície do eletrodo da EQCM, o experimento consistiu em mergulhar a EQCM na seqüência de béqueres com 100 ml de água Milli-Q e solução a ser estudada, Figura 5.5. No caso desse trabalho foram usadas soluções de lipossomos de Dimiristoilfosfatidilcolina, DMPC, concentração de 10-4 M. Foi feito controle de temperatura a 25 °C. A f e R foram medidos logo depois da estabilização do sinal da EQCM em cada solução.
Figura 5.5: esquema do procedimento do experimento feio com a QCM.
5.6 Medidas de Força versus Distância com AFM
Para nossos experimentos o equipamento utilizado foi o Thermo Microscopes, Figura 5.6.
Figura 5.6: foto do equipamento de microscopia de força atômica. O alinhamento do laser sobre o tip é acompanhado pelo televisor.
Para as medidas de microscopia de força atômica o procedimento de limpeza e preparação do substrato é idêntico ao da QCM (ver seção 5.3).
Nas medidas de força vs. distância em líquido (seção 6.2), no modo contato, o laser é devidamente alinhado para incidir sobre a ponta do tip e ser refletido para os fotodetectores. A configuração compreende o eletrodo de trabalho sobre o piezo do AFM, com eletrodos de controle e referência em contato com a célula eletroquímica. Figuras 5.7 e 5.8.
Figura 5.7: foto da célula eletroquímica montada em configuração do AFM para medidas eletroquímicas.
Figura. 5.8: foto da célula eletroquímica utilizada no AFM, com o substrato metálico como eletrodo de trabalho (dourado), contra-eletrodo de platina (baixo) e pseudo-eletrodo de
referência com fio de prata recoberto com AgCl.
A medida consiste em aproximar lentamente o tip em direção à superfície até tocá-la.
Uma força máxima de contato é estabelecida para que o cantilever e o tip não sejam danificados. Quando o ápice de força é atingido, inicia-se automaticamente o afastamento do cantilever. O perfil é registrado durante todo o processo.