Programa Doutorado Sanduíche no Exterior:

Após o estudo com eletrodos funcionalizados com tiol para alterar o estado de hidrofobicidade do eletrodo da QCM, nos perguntamos como seria o comportamento de uma interface biológica na sua interação com os lipossomos zwiteriônicos. Em cooperação com o departamento de físico-química da faculdade de Viena conseguimos efetuar o recobrimento do eletrodo da QCM com um filme de proteínas de membrana de bactérias, indicando como seria então o comportamento da interface sólido/líquido de uma bactéria, por exemplo, e identificar qual tipo de funcionalização com tiol mais se aproxima de uma situação biológica. Eletrodos Funcionalizados com Filmes de Proteínas S-Layer de Bactérias: Aplicação no Estudo da Adsorção de Lipossomos

W. E. Gomesa, T. Werzerb, D. M. Soaresa, W. Kautekb

a

Instituto de Física Gleb Wataghin, Departamento de Física Aplicada, Universidade Estadual de Campinas, Brasil

b

Departamento de Físico-Química, Faculdade de Química, Universidade de Viena, Viena, Áustria

Resumo

Neste trabalho utilizamos a capacidade de auto-organização das proteínas S-Layer de Lysinibacillus sphaericus CCM2177 para formar uma película sobre o eletrodo de ouro de uma QCM, a fim de estudar a interação de lipossomos de DOPC com estes filmes. As aplicações deste trabalho envolvem terapia através de medicamentos inteligentes, vacinas, formulações e desenvolvimento de biossensores, e muitas outras aplicações em nanomedicina e em nanobiotecnologia.

Um dos principais aspectos em nanobiotecnologia é a utilização de sistemas auto- organizados, nos quais, sob condições de equilíbrio, moléculas associam-se espontaneamente em estruturas supramoleculares unidos por ligações não covalentes [55, 100].

Proteínas de camadas celulares de bactérias, conhecidas como S-layer, representam um sistema de auto-organização que foi aperfeiçoado no decorrer de bilhões de anos de evolução. Sendo composta de espécies únicas de proteínas ou subunidade glicoproteínas, as camadas de S-Layer podem ser consideradas como o mais simples tipo de membrana biológica desenvolvida durante a evolução [100].

Proteínas S-Layers estão presentes nas bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e Archae, e podem ser associadas a diferentes estruturas de suporte [100-102]. Para uma grande variedade de aplicações em nanotecnologia, as subunidades das S-Layer têm a capacidade de recristalizar-se em reticulados monomoleculares coerentes de proteína em suspensão, em interfaces sólido-líquido, em filmes lipídicos e em lipossomos, bem como sobre uma grande variedade de suportes sólidos, tais como lâminas de silício, metais nobres, e polímeros [102-110].

Neste estudo simulamos a superfície de bactérias através da utilização de camadas de proteínas S-Layer para estudar a adesão de lipossomos sobre as estas superfícies, permitindo avaliar a utilização de drogas anti-bacterianas encapsuladas em lipossomos. Formamos filmes de S-Layer de Lysinibacillus sphaericus CCM2177sobre o eletrodo de ouro de uma microbalança eletroquímica de cristal de quartzo, EQCM, para estudar a interação entre esta camada e lipossomos zwiteriônicos na sua superfície. Comparamos esse resultado com superfícies não funcionalizadas e funcionalizadas com filmes de tiol, hidrofóbico e hidrofílico.

Temos cooperado com o grupo do professor Kautek no desenvolvimento e uso da QCM [59]. Agora cooperamos no estudo e desenvolvimento de ferramentas para a nanotecnologia. A técnica de uso de bactérias descrita neste projeto, a nosso conhecimento, não é feita no Brasil e no laboratório em Viena foram publicados muitos trabalhos sobre o assunto. Aplicações deste projeto são na tecnologia de sensores, diagnósticos, desenvolvimento de vacinas, e biocatalisadores [101-102, 106, 111-114].

O aparato experimental é semelhante ao utilizado em referência [54]. Um setup de três eletrodos para célula eletroquímica com volume de 5mL é apresentado na Figura 6.49.

Foi empregado o sistema de microbalança de cristal de quartzo eletroquímica (CH Instruments, modelo CHI 440), com cristais osciladores em 8 MHz em corte AT, cobertos com filmes de ouro de 200 nm de espessura, utilizados como eletrodo de trabalho. A superfície ativa é de 0,265 cm2, com área geométrica de 0,205 cm2. O fator de conversão freqüência massa para esse sistema é de -1,83 ng/Hz [103]. Uma configuração de três eletrodos com um fio de platina como o contra-eletrodo e eletrodo de Ag/AgCl/KCl (3 M) como o eletrodo de referência serão usados num recipiente de teflon (Figura 6.49). As soluções de eletrólitos são preparadas com água deionizada, Milli-Q (18 M cm-1, Millipore) e produtos para análise. Medições potenciostáticas também são realizadas, utilizando um equipamento de potenciostato / galvanostato(CH Instruments).Utilizamos como moléculas de funcionalização hidrofóbica octadecanethiol (18 C), para funcionalização hidrofílica 2- mercapto etanol.Os lipossomos de DOPC e as S-Layers Lysinibacillus sphaericus CCM2177 (provenientes do AIT – Instituto Austríaco de Tecnologia), tabela 1, foram depositadas conforme referência (103): com o sistema mantido a +200 mV do ponto de zero carga, em solução buffer: 100 mM Na2SO4, 5 mM CaSO4, 1mM B(OH)3, a pH 9,0. Lipossomos

utilizados de DOPC. Uma alíquota de 150 L com solução concentrada 1 mM foi adicionada à célula eletroquímica, para concentração final de 10 - 4 M de DOPC .

Figura 6.49: Setup de célula eletroquímica para deposição de proteínas sobre eletrodo da EQCM.

Tabela 1: Informações da proteína S-layers da Lysinibacillus sphaericus CCM2177 [103]:

Tipo de rede cristalina quadrada Número de subunidades por célula unitária 4 Vetores de base da célula unitária (a b)/ nm 13,1 ±0,4

Massa molar da subunidade / g mol -1 132000 Densidade de sítios de ligação (-COOH)/nm2 1,6

Área por célula unitária / nm2 172

Diâmetro do poro / nm 4 -5

Cobertura de superfície / ng cm-2 510 Módulo de compressibilidade / MPa 0,6

Resultados

As informações sobre extração e purificação das proteínas S-Layers estão descritas em detalhe na seção 3.4. Seguem os resultados para deposição de lipossomos de DOPC em meio contendo água. Uma alíquota de solução concentrada é adicionada, resultando em concentração final de DOPC em 10-4M. O número de moléculas de fosfolipídios num arranjo HCP, é:

onde A é a área ativa do cristal e RLip é o raio da cabeça polar do fosfolipídio [38]. Desse

modo, para o eletrodo utilizado uma monocamada de fosfolipídios (12,07 ng) de DMPC representa uma variação de freqüência de -6,6 Hz. A dupla camada de lipossomos corresponde a - 13,1 Hz. A QCM utilizada não realiza medidas diretas de dissipação, apenas freqüência.

A Figura 6.50 mostra a dinâmica de deposição de lipossomos de DOPC sobre eletrodo de ouro sem funcionalização. A variação de freqüência foi de -41 Hz, em um intervalo de 17200 s.

7000 14000 21000 -60 -30 0 F re q u e n cy Shi ft / H z

Sample Interval (s) = 0.2 (Run Time (sec) = 4e+4) B bare gold liposome

f = -41Hz DOPC

Figura 6.50: gráfico f vs. t para adsorção de lipossomos de DOPC sobre eletrodo de ouro não funcionalizado.

Esse valor de diferença de freqüência é compatível com 3 bicamadas de fosfolipídio depositando sobre o eletrodo da QCM.

4000 8000 12000 -300 -200 -100 0 F re q u e n cy Shi ft / H z

Sample Interval (s) = 0.2 (Run Time (sec) = 4e+4) B

f=-300 Hz Octadecanethiol - liposome DOPC

Figura 6.51: gráfico f vs. t para adsorção de lipossomos de DOPC sobre eletrodo de ouro funcionalizado hidrofóbico.

Para o eletrodo funcionalizado com octadecanotiol Figura 6.51, há maior variação de freqüência, indicando uma maior deposição de lipossomos sobre a interface sólido/líquido: f = -300 Hz em 10600 s. Essa variação de freqüência é compatível com o depósito de 23 dupla-camadas de fosfolipídios de DOPC sobre o eletrodo.

A superfície com funcionalização hidrofílica mostra uma rápida adsorção dos lipossomos, Figura 6.52. Uma variação de -35 Hz foi observada nos primeiros segundos, seguida de um aumento da freqüência até uma variação final de -27 Hz.

2800 3500 -40 -30 -20 -10 0 F re q u e n cy Shi ft / H z

Sample Interval (s) = 0.1 (Run Time (sec) = 4e+4) B mercapto liposome

f = -27 Hz DOPC

Figura 6.52: gráfico f vs. t para adsorção de lipossomos de DOPC sobre eletrodo de ouro funcionalizado hidrofílico.

A variação de freqüência aferida para a funcionalização hidrofílica é compatível com a formação de apenas duas camadas de DOPC sobre o eletrodo, porém de maneira mais rápida quando comparado às situações de superfícies hidrofóbicas.

-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 F re q u e n cy / H z

Init E (V) = -0.43 (Sample Interval (s) = 0.1) lipossomos

S-layer

Figura 6.53: Gráfico f vs. t para a formação dos filmes de S-layers e posterior adsorção de lipossomos de DOPC sobre eletrodo de ouro funcionalizado.

A deposição de S-layer não ocorre de maneira espontânea. É necessário fazer uma voltametria cíclica com o buffer a pH 9,0 para obter o ponto de corrente nula (quando não há qualquer reação na superfície). O eletrodo é mantido a 200 mV mais anódico que o potencial de zero carga, e então se adiciona a solução contendo as proteínas [103]. Após a estabilização da freqüência, se adiciona solução contendo lipossomos de DOPC. A Figura 6.53 mostra o resultado da deposição de S-layers.

A adsorção de S-layers começa em t= 200s. A freqüência aumenta diminui em 50 Hz, correspondente a uma massa depositada sobre o eletrodo de 91,5 ng. Para esta área de eletrodo, não é uma camada completa formada sobre o ouro. Uma cobertura completa de proteínas é atingida com 73 Hz (135 ng) [103].

A adição de lipossomos acontece em t = 900 s. Uma pequena diminuição de freqüência de 1,0 Hz é observada em , seguida por um aumento de aproximadamente - 26 Hz. O comportamento posterior é similar ao que foi visto com a deposição de lipossomos em eletrodo funcionalizado com moléculas hidrofílicas. Há na literatura indícios de que os lipossomos podem ter capturado as S-Layers em solução, acumulando um segundo revestimento sobre eles [55].

Conclusões e comentários

O estudo realizado no estágio sanduíche também indicou que a adsorção de lipossomos zwiteriônicos de DOPC sobre eletrodos de ouro depende da funcionalização realizada. Quanto mais hidrofóbico, maior a massa depositada, num grande intervalo de tempo. A superfície com funcionalização biológica (S-layers) submetida ao contato com lipossomos teve uma dinâmica de adsorção similar a de uma superfície funcionalizada hidrofílica.

Mais estudos envolvendo interfaces biológicas/biomiméticas e o meio líquido adjacente são necessários. No entanto, é evidente que o emprego da técnica da microbalança de cristal de quartzo é importante para obtenção de informações na interface sólido/líquido com eletrodos funcionalizados.